Аналитические системы с иммобилизованным катализатором в вольтамперометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

РГБ

Ой

/ /; - УДК 543.253

■I рл/.

МЕДЯНЦЕВА Эльвина Павловна

АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ КАТАЛИЗАТОРОМ В ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ю.Г.Власов

доктор биологических наук, профессор А.М.Егоров

доктор химических наук, профессор О.М.Петрухин

Ведущая организация: Институт геохимии и аналитической

химии им.В.И.Вернадского РАН

Защита состоится " 21 " ¿У/^/ 1994 г.

в "/¿^ час. на заседании специализированного сове! по химическим наукам Д.053.05.60 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова в ауд. 62? хим! ческого факультета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им.Н.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " /X " июня 1994 г.

Отзывы и замечания просим направлять по адресу: 119899 ГСП, Москва В-234, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет, кпфедра аналитической химии, ученому секретарю специализированного совета

Учений секретарь

специализированного совета, к.х.н^.

Т.В.Беляева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОЗЫ

Актуальность. Одной'из важнейших задач современной аналитической химии является разработка чувствительных, селективных и в то же время экспрессных и достаточно простых по выполнению методов определения различных биологически активных веществ в природных объектах. Следует отметить и социальную значимость этого направления развития аналитической хшии в связи с проблемами экологии. Большие перспективы в этом плане представляют вольтамперометрические методы, обладающие целым рядом вышеперечисленных свойств. Однако при анализе природных образцов часто приходится сталкиваться с трудностями, обусловленными присутствием в исследуемом растворе нескольких электроактивных веществ. Такие помехи .особенно часто возникают в случае биологических жидкостей.^

Повышенные требования к аналитическим разработкам диктуют необходимость в экспрессных и в то яе время достаточно простых по выполнению методиках определения биологически активных соединений. И здесь определенного успеха можно достичь за счет разработки различных химических сенсоров. В этом направлении исследований весьма интересно и перспективно сочетание тех или иных вольтамперных датчиков - электродов с каталитическими реакциями. Заманчивым и перспективным оказалось использование для этих целей свойств'ферментов и содержащих их препаратов, биоматериалов, которые являются, по существу, аналитическими реагентами нового поколения. Использование иммобилизованных ферментных препаратов в таком варианте позволяет разрабатывать так называемые биохимические сенсоры (биосенсоры). Большой интерес вызывают и сенсоры на основе угольно-ластовых электродов, позволяющие вводить катализатор (модификатор) непосредственно в состав электродного материала.

-'К началу наших исследований ферментативные реакции очень редко и весьма односторонне использовались в вольтамперометрии Исключение, составляла, пожалуй, лишь реакция ферментативного окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы в сочетании с кислородным электродом Кларка, которая оказалась весьма перспективной для осуществления высокоселекгивных анализов, прежде всего в медицинских целях (определение глюкозы). Реакции

ферментативного катализа почти не использовались для контроля объектов окружающей среды. Имелись лишь отдельные публикации и упоминания в монографиях на эту тему. В настоящее время ферментные методы анализа и основанные на их закономерностях различные биосенсоры - новое, перспективное и успешно развивающееся направление современной аналитической химии, одна из задач которого разработка методов, способов и средств их осуществления для организации и развития экологического мониторинга природных объектов.

Использование различных, в том числе и каталитических, процессов в вольтамперометрии, основанное на применении специально подобранных катализаторов или модификаторов, с той или иной степенью жесткости закрепленных на твердофазной подложке, позволяет значительно расширить возможности этого метода исследования и анализа как в плане решения ряда проблем электрохимии, так и в плане аналитических приложений, что отвечает современный тенденциям развития науки.

Цель настоящего исследования -заключается в обосновании общеме^'одических подходов к разработке новых вариантов амперо-метрических сенсоров, в том числе и биосенсоров, и создании на их основе высокочувствительных, селективных и экспрессных способов определения широкого круга биологически активных соединений в сложных многокомпонентных средах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: Г. Обоснование принципов электрохимического контроля ферментных, других каталитических и иммунологических реакций. 2. Подбор. соответствующих стационарных электродов-трансдьюсеров как основы химических сенсоров, в том числе и биосенсоров. 3. Изучение механизма электрохимических реакций, лежащих в основе волътамперометрического контроля процессов ферментативного катализа, и процессов каталитического выделения водорода на модифицированных угольно-пастовых электродах. Разработка способов и условий получения биоспецифических мембран. 5. Оптимизация условий амперометрического детектирования реакции ферментативного катализа гидролиза серосодержащих субстратов холинэс-теразы и каталитического выделения водорода на угольно-пасто -вом электроде.

5. Обоснование методологических аспектов новых вариантов ш-(унологического анализа с ампероыетрическим детектированием. 7. Определение кинетических параметров реакции ферментативного гидролиза субстратов холинэстеразы и процессов комплексо-эбразования в системе антиген - антитело по вольтамперным данным. 8. Разработка рекомендаций практического использова-П1я сенсоров для анализа состояния и динамики изменения объ-зктов эколого-аналитического контроля. 9« Разработка различ-шх способов модификации электродной- поверхности и электро-1ктивного материала с целью придания определенных свойств химическим сенсорам.

Научная новизна работы. Предложены и обоснованы подходы 1 принципы вольтампероиетрического детектирования систем фер-«ент - субстрат, антиген - антитело, металл - лиганд, на ос-!ове которых разработаны новые варианты амперомегрических сенсоров с иммобилизованным катализатором, в том числе и био-зенсоров с иммобилизованной холинзстеразой, обладающих расши-5синим динамическим диапазоном концентраций, использующих электровосстановление продуктов предшествующих собственно электродному процессу реакций. Предложены новые способы иммобилизации холинэстеразы, приводящие к получению образцов с хорошими эксплуатационными характеристиками. Намечены пути )егулирования каталитической активности иммобилизованной хо-¡инэстеразы. Предложены новые трансдьюсеры для биосенсоров -¡тационарный ртутно-пленочный электрод с серебряной подлоа-сой и угольно-ластовый электрод, позволяющие работать не юлько в режиме электроокисления, но и электровосстановления [родуктов реакций. Разработан способ оценки ферментативной 1Ктивности по данным вольтамперных измерений. Обнаружено активирующее действие щелочных, щелочно-земельных и некоторых (ругих металлов (алюминия, марганца, цинка), а также микроко-[ичеств тяжелых металлов (свинца, кадмия, ртути, таллия) на ¡аталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы.Оце-Еено ингибирукхцее действие широкого круга ионов тяжелых ме-'аллов, азот-, фосфор-, серо- и хлорсодержащих органических оединений (в том числе и пестицидов) на биочувствительную асть холинэстеразного биосенсора. Показаны пути снижения

нижней границы определяемых-содержаний как за счет особенностей фермент-субстратной системы, так и условий вольтамперо-метрической регистрации получаемого сигнала. По вольтамперным данным оценены значения кинетических параметров ферментативной реакции в присутствии иммобилизованного фермента и их изменение в присутствии ингибиторов холинэстеразы. Проведено сравнительное исследование ингибирувдей способности этих соединений. Найден новый -вариант гомогенного иммуноферментного анализа с использованием амперометричесного холинэстеразного биосенсора и ингибиторов фермента в качестве метки иммуноглобулинов. Разработаны иммуноферыентные электроды разных видов, включающие в состав биочувствительной части помимо фермента различные компоненты биоспецифического взаимодействия и позволяющие проводить иммуноферментный анализ в гетерогенном варианте. Предложен способ определения эффективных значений констант' связывания иммунного комплекса антиген - антитело по данным вольтампероыетрических измерений с использованием способности микроколичеств белков в особых условиях вольтамперо-метрии вызывать каталитическое выделение водорода на стационарных электродах. Показана возможность" модификации угольно-пастовых электродов хелатами, солями металлов и органическими реагентами с целью повышения селективности определений. Найдена взаимосвязь между величиной каталитического эффекта выделения водорода и устойчивостью образующихся на поверхности модифицированного угольно-пастового электрода комплексных соединений.

В результате проведенных исследований значительно расширены рамки-аналитических возможностей вольтамперометрии. Намечены новые пути развития данного метода, всесторонне обосновано использование реакций ферментативного катализа и других видов каталитических процессов.

