Влияние модуляторов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы: аналитический аспект тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

пг 01\

> * К^АНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

. о

На правах рукописи УДК 543.253:577.15.08

ВЕРТЛИБ МАРГАРИТА ГИРШЕВНА

ВЛИЯНИЕ МОДУЛЯТОРОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ: АНАЛИТИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

' КАЗАНЬ - 1996

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанско! государственного университета

Научные руководители: академик МАВШ, член-корр. РАЕН,

доктор химических наук, профессор Г.К.БУДНИКОВ

доктор химических наук, профессор Э.П.МЕДЯНЦЕВА

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор И.А.АБДУЛЛИН

кандидат химических наук, доцент Г.А.БООС

Ведущая организация: Башкирский государственный

университет, г. Уфа

Защита состоится " .^СС&лО- 1996 г. на заседании диссертационного Совета К 053.29.02 по химическим наукам Казанского государственного университета, ул. Ленина, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.ИЛобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г. Казань, ул. Ленина, 18, КГУ, научная часть.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

а

1996 г.

Н.Р.Федотова

Актуальность темы. Разработка чувствительных и селективных способов тределения постоянно расширяющегося круга физиологически активных сое-;инений - одна из актуальных задач современной аналитической химии. Эта за-.ача приобретает особое значение в настоящее время в связи с проблемами эко-:огии. Один из путей решения этой сложной и многогранной проблемы - разра-ютка новых электрохимических биохимических сенсоров, в частности, амперо-1етрических. Амперометрические биохимические сенсоры на основе иммобили-ованных ферментов, как современные средства измерения, позволяют получать .налитический отклик на многие экотоксиканты, которые часто выполняют роль юдуляторор. ферментов. Высокая каталитическая активность биочувствительной :асти таких сенсоров - одно из главных условий их успешной работы. Поэтому «основание и разработка способов, позволяющих увеличить каталитическую ак-ивность иммобилизованных ферментов - один из подходов к расширению ана-[итических возможностей такого рода устройств. В роли активаторов фермента-ивных процессов весьма перспективно использование ионов металлов.

Процессы активации ферментов изучены гораздо в меньшей степени, чем шгибирование. Знание же различных аспектов этого явления может оказаться |есьма полезным для подбора рабочих условий и получения максимального ана-штического сигнала при работе с биохимическими сенсорами.

Биохимичекие сенсоры позволяют определять многие физиологически ак-ивные соединения, в частности, пестициды, по их ингибирующему действию. Зднако, имея высокую чувствительность, широкий концентрационный диапазон, шзкий предел обнаружения, обладая экспрессностью определений, амперомет-»ические биосенсоры, в частности, на основе иммобилизованной холинэстеразы ИХЭ), не обладают достаточной селективностью, дают отклик на все присут-;твующие в системе ингибиторы фермента. Обеспечение селективности опреде-[ения соединений, близких по своей структуре, и особенно различных производ-шх одного соединения, является сложной задачей для аналитика. Одним из соименных подходов к решению этой проблемы является использование высоко-:пецифичных иммунохимических реакций. Возможность сделать низкомолеку-1ярные соединения, являющиеся экотоксикантами, иммуногенными, открывает ювые перспективы селективного их определения с помощью электрохимических мохимических сенсоров.

Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с ;оординационным планом РАН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 1.20.4.7) и грантом Российского фонда фундаментальных исследований "Реакции ¡иоспецифического взаимодействия в вольтамперометрическом анализе" (номер гроекта 94-03-09265).

Цель исследования заключалась в изучении действия некоторых юдуляторов на каталитическую активность ИХЭ: активаторов - для получения

максимального аналитического сигнала, ингибиторов - для разработки селекти ных способов их определения на основе сочетания иммунохимических реакций вольтамперометрической индикацией результатов биоспецифического взаим действия.

Научная новизна и практическая значимость работы. Выяснено влияи различных факторов на процесс активации ИХЭ ионами щелочноземельных м таллов. Установлены условия получения максимального аналитического сигна при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсором. Определен количественные характеристики ферментативных реакций с участием ИХЭ присутствии ионов-активаторов.

Предложен и обоснован новый подход к селективному определению пе тицадов, основанный на сочетании реакции образования иммунного комплею антитело-пестицид с детектированием этого взаимодействия с помощь биохимического сенсора на основе ИХЭ. Разработаны различные вариант иммунохимических определений хлорпроизводных феноксиуксусной кислот (2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кисж (2,4,5-Т) с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора и использованием раствора антител (Ат) или иммобилизованных Ат против даннь пестицидов. Предложен способ получения иммобилизованных Ат, позволяют:; сохранить их способность к биоспецифическому взаимодействию в течеш длительного времени. Найдены рабочие условия проведения определен« изучаемых пестицидов. Показана возможность использования разработаннь способов иммунохимических определений для контроля содержания 2,4-Д пищевых продуктах.

