Аналитические возможности биохимического сенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В.И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

БАБКИНА Софья Сауловна

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ БИОХИМИЧЕСКОГО СЕНСОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ - 1990

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственного университета имени В.И.Ульянова-Ленина

Научные руководители: докгор химических наук,

профессор Г.К.БУД1ИК0В

кандидат химических наук, доцент Э.П.ЩЦЯНЦЕВА

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

ст.н.с. Е.Б.НИКОПЬСКАЯ

кандидат химических наук, доцент М.И.ЕВГШЬЕВ

Ведущая организация: Башкирский государственный-

университет (г.Уфа)

Защита состоится "(р " /^ 1990 г. в час, на заседании специализированного совета К 053.29.02- при Казанско государственном университете им.В.И.Ульянова-Ленина (ул.Ленина, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просьба присылать по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18, КГУ, Научная часть.

Автореферат разослан " /О __ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного

совета,кандидат химических наук "^^^/Н.Р.Федотова

Актуальность теш. Одной из вакнейших задач аналитической химии является создание чувствительных и селективных методов анализа биологически активных веществ. В связи с проблемами экологии эта задача становится еще более актуальной. Для ее решения перспективно использование аналитических реагентов нового поколения - ферментов или содержащих их биоматериалов. Важный этап в создании аналитических систем контроля - разработка различных ферментных датчиков С биохимических сенсоров) на основе иммобилизованных ферментов, сочетающих в себе как преимущества способа детекции аналитического сигнала, ту: и высокую стабильность и активность работы ферментной системы. фтчики на основе иммобилизованной холинэстеразы (Ж)) могут найти достойное место среди средств контроля состояния: воздуха, воды, почвы, других природных объектов, а также могут с успехом быть использованы дня анализа биологических объектов и пищевых продуктов.

В последнее время ферменты все чаще используются, в качестве метки антигена САГ) или антител (АТ) для контроля протекания иммунологических реакций. В данном случае они поступает прекрасной альтернативой радиоиммунным и люминесцентном меткам, являясь более безопасными и высоко чувствительными -маркерам. Применение датчиков на основе иммобилизованной холгагесгеразн (ШВ) в иммуноферментном- анализе (ИМ) позволило бы разработать принципиально иной вариант экспрессной имыунодиагксстккг.

Такта образом разработка способов иммобилизации ХЭ и создание на зз основе амперометрического ферментного электрода является актуальным как в теоретическом аспекте - изучение оптимальных условий работы фермента и ее количественная оценка, так и для практического использования, поскольку это исследование служит основой создания нового биохимического сенсора с практически неограниченны® возможностями применения.

Цель исследования заключалась в разработке и создании биохимического сог'сора на основе ИХЭ и применение его для аналитического ;:;-нтрэля различных объектов, а таклз в иммунологии и ветеринар:«! для диагностики некоторых заболеваний. Дчя достижения поставленной цели необходимо получить гогазщ

на основе нитрата целлюлозы (Щ), оценить влияние рй, температур!, диффузии субстрата, воздействие ряда металлов, фосфор-органических соединений (ФСС) и других эффекторов на активность ИХЭ; оценить кинетические параметры ферментативной реакции, а также возможность работы ферментного электрода (ФЭ) в проточной системе; модифицировать биосенсорную часть ФЭ с Целью использования его в Шк.

Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН СССР по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4. 7) по теме № 01.86.0106158 и согласно приказу Государственного комитета СССР по народному образованию Р 59 от 31.01.89 г.