Практическая значимость. Разработаны и сконструированы новые типы амперометрических сенсоров для определения физиологически активных соединений в объектах окружающей среды, био-

логических жидкостях, продуктах питания и другой сельскохозяйственной продукции. Предложены простые и эффективные способы получения образцов иммобилизованной ХЭ, отличающиеся минимальным воздействием на ее каталитическую активность. Способы технологичны, позволяют получать однородные по составу образцы с большой механической прочностью, формировать специфичные биомембраны нужной конфигурации и размера, использовать данные подходы при иммобилизации других ферментов. Предложены варианты получения биоспецифических мембран для изготовления биосенсоров и иммуноферментных электродов. Разработан простой, удобный и наглядный способ контроля изменения каталитической активности иммобилизованной ХЭ. Разработаны селективные и высокочувствительные способы и методики определения серосодержащих субстратов ХЭ, лекарственных препаратов, потенциальных загрязнителей окружающей среды (тяжелых металлов, пестицидов, серных компонентов вулканизующих систем) с помощью новых сенсоров в широком концентрационном диапазоне с величиной сн на уровне ПДК и ниже на несколько порядков. Методики отличаются простотой и экспрессностью. Показано преимущество использования данных биосенсоров при анализе биологических систем, так как в этом случае аналитический отклик наиболее адекватен реакции живого организма на воздействие извне. Разработан проточный ферментный реактор периодического действия для определения экотоксикантов в потоке.

Предложены общеметодические подходы и рекомендации к разработке амперометричесних сенсоров и биосенсоров, позволяющие распространить и использовать выявленные закономерности при разработке сенсоров для анализа других объектов и конкретных зоединений. Показана возможность применения разработанных (в гом числе и модифицированных) амперометрических биосенсоров на основе ХЭ в иммуноанализе ряда веществ после предварительного зеревода их в иммуногенное состояние.

Разработаны новые варианты осуществления иммуноферментно-го анализа (ИФА) с ампероыетричвским детектированием, отличающиеся простотой и экспрессностью (время анализа 15-30 мин).

7

Эти варианты ИФЛ. использованы для обследования ряда животных и растений с целью диагностики их заболеваний. Показана перспективность данного подхода к выявлению заболеваний на разных стадиях развития, а также целесообразность применения разработанных вариантов ИФА для энзимодиагностики патологических состояний человека. Разработан способ определения констант связывания иммунных комплексов антиген - антитело (вирус крапчатости гвоздики - 5" ) по данным вольтамперометрии с использованием высокочувствительной реакции каталитического выделения водорода микроколичесгвами белка в присутствии солей кобальта. Каталитически активные комплексы кобальта и серебра нашли применение в качестве модификаторов УПЭ, предназначенных для определения серосодержащих пестицидов и серных компонентов вулканизующих систем. Высокая селективность сенсоров данного типа обусловлена кинетикой лигандного обмена с участием модификатора УПЭ. Явление каталитического выделения водорода на модифицированных электродах из угольных паст использовано также для снижения сн ионов тяжелых металлов в природных объектах.

Практические разработки защищены 9 авторскими свидетельствами, получено 10 актов о внедрении НИР и использовании их в различных лабораториях я институтах. Теоретические и экспериментальные результаты диссертации послужили основой для цикла лекций,- читаемых на кафедре аналитической химии Казанского университета и на курсах повышения квалификации для работников аналитических лабораторий и служб экологического мониторинга предприятий и организаций региона, а также нашли отражение в учебной литературе (Г.К.Будниксв, Н.А.Улахович, Э.П.Медянцева. Основы электроаналитической химии, Казань: Изд-во КГУ, 1986).

На защиту выносятся:

- основные подходы к разработке, исследованию и конструированию амперометрических химических и биохимических сенсоров;

- результаты исследования электрохимического поведения соединений, отвечающих за аналитический сигнал в системах на основе реакций с иммобилизованным катализатором;

подход к выбору трансдьюсеров как основы амперомет рических сенсоров;

- способы иммобилизации холинэстеразы для получения био-

8

чувствительной части ферментных электродов;

I

- способы модификации биомембран, электродной поверхности и состава электродно-активноро материала с целью получения сенсоров с заданными свойствами;

- вольтаыперометрический способ контроля изменения каталитической активности иммобилизованной холинэстеразы;

- обоснование подходов к разработке новых вариантов иину-ноанализа с амперометрическим детектированием; вольтамперомет-рический способ определения констант связывания иммунных комплексов антиген - антитело;

- комплекс унифицированных вольтамперометрическнх методик определения пестицидов, ускорителей вулканизации, лекарственных препаратов, тяжелых металлов и систем для диагностики некоторых заболеваний живых организмов и растений;

- рекомендации для практического использования сенсоров при анализе состояния и динамики изменения объектов окружающей среды, биологических жидкостей, медицинских препаратов и материалов химической промышленности.

Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2,20.4.7) по теме № 01.86.0106158, согласно приказам Государственного комитета СССР по народному образованию К? 59 от 31.01.89 и Миннауки РФ » 133-ф от 04.02.92 г. и К» 13-ф от 08.02.93 г. по приоритетному направлению развития химической науки и технологии 29 "Анализ".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на УШ (Днепропетровск, 1984 г.) и IX (Усть-Каменогорск, 1987 г.) Всесоюзных совещаниях по полярографии, Республиканской конференции по охране окружающей среды (Казань, 1984 р.), П (Томск, 1985 г.) и И (Томск, 1989 г.) Всесоюзных конференциях по электрохимическим методам анализа, XI Всесоюзном зовещании по электрохимии органических соединений (Льнов,1986 е.), Всесоюзной конференции по методам анализа объектов окру-(ающей среды (Москва, 1985 г.), Всесоюзном симпозиуме "Охрана жружающей среды в химической, нефтехимической промыиленностях « промышленности по производству минеральных удобрений"(Самар-

канд, 1983 г.), У1 Всесоюзной конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1989 г.), IX Конференции "Аналитика - 89" (Алма-Ата, 3989 г.), И Всесоюзной конференции "Проблемы, разработки средств контроля окружающей среды" (Казань, 1989 г.), конференции "Химические сенсоры - 89й (Ленинград, 1989 г.)» Е Всесоюзной конференции по методам концентрирования в аналитической химии (Черноголовка, 1990 г.)» конференции "Анализ-ЭО" (Ижевск, 1990 г.), У1 конференции Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Калининградской области (Рига, 1990 г.), Всесоюзной конференции по истории и методологии аналитической химии (Москва, 1990 г.), Всесоюзной конференции "Экология химических производств" (Северодонецк, 1990 г.), 1У Всесоюзной школе-семинаре по электрохимическим методам анализа (Краснодар, 1990 г.), семинаре секции "Методы контроля химического состава материалов" Центрального Российского Дома знаний (Москва, 1990 г., 1992 г.), выездной сессии Комиссии по электрохимическим методам анализа Научного совета по аналитической химии АН СССР (Казань, 1990 г.), Международном конгрессе по полярографии памяти Я.Гейровского (Прага, 1990 г.), Международном симпозиуме по электроанализу объектов биомедицины, окружающей среды и промышленности (Великобритания, Лохборо,

1990 г., 1993 г.), У1 Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991 г.), Всесоюзной научно-практической конференции "Современные методы контроля окружающей среды и пищевых продуктов" (Краснодар, 1991 г.), IX Всесоюзной конференции по экстракции (Адлер, 1991 г.), конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды" (Сочи,

1991 г.), Международной конференции по экстракции органических соединений (Воронеж, .1992 г.)» Европейской конференции по электроанализу (Нидерланды, Г992 г.)» П семинаре "Проблемы экологии в преподавании химических дисциплин" (Ростов-на-Дону, 1992 г.)» Всесоюзной конференции "Химические и биологические методы в охране окружающей среды" (Усть-Каменогорск, 1990 г.)« Московском семинаре ло аналитической химии при ГЕОХИ РАН (1991 г»), I Всероссийской школе по биохимическим и биологическим методам анализа (Москва, 1992 г.)» М Менделеевском съезде (Минск, 3993 г.)» ХУ Черняевском совещании по химии,

анализу и технологии платиновых металлов (Москва, 1993 г.), Ш

10

конференции "Проблемы преподавания аналитической химии" (Ека-'еринбург, 1993 г.), Международной конференции "Евроанализ УШ" Эдинбург, 1993 г.), Московском семинаре по аналитической химии, освященном 70-легию развития метода полярографии (Москва,1992 '.), 1У конференции "Электрохимические методы анализа" (Иоск-а, 1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 80 работ, из их 5 обзоров.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 13 страницах маиинописного текста и содержит 40 рисунков, 63 аблицы, 330 литературных ссылок. Диссертация состоит из вве-ения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и риложений, в" которых представлены документы об использовании азработок и вспомогательный расчетный материал.

