Групповое и индивидуальное иммунохимическое определение некоторых биологически значимых соединений с амперометрическим детектированием тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

>

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВАРЛАМОВА РЕГИНА МАРКОВНА

ГРУППОВОЕ И ИНДИВИДУАЛЬНОЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ии^и71288

Казань -2007

003071288

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им А М Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им В И Ульянова-Ленина" Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор ЭП МЕДЯНЦЕВА

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор СЮ ГАРМОНОВ

кандидат химических наук, доцент, М П КУТЫРЕВА

Ведущая организация Казанский государственный

технический университет им А Н Туполева

Защита диссертации состоится «31» мая 2007 г. в 14 00 на заседании диссертационного Совета К 212 081 04 по химическим наукам Казанского государственного университета по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, 18, Химический институт им А М Бутлерова, Бутлеровская аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н И Лобачевского Казанского государственного университета

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, 18, КГУ, Служба аттестации научных кадров

Автореферат разослан «. » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совета, <

кандидат химических наук У Шайдарова Л Г

Актуальность темы Разработка простых, экспрессных и в то же время чувствительных и селективных способов определения широкого круга биологически активных соединений - задача, которая была, есть и будет актуальной еще долгое время

Зачастую, на стадии предварительных испытаний, отсутствует необходимость определять конкретное соединение и можно ограничиться информацией о наличии соединений определенного класса, т е получить сигнал «есть-нет», например, относительно потенциальных загрязнителей в объекте анализа Это может послужить основанием для оперативного принятия соответствующих природоохранных мер и лишь затем, при необходимости, выявить конкретный загрязнитель, что всегда сопряжено с дополнительными материальными и временными затратами

Концепция обобщенных показателей и группового анализа, характеризующих состояние анализируемых объектов, которые в ряде случаев предшествуют определению индивидуальных соединений, находит все больше сторонников среди исследователей При гораздо меньших затратах групповой анализ позволяет получить результат, который можно использовать в практических целях и который, в целом, определяет общую стратегию дальнейшего исследования

Один из путей решения этой проблемы - разработка новых способов анализа, новых тест-систем, которые в зависимости от принципа действия, используемых химических реагентов, состава, условий проведения определений и способа получения информации, позволяют найти подходы к анализу объектов неизвестного состава, что по-прежнему составляет одну из сложнейших задач аналитической химии

Цель исследования- разработка подходов и методических приемов для создания комбинированного способа определения класса (группы) биологически активных веществ (пестициды, лекарственные препараты) и последующего определения индивидуальных соединений в сложных по составу объектах, путем иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (сорбентов) с последующим определением амперометрическими биосенсорами

Научная новизна Предложен методический подход, основанный на иммуноэкстракции сначала группы соединений одного класса (групп-специфичный анализ), а затем иммуноэкстракции отдельных представителей этого класса соединении (индивидуальный анализ), осуществляемый за счет сочетания специфичности действия иммобилизованных сорбентов различной природы (антитела, полимеры с молекулярными

Научным консультантом работы является академик РАЕН и МАНВШ, доктор химических наук, профессор Будников Г К

отпечатками) и амперометрических биосенсоров Рассчитаны количественные характеристики процесса ичмуноэкстракции пестицидов и антидепрессантов разных классов с помощью иммобилизованных антител Оценена возможность использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками как альтернатива иммобилизованным антителам для определения гербицида 2,4-Д Показана возможность концентрирования, исходя из максимальной сорбционной емкости иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками и величины отклика холинэстеразного биосенсора

Для реализации предлагаемого способа определения антидепрессантов разработаны новые амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной моноаминоксидазы, печатных платиновых и стеклоуглеродного электродов, в основу функционирования которых потожены сочетание реакции окисчительного дезаминирования биогенных аминов и эчектрохимического окисления продуктов их ферментативной реакции Показана возможность оценки количественного содержания антидепрессантов разных классов по их ингибирующему действию на иммобилизованную моноаминоксидазу Рассчитаны кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в отсутствие и в присутствии различных концентраций ингибиторов моноаминоксидазы

Предложен алгоритм проведения иммуноэкстракционных определений биологически значимых веществ в образце неизвестного состава с помощью иммобилизованных антител разной специфичности действия и амперометрических биосенсоров