Научная новизна. Разработан способ иммобилизации ХЭ путем комбинированного действия глутарового альдегида и включения в пленку из НЦ. ИХЭ использована для создания амперомет-рического ФЭ. Выяснено влияние рН, температуры, диффузии субстрата к ИХЭ на каталитическую активность фермента. Обнаружено активирующее действие ионов Са(П) и других щелочных и щелочноземельных металлов,- а также активирующее действие ионов тяжелых металлов в малых концентрациях, йнгибирующее действие ряда азот-, фосфор- и хлорсодержащих соединений на биосенсорную часть электрода использовано для определения их микроколичеств. Оценены значения кинетических параметров ферментативной реакции и их изменение в присутствии ингибиторов ХЭ. Найдены'-значения констант ингибирования и р1§о для изученных ингибиторов, с помощью которых проведено сравнение ингибирую-щей способности соединений. Разработаны условия реактивации сенсорной части датчика. Списана возможность использования биосенсора в проточной системе. Разработаны новые варианты ША с использованием иммуноферментного электрода и ингибиторов ХЭ в качестве метки иммуноглобулинов. Предложены тест-системы для диагностики алеутской болезни норок.

Практическая значимость. Предложены высокочувствительные и селективные способы определения тиохолиновых эфиров, тяжелых металлов, прозерина, хлорофоса, армина и других азот-, хлор- и фосфорсодержащих ингибиторов ХЭ с помощью разработанного 3>Э. Разработан проточный ферментный реактор периодическо-

го действия для анализа токсикантов в потоке. Конструкция ферментного электрода, устройство ферментного реактора, способ определения хлорофоса и лрозерина, а также состав биосенсорной части иммуноферментного электрода и его использование в иммунодиагностике защищены авторскими свидетельствами. Предложена тест-система для диагностики алеутской болезни норок с помощью иммуноферментного электрода. Методика определения ингибиторов ХЭ внедрена в Казанском химическом научко-исследова-тельсном институте. Методика определения 2,4-дихлорфеноксиук-сусной кислоты применяется на Республиканской санитарно-эпи-дешологической станции.

На защиту выносятся:

- устройство ФЭ на основе разработанного способа иммобилизации ХЭ в пленку из НЦ и условия его функционирования;

- возможность определения кинетических констант ферментативной реакции, константы ингибирования и plgg п0 вольташерометри-

чесним данным (изменению величины тока), полученным с использованием ФЭ на основе ЙХЭ;

- активирующее действие ионов СаШ) и его использование для определения микроколичеств азот-, фосфор-, и хлорсод ерэкащих ингибиторов ХЭ. Способ определения микроколичеств ионов тяжелых металлов по их активирующему действию на ИХЭ;

- устройство ферментного реактора периодического действия на основе полярографической ячейки и ФЭ;

- состав биосенсорной части иммуноферментного .электрода и экспрессный способ проведения иммунодиагностики с его помощью;

- новый вариант ингибиторного иммуноанализа с использованием конъюгата £ денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота -фосфорорганический ингибитор X3J и состав конъюгата.

Апробация работы. Основные, результаты диссертации представлены и отражены в материалах Всесоюзной конференции "Химические сенсоры-89" (Ленинград, 1989 г.), Ш Всесоюзной конференции по электрохимическим методам анализа (Томск, 1989 г.), И Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы разработки и эксплуатации систем контроля загрязнения окружающей среды" (Казань, 1989 г.), Всесоюзной конференции "Современные