Кетоды и объекты исследования. С целью решения поставлен-ых задач использовали различные электрохимические, физико-хи-ические и физические методы исследования: постояннотоковая ольтамперометрия, вольтамперометряя с быстрой разверткой по-энциала, циклическая волыампброиетрня, переменнотоковая ольтамперомехрия, потенциометрия, микрокулонометрия, спектро-этеметрия, эмиссионная спектрометрия, атомно-абсорбционная гектрометрия, хроматография. В работе изучены 0-эткл~0-(4-атрофенил)этилфосфонат (армии), 0,0-диэтилфенилфосфонат ЦЗФФ), 0,0-диметил-(2,2,2-трихлор-1-океиэтил)фосфонат (хлорозе), 0,0-диметил- 5-(1,2-дикарбэтоксиэтил)дитиофосфа1 (карбо-эс), 5 -(6-хлорбензоксазолинон-2-ил-3-метил)-0,0-диа1илдитно-эсфат (фозалон), 0,0-диметил- Э -( N -фталимидометил)дитиофос-1Т (фталофос), 0,0-диметил-0-(4-нитрофенид)-тиофосфа1 (мета-эс), 0,0-диметил-0-(2,4,5-трихлорфенил)тиофосфат (трихлорнз-1фос), 0,0-диэтил-0-(4-нитрофеннл)тиофосфат (паратнон), 0-бу-ллбутилтолилфосфинат (ББТФ), 0,О-диэтилтиофосфорил-О-окснм-ганобензальдегида (волатон), ы-(фосфононетнл)глнцян (глкфо-и), бис(оксиметил)фосфиновая кислота (БОФК), 2-диме1иламино-,3-бис(фенилсульфоннлтпо)пропан (банкол), гидрохлормд )тиламиноэтиловый эфнр бензгидрола (димедрол), 2,4-дихлорфвн-ссиуксусная кислота (2,4-Д), 1,3-(4-оксямвномв1нлп1ршдиннй-эомид)пропан (дилироксин), прозврин, 1,2,3,4,7,7-гексахлор-«цккло(2,2,I)-гептан-2-5,б-басметыенсужьфат (тиоданЬ М, N -

II

этиленбисдитиокарйаминаты аммония (амобен), марганца (манеб), цинка (цинеб), метилдитиокарбаминат натрия (кзрбатион), диме-тилдитиокарбаминат цинка (цирам), теграметилтиурамдисульфид (тирам), 2~меркал'^обензтиазол (каптакс), 2-меркаптобензтиазо-лат цинка (тиазол БМ-Ц). К объектам исследования относятся также ионы металлов Ла(1), Mj(B), А1(Ш), К (I), Са(Л), Ti (1У Сг (Ш), lin. (П), Рв(П,Ш>, Со(П,И), Си (П), Zn (Я), ?,г> (1У), N8 (У), Cet (П), Hf (1У), Та(У), Нд (П), Т1(1), Рв(П), Вi (Ш).

РЕАКЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА В ВОЛЬТАМПЕРОЫЕТРЙИ

НА ПРИМЕРЕ СИСТЕМ С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ Х0ШНЭСТЕРА30Й

Возможности вольтамперометрни в контроле реакций с иммобилизованными катализаторами рассмотрены на примере разработки химических сенсоров, в частности, ампероыетрических биосенсоров (БС), которые представляют собой комбинацию традиционно используемых в вольтамперометрии стационарных электродов с ферментами в иммобилизованной состоянии. Наиболее перспективны для определения потенциальных загрязнителей окрукающей среды различные виды ХЭ. В качестве транедью-серов использовали стационарный ртутно-пленочный электрод с серебряной подложкой (СРПБ), платиновый электрод, электроды из различных графитовых материалов, УПЭ. В основу действия разработанных БС полонены реакции гидролиза тиохединовых эфиров уксусной, масляной и пролноновой кислот в присутствии иммобилизованной ХЭ и электрохимические реакции продуктов ферментативного гидролиза этих субстратов. Для иммобилизации ХЭ применяли физические и химические методы (адсорбцию на носителях, включение в полиакриламидннй гель, пришивание к мембранам). Нанлуч-иими эксплуатационными характеристиками обладает ХЭ, иммобилизованная комбинированным способом: путем включения в пленки из нитрата целлюлозы с параллельной (способ!) или последующей (способ 2) обработкой бифункциональным реагентом - глутаровыи альдегидом. Образцы, иммобилизованной ХЭ (ИХЭ) обладают высокой каталитической активностью (0,35 + 0,05 и 1,19 + 0,05 Е/см2) и не утрачивают своих свойств от 2 недель до 5 месяцев.

Предлагаемые модели БС, состоящие из стационарного электрода, иммобилизованного фермента и, в ряде случаев, полупроницаемой мембраны, просты по устройству и условиям эксплуатации

12

позволяй легко заменять биочувствительную часть сенсора на новую. В качестве аналитического сигнала использовали или величину катодного пика при потенциале -0,55 В (СРПЗ), отвечающего обратимому восстановлению меркаптида ртути, образующегося в результате взаимодействия тиола - продукта холинзстеразного гидролиза бутирилтиохолин иодида (БГХИ)-с материалом электрода - ртутью, или величину тока пика при потенциалах 0,6-0,9 В (платиновый, графитовый, угольно-пастовьгй электроды), отвечающего процессам электроокисления продуктов гидролиза серосодержащих субстратов фермента. Условия оптимальной работы данных БС: концентрация серосодержащих субстратов 1,5-2,0.10"^ моль/л, боратный буферный раствор с рН 9,0-9,1, креня ферментативной реакции не более 15 мин. Поскольку значения кажущейся константы Михаэлиса (К т (каа)) (4,2+0,6) Л0~б и (5,6+0,6) ЛО-4 Н,в зависимости от способа иммобилизации, намного меньше используемой концентрации субстратов ХЭ, то диффузия

этих молекул через поры носителя к молекулам фермента, не влияет на скорость реакции ферментативного гидролиза. Значения удельной каталитической активности ИХЭ, полученные но данным вольтамперометричесних намерений, хороио согласуются о результатами потенциометрического анализа (1,19+0,05 и 1,05+0,08 Е/см^ соответственно).

Действие эффекторов на активность иммобилизованного катализатора. Контролируя ход ферментативной реакции,мокно оценить наличие в растворе ингибиторов или активаторов ХЭ. Инги-бирующее действие, выражающееся в уменьвении величины аналитического сигнала при потенциале -0,55 В, оказывают не только фосфор- и азотсодержащие соединения, такие как хлорофос, гли-фосат, армии, ДЭФФ, ББТФ, прозерин, которые следует отнести к ингибиторам фермента, но и фталофос, фозалон, паратион, вола-тон (соединения с Р=Б -связью). Такое же действие оказывают и некоторые хлор- (тиодан, 2,4-Д) и серосодержащие (банкол) соединения.. Все это указывает на больную роль, чем отмечалось ранее, гидрофобных взаимодействий в механизме действия хслин-эстераэ. Определение этих соединений с помощью разработанных БС возможно в иироком концентрационном диапазоне ( п.10"^ -л. Ю-1' моль/л) с низкими величинами , которые практически во всех случаях ниже ПДК на несколько порядков (табл.1).

