Характеристики амперометрического холинэстеразного биосенсора как нестандартного средства измерения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Казанский государственный университет имени В. И. Ульянова-Ленина

На правах рукописи

г ■ " А П

У У.;''К

Федосеева Ольга Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО Х0ЛИНЭСТЕРАЗН0Г0 БИОСЕНСОРА

КАК НЕСТАНДАРТНОГО СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЯ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

КАЗАНЬ - 1996

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета имени В.и.Ульянова-Ленина

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член-корр. РАЕН, академик МАВШ Г.К.Будников

доктор химических наук, профессор Э.П.Медянцева

Официальные оппоненты: доктор химических наук.

П.М.Зайцев

кандидат химических наук Е.Ю.Ведерникова

Ведущая организация:

Казанский технологический университет

Защита состоится ¿1?/ ^¿¿йг^у 1996 г. в ^ часов

на заседании специализированного Совета К 053.29.02 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина (ул. Ленина, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просьба присылать по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18, КГУ, Научная часть.

Автореферат разослан /¿¿¡^¡¡Яг^у?'

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

1996 г.

.Р.Федотова

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной

аналитической химии является разработка высокочувствительных, селективных, экспрессных и, в то же время, простых по выполнению методик, способов определения токсичных веществ. Особенно актуальной эта задача становится в связи с проблемами экологии и организации экомониторинга. Один из путей решения этой сложной аналитической задачи видится в разработке различных химических сенсоров и, в частности, биосенсоров, которые в той или иной степени удовлетворяют этим требованиям. Например, амперометрические биохимические сенсоры сочетают в себе способность вольтамперомет-рии с высокой чувствительностью регистрировать аналитический сигнал Сизменение тока) с высокой специфичностью действия биологических препаратов, входящих в их состав. Разработка новых биосенсоров и определение их аналитических возможностей одно из перспективных направлений развития современных физико-химических методов анализа. Чтобы рекомендовать эти разработки для практического использования в реальных условиях С организация мониторинга физиологически активных веществ), необходима метрологическая аттестация как самих этих устройств, так и методик работы с ними. Задача статистической обработки экспериментальных данных как раз и заключается в улучшении метрологических характеристик методик данного метода (способа) анализа, з сравнении их и т.д., т.е. носит исследовательский характер. Как показывает практика - это очень большая, сложная и трудоемкая задача, на выполнение которой затрачивается гораздо больше времени, чем непосредственно на разработку самих датчиков. Однако эта стадия является в настоящее время одной из самых необходимых, в связи с остро стоящей проблемой адекватности получаемых результатов и реального содержания токсикантов в объектах анализа.

Цель исследования заключалась в дальнейшем изучении аналитических возможностей и кинетических параметров амперометрического холинэстеразного биосенсора как нестандартного средства измерения, а также в оценке и определении метрологических характеристик методик определения некоторых биологически активных соединений с его помощью, основных погрешностей при его изготовлении.

Научная новизна. Исследовано ингибирувщее действие ряда фосфор-, хлор- и азоторганических пестицидов в составе биохимическо-

го холинэстеразного сенсора, что позволило предложить методики ка чественного и количественного анализа указанных веществ с нижней границей определяемых содержаний на уровне ПДК и на несколько порядков ниже. Определены кинетические параметры ферментативных реакций с участием ИХЭ в присутствии ряда органических ингибиторов холинзстеразы, установлен тип ингибирования. Собран банк данных, позволяющих всесторонне оценить погрешности при работе биохимического сенсора и провести метрологическую аттестацию данного нестандартного средства измерения. Показана возможность разработки еще одного варианта иммуноферментного сенсора для качественной и количественной оценки содержания вируса сибирской язвы. Оценены погрешности и намечены пути их уменьшения при работе с биохимическими сенсорами как нестандартными средствами измерения. Проведена сравнительная оценка погрешностей, возникающих при работе ферментного и иммуноферментного сенсоров.