Определены константы активирования ИХЭ ионами щелочноземельна металлов и константы связывания иммунного комплекса Ат-пестицид по данны вольтамперометрических измерений.

На защиту выносятся:

- результаты изучения активирующего действия ионов щелочноземельнь: металлов (Са, Бг, Ва) на каталитическую активность ИХЭ;

- совокупность факторов, определяющих величину максимального аналк тического сигнала при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсс ром;

- кинетические параметры реакции гидролиза субстрата холинэстеразы присутствии ионов-активаторов; константы активирования ИХЭ ионами щелоч ноземельных металлов;

- действие платины (II) и родия (III) на каталитическую активность бис чувствительной части сенсора;

- новые варианты иммунохимических определений хлорпроизводных фе~ юксиуксусной кислоты, основанные на сочетании реакции биоспецифического ;заимодействия и амперометрического холинэстеразного биосенсора;

- способ иммобилизации Ат;

- определение констант активирования ИХЭ ионами щелочноземельных (еталлов и констант связывания иммунокомплекса Ат-пестицид;

- методики определения 2,4-Д в объектах эколого-аналитического конт-

10ЛЯ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладываясь и обсуждались [а Итоговой научной конференции Казанского государственного университета 1994 г), VIII Международной конференции "Евроанализ" (Эдинбург, 1993 г), :онференции "Химические сенсоры-93" (Санкт-Петербург, 1993 г), XV Черняев-ком совещании по химии, анализу и технологии платиновых металлов (Москва, 993 г), конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1994 г), юнференции "Экоаналитика-94" (Краснодар, 1994 г), 5Ш Международном сим-юзиуме по кинетике в аналитической химии (Москва, 1995 г), Международном ;импозиуме по экологической химии (Кишенев, 1995 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Из них 2 татьи и 11 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, статья принята к печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах ма-иинописного текста, содержит 19 таблиц, 6 рисунков (из них 1 в приложении), 'абота состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной [итературы, включающей 106 ссылок, и приложения.

В первой главе представлен обзор литературы о металлах, как модулятарах ферментов, об определении металлов по их действию на каталитическую актив-гость ферментов, Вторая глава посвящена обзору литературы по иммунохими-[ескому анализу низкомолекулярных соединений (пестицидов). Третья глава ¡одержит постановку задачи, описание объектов исследования, методы и условия жсперимента. В четвертой главе изложено влияние металлов на каталитическую ктивность ИХЭ, аналитический аспект применения наблюдаемых эффектов, шределение количественных характеристик кинетики холинэстеразного сатализа. Пятая глава посвящена обоснованию возможности селективного шределения отдельного низкомолекулярного соединения с помощью :олинэстеразного биосенсора и иммунохимических реакций. На примере лорпроизводных феноксиуксусной кислоты показаны аналитические юзможности данного подхода. Приведены методики определения пестицидов в {сдельных смесях и в реальных объектах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспериментальная работа выполнена на осциллографическом поляр графе ПО-5122, модель 03 с ячейкой, термостатированной при 25±0.2°С с л мощью термостата ТС-50. Рабочим электродом служил биохимический сенсс состоящий из стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подло: кой и холинэстеразы (ХЭ), иммобилизованной в пленку из нитроцеллюло: (площадь рабочей поверхности биочувствительной части сенсора 7.95+0.5 см Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод. Использова. бутирилхолинэстеразу сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8) с активносп 110 АЕ/мг. В качестве субстрата ХЭ применяли бутирилтиохолин иодид (БТХ1> Объекты исследования: хлорпроизводные феноксиуксусной кислоты: 2,4-Д 2,4,5-Т, ионы щелочноземельных металлов: кальция (II), стронция (II) бария (II). Применяли также моноклональные Ат против 2,4-Д поликлональные Ат против 2,4,5-Т.

Кинетические параметры ферментативной реакции определяли путем ш тегрального анализа полной кинетической кривой зависимости величины тока I времени при определенной концентрации субстрата.

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Изменение каталитической активности ИХЭ в присутствии модуляторе удобно наблюдать по высоте пика при потенциале -0.55 В, относящегося к во! становлению продукта взаимодействия тиола, образующегося в результате гидр< лиза БТХИ, с материалом электрода (ртутью), который служил аналитически сигналом при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсором.

Возможность регуляции каталитической активности ферментов и целен; правленного влияния на нее рассмотрена на примере действия рада ионе щелочноземельных металлов на ИХЭ.

В присутствии ионов щелочноземельных металлов (Са2+, Бг2*, Ва2+) нг блюдается увеличение высоты пика при потенциале -0.55 В, что указывает на аь тивирующее действие этих металлов по отношению к ИХЭ.