13

Таблица I Возможности определения пестицидов с помощью биосенсора на основе ИХЭ; рН = 9,05; сБВСЙ = 2Л0~3 моль/л

Тиодан

Банкол

Фозалон

Фталофос

Глифосат

Волатон

Паратион

Хлорофос 2,4-Д

1.Ю-10-

1,6Л0"б(5Л0~12 3,4.Ю"8(2Л0"13 1,2Л0"7(4Л0"ГЗ 2,ЗЛ0"7(9Л0"13

г 10-^(9,5 ЛО'1^) 0,01

2,2Л0"7(1Л0"12) 0,2

1.10"

Для выяснения закономерностей действия органических инги биторов на ИХЭ по данным вольтамперометрических измерений определены некоторые характеристические параметры ферментативно реакции гидролиза БТХИ: Кт(каг)> максимальная скорость, каталитическая ковстанга. Установлено, что кинетика гидролиза БТХИ в присутствии ИХЭ и изучаемых ингибиторов подчиняется уравнению Ыихаэдиса-Ыенген. Анализ данного уравнения в виде двойных обратных координат Лайнуивера-Берга в присутствии и в отсутствие ингибиторов позволил оценить тип ингибирования. Се рия прямых, пересекающихся в одной точке на оси ординат, указывает на конкурентный характер ингибирования хлорофоса, гли-фосата и банкола. Пересечение прямых в точке во втором квадра те (в случае фталофоса и фозалона) характерно для смешанного типа ингибирования, а серия пряных, пересекающихся в первом квадранте, указывает на псевдоингибирование (тиодан, 2,4-Д). Знание типа ингибирования в ряде случаев позволяет подобрать оптимальные условия определения самого ингибитора и снизить с до ЗЛО-1^ (банкол) и 6.Ю"15 (фталофос) моль/л. Величины

14

констант ингибирования и указывают на то, что антихолин-эстеразная активность исследуемых соединений уменьшается в ряду глифосат > ДЭФФ > фталофос > банкол > тиодан, что согласуется со строением этих ингибиторов.

Ионы тяжелых металлов, являясь неспецифическими ингибиторами ХЭ, вызывают уменьшение каталитической активности ИХЭ.что выражается в уменьшении ведлчины аналитического сигнала в их присутствии по сравнению с холостым опытом. Максимальный инги-бирующий эффект вызывают ионы С«- (П) и 2п (1У) (табл.2). Линейная зависимость между величиной тока пика и - сохраняется в нироком диапазоне концентраций (от 1.10~3 до л.Ю-5- п.Ю'7 и от 1.10"5 до п.Ю-8 - а. 10 моль/л в зависимости от исходной каталитической активности биочувствительной части сенсора). Определение каждого из них возможно только в отсутствие другого. Б присутствии нескольких ионов металлов БС будет работать как датчик общей токсичности.

Таблица 2 Минимальные концентрации ионов тяжелых металлов, инги-бирующие иммобилизованную холинэстеразу

Ион

металла

^тп'

моль/л

Ион

металла

моль/л

Ион

металла

' пил »

моль/л

N¿(11) гп(П) Т1( Г )

«3 (П)

2.10 6.10' 5.10

Г*

-5

г5

(1.КГ11) 5.10*5 (1.ИГ12)

С<1 (П)

Ре (Ш) Рв (П)

С г (Ш)

Т.10"6 (5.10-9)

1.10' 5.10'

Г6 г?

5.Ю-8

Та(У) нf (1У)

N6 (У) Тъ (1У) 2/> (1У) Си. (П)

5.10' 5.10' 2.10' 8.10' 5.10' 4.10'

Г*

Г9

Г10 Г10 ,-Ю

В ю же время щелочные (Кэ, К), целочно-земельные (Са) и некоторые другие металлы (Нп ,А1) оказывают в определенном интервале концентраций на ИХЭ активирующее действие (увеличение величины тока регистрируемого сигнала). Наибольший активирующий эффект вызывают ионы Са(П) в интервале концентраций 1.10 -ЗЛО-3 моль/л. Их действие связывает анионную группу вблизи активного центра, препятствующую взаимодействию фермента с субстратом. Наблюдается определенная зависимость: чем больше радиус иона металла-активатора,тем меньшая его концентрация необходима

15

для блокирования анионной группы. Активирующее действие оказывает и ряд ионов тяжелых металлов в области концентраций меньше I.IO"5 (TI, Нд ) и I.I0"7 (Рв, Cet ) моль/л. Минимально определяемые концентрации приведены в табл.2 (в скобках). Это создает условия для их определения на уровне ПДК и ниже, не прибегая к дополнительному концентрированию. Биосенсоры на основе реакций электроокисления уступают по своим аналитическим возможностям вышеописанным устройствам (с .= I.IO-7 - 5.I0"8

, г 4 ПИЛ

моль/л для ингибиторов ХЭ), однако они позволяют упростить процедуру анализа и сделать его более экспрессным (не требуется деаэрирования растворов), а также удобны для работы в проточном режиме. Разработанная простая и удобная в эксплуатации конструкция ферментного реактора позволяет работать с такого типа биосенсорами в непрерывном режиме в течение не менее 16 часов, а в периодическом - 3 суток.

АИПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ В КОНТРОЛЕ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Еще одно современное направление использования амперомет-рических биосенсоров - юшуноферментный анализ.

Холинэстеразный биосенсор в иммуноаналиэе с помощью ингибиторов фермента. В предлагаемом гомогенном варианте ИФА с помощью модуляторов (ингибиторов) фермента использовали разработанные амперометрические холинэстеразные БС. Необходимой стадией такого иммуноанализа является получение конъюгата -соединения антигена (Аг) или антител (Ат) с модулятором, способным изменять активность индикаторного фермента. В качестве компонентов конъюгатов использовали ингибиторы ХЭ хлорофос и БОФК, а в качестве аналога Аг для определения аутоаитител - денатурированную ДНК (д-ДНК). Ни подобные коньвгагы, ни ИХЭ,входящая в состав БС в качестве индикаторного фермента, для этих целей ранее не применялись. Оптимальный состав конъюгатов (масс. Я: I. 0,0048 д-ДНК; 0,60 БОФК; 2,91 глутаровый альдегид; 47,81 вода; остальное карбонатный буферный раствор с рН 9,6. 2. 0,0094 д-ДНК; 0,012 хлорофос; 4,30 глутаровый альдегид; остальное карбонатный буферный раствор с рН 9,6.

Способ основан на эффекте пространственных затруднений: наличие в растворе специфических Ат приводит к связыванию их

16

с Аг конъюгата. При этом Ат стерически блокируют ингибитор, и он не может взаимодействовать с ЙХЭ. Величина тока лика при потенциале -0,55 В пропорциональна содержанию Ат в растворе. Минимально определяемая концентрация Аг 1.10""® моль/л. Данный вариант иммуноанализа позволяет проводить диагностику ряда аутоиммунных заболеваний. Реактивация биочувствительной части сенсора с помощью 2.10"^ М гидроксиламина приводит к 100 %-но-му восстановлению каталитической активности иммобилизованного фермента, что позволяет использовать БС многократно.

Модифицированные биосенсоры в иммуноферментном анализе.

Другой вариант - использование в ЙФА модифицированных амперометрических БС путем включения в состав их биочувствительной части не только фермента, но и компонента биоспецифического взаимодействия. В этой роли выступают Ат, Аг, д-ДНК. Наилучшими свойствами (устойчивостью при хранении, стабильностью в работе, прочностью связывания) обладает биочувствительная часть сенсора следующего состава (масс.%): I. ХЭ -10,6-12,6; д-ДНК - 0,94-1,86; глутаровый альдегид (ГА) - 17,518,0; остальное нитроцеллюлоза (НЦ). 2. ХЭ - 10,6-12,6; Ат -0,45-0,55; ГА - 17,5-18,0; остальное НЦ. 5. ХЭ - 26,5; Ат -5,9.10"^; НЦ - остальное. Готовую пленку обрабатывают 5%-ным раствором ГА. Введение в состав мембран помимо ХЭ Ат (Аг) незначительно сказывается на их каталитической активности (удельная активность биочувствительной части до модификации составляет 1,15+0,06, а после модификации - 1,03+0,06 мкмоль/л.мин. см^). Разработанные БС представляют собой новый тип электрохимических датчиков - иммуноферментные электроды, которые являются и иммунологической твердой фазой, содержащей фермент-маркер (ХЭ), и обеспечивают возможность электрохимической регистрации продуктов ферментативной реакции.