методы анализа металлов, сплавов, объектов окружающей среда" (Ижевск, 1990 г.), Всесоюзной научно-практической конференции "Химические и биологические методы в охране окружающей среды от загрязнения тяжелыми металлами" (Усть-Каменогорск, 1990 г.), Международного симпозиума по электроанализу объектов окружающей среды, биохимии и промышленности (Лохборо, Англия,1939 г.), 32-го конгресса ИШАК (Стокгольм, Швеция, 1989 г.), конгресса по полярографии к 100-летию со дня рождения Гейровского (Прага, 435 Р, 1990 г.); открытого скандинавского симпозиума по новым достижениям в теоретической и прикладной электрохимии (Копенгаген, Дания, 1990 г.), а также доложены на итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 1990 г.), и секции "Методы контроля химического состава материалов" Московского Дома научно-технической пропаганды (Москва, 1930 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ. Из них 4 авторских свидетельства на изобретения, 5 статей и 10 тезисов докладов на всесоюзных и международных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит 22 рисунка (из них 3 в приложениях), 23 таблицы и список литературы из 188 наименований. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы и 3 приложений. Первая глава посвящена обзору литературного материала, относящегося к характеристике ХЭ как биокатализатора, ее эффекторов, реактиваторов, а также характеристике амперометрических датчиков на основе различных ферментных систем, работающих как в стационарном, так и в проточном режимах, и их использованию в Шк. Во второй главе на ос-ноер анализа литературных данных подробно формулируется задача предстоящего исследования, охарактеризованы объекты и описана техника и условия эксперимента. В третьей главе рассматри-г вается электрохимическое поведение серосодержащих субстратов ХЭ, устройство и условия работы электрохимического сенсора на основе ИХЭ. Четвертая глава посвящена различным аспектам аналитического использования предложенного ФЭ, включая влияние ионов щелочных и щелочноземельных металлов, определение тяже-

- б -

лых металлов, а также азот-, хлор- и фосфорсодержащих ингибиторов ХЭ; описана также работа ШЭ в проточных условиях. В пятой главе показана возможность использования ФЭ на основе ИХЭ в различных вариантах ИЗД.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспериментальная работа выполнена на осциллографическом полярографе ЦЛА модели СВ. Рабочим- электродом служил стационарный ртутно-пленочный электрод (СН1Э) с серебряной подложкой, электродом сравнения - насыщенный каломельный электрод. Использовали бутирилХЭ сыворотки крови лошади (КШ 3.1.1.8) с активностью НО АЕ/мг; ФОС: 0,0-диэтилфенилфосфонат (ДОШФ) и О-бу-тилбутилтолилфосфинат (ББТШ), синтезированные на кафедре физ. химии КГУ, бис(оксиметил)фосфиновую кислоту (БСФК)> синтезированную в И (Ж им.А.Е.Арбузова КНЦ Ш СССР. Использовали также иммуноглобулин (г (0,8 и 1,5 мг/мл), полученный из сыворотки больных норок, денатурированную ДЖ (д-ДЖ) селезенки крупного рогатого скота (0,01 и 0,1 мг/мл), продажный препарат антигена алеутской болезни норок.

Получение ИХЭ. 0,05 - 0,1 г НЦ типа коллоксилин растворяли в смеси толуола и бутилацетата (1:1,6), добавляли 0,2 мл еодного раствора ХЭ (навеска 0,0180 г), после перемешивания приливали 0,06 - 0,1 мл 25^-го раствора'глутарово-го альдегида и затем гексан в качестве коагулянта.

Изготовление сенсорной части иммуноферментных электродов (ЙФЭ). 0,05 г НЦ растворяют,как описано выше, добавляют 0,2 мл раствора АГ (ДЖ, АТ), содержащего 0,018 г ХЭ. После перемешивания добавляют 0,06 мл 25%-ного раствора глута-рового альдегида и гексан. Получают пленку, вырезают, кусочки 25x65 мм и помещают их на 30 мин при комнатной температуре в 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в 0,01 М физиологическом фосфатном буферном растворе (7,0-7,4). После промывки боратным буферным раствором (9,05) пленку закрепляют в гофрированном виде на поверхности корпуса СНТЭ с серебряной подложкой с помощью прижимных колец.

При получении конъюгата ГБСШК - д-ДЖ] I мл раствора д-

ДНК (0,1 мг/мл) смешивают с I мл раствора БСШК (0,1 моль/л). После перемешивания в течение 10 мин добавляют 0,04 мл глута-рового альдегида. Полученную смесь перемешивают в течение 5 мин. Для получения конъюгата [хлорофос - д-ДЖД 0,0004 г хлорофоса растворяют в 2 мл раствора д-ДЖ (0,1 мг/мл). После 15 мин перемешивания добавляют 0,06 мл глутарового альдегида. Полученный раствор перемешивают 15 мин.