Практическая значимость. Практическая значимость работы вытекает из тех методик анализа с использованием амперометрического холинэстеразного биосенсора, которые разработаны и предложены для количественного анализа следовых количеств пестицидов в различных объектах окружающей среды. Предложенные методики обладают высокой чувствительностью Сдля фосфорорганических соединений с >Р=0 связями - на уровне до 2,0.10 моль/л, а для хлорсодержащего пес тицида 2,4-0 до 6,5. Ю^^моль/л), экспрессностью и простотой исполнения с использованием доступной аппаратуры. Разработка иммуноферментного сенсора для определения вируса сибирской язвы с учетом предыдущих исследований позволила наметить общие принципиальные пути для разработки аналогичных систем для диагностирования широкого крута соединений, вступающих в реакции биоспецифического взаимодействия. Выявлены различные виды погрешностей при работе амперометрического биосенсора как нестандартного средства измерения, оценен их вклад в суммарную погрешность измерений. Разработаны соответствующие рекомендации по избежанию ряда ошибок при работе с данным нестандартизированным средством измерения. Подобраны более оптимальные условия для работы холинэстеразного биосенсора.

На защиту выносятся: - количественные характеристики кинетических параметров реакции

гидролиза субстрата холинэстеразы в присутствии и в отсутствие ингибиторов холинэстеразы;

- разработанные методики по определении некоторых хлорсодержащих

пестицидов, фосфорорганических соединений с -Р=0 и -P=S связями, а также пестицидов группы 1,3,5-триазинов.

- вариант качественного и количественного определения вируса сибирской язвы с использованием нового иммуноферментного электрода на основе иммобилизованной холинэстеразы и антител к вирусу сибирской язвы;

- оценка выявленных погрешностей и возможности их уменьшения при работе с биохимическими сенсорами как нестандартными средствами измерения.

Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с координационным планом РАН по направлению 2.20.1. Сразделы 2.20.2.1. , 2.20.4.7.) и грантом Российского фонда фундаментальных исследований "Реакции биоспецифического взаимодействия в вольтамперометри-ческом анализе" (номер проекта 94-03-09265).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и об-обсуждались на IV Всесоюзной конференции "Электрохимические методы анализа"(г.Москва, 1994г.), конференции "Химические сенсоры" (г.Санкт-Петербург, 1993г.), International conference "Quality analytical control" (Italy, Rome, 1994), на 5-см симпозиуме по кинетике в аналитической химии Сг.Москва, 1995г.), Symposium on ecological chemistry (Chisinau, Moldova, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Из них 4 статьи и 6 тезисов докладов на Всесоюзных и международных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и содержит 9 рисунков, 31 таблица и список литературы из 146. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы, 5 приложений.

В первой главе рассмотрены современные варианты амперомет-рических биосенсоров, проанализированы литературные сведения по созданию амперометрических биосенсоров на основе различных ферментных систем и иммуноферментных сенсоров. Рассмотрены электрохимические реакции, лежащие в основе детекции аналитического сигнала.

Во второй главе рассмотрены некоторые основы хемометрики в приложении к аналитическим определениям.

В третьей главе формулируются поставленные задачи, описывается аппаратура, объекты исследования, условия эксперимента и обработка экспериментальных данных.

В четвертой главе представлены экспериментальные данные по изучению ингибирующего действия некоторых физиологически активных веществ, кинетические параметры реакций ферментативного катализа в присутствии изученных пестицидов. Приводятся разработки нового амперометрического иммуноферментного сенсора для диагностики сибирской язвы. Оценены аналитические возможности разработанных методик анализа.

Пятая глава посвящена метрологическим аспектам работы с ам-перометрическим холинэстеразным биосенсором. Оценены погрешности при изготовлении различных вариантов биохимических сенсоров, методик определения удельной активности иммобилизованной холинэсте-разы различными методами Свольтамперометрия, потенциометрия). Проведена сравнительная оценка этих погрешностей. Оценены погрешности методик определения изученных пестицидов и намечены пути их уменьшения при работе с данным нестандартным средством измерения.