При наличии в растворе специфических Ат (Аг) происходит связывание Ат (Аг) с иммобилизованным вместе с ХЭ Аг (Ат) с образованием иммунного комплекса Аг-Ат, что создает стеричес-кие препятствия для подхода молекул субстрата к активным центрам ИХЭ. Это приводит к уменьшению аналитического сиглала.Время единичного анализа не превышает 15 мин. Нижняя граница определяемых содержаний моль/л.

Новые варианты гомогенного и гетерогенного иммуноайализов

17

отличаются простотой, отсутствием ыногостаднйности, экспрес-сностыэ, высокой чувствительностью и селективностью. Преимущества этих способов осуществления ИФА показаны на примере диагностики ряда заболеваний (крапчатость гвоздики, алеутская болезнь норок и другие аутоиммунные заболевания). Результаты диагностики заболеваний согласуются с результатами классического ИФА со слекгрофотометрической мидикацией.

Одним из факторов, определяющим чувствительность ИФА, является значение констант связывания иммунного комплекса Аг-Ат. На основе данных определения вируса нрапчатости гвоздики были оценены константы связывания иммунокомплекса [Хд&- вирус крапчатости гвоздики]. Микроколичество Аг, оставшееся в растворе после образования соответствующего комплекса, необходимое для расчета констант связывания, было определено с помощью реакции Брдички, т.е. реакции каталитического выделения водорода в присутствии ионов Со(И,И) к белка на СРЛЭ. Величины констант (Ка), найденные из графика Скэтчарда, составляют: = (3,3+ 0,5)Л010, Ка = (6,6+1,5).10^ И-1. Нелинейный характер взаимодействия Аг-А? в координатах Скэхчарда свидетельствует о возможности существования двух популяций Ат с более высокой и низкой специфичностью к определяемому вирусу.

ХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГОЛЬНО-НАСТОВЫХ ЭЛЕКТРОДОВ,

МОДИФИЦИРОВАННЫХ КАТАЛИЗАТОРАМИ

Одна из тенденций развития биохимических сенсоров - это упрощение конструкций и совмещение свойств и функций биохимических реакций и физического первичного преобразователя, в измеряемый сигнал. Этого позволяют достигнуть сенсоры на основе УПЭ, которые содержат помимо традиционных составных частей (графитового токопроводящего материала и связующего вещества) тот или иной модификатор (в данном случае биологический препарат ).В качестве эдектродноактивного материала для БС использовали образцы предварительно обработанного ГА спектрально-чистого графита и сажи. Экспериментально определяемой величиной служила высота пика при потенциале 0,65-0,6? В, отвечающего процессу электроокисления тиола - одного из продуктов ферментативного гидролиза специфичного субстрата ХЭ - бутирилтиохо-лин нитрата. Ток пика подчиняется, в основном, тем же законо-

18

мерностям, что и в случае БС на основе СРПЭ. С помощью угольно-пастовых БС можно определять обратимые и необратимые ингибиторы ХЭ. Проведено определение хлорофоса (с^ = 1.10~7моль/л), армина (с^д = 7.Ю-8 моль/л), прозерина (с^ = 3.10"7моль/л). Конструкция УПЭ дает возможность от измерения к измерению воспроизводить рабочую поверхность датчика, выдавливая небольное количество пасты и срезая ее излишек* Устойчивость угольной пас-»-гы при хранении (при пониженной температуре), простота изготовления электрода, несложные операции по обновлению рабочей поверхности позволяют обойтись, особенно при серийных определениях, без реактивации каталитической активности иммобилизованного фермента.

В связи с необходимостью массового контроля содержания гоксикантов в объектах окружающей среды перспективным представ— пяется также применение модифицированных хелатамн и органичес-.. кими реагентами УПЭ. С их помощью можно добиться селективности эпределений за счет различной способности субстратов вступать з реакции лигандного обмена с хелатом-модификатором. Для определения органических серосодержащих примесей (ускорителей вул-санизации, флотореагентов, фотохимикатов и пестицидов) разработаны УПЭ, модифицированные солями металлов-комплексообразо-зателей и их хелатами. Определение пестицида карбагиона и вул-ганизита каптакса методом вольтамлеромегрии проведено с помощью ШЭ, который модифицировали диметилдитиофосфатои Со(П). В прн-;утствии токсикантов после 10-20-минутного выдерживания такого электрода в анализируемом растворе на фоне ацетатного буферного эаствора на вольтамперограмме регистрируется каталитическая 50лна выделения водорода при потенциале -1,0 В. Это позволяет ;читать, что карбатион и каптакс концентрируются на электроде ! виде каталитически активных соединений с Со(П), образующихся з результате лигандного обмена. Это согласуется с различием в сонстантах устойчивости хелатов Со(П) с диметилдитиофосфатом и (етилдитиокарбаматом. В присутствии пестицидов амобена, набама, >птама, тиллама и цинеба каталитических волн не наблюдается,что зоздает благоприятные условия для избирательного определения сарбатиона с нижней границей определяемых содержаний 0,007. мг/л. 1оскольку этиленбисдитиокарбаматы не вступают в реакции лиганд-юго обмена с дитиофосфатами для их определения УПЭ модмфицн-

19

ровали перхлоратами металлов. Такие электроды менее эффективны, чем датчики на основе хелатов. 2-Меркаптобензтиазолат цинка так же,как и этиленбисдитиокарбаминаты, не вступает в реакцию лигандного обмена с диметилдитиофосфатом Со(П). Поэтому УПЭ в этом случае модифицировали роданидом серебра, в виде комплекса с которым и концентрируется на электроде 2-меркапто-бензтиазолат цинка (тиазол БМ-Ц). Оптимальные условия регистрации аналитического сигнала реализуются в анодном режиме. По величине тока электроокисления координированного 2-меркапто-бензтиазола (Еп = 0,65 В) определено до 0,08 мг/л тиазола БМ-Ц. Для снижения величины сн до 0,007 мг/л тиазол БМ-Ц экстрагировали из водных растворов в дихлорэтан и определяли содержание в экстракте.на фоне 0,05 М перхлората тетрабутиламмония.

ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ КАТАЛИЗАТОРОМ ДЛЯ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, БИОМАТЕРИАЛОВ, ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ФАРМПРЕПАРАТОВ И МАТЕРИАЛОВ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Выявленные закономерности электродных процессов в присутствии систем с иммобилизованным катализатором положены в основу разработанных селективных экспрессных методик, характеризующихся низкой границей определяемых содержаний. Их применение позволило решить ряд сложных задач, имеющих значение для контроля эколого-аналитических объектов. Снижение сн, селективность определений достигнуты за счет применения наиболее чувствительной к ингибиторам фермент-субстратной системы (БТХИ - бутирил-холинэстераза), высокой каталитической активности иммобилизованного фермента, выбора соответствующих индикаторных электродов, использования серосодержащих субстратов (адсорбирующихся на электроде), комбинирования состава электродно-активного материала и способов модификации химических сенсоров. Примеры, иллюстрирующие возможности вольтамперометрии в контроле реакций с иммобилизованными катализаторами, приведены в табл.3. Правильность определений оценивали сопоставлением со стандартными растворами и образцами, способом введено-найдено и сравнением с независимыми методами анализа в пределах их аналитических возможностей.