БИОЭЛЕКТРСКИМИЧЕСЮЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ И УСЛОВИЯ- ЕГО ШКЦИСНИРОВАНИЯ

Экспериментально определяемой величиной является высота пика при потенциале -0,55 В, относящегося к обратимому восстановлению продукта взаимодействия тиола, образовавшегося при гидролизе бутирилтиохолин иодида (ВГХИ), с материалом электрода - ртутью. В присутствии нативной и иммобилизованной ХЭ пик этот быстро растет, достигая предела через 15-20 мин. Пик восстановления меркаптида ртути имеет адсорбционную природу. Величина тока пика зависит от активности ИХЭ и от эффекторов ХЭ, присутствие которых в исследуемом растворе определяли с помощью ФЭ. Для изготовления 3>Э предложен новый способ иммобилизации ХЭ: включение фермента в матрицу из НЦ с параллельной обработкой глутаровым альдегидом (бифункциональным реагентом). Полученную пленку с равномерно распределенной в ней ИХЭ (А= 0,57 Е/см^) закрепляют на корпусе ШЭ (рис.1). При данном способе иммобилизации ХЭ на 28 % сохраняет свою каталитическую активность и не утрачивает своих свойств не менее 2-х недель. В данных условиях оптимальное значение рН - 9,05. Найденное значение кажущейся константы Михаэлиса кажр (4,24*10Г® М) намного меньше используемой концентрации БТХИ (1,9'10~\оль/ л), то есть диффузия молекул БТХИ через поры носителя к молекулам ХЭ не влияет на, скорость реакции ферментативного гидролиза

АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕНЖШОГО ЭЛЕКТРОДА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Ионы Са(П) в области концентраций 1*10 - З'Ю моль/л, а также ионы Na(I), К(1), М^(П), Мп(П), А1(Ш) в определенном

ж

интервале концентраций оказывают активирующее действие на ИХЭ (увеличение величины тока регистрируемого пика, тан как связывают анионную группу вблизи активного центра ХЭ, препятствующую взаимодействию фермента с субстратом. Чем больше радиус и заряд иона металла-активатора, тем меньшая концентрация его необходима для блокирования анионной группы. Поскольку соли данных металлов входят в состав природных объектов, их действие необходимо учитывать при анализе реальных образцов с помощью ФЭ., Ионы тяжелых металлов Т1(1), 2л(П), НКП), РКП), Н^П), С<КП), Сы(П), Ре(Л), ВКШ) являются неспецифичными ингибиторами ХЭ. Максимальный ингибирующий эффект оказывают Си(П) и РКП), вызывая уменьшение тока уже в концентрациях 1,0* 10~9 и 5,0*10"^ моль/л соответственно. Определение каждого из перечисленных металлов возможно только в отсутствие другого. При анализе реальных объектов 3>Э будет давать отклик на суммарное содержание тяжелых металлов и работать как датчик общей токсичности. При действии малых концентраций ионов Т1(1) (10~®-Ю"11 моль/л), Н^(П) (10~5-Ю~12 моль/л), Р&(П) (Ю"7-10"9моль/ л) и СсКП) (10~^-5М0~^ моль/л) наблюдается активация ИХЭ, что использовано для их определения на уровне ПДК и ниже, не прибегая к дополнительному концентрированию.