Экспериментальная часть

Осцилловольтамперометрические измерения проводили на поля-рографе ПО-5122: модель 03. Рабочим электродом служил холинэсте-разный биохимический сенсор, состоящий из стационарного ртутно-пленочного электрода с серебрянной подложкой и иммобилизованной холинэтеразой СХЭ). В качестве матричного материала для иммобилизации использовали образцы нитроцеллюлозы с различным процентным содержанием азота. Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод. Все измерения проводили при 25±0,2°С. Использовали ХЭ СКФ 3.1.1.8) с активностью 110 АЕ/мг. В качестве субстрата ХЭ применяли перекристаллизованный иодид бутирилтиохолина СБТХИ; S). В качестве объектов исследования применяли пестициды: глифосат, трихлорметафос, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, атразин и си-мазин. Использовали также специфичные к вирусу сибирской язвы иммуноглобулины G (IgG) с различными степенями очистки и активностями; вирус сибирской язвы с содержанием белка 100 мкг/мл;

очищенный препарат вируса крапчатости гвоздики, очищенные иммуноглобулины в, специфичные к вирусу сибирской язвы.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО БИОХИМИЧЕСКОГО СЕНСОРА В ОПРЕДЕЛЕНИИ НЕКОТОРЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В качестве аналитического сигнала биохимического холинэстеразного биосенсора использовали величину катодного пика при потенциале - 0,55 В, которая отвечает восстановлению образующегося продукта ферментативного гидролиза серосодержащего субстрата ХЭ -БТХИ Св области концентраций от 2.10 до 1.10~^моль/л) с материалом электорода. Такое взаимодействие обеспечивает наличие самого регистрируемого сигнала и дополнительное концентрирование электроактивного вещества на электроде, что увеличивает аналитический сигнал.

Хорошие эксплуатационные характеристики биочувствительной части мембраны из нитроцеллюлозы с включенной ХЭ позволяют использовать ее в вариантах биосенсоров с другими трансдьюсерами,

в частности, с иокоселективным полевым транзистором.

Кинетические параметры ферментативной реакции гидролиза БТХИ в присутствии иммобилизованной холинэстеразы и пестицидов, определение их остаточных количеств В присутствии изучаемых нами пестицидов величина тока пика изменялась обратно пропорционально их концентрации, что указывает на их ингибирующий эффект. По данным вольтамперометрических измерений определены кинетические параметры реакций ферментативного гидролиза БТХИ, такие как кажущиеся константы Михаэлиса, исходная и эффективная максимальные скорости реакций СУ х), каталитическая константа и константа ингибирования. Для их определения использовали интегральный анализ полной кинетической кривой и линеаризацию экспериментальных данных в двойных обратных координатах С1/8, 1/4). Использование относительных данных вместо абсолютных величин в случае полной кинетической кривой С начальной концентрации субстрата, начального времени реакции, абсолютной концентрации продукта и т.д.3 повышает точность результатов определения кинетических характеристик.

Полученные данные показали, что ингибиторы конкурентного С глифосат) и смешанного С трихлорметафос,атразин, симазин) типов оказывают более сильное ингибирущее действие на иммобилизованную ХЭ. Наименьший ингибирующий эффект оказывает хлорсодержащий пестицид 2,4-0.

Полученные значения К^ и р1д0 позволили оценить сродство различных ингибиторов к иммобилизованной ХЭ и силу ингибиругадего эффекта изученных пестицидов Стабл. 1).