20

Таблица 3 Результаты определения физиологически активных соединений в объектах эколого-аналитического контроля ( л= 5, Р = 0,95)

Объект анализа Определяемый компонент V моль/л Найдено с + 0

I 2 3 4 5

Лекарственные Димедрол I Л 0~7 5Л0"8 (0,019+0,003) г 0,16

формы:таблетки, Супрастин (0,053+0,009) г 0,14

растворы для 5Л0'13 (0,022+0,005) г (5,2+0,4). Ю"9 моль/л 0,18

инъекций Ариин 0,07

Водные вытяжки Си (П): 10 5.10"10 (8 + 2)Л0"10 0,20

материалов, ис- 30 (1,6+0,2) ЛО"9 (5,0+0,4) ЛО"9 0,10

пользуемых для 90 1.10"9 0,06

имплантации: ВДУ): 10 (8+1) Л О-9 (9+1) ЛО" 9 0,10

металлы, 90 5 Л О"9 0,09

сплавы Та(У): 60 (6 + 1)Л0~9 0,13

90 5 Л О"8 (8 + 2)Л0"9 0,20

Сг (Ш): 10 (3,2+0,3) ЛО"8 0,08

60 (5,0+0,5) ЛО-8 0,08

90 суток (5,0+0,4).Ю-7 "моль/л 0,06

Сточные воды оптического производства Рв(П) Н3(П) Т1(1) СсЕ (П) 2. Ю-9 2 Л О-12 ЗЛО"11 5.10-9

Продукты питания: 2,4-Д 1Л0-12

молоко

Природные Банкол 5 Л О-12

воды Карбатион 5. Ю-8

0,90+0,04).Ю-8 1,0 + 0,1)Л0-П

1,30+0, Об), иг7

1,20+0, Об). Ю'8 моль/л

7 + 2).Ю-11 1,8+0,5).Ю"10 5,7+0,9).10-1°

з,8+о,8)ло-11

""моль/л

0,8+0,1)ЛО"8 Пиоль/л

0,012+0,002) мг/л

0,03 0,09 0,03 0,03

0,23 0,23 0,13 0,17

0,12 0,13

I

5

Природные воды

Сточные воды производства СК

Сыворотка

крови

животных

Экстракты растительного материала (гвоздики)

Аналоги

компонентов

биосистем

П родукция сельского хозяйства: злакй,корнеплоды

Грунт промышленной зоны

Амобен Ыанеб Каптакс Тиазол БМ-Ц

Каптакс Тиазол БМ-Ц

Ат к вирусу алеутской болезни норок

Антиген -вирус крал-чатости гвоздики

Гиохолино-вые эфиры: БШ,БТХН

Полимарцин:

пшеница

рохь

картофель Рв(П)

ЗЛО'

г5

7.5Л0710 2.10' " ЗЛО'

1-8

г8

5 Л О' 1Л0'

"8

,-7

1Л0-8 (5,9+0,1).10

(ИМ) 5 Л О' (ИФЗ)¡

-Ю

Г .10

4 Л О"8

(БГХИ)

1.10"6 (БТХН)

5.10'

(0,8 + 0,2) (0,006+0,002) (0,005+0,001) (0,008+0,002) мг/л

(0,030+0,004) (0,08 ± 0,02) мг/л

Г* ,-8

,-Ю

г9

5,5.10"9

(4,2+0,2) .10" (2,15+0,08).10" (6,5+0,2) ЛО"9 моль/л

(0,60+0,07)

(1,2 I 0,2)

мг/л

(3,1 + 0,6)Л0"

(4,5 + 0,8).10 моль/л

(0,008+0,002) (0,004+0,001) (0,05 + 0,01) мкг/кг

(0,47+0,04) (0,35+0,04) (0,56+0,05) (0,52+0,04) мкг/кг

0,21 0,2? 0,13 0,20

0,11 0,20

0,02 0,03 0,04 0,03

0,07 0,11

гб

0,16 0,14

0,20 0,20 0,16

0,11 0,14 0,12 0,09

Обозначения: ИИА - ингибиторный иммуноанализ, ментный электрод ^

ИФЭ - иммунофер-

3

4

г

4

5

Питьевая вода

Воздух

рабочей

зоны

Рв(П)

5.5.10"9 (8,0+0,6).10" (4,3+0,8).10 (5,4+0,6) .10'

1-Фенил-5- 0,05

■г

меркапготет- мг/ы разол

1-4

(8,5+0,9).10 (6,2+0,9).Ю-4 иг/л

(0,51+0,03) (0,56+0,06) (0,12+0,02)

0,06 0,15 0,09 0,08 0,12

0,05 0,08 0,13

Выявленные в работе особенности электрохимических процессов с участием иммобилизованных катализаторов могут быть использованы для исследования и разработки способов определения других экотоксикан'х'ов и биологически активных веществ. Прикладное значение данной работы не исчергывается приведенными примерами.

Заключение

Проведенное исследование позволило выявить большие потенциальные возможности вольтамперометрического контроля (биохимических и электрохимических) процессов с участием имнобилизо-ванных катализаторов. Прежде всего - это возможность разработки амперометрических биохимических сенсоров.От того, как подобрано сочетание трансдьюсера-электрода, способа иммобилизации фермента и электрохимической и ферментативной реакций зависят и аналитические возможности разработанного устройства. Использование реакций электровосстановления компонентов ферментативной реакции значительно расширяет возможности вольт-амперометрии в плане создания биохимических сенсоров. Помимо определения отдельных соединений разработанные биосенсоры в режиме "красный-зеленый" могут дать интегральную экспрессную оценку качества анализируемого объекта. Получающийся сигнал является по своей информативности более адекватным воздействию на изучаемую систему, поскольку биосенсор моделирует одну

25

из функций живого организма, что позволяет сделать более ценные выводы, например, об экологической обстановке в данном регионе.

Разработанные БС обладают рядом свойств,отличающих их от других холинэстеразных, в частности, потенциометрических БС. Это высокая чувствительность определений, широкий диапазон линейности аналитического сигнала, большой интервал определяемых концентраций и быстрый отклик на присутствие ингибиторов или активаторов в растворе, способность работать в более широком и оптимальном интервале рН.

С помощью амперометрических биосенсоров можно определять не только соединения, являющиеся непосредственными эффекторами фермента, но и не относящиеся к его модуляторам (антитела, антигены, гапгены и т.д.). Разработанные биосенсоры позволяют расширить границы применимости иммунологических определений, если сделать определяемое вещество иммуногенным (например, высокоселективное определение пестицидов). Полученные результаты свидетельствуют о том, что области применешяшперометрн-ческих биосенсоров я анализе объектов эколого-аналитнческого контроля практически не ограничены.

Идеи иммобилизации и ее методология применимы не только к ферментам, но и другим соединениям. К системам с иммобилизованным катализатором относятся модифицированные химические сенсоры и ряд систем, обеспечивающих протекание на поверхности электрода последующих каталитических процессов. Введение в состав электродно-активного материала модификаторов позволяет получить сенсоры с заданными свойствами и повысить селективность определений за счет избирательной способности катализировать выделение водорода в определенных условиях.

Возможности и направления использования вольтамперомет-рии дают основу для разработки новых высокочувствительных, селективных, Экспрессных и универсальных сенсоров для определения физиологически активных соединений как в объектах окружающей среды, так и при медико-биологических исследованиях.

выводы

1. Предложены и обоснованы подходы к разработке и созданию ампероиетрнческих сенсоров для решения аналитических задач на основе иммобилизованных катализаторов, включающие анализ, исследование и обоснование используемых каталитических и электродных реакций, протекающих на стационарных электродах, учет факторов, влияющих на величину аналитического сигнала, природы модификаторов, используемых для придания сенсорам заданных свойств.

2. Предложены новые способы иммобилизации холинэстеразц, обеспечивающие высокую каталитическую активность ферментсодер-защих мембран (0,60-1,15 мкмоль/мин.си2) и устойчивость ео времени (от двух недель до пяти месяцев). Разработан способ совместной иммобилизации компонентов биоспецяфического взаимодействия (антител, антигенов, денатурированной ДНК) н ХЭ, позволяющий получить мембраны, сохраняющие способность к комплементарным и биохимическим реакциям.

3. Разработаны варианты новых химических агшерометри-ческих сенсоров:

- на основе сочетания оригинального трансдьюсера - стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и иммобилизованной различными способами холинэстеразы (биохимические сенсоры) или совместно иммобилизованных биокатализатора и компонентов биоспецифнческого взаимодействия (имыуноферментные сенсоры);

- на основе угольно-пастовых электродов с сорбциоино иммобилизованной холинэстеразой;

- на основе угольно-пастовых электродов, модифицированных хе-латами, солями металлов или органическими реагентани (химические сенсоры). Созданы лабораторные модели химических и биохимических сенсоров.

4. Предложен способ оценки каталитической активности иммобилизованной холинэстеразы, основанный на вольтамперометри-ческом измерении количества образующегося серосодержащего продукта реакции ферментативного гидролиза субстрата в единицу времени.