Практическая значимость. Предложен комбинированный способ анализа, представляющий собой новое решение задачи селективного и высокочувствительного определения группы соединений и (или) отдельного соединения в сложной по составу смеси, в присутствии родственных по структуре и свойствам соединений, что невозможно с использованием других приемов и подходов Разработана методика иммунохимического определения как группы триазиновых гербицидов, так и их отдельных представителей в продуктах питания, гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в молоке с использованием полимера с соответствующими молекулярными отпечатками

Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров Проведена апробация разработанных биосенсоров при определении лекарственных соединений (пиразидола и флуоксетина) в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови

Показаны перспективы практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем для группового и

индивидуального иммуноэкстракционного определения пестицидов, лекарственных соединений с амперометрическим детектированием На защиту выносятся.

• Результаты изучения сочетания ичмуноэкстракции группы триазиновых гербицидов, нескольких антидепрессантов с помощью соответствующих иммобилизованных Ат разной специфичности действия, а также отдельных представителей определяемых классов соединений с последующим детектированием амперометрическими биосенсорами (хочинэстеразным, моноаминооксидазным)

• Количественные характеристики и аналитические возможности иммуноэкстракции (сорбции, десорбции) и концентрирования с помощью иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками

• Модели амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе различных физических преобразователей - платиновых печатных и стеклоуглеродного электродов для определения антидепрессантов разных классов

• Кинетические параметры реакции окисчительного дезаминирования дофамина в присутствии антидепрессантов

• Константы образования иммунных комплексов и оценка перекрестной реактивности используемых антител к антидепрессантам

• Методики определения группы триазиновых пестицидов, отдельных представителей гербицидов триазинового ряда, гербицида 2,4-Д в пищевых продуктах, антидепрессантов в лекарственных формах (пиразидол, флуоксетин) и в биологических жидкостях (дезипрамин)

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И П Алимарина "Аналитика России" (Москва, 2004), II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием "Электроаналитика-2005" (Екатеринбург, 2005 г), Международной научной конференции "Химия, химическая технология и биотехночогия на рубеже тысячелетий" (Томск 2006), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (2006), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века", Российской школе -конференции молодых ученых "Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино 2006)

Работа проводилась при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 03-03-33116

Публикации По теме диссертации публиковано 17 работ Из них 5 статей (2 из них включены в перечень ВАК) и 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях 2 статьи приняты к печати

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 14 рисунков Работа состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы, включающего 163 ссылок

Первая глава литературного обзора посвящена современным методам определения триазиновых и хлорорганических пестицидов твердофазной экстракции, ичмунохимическому анализу, применению сенсорных устройств и полимеров с молекулярными отпечатками

Во второй главе литературного обзора описаны современные методы анализа лекарственных соединений на примере антидепрессантов

Третья глава содержит постановку задачи, методы и условия эксперимента Четвертая глава посвящена разработке принципов комбинированного способа анализа за счет сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов с помощью иммобилизованных Ат, их отдельных представителей с последующим детектированием амперометрическим холинэстеразньм биосенсором

В пятой главе представлены результаты использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками для определения гербицида 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кистоты, как альтернатива иммобилизованным антителам

В шестой главе нашли отражение результаты, связанные с дальнейшим развитием описанных ранее (глава 4) подходов и приемов на примере иммуноэкстракционного определения антидепрессантов Представлены результаты разработки новых амперометрических биосенсоров на основе иммобичизованной моноаминоксидазы и пленарных платиновых или стеклоуглеродного электродов, их аналитические возможности Описаны методики определения отдельных антидепрессантов в фармпрепаратах и биологических жидкостях

Седьмая глава посвящена перспективам практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объектов исследования использовали хроматографически чистые симазин, атразин, пропазин, 2,4 - Д, дезипрамин, имипрамин, нортриптилин, флуоксетин пиразидол,