Таблица 1

Константы ингибирования ^ и р!^ некоторых ингибиторов ХЭ

Ингибитор К|,моль/л Р*50

Глифосат 1,11.10"9 6,74

Трихлорметафос 1,28.10"8 5,68

2,4 - Б 5,34.10"7 4,06

Симазин 4,25.10"8 5,18

Атразин 4,05.10~8 5,13

Знание типа ингибирования позволило подобрать рабочие условия проведения реакции. Для достижения наибольшей чувствительности данной фермент-субстратной системы к ингибиторам, действующим по конкурентному типу, возможно использовать меньшие концентрации субстрата. Уменьшение концентрации субстрата на два порядка позволило снизить сн примерно на порядок для глифосата Ссд = 2,0.Ю"^ моль/л). И в случае смешанного ингибирования уменьшение концентрации субстрата оказывается полезным.

Анализ данных табл. 2 показывает, что возможно определение изученных пестицидов в широком концентрационном диапазоне с низкими нижними границами определяемых содержаний на концентрационных уровнях ПДК и ниже. Это создает условия для использования ам-перометрического БС на основе ИХЭ для контроля остаточных количест этих соединений как в продуктах питания, так и в сельскохозяйствен ной продукции.

Подобные определения возможны в системах, содержащих только

Таблица 2

Аналитические возможности определения пестицидов с помощью амперометрического биохимического датчика на основе

иммобилизованной холинэстеразы

Пестицид Интервал определ. конц-ций, моль/л Уравнение гра-дуировочного графика г Сн, моль/л (мг/мл) ПДК для воды (гигиен) мг/мл

Глифосат 1.10~6-2.10"13 У=(0,36±0,01)Х+ (4,76±0,10) 0,9970 2,0.10~13 (1.18. Ю-11) 0,1

Трихлор-иетафос 1.10"6-1.10"13 У=(1,65±0,17)Х+ (0,48±0,04) 0,9778 5,1.10-13 (1.76. Ю-11) 0,02

2,4-0 1.10~е-1.10'12 У=(0,88±0,20)Х+ (0,63±0,03) 0,9959 6,5.10~12 (2,94.10"10; 0,002 В продуктах дет.питания недопустимо

Симаэин 1Лй"4-1.10'12 У=С0,92±0,09)Х+ (0,44±0,01) 0,9987 7,5.10"12 (3,72.10"10) Недопустимо

Атразин 1.10"4- 1. ю-12 У=(0,13±0,20)Х+ (0,47+0,04) 0,9799 4,3. КГ1* (1,99.10~10; 0,2

отдельный пестицид. При одновременном присутствии•нескольких пестицидов получаем интегральную оценку их содержания в анализируемом

образце. Однако анализ изменения величины аналитического сигнала в зависимости от условий проведения определений (время контакта пестицида с биосенсором, действие различных по природе реактивато-ров) позволяет сделать предположения о природе (обратимые, необратимые) присутствующих в растворе ингибиторов.

- 10 -

Изучение возможности комбинации биокаталитических и иммунологических реакций в сочетании с вольтамперо-метрическим методом регистрации аналитического сигнала Комбинация биокаталитических и иммунологических реакций в сочетании с высокочувствительными методами регистрации аналитического сигнала позволяет находить, рекомендовать и обосновывать условия получения высокоселективного максимального аналитического отклика на отдельные соединения, необладающие электрохимической активностью.

Разработан новый вариант амперометрического иммуноферментногс сенсора для диагностики сибирской язвы. Введение в состав биосенсорной части одного из компонентов биоспецифического взаимодействия - специфических антител против вируса сибирской язвы, позволил регистрировать в исследуемом растворе другой компонент этого взаик действия - антиген.

Установлено, что включение помимо ХЭ в состав биосенсорной части антител незначительно сказывается на каталитической активное и Судельная активность биочувствительной части сенсора до модификг ции С0,32*0,03), а после модификации (0,28±0,02) мкмоль/мин.мг).