В боратном буферном растворе (£й 9.05) наблюдается линейная зависимость от РСбтхИ в штеРвале концентраций 10"^-4' Ю-8 моль/л в присутствии ионов Са(П), которая описывается уравнением у=(-0,93+0,07)х+(3,1+0,3), г =0,9967. ФЭ использован для определения обратимых (сн=10 -10"-^ моль/л) и необратимых (с =10"^ моль/л) N-,01-, и Р-содержащих ингибиторов ХЭ, гидрофобное взаимодействие незаряженных молекул которых с гид-

Рис. I. Ферментный электрод на основе ИХЭ. I - Корпус: 2 - Ао-про-волокаы =0,5 мм)? 3 -Си-проволока; 4 - гофрированная пленка из НЦ с включенной ИХЭ; 5 -прижимное кольцо

рофобными участками в районе эстеразного, центра ХЭ усилено за счет введения ионов Са(П) (табл.1).

Таблица I

Результаты, определения ингибиторов ХЭ (Л =5, Р=0,95)

Ингибитор Введено,с,моль/л Найдено,с,моль/л 5г'1с£

Прозерин 1-Ю"6 1,4'Ю"6 4,50

1-Ю"8 0,7-Ю"8 17,00

1-Ю'10 2,4-Ю"10 25,00

Хлорофос 1-Ю"6 1,4'Ю'6 4,27

1-Ю"9 1,0'Ю"9 4,37

ПО'11 3,0'Ю~П 19,00

ДЭШФ 1-ю-7 1,5'Ю"7 3,60

1-Ю"8 0,8-ю"8 4,00

1-Ю"9 2,0'Ю"9 12,00

ББ® . 1-Ю"7 0,8.10-7 10)50

ПО"9 2,0'Ю~9 13,10

5'Ю"11 1,8-Ю"11 19,90

Армия 5'10"9 5,2* Ю"9 7,10

1-Ю"11 1,3* 10"11 7,30

1ЧСГ12 3,0-Ю"12 9,60

2,4-Д 1-Ю"9 1,1'Ю"9 1,60

1'1<Г10 1,0'Ю"10 2,30

1'Ю"П 1,1'1£ГП 2,80

1'Ю"12 1,5'Ю~12 13,00

Разработана методика"быстрого "безреагентного" определения пестицида 2,4-Д в молоке в области концентраций от 10 до Ю"^2 моль/л без предварительной подготовки пробы. Эффективные способы реактивации биосенсорной части ФЭ путем обработки 0,1 М раствором ЭДТА или 0,97 М раствором цистеина после действия тяжелых металлов (время реактивации 15 и 25 мин соответствен-

но) и 2*10"^ M раствором гидроксиламша или дипироксима после действия ЗОС и прозерина (5 - 15 мин в зависимости от концентрации ингибитора) позволяют использовать §>Э многократно. Для работы в потоке разработана простая, удобная в эксплуатации конструкция ферментного реактора на основе стандартной полярографической ячейки, работающего в непрерывном режиме в течение 16 часов, а в периодическом-трое- суток. С помощью ФЭ определены количественные характеристики ферментативной реакции (%(каж) » максимальная скорость и каталитическая константа) в присутствии хлорофоса, ДЭШ и ЕБТФ, значения которых указывают на обратимьй конкурентный характер ингибирования в случае ЙХЭ. Найденные значения констант ингибирования и PÏ50 подтверждают теоретический ряд уменьшения ингибирующего действия: да>ББ1Ш>хлорофос.

БИОХИМИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАНИЙ ХОПИНЭСТЕРАЗЫ В ИММУНШЕРМЕНИСМ АНАЛИЗЕ

ФЭ использован для разработки нового варианта ША с помощью модуляторов (эффекторов) ХЭ. В качестве меток АГ или AT служили модуляторы Б®К и хлорофос, а в качестве АГ для определения аутоантител - д-ДЖ. Подобраны оптимальные условия получения устойчивых и селективно действующих конъюгатов [ ФСС - д-ДЖ "} . Ранее подобные конъюгаты и ИХЭ как индикаторный фермент в ША не применялись. При отсутствии в исследуемом растворе специфических AT конъюгат, содержащий ФСС, ингибирует ИХЭ, что приводит к уменьшению аналитического сигнала. При введении специфических AT происходит быстрое, благодаря перемешиванию, связывание их с д-ДйС конъюгата. Являясь биологическими макромолекулами, AT стерически блокируют ФСС в конъюгате, препятствуя ингибированию фермента. Ей-сота.контролируемого пика при этом неизменна. Вариант инги-биторного MA использован для диагностики аутоиммунного заболевания - алеутской болезни норок. Методика диагностики позволяет количественно оценить степень тяжести заболевания. Для расширения аналитических возможностей ФЭ его биосеноор-