Установлено, что на данный активирующий эффект влияет целый ря факторов: рН среды, концентрация изучаемых ионов, величина каталитическо активности фермента и, как следствие этого, способ иммобилизации фермент! время инкубации биочувствительной части сенсора с данными ионам! присутствие или отсутствие при этом субстрата фермента.

В области рН 8.95-9.05, которая является оптимальной для работы даннс го биосенсора и в отсутствие ионов щелочноземельных металлов, активирующи

эффект наблюдается лишь в очень узкой области концентраций: (2-7)-10~6 моль/л для Са24" и 5г2+и.(4-9)-10"6 моль/л для Ва2+. Наибольшая активация достигается при концентрации 5-Ю"6 моль/л для Са2+ и 5г2+ и (5-6)-10 6 моль/л для Ва2+. В интервале рН 7.0-8.0 обнаружить область концентраций активирующего действия изучаемых ионов не удалось.

Кроме того, область концентраций максимального активирующего действия рассматриваемых ионов связана и с исходной каталитической активностью биочувствительной части сенсора. Причем чем меньше каталитическая активность ИХЭ, тем большая концентрация ионов металлов необходима, чтобы наблюдать подобный эффект.

Процесс взаимодействия ионов щелочноземельных металлов с ИХЭ, очевидно, вдет во времени. Оптимальное время инкубации биочувствительной части сенсора с ионами изучаемых металлов, как следует из табл. 1, составляет 15 минут. Увеличение или уменьшение этого времени приводит к уменьшению величины тока пика по сравнению с максимальным значением.

В присутствии субстрата ХЭ активирующий эффект больше, чем в его отсутствие (см. табл. 1). Это подтверждается и данными, полученными с помошыо радиохимических методов с использованием 855г. Это может быть связано с тем, что конформация молекулы фермента, наиболее благоприятная для образования комплекса Мехаэлиса, образующаяся в момент взаимодействия ХЭ с субстратом, [юполнительно стабилизируется введением ионов металлов-активаторов. Все это и приводит к увеличению каталитической активности фермента.

Таблица 1.

Влияние условий эксперимента на величину аналитического сигнала (рН 9.05; п=3; сБТХи=210-3 моль/л; ток в отсутствие ионов металлов-активаторов 5.0 мкА; концентрация ионов металлов 5- Ю-6 М)

Ионы Время инкубации, мин

металлов 5 10 15 15 без БТХИ 20 25

Са2" 5.3 7.4 8.7 5.4 7.7 6.4

Sr2+ 5.6 6.4 7.3 5.0 6.9 5.7

Ва24 6.0 6.3 6.8 4.7 6.7 4.8

Из данных табл. 1 следует, что в присутствии ионов щелочноземельных металлов каталитическая активность ИХЭ изменяется в следующем порядке: Са > Sr > Ва, что согласуется с радиусом ионов (1.04 Á, 1.20 Á, 1.38 Á соответственно).

Полученные экспериментальные данные дают возможность предложить не( колько вариантов увеличения каталитической активности биочувствительнс части сенсора. Первый способ: ИХЭ выдерживают в течение 15 минут растворе, содержащем ионы Са2+ в концентрации 5-106 моль/л, субстрат концентрации 2-Ю"3 моль/л и боратный буферный раствор с рН 9.05, зате промывают дистиллированной водой и используют как составную част биохимического сенсора. Второй способ: к анализируемому образцу добавляй раствор соли кальция, чтобы концентрация ионов Са2+ составляла 5-10'6 моль/, стандартный раствор БТХИ и боратный буферный раствор с рН 9.05. Биосенсс помещают непосредственно в анализируемую пробу и через 15 минут снимаю осцилловольтамперограмму в интервале потенциалов от -0.1 до -0.9 В пр скорости изменения потенциала 1 В/с.

Предварительная обработка ИХЭ по первому способу, на наш взгляд предпочтительнее, так как после промывания нитроцеллюлозной мембраны дис тиллированной водой на ней остаются лишь те ионы, которые стабилизирую активную конформацию фермента.

Полученные результаты позволяют подобрать условия проведения экспе римента, при которых каталитическая активность биочувствительной части сен сора увеличивается в 1.5-2 раза за счет соответствующего состава фонового элек тролита и других факторов, обеспечивая оптимальные условия работы ампере метрического холинэстеразного биосенсора. Это дает возможность получить сш нал удобной для измерения формы и величины, что расширяет аналитически возможности данного устройства при определении ингибиторов и субстратов ХЭ

Полученные нами результаты позволяют предположить, что повысить ка талитическую активность нативного фермента можно, действуя на нативную X! растворами солей щелочноземельных металлов. Поскольку в присутствии ионо Са2+ наблюдается наибольший активирующий эффект, именно соли кальци были использованы для этих целей.