соответствующие антитела к ним (предоставлены проф С А Ереминым, каф химической энзимочогии МГУ) и полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) на 2,4-Д (предоставлены проф С Г Дмитриенко, каф аналитической химии МГУ) Для определения нескольких представителей одного класса соединений использовали или полиспецифичные Ат (антидепрессанты), или смесь Ат против отдельных соединений (триазиновые гербициды) Применяли бутирилхолинэстеразу (БуХЭ) сыворотки крови лошади с активностью ЗОАЕ/мг и моноаминоксидазу из мозга человека с активностью 0 075 мкм/минхмг (предоставлена доц А Н Фаттаховой, каф биохимии КГУ) В качестве субстратов использовали бутирилтиохолин иодид (БТХИ) и 0 5% раствор дофамина Дм иммобилизации моноаминоксидазы в качестве матрицы использовали пищевой желатин марки П - И Применяли промышленно изготовленные нитрат целлюлозные (НЦ) мембранные фильтры фирмы "Сарториус", Германия Для иммобилизации ПМО использовали нитрат целлюлозу типа колоксилин Применяли 12 5%-ный раствор глутарового альдегида и сывороточный альбумин человека (ЧСА)

Основой холинэстеразных и моноаминоксидазных биосенсоров служила система, состоящая из птатинового, вспомогательного электродов и электрода сравнения, полученная на керамической подложке методом печатных технологий (фирма BVT Technologies, Брно, Чехия) Объем рабочей ячейки системы составлял 200 мкл Измерения проводили с помощью многоцелевого электрохимического детектора "МЕВ" с компьютеризированным управлением

Отдельные контрольные опыты проводили с использованием стационарных платинового, ртутно-пленочного с серебряной подтожкой, стеклоуглеродного электродов на осциллографическом почярографе ПО-5122 модели 03 и вотьтамперометрическом анализаторе "Экотест-ВА" (Россия)

ВОЗМОЖНОСТИ ГРУППОВОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИММУНОЭКСТРАКЦИОННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЗИНОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ Для оценки возможности проведения группового анализа триазиновых пестицидов были использованы модельные растворы, в состав которых входили симазин и атразин при различных соотношениях (1 1, 1 10, 10 1), в различных диапазонах концентраций и холинэстеразные биосенсоры на основе печатных платиновых электродов В основе формирования аналитического сигнала холинэстеразного биосенсора лежит сочетание реакции ферментативного гидротаза БТХИ и электрохимической реакции окисления продукта гидролиза субстрата, что регистрируется при потенциале +0 55 В

Уменьшение величины аналитического сигнала в присутствии изучаемых гербицидов указывает на ингибирующее действие их на ИХЭ, входящую в состав биочувствительной части амперометрического биосенсора на основе печатных электродов, что наблюдается в определенном диапазоне концентраций (табл 1)

Таблица 1

Аналитические возможности определения триазиновых гербицидов холинэстеразными биосенсорами на основе планарных платиновых электродов

Гербициды (соотношения концентраци) Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение градуировочной зависимости I* =А + В1ёСи коэффициент корреляции г % ингиби рования

А±§ (В±5)х(-1ё С) Я

Симазин 1х10"7- 5x10 12 (107±3 5) (-9 1+0 4)х(-1ё С) 0 9947 32 4±0 6

Атразин 1х10"6- 1x10 10 (33 8±0 9) (-2 6+0 1)х(-1ё С) 0 9984 25±1

(симазин атразин) 1 1 ШО-МхЮ"11 (46 6±1 9) (-4 0±0 2)х(-1Е С) 0 9939 30 0+0 6

(симазин атразин) 1 10 1х10'6- 1хЮ"'° (55 5±0 9) (-4 9+0 1)х(-1ё С) 0 9992 25 4+0 8

(симазин атразин) 10 1 1х10"6- 1x10" (79 1±2 8) (-6 7±0 3)х(-18 С) 0 9953 35±1

*1=(1Д,)*100%

Полученные результаты показывают, что возможно одновременное определение как нескольких представителей гербицидов триазинового ряда, так и их отдельных представителей

Повысить селективность определений можно, используя процессы иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (ИАт), с последующей регистрацией степени протекания биоспецифических взаимодействий с помощью холинэстеразного биосенсора В основу такого определения положены стадии образования и последующего разрушения иммунного комплекса Ат-пестицид

Оценены некоторые параметры, характеризующие физико-химические свойства ИАт, от которых зависит эффективность экстракции (а также, в наших условиях, и концентрирования)