ная • часть модифицирована введением молекул АГ. ■ Полученный новый Шд для гетерогенного ИЕА без разделения компонентов является одновременно иммунологической твердой фазой, содержит фермент-маркер г ХЭ и обеспечивает возможность электрохимической детекции продуктов ферментативной реакции. При наличии в исследуемом растворе специфических АТ происходит быстрое их связывание с иммобилизованным АГ. Образовавшиеся иммобилизованные иммунокомплексы стерически препятствуют подходу субстрата к активным центрам ИХЭ, что приводит к спаду аналитического_сигнала (рис.2). ШЭ использован как для установления факта заболева-¡АГ | ния (алеутской болезни), так и для оценки степени I £ I тяжести заболевания. Резуль таты диагаостики заболева-

Рис.2. Ш?А с помощью ШВ ния,. полученные с помощью

®Э, хорошо согласуются с результатами классического ША со спектрофотометрической индикацией, а также с данными, полученными специфической серологической реакцией иммуноэлектроосмофореза. Метод диагностики отличаются чувствительностью (5,33*1СГ*® моль/л), простотой, экспрессностью (время проведения диагностики 15 мин), специфичностью, что подтверждается отсутствием спада контролируемого пика при введении человека и крупного рогатого скота. Введение в биосенсорную часть антител позволяет определять АГ в биологических жидкостях. Поскольку алеутская болезнь имеет аутоиммунную природу, для выявления ауто-АТ использована д-ДЖ, иммобилизованная в пленке из НЦ. Диагностика проводилась аналогично. Модифицированный таким образом ШЭ можно использовать для диагностики ряда аутоиммунных заболеваний. Наилучшими свойствами (устойчивостью при хранении,стабильностью в работе, отсутствием вымывания компонентов) обладает пленка из НЦ состава (масс.56): ХЭ - 10,6-12,6; д-ДЖ -0,94-1,86; глутаровый альдегид -'17,5-18,0. Для многократного использования ШЗ и автоматизации диагностики найдены условия I0096-ной реактивации биосенсорной части Ш>Э путем ее

обработки 0,6 М раствором MgCIg в течение 15 мин для разрушения образовавшихся на.поверхности пленки иммунных комплексов.

вывода

1. Разработан новый ферментный электрод на основе стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и холинэстеразы, иммобилизованной путем включения в пленку из нитрата целлюлозы и ковалентной пришивки глутаровым альдегидом, с активностью фермента 0,57 Е/см2 и временем жизни биосенсорной части не менее двух недель. Оптимальные условия работы: время ферментативного гидролиза субстрата холинэстеразы (бутирилтиохолин иодида) - 15 мин, температура - 25 °С, бо-ратный буферный раствор с pH 9,05. Нижняя граница определяемых содержаний тиохолиноных эфиров составляет 4*10"® моль/л.

2. Показана возможность использования ферментного электрода для определения кинетических параметров ферментативной реакции (кажущейся константы Михаэлиса и каталитической константы) в отсутствие и в присутствии ингибиторов холинэстеразы. Ингибирующая активность уменьшается в ряду: 0,0-диэтилфе-нилфосфонат > О-бутилбутилтолилфосфинат > хлорофос.

3. Ионы Na(I), К(1), Са(П),. М$(П), Мл(П), АГ(Ш) увеличивают каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы. Максимальный каталитический эффект наблюдается в присутствии ионов Са(П) в области концентраций 3*10 моль/л.