Максимальное увеличение аналитического сигнала в этом случае наблю дается в присутствии ионов Са2+ в концентрациях 5- Ю-3 моль/л и 1-Ю"7 моль/1 В случае малой исходной активности нативной ХЭ, предварительная обработк фермента раствором соли кальция в данных концентрациях позволяет получит ИХЭ, обладающую достаточно высокой каталитической активность! (1.15 мкмоль/мин- см2), что дает возможность использовать ее в качестве биочув ствительной части амперометрического сенсора. Наилучший результат дае добавление ионов Са2+ в концентрации 5-10"3 моль/л.

Таким образом, для изготовления биочувствительной части сенсора и ХЭ, имеющей низкую исходную каталитическую активность, целесообразн проводить стадию обработки фермента раствором СаС12.

Анализ полученных значений кинетических параметров (кажущейся константы Михаэлиса Кпмкй-Ж!, максимальной скорости V,,,) реакции ферментативного гидролиза БТХИ в отсутствие и в присутствии ионов-активаторов позволяет сделать следующее заключение о характере активационных процессов. Присутствие ионов Ва2+ проявляется в рассогласованности воздействия его на фермент, то есть в увеличении максимальной скорости реакции и в ослаблении связывания фермента с субстратом (двухпараметрически рассогласованная активация). Ионы Са2+ в зависимости от концентрации могут либо усиливать (сса=7- ДО6 моль/л) связывание фермента с субстратом и не влиять на его каталитические функции (ассоциативная активация), либо, ослаблять (сСа=8-10-6 моль/л) связывание фермента с субстратом и увеличивать максимальную скорость реакции (двухпараметрически рассогласованная активация).

С увеличением концентрации субстрата ( от 1.5- Ю-3 моль/л до 4- Ю-3 моль/л) изменяется вид активации от ассоциативной и псевдоакгавации (усиление связывания фермента с субстратом и снижение максимальной скорости реакции при сохранении основного признака активации - соотношения начальных скоростей уа>у0, где Уа и у0 - начальная скорость реакции в присутствии и в отсутствие активатора соответственно) к двухпараметрически рассогласованной (при сбтхи=4' Ю"3 моль/л).

Значения констант активирования, приведенные в табл. 2, указывают на более сильный активирующий эффект ионов Са2+ по сравнению с ионами Ва2+ (при одинаковых концентрациях субстрата), что согласуется с экспериментальными данными.

Таблица 2.

Значение констант активирования для ионов Са2+ и Ва2+ в присутствии

ихэ

Активатор сктхи, моль/л КА, моль/л

1.5- Ю-3 (3.8+0.3 )■ Ю-6

Са2+ 2.0' Ю-3 (3.7+0.2)- 10-«

з.о- ю-3 (3.3+0.1)- Ю-6

4.0- Ю-3 (1.8±0.2>- Ю-8

Ва2+ 1.5-10"3 (8.4±0.3)- Ю-6

Причем большое значение имеют и концентрация металла - активатора, и соотношение концентраций изучаемых ионов и субстрата.

Возможность количественной оценки активирующего влияния ионов щелочноземельных металлов на ИХЭ, входящую в состав амперометрического биохимического сенсора позволяет, на наш взгляд, в каждом конкретном случае

биохимического сенсора позволяет, на наш взгляд, в каждом конкретном случа подобрать наилучшие условия использования данного сенсора для определени экотоксикантов. Подобные подходы могут быть использованы для оценю активирующего эффекта и других соединений.

Платина (И) и родий (III) оказывают активирующее действие на ИХЭ широком концентрационном интервале, что создает предпосылки для разработю способов их определения с помощью амперометрического холинэстеразноп биосенсора.

СЕЛЕКТИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО

БИОСЕНСОРА

Наличие линейной зависимости между величиной аналитической сигнала и концентрацией ингибиторов различной природы позволяв' использовать холинэстеразный биосенсор для определения отдельной ингибитора в отсутствие других. Для повышения селективности определени! можно использовать иммунохимические реакции (т.е. реакции образовали) иммунных комплексов Ат-антиген). Низкомолекулярные вещества, например пестициды, не способны вызывать образование Ат при попадании в живо! организм. Однако после соединения с белковым носителем они приобретаю-свойства антигенов.

Возможность селективного определения пестицида в присутствии друга ингибиторов с помощью биосенсора на основе ИХЭ была показана на пример! совместного определения хлорпроизводных феноксиуксусной кислоты (2,4-Д I 2,4,5-Т). В присутствии данных пестицидов наблюдается уменьшение высота пика при потенциале -0.55 В, что указывает на их ингибирующее действие.