5. Показана возможность использования вольтампероиетрии

25

для определения эффективных кинетических констант реакции хо-линэстеразного гидролиза БТХИ в присутствии и в огсутствие органических ингибиторов. Установлено, что глифосат и банкол относятся к ингибитора« конкурентного типа, для фталофоса характерен смешанный тип ингибирования, а тиодан и 2,4-Д действуют по типу псевдоингибирования. Ингибирущая способность уменьшается в ряду глифосат > ДЭФФ > фталофос > банкол > тиодан. Определены константы связывания иммунного гетерогенного комплекса антиген - антитело (на примере взаимодействия иммуноглобулин & - вирус крапчатосги гвоздики: Kaj = (3,3 + 0,5)х Ю10 Ц"1 и Ка = (6,6 ± I,5).I09 И"1);способ основан на измерении изменения эффекта каталитического выделения водорода в результате комплементарных взаимодействий.

6. Рассмотрены методологические аспекты имнуноферментного анализа биологически активных соединений с аынерометрическым детектированием. Предложены и разработаны методические принципы и подхода к оценке результатов иммунологических реакций:

- новый вариант гомогенного ингибиторного иммуноанализа, основан на использовании биохимического сенсора с иммобилизованной ходинэстеразой и модуляторов фермента, в качестве которых использованы ингибиторы - хлорофос и бис(оксиыетил)фосфияовая кислота. Подобран оптимальный состав коньюгатов ингибитор -денатурированная ДНК;

- новый вариант гетерогенного имиуноферментного анализа без предварительного разделения компонентов основан на использовании нового типа сенсоров - иммуноферментных электродов,биочувствительна я часть которых включает в иммобилизованном состоянии холинэстеразу и компонент иммунологической реакции (антиген, антитело, денатурированную ДНК).

7. На примере крапчатое?» гвоздики и алеутской болезни норок продемонстрирована возможность использования разработанных вариантов иммунологических определений для диагностики заболеваний. Показана возможность применения аналогичных приемов для диагностики ряда аутоиммунных заболеваний. Предлагаемые варианты проведения иммуноанахизов позволяют проводить диагностику заболеваний в течение 15-30 минут с нижней границей определяемых содержаний антигенов и антител I.I0"9 -I.I0"10 моль/л.

8. Установлено, чго ингибирукщим действием на иммобилизованную холинэстеразу обладают фосфор- (хлорофос, глифосат, волатон, фталофос, фозалон, паратион), хлор- (2,4-Д, тиодан) и некоторые серосодержащие (банкол) пестицида, а также тяжелые металлы (Т1, Ял , Ж , Р8, Н^ , Сс£ , Си , Въ , Ре, Сг> , 2г , Тг , , N6 , Та). Максимальный ингибируюций эффект наблюдается для Си (П) н2г(1У) (сн = Ч-.10"10 н 5.Ю--0 моль/л соответственно). Разработан комплекс экспрессных, высокочувствительных и селективных методик определения этих токсикантов с

—ТТ —Т"?

нижней границей определяемых содержаний />Л0 - л.10 ^ моль/л (пестициды) и п Л О-6 - пЛО-*0 моль/л (тяжелые металлы) .

9. Увеличение каталитической активности иммобилизованной холкнэстеразы в присутствии ряда ионов металлов использовано для:

- создания биосенсоров с более чувствительной сенсорной частью; максимальный эффект наблюдается в присутствии ионов кальция (П) с концентрацией 1.1СГ-3 - З.ЗО"3 моль/л;

- снижения нижней границы определяемых содержаний ионов таллия (I) и ртути (П) (активирующее действие при концентрациях, меньших, чем 1.10-5 моль/л), свинца (П) и меди (П) (активирующее действие при содержании ниже 1.10"*^ моль/л) до уровня

п ЛО-9 - я.Ю- моль/л.

10. Найдены и обоснованы оптимальные условия использования биохимических сенсоров при анализе объектов эколого-аналитического контроля: подобраны составы растворов, обеспечивающие реактивацию биочувствительной части сенсоров, восстановление и обновление рабочей поверхности модифицированных угольно-пастовых электродов. Установлены фактсюы, позволяющие проводите определения ингибиторов холинзстеразы в области концентраций ниже ПДК.

11. Найдена взаимосвязь между величиной каталитического эффекта выделения водорода и устойчивость» образующихся на поверхности модифицированных угольно-пастовых электродов комплексных соединений. На основе обнаруженных каталитических эффектов предложены высокочувствительные и селективные методики анализа объектов окружающей среды и материалов химической промышленности. Каталитическая активность в реакции

27

электрохимического выделения водорода хелатов-модификаторов использована для разработки способов определения серосодержащих пестицидов (сн = 5.Ю-8 - 7,5.Ю-10 моль/л), компонентов вулканизующих систем (сн • = 2,5.Ю-9 ыоль/л) и тяжелых металлов (сн = 5.Ю-9 моль/л). Применительно к задачам анализа установлены оптимальные условия определения п. .Ю-8 - п.Ю-9 моль/л экотоксикантов в сложных смесях с протонодонорной составляющей.

12. Разработана простая и удобная в эксплуатации модель ферментного реактора для работы в проточных условиях в течение не менее 16 часов при скорости потока не более 2 л/мин, а при периодическом включении - в течение не менее 2 суток.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В обзорах:

1. Торопова В.Ф., Будников Г.К., Медянцева Э.П. Каталитические токи водорода в растворах комплексных соединений // Полярография. Проблемы и перспективы. - Рига: Зинатне, 1977. -С.216-228.

2. Toropova V.i.» Budnikov Н.С., Ul&khovich H.A., Nedyant-seva E.P. Catalytic evolution of hydrogen on a mercury electrode in cyclic voltammetry and its analytical application // J.Electroanal. Chem. - 19S3. - V.-m, И 1. - P. 1-10.

3. Будников Г.К., Ыедянцева Э.П., Бабкина С.С. Амперо-метрические датчики на основе иммобилизованных ферментов // Успехи химии. - 199I. - Т.60, № 4. - С.880-909.

4. Улахович H.A., Медянцева Э.П., Будников Г.К. Концентрирование в вольтамперометрическом анализе платиновых металлов // Журн.аналит.химии. - 1992. - Г.47, fe 9. - C.I546-I566.

5. Улахович H.A., Медянцева Э.П., Будников Г.К» Угольно-пастовый электрод как датчик в вольтамперометрическом анализе II Журн.аналит.химии. - 1993. - Т.48, № 6. - С.980-998.

статьях:

6. Торопова В.Ф., Будников Г.К., Медянцева Э.П., Фролова В.П. Изучение каталитических токов водорода в растворах 2-меркаптобензтиазола в присутствии ионов кобальта (П) // Журн. общ.химии. - 1977. - Т.47, tel. - СЛ54-156.

7. Будников Г.К., Медянцева З.П., Волков A.B., Аронзон

28

С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэсте-разы // Журн.аналит.химии. - 1983. - Т.38, » 7. - C.I283-I288.

8. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С., Волков A.B. Влияние ионов металлов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы // 1урн.аналит.химии. - 1989. -

Т.№ 12. - С.2253-2257.

9. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С. Электрохимическое определение кинетических параметров ферментативной реакции с участием иммобилизованной холинэстеразы // Электрохимия. - 1989. - Т.25, № 9. - C.I283-I286.

10. Медянцева Э.П., Будников Т.К., Бабкина С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы в анализе потенциальных загрязнителей окружающей среды Ц 1урн.аналит. химии. - 1990. - Г.45, № 7. - C.I386-I389.

11. Медянцева Э.П., Улахович H.A., Гройсберг А.Т. Химические сенсоры на основе уголыю-пасговых электродов для определения токсичных компонентов Ц Современные приборы и оборудование для химических и спектральных лабораторий. - Д.: Изд-во МДНТП, 1990. - С.54-60.

12. Медянцева Э.П., Будников Г.Н., Бабкина С.С, Ферментный амперометрический датчик для определения токсикантов // Современные приборы н оборудование для химических и спектральных лабораторий. - Ы.: Изд-во ЦДНТП, 1990. - С.61-65.

13. Медянцева Э,П., Бабкина С.С. Биохимический сенсор на основе иммобилизованной холинэстеразы в анализе фосфорсодержащих соединений // Казан.ун-т. - Казань, 1990. - Деп. в ОНИЙТЭХИМ г.Черкассы 21.06.90, № 442-хп 90.

14. Медянцева З.П., Будников Г.К., Бабкина С.С., Вертлиб М.Г. Ферментный датчик на основе иммобилизованной холинэстеразы в иммуноферментном анализе // Казак.ун-т. - Казань, 1990.