Таблица 3

Кинетические параметры реакций гидролиза БТХИ в присутствии биочувствительной части ферментного СИХЭ) и иммуноферментного сенсоров СИХЭ и иммобилизованные Ат)

Сп=5, Р= 0,95, Бг= 0,05 - 0,30)

Биокомпоненты, вхо дящие в соо-тав матрицы СБТХИ' моль/л ^Скаж)"105' моль/л УмСкаж)Л°7, моль/л кат, -1 сек

ХЭ 9.10"4 0,5±0,1 10,3 ¿0,6 0,523

1.10"3 0,8±0,2 12.8 ±0,6 0,654

2.10"3 1,2±0,2 15,4 ¿0.7 0,785

ХЭ + Ат 9.10"4 0,6±0,2 11,3 ±0,7 0,576

1.10"3 0,8*0,2 13,8 ±0,9 0,706

2. Ю-3 . 1,4±0,3 16,6 ±0,8 0,845

- и -

Оценка кинетических характеристик реакции гидролиза БТХИ в присутствии ИХЭ и биочувствительной части иммуноферментного сенсора, с включенными в нее антителами, для различных концентраций субстрата показывает, что включение антител в биосенсорную часть датчика незначительно изменяет величину кажущейся константы Михаэ-лиса Сем. табл. 3).

Оценены аналитические возможности разработанной методики анализа для определения сибиреязвенной бациллы. Линейная часть зависимости между величиной тока в пике и концентрацией антигена в растворе использовали в качестве градуировочного графика для определения концентраций антигена в растворе Суравнение У=(8,09+0,07)Х -(0,25+6,40Е4), г=0,9986) Некоторые из полученных результатов представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты определения сибирской язвы с помощью разработанного иммуноферментного сенсора

Сп = 5, Р = 0,95, Со = 2.10~3моль/л)

Введено,мкг/мл Найдено,мкг/мл 2г

150,0 140,3+25,9 0,186

100,0 90,4+22,8 0,265

50,0 45,6+13,1 0,308

10,0 10,2+ 3,5 0,352

Нижняя граница определяемых содержаний вируса составила 1,0 мкг/мл, время анализа 15 минут.

Линейный характер взаимодействия антиген-антитело в координатах Скэтчарда указывает на однородность используемых антител. Значение константы связывания (К = (1,08+0,03). 10®М~Ч, находится

а

в оптимальном интервале значений констант связывания. Полученные результаты указывают на то, что в данном случае реализуются условия, обеспечивающие достаточную чувствительность ИФА.

- 12 -

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАбОТЫ С АМПЕРО-МЕТРИЧЕСКИМ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫМ БИОСЕНСОРОМ Совершенствование способов определения физиологически активных веществ привело к разработке новых средств измерения. Данный биосенсор относится к нестандартным средствам измерения, так как изготавливается пока в единичных экземплярах при выполнении научно-исследовательских работ.

Использование биосенсора для анализа реальных объектов диктует необходимость оценки погрешностей, возникающих при работе с ними. Особенностью подобных нестандартных средств измерения являете то, что методики, по которой они работают, заложены в них уже самим устройством биосенсора. Таким образом, именно устройство биосенсора обуславливает операции и их последовательность при выполне нии того или иного определения.

Оценка погрешности при изготовлении биосенсорной части нестандартного средства измерения Проведена оценка погрешности изготовления ферментной и имму-ноферментной частей датчика. Погрешность при изготовлении имму-ноферментной части составила 3,67%, что больше значения погрешности С2,56%), возникающей при изготовлении биочувствительной части амперометрического холинэстеразного биосенсора. Это связано с дополнительными аналитическими операциями по введению антител. Оценка погрешности методики определения удельной активности иммобилизованной ХЭ методами вольтамперометрии и потенциометрии