Если водный раствор пестицида инкубировать в течение некоторой времени с определенным количеством Ат против него, то образуется иммуннь» комплекс Ат-пестицид. Контролировать этот процесс можно путем оценю-высоты катодного пика при потенциале -0.55 В по ингибирующему действик пестицида на биочувствительную часть сенсора.

В присутствии фиксированной концентрации Ат и при мальо концентрациях пестицида порядка 10"и моль/л происходит практически полное связывание его в иммунный комплекс. Оставшееся количество пестицида не влияет на величину аналитического сигнала. Если в растворе присутствует пестицид в области концентраций от 1- 10"и до 5-10"7 моль/л для 2,4-Д и от 5- 10'и до 5Т0*7 моль/л для 2,4,5-Т, то часть его связывается Ат, а оставшаяся

и

пестицидов является наиболее возможной при" определении в реальных объектах, подобраны наилучшие с точки зрения времени единичного анализа и расхода реактивов условия проведения эксперимента: время инкубации 5 минут, концентрация Ат 0.014 мг/мл для 2,4-Д и 0.015 мг/мл для 2,4,5-Т.

Следует отметить,что для каждой концентрации Ат всегда можно найти ту граничную концентрацию пестицида, при которой не наблюдается изменения аналитического сигнала. Для повышения надежности получаемых результатов концентрация Ат должна превышать анализируемую концентрацию пестицида примерно в 100-1000 раз. Такой подход особенно перспективен для экспрессного качественного определения состава исследуемого раствора, поскольку время единичного определения не превышает 20 минут.

Однако непосредственное добавление Ат в исследуемый раствор приводит к большому их расходу, невозможности многократного использования одной и той же порции реагента. Следует также учитывать, что получение специфических Ат на любое низкомолекулярное соединение является в настоящее время длительным, сложным, дорогостоящим и весьма трудоемким процессом. Поэтому гораздо экономичнее и удобнее был бы способ определения пестицидов, основанный на использовании иммобилизованных тем или иным путем Ат.

Ранее было показано, что Ат и антигены можно иммобилизовать совместно с ХЭ путем включения в пленки из нитроцеллюлозы для получения иммуноферментных сенсоров. Однако для решения задачи селективного определения отдельного ингибитора совместная иммобилизация ХЭ и Ат невозможна. В этом случае будет наблюдаться параллельное взаимодействие пестицида и с ХЭ, и с Ат против него. И то, и другое приводит в уменьшению аналитического сигнала. Выделить нужную нам составляющую этого взаимодействия не представляется возможным. Кроме того, такое определение не будет селективным в присутствии других ингибиторов фермента, поскольку они также смогут вступать в соответствующие реакции.

Поэтому был разработан способ иммобилизации Ат отдельно от фермента путем комбинированного действия: включения в пленку из нитрата целлюлозы в процессе ее формирования и ковалентного связывания с материалом матрицы с помощью бифункционального реагента - глутарового альдегида. Ат в такой пленке сохраняют свои свойства специфически взаимодействовать с пестицидами в течение длительного времени (время хранения иммобилизованных Ат составляет 30 дней).

Иммобилизованные Ат позволяют извлечь пестицид из анализируемого раствора за счет образования иммунного комплекса, что дает возможность

дальнейшего его селективного определения. Такой подход отличается просто! и экспрессностью.

Определение отдельного пестицида с использованием иммобюгазованн Ат и амперометрического холинэстеразного биосенсора включает следую и. стадии:

1) образование иммунного комплекса Ат-пестицид. Это происходит л инкубации иммобилизованных Ат с исследуемым раствором.

2) Разрушение иммунного комплекса. Для этого пленку образовавшимся комплексом промывают дистиллированной водой обрабатывают боратным буферным раствором с рН 9-10.

3) Определение концентрации освободившегося пестицида с помощ холинэстеразного биосенсора.

Возможность селективного определения 2,4-Д с использовани иммобилизованных Ат и амперометрического холинэстеразного биосенсора бь показана на примере смеси 2,4-Д с пестицидами различной природы, частности, фосфор- (глифосат, фозалон, трихлорметафос) и хяорсодержащи (тиодан, трихлорметафос) (табл. 3).

Таблица

Результаты определения 2,4-Д в присутствии модельной смеси пестицидов (глафосата, фозалона, трихлорметафоса, тиодана) (п=5; р=0.95)

Введено 2,4-Д, моль/л Введено смеси пестицидов, моль/л Найдено 2,4-Д, моль/л

5.0- Ю-7 5.0-10-9 (4.9±0.2> Ю-7 0.05

5.0- Ю"7 5.0- Ю-8 (5.2±0;3)-10"7 0.06

5.0- Ю-9 5.0- Ю-7 (5.1+0.4)- Ю-9 0.09

5.0- 10-9 5.0- 10-8 (4.9±0.5)- Ю-® 0.11

5.0- 10"8 5.0-10-« (4.8±0.3)-10"8 0.07

Таким образом, селективное определение 2,4-Д возможно в присутств ингибиторов, обладающих различным механизмом действия на ИХЭ, даже п 100-кратном их избытке.