- Деп.в ОНИЙТЭХИМ г.Черкассы 01.08.90, № 572-хп 90.

15. Медянцева Э.П., Улахович H.A., Будников Г.К., Гройсберг А.Т. Волыампероыетрическое определение пестицидов кар-батиона и амобена с помощью угольно-пастовых электродов // Журн.аналиг.химии. - 1991. - Т.46, » 6. - С.962-966.

16. Медянцева Э.П., Будников Г.К. Каталитическое выделение водорода на графитовом и угольно-пастовом электродах в

растворах комплексов свинца (П) и кадмия (П) с серосодержащими лигандами // Журн.аналит.химии. - 1991. - Т.46, № 4. -С.783-788.

17. Budnikov Н.С., Medyantseva Е.Р., Babkina S.S. An enzyme araperonetric sensor for toxicant determination // J.Elec-troanal.Chem. - 1991. - V.310. - P.49-55.

18. Медянцева Э.П., Будникоз Г.К., Ли Фа-шень. Амперомет-рические биосенсоры в анализе пищевых продуктов и природных вод И Химический анализ пищевых продуктов и загрязнений окружающей среды. - Д.: Изд-во ЦРДЗ, 1992. - С.42-45.

19. Иедянцева Э.П., Бабкина С.С., Будников Г.К., Федорова И.Л., Ибрагимова H.H. Амперомегрический иммуноферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы // Журн. аналит.химии. - 1992. - Т.47, № 6. - C.II0I-JI06.

20. Иедянцева Э.П., Улахович H.A., Будников Г.К., Шай-дарова Л.Г. Экстракционно-вольтамперометрическое определение цинеба и манеба // Курн.аналит.химии. - 1992. - Т.47, К 9. -C.I607-I6I2.

21. Иедянцева Э.П., Улахович H.A., Будников Г.К. Экстракционное концентрирование и вольтамперометрическое определение серосодержащих пестицидов // Экстракция органических соединений. Вып.1. - Вороне*, 1992. - С.94-99.

22. Иедянцева Э.П., Ли Фа-шень, Федосеева О.В., Будников Г.Е. Аналитические возможности биосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы при определении пестицидов // Казан, ун-т. - Казань, 1992. - Дел. в ОНИИТЭШ г.Черкассы 22.04.92, Ш 187-хп 92.

23. Иедянцева З.П., Бабкина С.С., Вертлиб П.Г., Будников Г.К. Вольтамперометрический контроль иммунологических реакций // 1урн.аналит.химии. - 1993. - Т.48, И? 10. -C.I632-I638.

24. Медянцева Э.П., Каргина И.Ю., Будников Г.К. Определение димедрола с помощью амперонетрического биохимического сенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы // Химико-фармацевтический журнал. - 1993. - Т.27, fe 8. - С.63-64.

25. Медянцева Э.П., Федосеева О.В., Будников Г.К., Скро-делис О.Э., Зейдака A.A. Определение вируса крапчатости гвоздики с помощью иммуноферментного электрода // Прикладная би-

30

охимия и микробиология. - 1993. - Т.29, № 4. - С.619-624.

26. Будников Г.К., Медянцева Э.П. Биохимические сенсоры как этап в эволюции электроанализа: методологический аспект // Зурн.аналит.химии. - 1992. - Т.47, № I. - С.74-79.

2?. Babkina S.S., Medyantseva Е.Р., Budnikov Н.С., Vinter V.G. Enzyme amperometric sensor for the determination of Cholinesterase inhibitors or activators // Anal.Chim.Acta. -1993. - V.273. - P.419-424.

28. Медянцева Э.П., Улахович H.A., Будников Г.К. Применение модифицированных угольно-пастовых электродов для определения каптакса и тиазола БМ-Ц // Заводск.лаборатория. - 1994. -Г.60, № 3. - С.6-8.

авторских свидетельствах:

29. A.C.I2969I3. Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эмиров / Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, Н.А.Улахович, С.С.Бабкина. - Опубл.1986. Б.И. № 10.

30. А.с.1562831. Способ определения хлорофоса и прозери-на / Г.К.Будников, С.С.Бабкина, Э.П.Медянцева, И.Л.Федорова. -Опубл.1990. Б.И. te 17.

31. А.с.1615173. Устройство для определения ингибиторов и активаторов холинэстераз / Г.К.Будников, С.С.Бабкина, Э.П.Медянцева. - 0публ.1990. Б.И. № 47.

32. А.с.1707522. Ферментный электрод для иммунофернентко-го анализа / Э.П.Медянцева, С.С.Бабкина, Г.К.Будников, И.Л. Федорова, Н.Н.Ибрагимова, В.Т.Винтер, Г.В.Бочкарев. - Опубл. 1992. Б.И. К? 3.

33. А.с.1822971. Способ опеределения мккроколичеств тяжелых металлов / 3.П.Медянцева, С.С.Бабкина, Г.К.Будников, И.Л.Федорова, М.Г.Вертлнб. - 0дубл,1993^ Б.И. К 23. ,

34. Решение о выдаче патента от 15.05.93 по заявке № 4929346/13. Способ получения иммобилизованной холинэстеразы / Э.П.Медянцева, Ли Фа-шень, Г.К.Будников,. Е.Б.Никольская, A.B.Волков. , ,

35. Положительное решение от 20.08.91 по заявке № 4902268/14. Способ определения антител в сыворотке крови / С.С.Бабкина, Э.П.Медянцева, Г.К.Будников, М.Г.Вертлиб, H.H. Ибрагимова, В.Г.Винтер.

тезисах докладов:

36. Медянцева Э.П., Аронзон С.С. Вольтамперометрический датчик на основе иммобилизованных ферментов // Тез.докл.У! Всесоюзн.конф.по полярографии. - Днепропетровск, 1984. - С.17.

37. Медянцева Э.П., Бабкина С.С. Вольтаыперометрическое определение субстратов и ингибиторов холинэстеразы с помощью ферментного электрода // Тез.докл. П Всесовзн.конф. по электрохимическим методам анализа. - Томск, 1985. - С.65.

38.Медянцева З.П., Бабкина С.С., Будников Г.К. Определение кинетических параметров ферментативной реакции с помощью биосенсора на основе иммобилизованной холинэстерайы // Химические сенсоры-89: Тез.докл. - Л., 1989. - С.254.

39. Медянцева Э.П., Будников Г.К. Концентрирование токсичных компонентов с помощью угольно-пастовнх электродов, модифицированных хелатами и органическими реагентами // Тез.Ш Всесо-юз.конф. по методам концентрирования в аналитической химии. -Черноголовка, 1990. - С.26.

40. Медянцева Э.П., Бабкина С.С. Биохимический сенсор с амперометрической индикацией в анализе объектов окружающей среды // Тез.конф. "Анализ-90". - Ижевск, 1990. - С.118.

41. Medyantseva Е.Р», Budnikov H.C. Voltammetry with chemical modified, electrodes in environmental problems solution //Abstr.Heyrovsky Cent.Congr.- Prague, 1990. - P.Tu-93.

42. Budnikov H.C., Medyantseva E.P., Babkina S.S. Enzyme electrode based on the immobilized Cholinesterase for pesticides control //Abstr.52nd IUPAC Congr.- Stockholm,1989.- P.214.

43. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С. Ферментные и иммуноферментные сенсоры в экомониторинге биологически активных соединений // Тез.докл. ХУ Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Т.2. - Минск: Навука и тэхника, 1993. - С.307-308.

44. Medyantseva Б.P., Vertlib M.G., Budnikov H.C. The effect of metal ions on the amperometric responce of biosensor based on immobilized Cholinesterase // Senscr-Techno: Proceeding abstr. - St.Peterburg. - 1993. - P.107-108.

45.Babkina S.S., Medyantseva E.P., Budnikov H.С., Vert-lib K.G. Various types of amperometric biochemical sensoro for cholinesteraae effectors determination // Euroanalysis VIII. Book of abstr. - Edinburgh (UK), 1993- - PI 13.

46. Медянцева Э.П. Возможности вольтампероыетрии в контроле ферментных реакций // Тез.докл.1У конф. "Электрохимические методы анализа". - Ы., 1994. - С.20-21.