Суммарная погрешность методики определения удельной активности иммобилизованной ХЭ вольтамперометрическим методом для биочувст вительной части датчика составила 5,41%, а для иммуноферментной части - 7,03%. В отличии от вольтамперометрического метода определения удельной активности иммобилизованной ХЭ, в методе потенцио-метрического титрования используется иная измерительная аппаратуре и условия проведения определения СрН, концентрация субстрата). Сук марная погрешность методики определения удельной активности иммоб* лизованной ХЭ методом потенциометрического титрования составила 7,80%. Это значение является большим по сравнению с суммарными по1 решностями методики определения удельной активности иммобилизован* ХЭ вольтамперометрическим методом, что объясняется неоптимальными

условиями проведения определений, при более низком значение рН(7,55). Оценка некоторых метрологических характеристик методик определения пестицидов-и вируса сибирской язвы-с помощью разработанных нестандартных средств измерения Расчет погрешности методик определения физиологически активных веществ проводили в соответствии с ГОСТом 8.505-84, ГОСТом 12.1.016-79. В качестве предписанных характеристик погрешности результатов анализа пестицидов были приняты границы интервала, в котором погрешность результатов анализа находится с заданной доверительной вероятностью Р = 0,95 при условии, что распределение отвечает нормальному закону. Проверку нормальности распределения результатов, полученных с амперометрическим холинэстеразным биосенсором, проводили расчетом - критерия Пирсона. Значения характеристик погрешности результатов анализа определяли расчетным способом по установленным значениям характеристик случайных и систематических составляющих номенклатуру метрологических показателей.

При сопоставлении случайных и неисключенных систематических погрешностей для изученных соединений получено неравенство $/5с > 8. Это позволяет характеризовать погрешность результата измерения только неисключенными систематическими погрешностями, пренебрегая случайными.

Полученные результаты позволяют считать, что при использовании разработанного амперометрического холинэстеразного биосенсора

—А -19

в области концентраций от п. 10 до п.10 моль/л возможно проводить однократные измерения, результаты которых будут вполне приемлемыми. Проведение однократных измерений при решении конкретных аналитических задач позволяет продлить время действия биосенсора и сэкономить материалы, необходимые для его изготовления.

В отсутствие стандартных образцов пестицидов для оценки значимости систематической погрешности использовали способы удвоения аналитической навески и добавок. Полученные данные приведены в табл. 5.

При определении пестицидов глифосата и трихлорметафоса систематическая погрешность незначима во всем исследуемом интервале концентраций, поскольку выполняется соотношение: а < и !в-1|< 10 95-д-2Е. В случае симазина и 2,4-Б постоянная составляющая систематической погрешности значима на уровне пикомолей:

Таблица 5

Результаты оценки систематической погрешности определения пестицидов с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора Сп^=П2=Пз=5; 1тайл=2,31; Р=0,95)

Пестицид с, жг/мк с1' МГХ/М.К с2, мкт/мл \ а в 2а 2в 1 Л г .8_ С?5;& В

Глифосат 1,0 5,22 10,53 6,22 0,09 0,98 0,27 0,07 0,21 0,068

2,4-0 0,05 0,09 0,19 0,14 0,01 0,99 0,0005 0,009 0,001* 0,207

Симазин 0,2 0,50 1,02 0,71 0,02 1,05 0,008 0,03 0.018Г 0,069

Трихлор-

метафос 0,5 4,85 9,784 5,36 0,04 1,02 0,15 0,05 0,35 0,115

* - наличие постоянной составляющей систематической погрешности

а * 95'8"^а" из причин появления систематической погреш-

ности может быть неспецифичность взаимодействия симазина и 2,4-Б с биочувствительной частью сенсора. Эти же обстоятельства приводят и к завышенной погрешности в случае этих же соединений, возни кающей при построении градуировочного графика. Таким образом боле высокую точность анализа можно ожидать при определении специфичны ингибиторов холинэстеразы типа такого фосфорорганического соедине ния как глифосат.