Изучаемые пестициды являются соединениями, близкими по сво структуре и свойствам, но оказалось, что 2,4-Д не взаимодействует иммобилизованными Ат против 2,4,5-Т во всем изучаемом динамичесю диапазоне концентраций данных пестицидов. Это позволяет селектив определять ее в присутствии 2,4-Д (табл. 4).

Таблица

Результаты определения 2,4,5-Т в присутствии 2,4-Д с использованием _ иммобилизованных антител против 2,4,5-Т и холинэстеразного биосенсора

(п=5; р=0.95; 1=2.78)

Введено 2,4,5-Т, моль/л Соотношение концентраций 2,4,5-Т и 2,4-Д Найдено 2,4,5-Т, моль/л Sr 'расч

5.0- Ю-7 1:100 (5.1±0.1)- Ю-7 0.02 2.31

5.0- Ю-7 1:1 (4.9+0.3)- Ю-7 0.06 0.81

5.0 Ю-7 100:1 (5.2+0.2)- Ю-7 0.04 2.39

5.0- 10'11 1:100 (4.8+0.3)- Ю-" 0.06 1.58

5.0- Ю-" 1:1 (5.3±0.4)- Ю-" 0.07 1.73

Процент перекрестных реакций Ат против 2,4-Д на 2,4,5-Т не превышает 3%, т. е. если в анализируемом растворе присутствует 2,4,5-Т в количествах, эизмеримых с 2,4-Д, то она не мешает определению 2,4-Д. Если же 2,4,5-Т аходится в концентрации, в 100 раз превышающей концентрацию 2,4-Д, то остоверное определение последнего невозможно.

Таким образом, предлагаемый нами вариант иммунохимических пределений имеет следующие преимущества по сравнению с используемыми в астоящее время способами определения пестицидов: высокую селективность, шрокий динамический диапазон рабочих концентраций, экспрессность, ростоту пробоподготовки, отсутствие стадий концентрирования и [аскирования, высокую чувствительность определений, возможность получения налитического сигнала в оптимальных условиях независимо от состава, рироды анализируемого образца.

Следует отметить, что предлагаемый нами вариант сочетания мперометрического холинэстеразного биохимического сенсора с ммунохимическими реакциями может быть использован и для определения елого ряда других пестицидов, являющихся ингибиторами ХЭ. Имея набор ммобилизованных подобным образом Ат против различных пестицидов, можно ыстро и селективно определять отдельный пестицид в сложных по составу месях.

Одним из факторов, определяющих чувствительность иммунохимического нализа, является значение константы связывания (Ка) иммунного комплекса ^-антиген (пестицид). Количество пестицида, оставшееся в растворе после бразования иммунного комплекса, необходимое для расчета Ка с спользованием графика Скэтчарда, было определено с помощью мперометрического холинэстеразного биосенсора. Для поликлональных Ат

график в координатах Скэтчарда (рис., кривая Б) имеет вид нелиней1 зависимости, которую можно аппроксимировать двумя прямыми, выделив смеси Ат две популяции, средние значения констант связывания антиг (гаптена) которых значительно отличаются (табл.5). Линейная зависим ост; координатах Скэтчарда (рис., прямая А) свидетельствует о моноклональности против 2,4-Д. Величины Ка для раствора Ат и иммобилизованных Ат (таб.! позволяют сделать вывод о преимуществе использования иммобилизованных что,наш взгляд, связано с жестким закреплением выгодной конформа1 молекул Ат в иммобилизованном состоянии и отсутствием мешающего шиш других находящихся в исследуемом растворе молекул, которое наблюдаете) водном растворе Ат. В этом случае проявляется, по-видимому, экранирую! действие матрицы.

График Скэтчарда для нахождения констант связывания иммунного комплекса Ат-2,4-Д (А) и Ат-2,4,5-Т (Б) для иммобилизованных Ат Ао - общая концентрация пестицида в системе х - равновесная концентрация иммунного комплекса

Таблица

Константы связывания иммунного комплекса Ат-пестицид (п=3; р=0.95)

Пестицид Константа связывания, МОЛЬ"1 Водный раствор антител Иммобилизован ные антитела

2,4-Д Ка (1.0+0.1)- 109 (1.4±0.1)' Ю10

2,4,5-Т Ка] Ка„ (2.3±0.1)-109 <7.8±0.1>-107 (3.5±0.2)- Ю10 (2.8±0.1)-10*

Поскольку пестицид 2,4-Д отностися к числу потенциальш загрязнителей объектов эколого-аналитического контроля, а содержание его пищевых продуктах не допускается, то представляет большой интерес разрабоп

высокочувствительного, и селективного способа его определения, например, в молоке."