4. Ферментный электрод использован для обнаружения ионов THI), 2п(П), ШП), РКП), Нд(П), СсКП), СиШ), Fe(ffl) и Bt(ID), оказывающих ингибирующее действие на иммобилизованную холинэстеразу. Максимальный ингибирующий эффект проявляют ионы Си(П).(от 1,0Т0"9 моль/л) и свинца (П) (от 5,0'Ю~7 моль/ л). Впервые обнаружено активирующее действие малых концентраций ионов TI(I) (<1*Ю"5моль/л), РКП) «,1*Ю"7моль/л), Но(П) «I" 10 моль/л) и Odin) (<I'I0 моль/л). Обнаруженный•эффект использован для снижения нижней границы определяемых с помо- ' щью ферментного электрода концентраций.

5. Разработанный биохимический сенсор использован в методиках определения прозерина, хлорофоса, 0,О-диэтилфенилфосфо-

ната, О-бутилбутилтолилфосфиката, арьшна и 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты с нижней границей определяемых содержаний для обратимых ингибиторов холинэстеразы 10"^- 10" моль/л, а для необратимых 10~^моль/л.

6. Найдены условия эффективной (от 5 до 15 мин) реактивации биосенсорной части датчика путем обработки ее 0,97 М раствором цистеина или 0,1 М раствором комплексона Ш (в случае тяжелых металлов) и 2' Ю М раствором гидроксиламина или 7'10~% раствором дипироксима (в случае прозерина и фосфорсодержащих ингибиторов).

7. Разработана простая, удобная в эксплуатации конструкция ферментного реактора для работы в проточных условиях на основе стандартной полярографической ячейки и ферментного электрода. .Ферментный реактор работает в непрерывном режиме

в течение не менее 16 часов, а при периодическом действии -в течение 3 суток.

8. Предложен новый вариант ингибиторного иммунофермент-ного анализа, основанный на использовании ферментного электрода и модуляторов ферментов, в качестве которых использованы бис(оксиметил)фосфшовая кислота и хлорофос. Оптимизированы состав коныогатов ингибиторов с денатурированной ДНК и условия проведения анализа. Разработана экспрессная и селективная тест-система диагностики алеутской болезни норок. Время единичного определения 30 мин.

9. Новый иммуноферментный электрод получен путем введения в состав биосенсорной.части антигена (денатурированной ДНК) или антител. Оптимизирован состав его биосенсорной части. Минимально определяемая концентрация специфических антител при диагностике. б^'Ю^^оль/л.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. А.с. 1296913 СССР, МКИ3 & 01 N 27/30. Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров/Г.К.Ву-дников, Э.П.Медянцева, Н.А.Улахович, С.С.Бабкина (СССР).-

3749229/31-25.Заявлено 19.08.84. СПубл. 1986,'Бюл.Р 10.

2. А.с.1562831 СССР, МКИ3 & 01 N 27/48. Способ определе-

ния хлорофоса и прозерина/Г.К.Будников, С.С.Бабкина, Э.П.Ме-дянцева, И.Л.Федорова (СССР)4485080/31-25.Заявлено 11.07. 88.Опубл.1990,Бюл.№ 17.

3. Положительное решение от 22.06.89 по заявке № 4458197/ 31 от 11.07.88. Устройство для определения ингибиторов и активаторов холинэстеразы/Г.К.Будников, С.С.Бабкина, Э.П.Медянцева

4. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С., Волков A.B. Влияние ионов металлов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы//Ж.аналит.химии.-1989.-Т.44,№ 12.-С.2253-2257.

5. Будников Т.К., Медянцева ЭЛ., Бабкина С.С. Электрохимическое определение кинетических параметров ферментативной реакции с участием иммобилизованной холинэстеразы//Элек-трохимия.-1989.-Т.25,Р 9 .-С,I283-1286.