Для выявления систематической погрешности часто использовали прием сопоставления средних результатов предлагаемого способа с данными, полученными по стандартной методике. Известно, что нормативными документами для определения большинства пестицидов рекомендован хроматографический метод. Поэтому нами проведено сопоставление результатов, полученных с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора и метода газожидкостной хроматографии Данные представлены в табл. 6.

Сравнение двух дисперсий с помощью Г-критерия показало, что они значимо не отличаются друг от друга, т.е. являются равноточными. Кроме того при определении глифосата, симазина, 2,44) и

Таблица 6.

Результаты определения остаточных количеств пестицидов в растениях Сп=5; Р=0,95; гтабл=2,78; Гтабл=6,4) "

Пестицид Биосенсор Хроматография р расч 'расч

Найдено, (С * Б), мм/м|ч Найдено, (¿¿о^ммулл 2г

Глифосат 0,93±0,09 0,08 0,95±0,08 0,07 1,3 1,59

Симазин 0,12±0,02 0,13 0,10*0,02 0,16 1,5 1,99

2,4-0 0,56*0,02 0,08 0,50±0,03 0,05 4,0 2,49

Трихлор-

метафос 0,28*0,03 0,08 0,32±0,02 0,05 2,3 1,88

трихлорметафоса с помощью биосенсора и методом хроматографии соблюдается условие tpacч < 1:та(3л> что свидетельствует о случайном

характере различия средних величин определяемых концентраций. Отсюда можно сделать еывод об отсутствии значимой систематической погрешности.

Рассмотренные примеры убедительно свидетельствуют об относительном характере статистических оценок значимости и их явной зависимости от значимости и диапазона рабочих концентраций.

В общем случае погрешность определения с помощью рассматриваемых нестандартных средств измерения не превышает 13%.

Для расчета суммарной погрешности методики определения вируса сибирской язвы с помощью амперометрического холинэстеразного иммуносенсора оценивали значения неисключенных систематической и случайной погрешностей. Суммарная погрешность методики определения вируса сибирской язвы составила 12,77% Сем. табл.4).

ВЫВОДЫ

1. Определены кинетические параметры ферментативных реакций с участием ИХЭ в присутствии и в отсутствие ряда органических ингибиторов. Трихлорметафос, атразин и симазин ингибируют ХЭ по

двухпараметрически согласованному Сили смешанному) типу инициирования фермента, для 2,4-D характерен тип псевдоингибирования. Ингибирующая способность изученных соединений изменяется в ряду глифосат трихлорметафос атразин симазин 2,4-D.

2. Разработаны методики определения глифосата, трихлорметафоса, 2,4-D и пестицидов группы 1,3,5 - триазинов в области концентраций от 10~3 до 10 моль/л с помощью амперометрического холин-эстеразного биосенсора с сн для глифосата 1,18. Ю'^мг/мл, для трихлорметафоса 1,76.10~^мг/мл, для 2,4-D 2,94. Ю-10 мг/мл,

для симазина 3,72. 10"^мг/мл и для атраэина 1,99.10"^мг/мл. Собран банк данных Собьем выборки п = 50), позволяющий всестороне оценить погрешности и провести метрологическую аттестацию данного нестандартного средства измерения.

3. Разработан вариант иммуноферментного анализа с помощью имму-ноферментного сенсора, биочувствительная часть которого модифицирована введением иммуноглобулинов кролика CIgG) для определения вируса сибирской язвы в интервале концентраций от 5 до 200 мкг/мл и сн = 1 мкг/мл.

4. Линейный характер графика Скэтчарда указьюает на моноклональ-ность антител IgG к вирусу сибирской язвы. Значение константы связывания гетерогенного иммунного комплекса [IgG-вирус сибирской язвы] Ка = (1,08±0,03).108М~*.

5. Оценены погрешности при изготовлении различных вариантов биохимических сенсоров, методик определения удельной активности иммобилизованной холинэстеразы различными методами. При вольташе-рометрическом измерении удельной активности суммарная погрешность методики составила 5,41%, а при потенциометрическом - 7,80%.