Разработанный нами вариант иммунохимических определений, эснованный на сочетании реакций биоспецифического взаимодействия с индикацией результатов этого взаимодействия с помощью холинэстеразного зиоеенсора, был использован для определения содержания 2,4-Д в молоке.

Определение 2,4-Д в молоке с использованием иммобилизованных Ат и (олинэстеразного биосенсора включает следующие операции:

1) инкубирование иммобилизованных Ат с исследуемым образцом, в результате чего происходит извлечение определяемого пестицида из шализируемого раствора путем связывания его в иммунный комплекс на говерхности нитроцеллюлозной пленки;

2) перенос пленки в другой раствор, в котором происходит разрушение )бразовавшегося комплекса Ат -пестицид;

3) определение освободившегося пестицида в этом же растворе с томощью биохимического сенсора на основе ИХЭ.

Результаты определения 2,4-Д в различных образцах молока, ¡¡оставленных из разных районов Татарстана, представлены в табл.6. Результаты юпосталены с данными санэпидемстанции, полученными с помощью газожид-состной хроматографии. Анализ значений г- и Б-критерия показал, что »схождения между средними результатами не значимы (1расч<1табл) и зредлагаемый способ является правильным.

Таблица 6.

Результаты определения 2,4-Д в молоке с использованием иммобилизованных антител и холинэстеразного биосенсора (п=5; р=0.95; ^асч=2.78; Ртабл=6.4)

№ образца Найдено 2,4-Д ^расч Р 1 расч

газожидкостная хроматография предлагаемый метод

(с±5), моль/л (с±5), моль/л

1 - - (3.8+0.8)- Ю-11 0.17 - -

2 - - (5.4±0.9)- Ю-11 0.13 - -

3 (1.6±0.1)- 10-ю 0.08 (1.8±0.2)-10"10 0.09 2.17 1.6

4 (5.9+0.2)- Ю-10 0.05 (5.7+0.4)- Ю-10 0.07 0.90 1.8

Следует отметить,что такой способ определения не требует специальной юдготовки пробы, в частности, экстракции для концентрирования и отделения >т других компонентов, отличается селективностью, простотой и

экспрессностью, обладает большей чувствительностью, чем хроматохрафическз методы, позволяет улучшить надежность аналитической информации о качест] продуктов питания. К несомненным преимуществам данного подхода относитс и то, что предлагаемый способ определения 2,4-Д не требует построен* адекватной градуировочной характеристики, что зачастую создает болыш трудности при анализе конкретных объектов.

ВЫВОДЫ

1. Активирующее действие ионов щелочноземельных металлов } каталитическую активность ИХЭ, входящей в состав амперометрическо) биохимического сенсора, изменяется в следующем порядке: Са > Sr > В Условия получения максимального аналитического сигнала при работе холинэстеразным биосенсором: сСа=510'6 моль/л, рН 9.05, сбххи=2-10~3 моль/. время инкубации биочувствительной части сенсора с раствором соли кальщ 15 минут.

2. Каталитическая активность нативной ХЭ увеличивается в присутстви ионов Са2+ в концентрациях 5Т0-3 и 1-10"7 моль/л в 2-3 раза. Обработ> нативного фермента с низкой исходной каталитической активностью растворо соли кальция в этих концентрациях позволяет получить ИХЭ, обладающу достаточно высокой каталитической активностью (удельная активное] 1.15 мкмоль/мин- см2).

3. Кинетические параметры ферментативной реакции гидролиза БТХ1 вычисленные по данным вольтамперометрических измерений в присутствии и отсутствие металлов-активаторов, использованы для определения активирующе способности (константы активирования) ионов щелочноземельных металлов вида активации. Для ионов бария (II) характерна двухпараметрическ рассогласованная активация (при сбххи=1-5'10"3 моль/л). Для ионов кальция (I; в зависимости от концентрации субстрата и самого иона характерны различны виды активации: ассоциативная, двухпараметрически рассогласованная псевдоаюгивация. Значения констант активирования (3.8+0.3)-10'6 моль/л дл ионов кальция (II) и (8.4±0.3)- Ю-6 моль/л для ионов бария (II) пр сбтхи=1-5'Ю'3 моль/л указывают на больший активирующий эффект ионо кальция (II).

4. Платина (II) и родий (III) оказывают влияние на каталитически активность ИХЭ. Показана возможность определения родия (III) в облает концентраций от 1- Ю-10 до 9-10"10 моль/л с помощью амперометрическог

колинэстеразного _ биосенсора с ошибкой, не превышающей 14%, время определения 15 минут.