6. Бабкина С.С., Федорова И.Л., Волков A.B. Вольтамперо-метрическое изучение влияния ионов металлов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстзразы//Тез.докл.Ш Всеео-юз.конф.по электрохимическим методам анализа.-Томск,1989.-С.47

7. Будников Г.К., Медянцева ЭЛ., Бабкина С.С. Вольтам-перометрический датчик на основе иммобилизованной холинэсте-разы: факторы, определяющие аналитический сигнал//Там же,-С.59-60.

8. Медянцева Э.П., Бабкина С.С., Будников Г.К. Определение кинетических параметров ферментативной реакции с помощью биосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы//Тез.докл. Всесоюз.конф."Химические сенсоры-89".-Л.»I989.-C.254.

9. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы в анализе потенциальных загрязнителей окружающей среды//Там же.-С.222.

10. Будников Г.К., Медянцева ЭЛ., Бабкина С.С."Ферментные электроды с амперометрической индикацией как новое направление в разработке систем и средств контроля загрязнения окружающей среды//Тез.докл.Ш Всесоюз.конф."Проблемы разработки и эксплуатации систем и средств контроля загрязнений окружающей среды".Казань,1989.-С.83-84.

11. Положительное решение от 26.06.90. по заявке Р 4766

894/25 or 05.07.89. Ферментный электрод/Э.П.Медянцева, С.С. Бабкина, Г.К.Будников, И.Л.Федорова, Н.Н.Ибрагимова, В. Г.Вин-тер, Г.Ю.Бочкарев.

12. Медянцева Э.П., рудников Г.К., Бабкина С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы в анали зе потенциальных загрязнителей окружающей среды//Ж.Аналит.химии. -1990. -Т. 45,® 7.-C.I386-I389. .

13. Медянцева Э.П., Бабкина С.С. Биохимический сенсор на основе иммобилизованной холинэстеразы в анализе фосфорсодержа щих соединений//Казанский ун-т.-Казань, 1990.-Деп.в ШИИТЭХЙМ 21.06.90,№ 442-хп 90.

14. Ферментный датчик на основе иммобилизованной холшэс теразы в иммуноферментном анализе/Э.П.Медянцева, Г.К.БудникоЕ С. С. Бабкина, М. Г. Вертлиб//Казанский ун-т. -Казань, 1990. -Деп. в СНИИТЭХИМ 01.08.90,W- 572-хц 90.

15. Медянцева Э.П., Бабкина С.С. Биохимический сенсор с амперометрической индикацией в анализе объектов окружающей среды//Тез.докл.Всесоюз.конф."Современные методы анализа металлов, сплавов, объектов окружающей среды".-Ижевск,1990.-4.1.-С.118.

16.Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С. Биохимический сенсор на основе иммобилизованной холинэстеразы для контроля и оценки состояния окружающей среды//Тез.докл.Всесо-юз.науч.-тех.конф."Экология химических производств".-Северо-донецк, I99Q -С. 68-69.

17. Budnikov Н.С. , Medyanteeva Е.Р., Babkina S.S. Enzyme electrode based on the immobilized cholineateras« for pesticides control//Abs.32nd IIJPAC Congr.-Stockholm, I989.-P.214.-No.8077.

18. Budnilcov Ы.С., Medyant seva E.P. , Babkina S.S. Enzyme electrode based on the immobilized cholineeteras« for organic suberates//Abs.Int.Symp,Electroanal.Biochem. Environment, and Ind.Sc.-Loughborough,1989.-P.25.

19. Medyantseva E.P., Budnikov H.C., Babkina S.S.

Enzyme electrodes with araperometric' indication in analysis of possible environment contaminants//Abs.Heyrovsky Cent.Congr.-Prague,1990.

Сдано в набор 19.10.90 р. Подписано в печать 23.10.90 г. Форм.бум. 60 х 84 I/I6. Печ.л.1. Тираж 100. Заказ 764. Бесплатно.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5