6. Оценены метрологические характеристики методики определения вируса сибирской язвы с помощью разработанного иммуноферментного электрода. Суммарная погрешность данной методики определения составила 12,77%.

7. Оценены различные виды погрешностей при определении фосфор-

Сглифосат), хлор- С2,4-D) содержащих пестицидов и соединений группы 1,3,5 - триаэинов Ссимазин и атразин) с помощью амперометрического холиэстеразного биосенсора как нестандартного средства измерения. Наибольший вклад в суммарную погрешность методики вносит погрешность градуировочного графика. Погрешность определения спе-

цифичных ингибиторов меньше, чем погрешность определения неспецифичных к данному ферменту ингибиторов.Подобраны рабочие условия работы с такими средствами измерения, разработаны соответствующие

рекомендции по избежанию ряда погрешностей при работе с такими устройствами.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Аналитические возможности биосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы при определении пестицидов./Э.П.Медян-цева, Ли Фа-шень, О.В.Федосеева, Г.К.Будников //Казанский ун-т. Казань, 1992. - Деп. в ОНШТЭХИМ 22.04.92, N187 - XII-92.

2. Медянцева Э.П., Ли Фа-шень, Федосеева 0.В. , Будников

Г.К., Скроделис 0.Э., Зейдака А.А. Определение вируса крапчатос-ти гвоздики с помощью иммуноферментного электрода //Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т.29, N4. - С. 619 -624.

3. Решетилов А.Н., Федосеева 0.В., Елисеева Т.П., Сергеев Ю. В., Медянцева Э.П., Будников Г.К. Влияние различных факторов на отклик биохимического сенсора на основе иммобилизованной на полевом транзисторе холинэстеразы //Журн.аналит. химии. - 1994. -Т. 50, N4. - С. 453-456.

4. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Федосеева О.В. Роль биохимических методов анализа в системе подготовки современного химика-аналитика //Журн. аналит.химии. - 1995. - Т. 50, N4. -

С. 375-377.

5. Медянцева Э.П., Бабкина С.С., Вертлиб М. Г., Федосеева О.В. , Будников Г.К. Биосенсоры на основе иммобилизованной холинэстеразы в иммуноферментном анализе //Тез.докл.конф. "Химические сенсоры". - Санкт-Петербург, 1993. - С. 263.

6. Федосеева О.В., Кремлева Н.В. Оценка метрологических характеристик методик определения некоторых пестицидов с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора //Тез.докл. IV конф. "Электрохимические методы анализа". - Москва, 1994. -4.II. - С. 214.

7. Babkina S. , Medyantseva Е., Fedoseeva 0. , Kremleva N. The évaluation of metrological characteristics of the procédures of détermination of some pesticides by means of cholinesterase amperometric biosensor //Abstr. of the conférence "Quality ana-

lytical control and reference materials life science". - Rome, Italy. - 1994. - P. 58.

8. Medyantseva E.P., Vertlib M.G., Fedoseeva 0.V., Babkina S.S., Budnikov H.C. , Eremin C.A. New approach to selective pesticide determination with amperometric Cholinesterase biosensor // Abstr. of the 5th International Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry. - Moscow, Russia. - 1995. - P. 16.

9. Medyantseva E.P. , Vertlib M. G., Tyshlek M.P. , Fedoseeva 0.V., Budnikov H. C. , Babkina S.S., Eremin C. A. The use voltam-metrically monitored immunochemical reaction for selective assay of pesticides //Abstr. of Symposium on ecological chemistry. -Chisinau, Moldova. - 1995. - P. 216.

10. Medyantseva E. P., Babkina S.S., Vertlib M. G., Fedoseeva O.V., Budnikov H. C. Biosensors based on immobilized Cholinesterase in enzyme immunoassay // Abstr. of the conference "Sensor techno". - St. Peterburg, 1993. - P. 108.