5. Предложен новый подход к селективному определению ингибиторов КЭ, основанный на использовании иммунохимических реакций и ■юлинэстеразного биосенсора, сочетающий специфичность реакций образования иммунного комплекса с высокой чувствительностью детектирования шалитического сигнала амперометрическим биосенсором. Найдены условия юлучения иммобилизованных Ат. Установлены рабочие условия проведения зазличных вариантов иммунохимических определений 2,4-Д и 2,4,5-Т с использованием раствора Ат (сн=8-10"12 моль/л и сн=3-10"11 моль/л ^ответственно) и иммобилизованных Ат (сн=5- Ю-12 моль/л и сн=1- Ю-11 моль/л ^ответственно). Предложенный способ определения 2,4-Д апробирован при шализе молока.

6. Значения констант связывания иммунных комплексов, равные 1.4±0.1)-1010 М"1 для Ат-2,4-Д и Kai = (3.5±0.2)- 10'° М"1, Кап=(2.8±0.1)-108 М"> Р1Я Ат-2,4,5-Т обеспечивают высокую чувствительность иммунохимических шределений.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К., Никольская Е.Б. Зыбор условий получения максимального аналитического сигнала при работе с 1мпер0метрическим холинэстеразным биосенсором // Журн. аналит. химии. -994. - Т.49, №11. - С. 1220-1223.

2. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К., Бабкина С.С., Еремин С.А. Амперомстрический биохимический сенсор на основе шмобилизованной холинэстеразы в иммуноанализе пестицидов // Журн. [налит, химии. - 1995. - Т.50, №7. - С.782-786.

3. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К., Иванов В.Б. Зпределение гогатиносодержащих лекарственных препаратов с помощью ¡иосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы // XV Черняевское овешание по химии, анализу и технологии платиновых металлов: Тез. докл. -Л.:Гиналмоззолото, 1993. - С. 198.

4. Медянцева Э.П., Бабкина С.С., Будников Г.К., Вертлиб М.Г., Федосеева О.В. Биосенсоры на основе иммобилизованной холинэстеразы в [ммуноферментном анализе // Химические сенсоры: Тез. докл. -.-Петербург, 1993. - С.263.

5. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К. Влияние ионов ¡еталлов на амнерометричеокий отклик биосенсора на основе

иммобилизованной холинэстеразы // Химические сенсоры: Тез. докл. -С.-Петербург, 1993. - С. 265.

6. Babkina S., Medyantseva Е., Budnikov Н., Vertlib М. Various of amperometric biochemical sensors for Cholinesterase effectors determination // Euroanalysis VIII: Proceeding abstracts. - Edinburgh (Scotland, UK), 1993. - P. 113.

7. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г. Выбор условий получения максимального аналитического сигнала при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсором // Электрохимические методы анализа: Тез. докл. - Москва, 1994. - С.77.

8. Вертлиб М.Г., Фахертдинова Г.Ф., Иванов В.Б. Возможность определения некоторых платиновых металлов с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора // Электрохимические методы анализа: Тез. докл. - Москва, 1994. - С 110.

9. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Т.К. Селективное определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты с использованием моноклональных антител и амперометрического холинэстеразного биосенсора // Экоаналитика-94: Тез. докл. - Краснодар, 1994. - С 153.

10. Vertlib M.G., Medyantseva Е.Р., Tyshlek М.Р., Budnikov H.C. The study of immobilized Cholinesterase activation processes in the presence of alkaline-earth metal ions // 5th International Symposium on kinetics in analytical chemistry: Proceeding abstracts. - Moscow, Russia, 1995. - P.51.

11. Medyantseva E.P., Kargina I.Yu., Vertlib M.G., Fakhertdinova G.F., Budnikov H.C. The amperometric Cholinesterase biosensors in drug analysis // 5th International Symposium on kinetics in analytical chemistry: proceeding abstracts. -Moscow, Russia, 1995. - P.52.

12. Medyantseva E.P., Vertlib M.G., Fedoseeva O.V., Babkina S.S., Budnikov H.C., Eremin S.A. New approach to selective pesticide determination with amperometric Cholinesterase biosensor // 5th International Symposium on kinetics in analytical chemistry: Proceeding abstracts. - Moscow, Russia, 1995. - L.16.

13. Medyantseva E.P., Vertlib M.G., Tyshlek M.P., Fedoseeva O.V., Budnikov H.C., Babkina S.S., Eremin S.A. The use of voltammetrically monitored immunochemical reactions for selective assay of pesticides // Symposium on ecological chemistry: Proceeding abstracts. - Moldova, Chisinau, 1995. - P.216.

14. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К., Тышлек М.П. Новы вариант использования холинэстеразного амперометрического биосенсора дл селективного определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты // Журн. г.рик, биохимии и микробиологии. - 1997. - Т.ЗЗ (рег.№ 4582).