Установлено, что в диапазоне рН от 7 до 8,6 наблюдается практически полное извлечение смеси триазиновых гербицидов из анализируемого раствора даже при однократной иммуноэкстракции (рис 1) Образование иммунного комплекса лучше всего проводить в нейтральной среде при комнатной температуре

На степень извлечения влияет время инкубации ИАт в исследуемом растворе Для образования иммунного комптекса пестицид - ИАт необходимо не менее 5 мин (рис 2), как в

случае определения смеси пестицидов, так и их индивидуальных представителей

Сорбционную емкость (СЕ) НЦ мембраны оценивали, анализируя содержание гербицидов сорбированных ИАт и в равновесном растворе после иммуноэкстракции в оптимальных условиях, меняя количество введенного соединения (рис 3)

Рис 1 Зависимость степени извлечения смеси гербицидов (1 1) (1) и симазина (2) от рН раствора, Сгербицидов = 1 * 10"7 М

Рис 2 Зависимость степени извлечения смеси гербицидов (1 1) (1), атразина (2) от времени образования иммунного комплекса, СгсРбицидо»= 1 * 10 7 М

СЕ 60 ] мкг/см1 50 Н

Характеристики процесса иммуноэкстракции приведены в табл 2

На практически полное извлечение симазина и атразина в выбранных условиях указывает и тот факт, что если в растворе дополнительно к исследуемым соединениям присутствует соизмеримая концентрация пропазина (также представитель группы 1,3,5-триазинового ряда) после иммуноэкстракции всегда наблюдался остаточный ингибирующий эффект

иммобилизованной ХЭ, чего не наблюдалось в его отсутствии

Таблица 2

Характеристики процесса иммуноэкстракции для группового и специфичного анализа

Рис 3 Зависимость сорбционной емкости ИАт от концентрации симазина и атразина в соотношении 1 1 (1), симазина (2), рН 9 05

Коэффициент распределения Степень извлечения изучаемых гербицидов, % Максимальная сорбционная емкость ИАт, мкг/см2

24 - 49 96±4 Групповой анализ Специфичный анализ (симазин)

54,6±0,9 50,4+0,6

Присутствие в анализируемом растворе пестицидов другой группы, в частности, фосфорорганических пестицидов (например, паратиона), являющихся ингибиторами ХЭ,

также позволяет наблюдать остаточный ингибирующий эффект иммобилизованной ХЭ в растворе после иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов, чего не наблюдалось при контрольных экспериментах в его отсутствие

Следует отметить, что вопросы концентрирования при использовании ИАт для извлечения исследуемого соединения на сегодняшний день практически не рассмотрены

Установлено, что наряду с идентификацией группы пестицидов существует возможность концентрирования триазиновых гербицидов из их разбавленных растворов (в области концентраций 10"'°-10"9 М из объема от 25 - 1000 мл) с помощью ИАт как в случае определения отдельных пестицидов, так и их смеси (табл 3) С целью изучения эффективности концентрирования рассмотрена зависимость коэффициента концентрирования от объема анализируемой пробы (см таблЗ) Установлено, что из 10 9 М раствора триазиновых гербицидов возможно концентрирование в 5-200 раз с помощью ИАт Разработаны методики определения как группы триазиновых гербицидов, так и их отдельных представителей с помощью ИАт против триазиновых гербицидов и амперометрического биосенсора на основе печатных электродов в молоке, молочных продуктах и виноградном соке

Для построения градуировочного графика определения триазинов в молоке использовали модельные растворы, приготовленные из сухого молока Затем в молоко вводили определенное количество симазина и атразина Перед стадией иммуноэкстракции образцы молока разбавляли в 10 раз Дальнейшие операции проводили так же, как в случае определения триазиновых гербицидов в водных растворах Правильность определений оценена способом "введено - найдено" (табл 4)

Таблица 4

Определение гербицидов триазинового ряда в модельных образцах молока с испотьзованием иммобилизованных антител и планарных электродов

Введено, моль/л смесь пестицидов (симазин+атразин) Найдено, моль/л смесь пестицидов (симазин+атразин)

5x107 (4 8±0 6)х10"7 0 119

5x10" (4 3+0 6)х108 0 132

5x10 9 (4 6±0 7)х10 9 0 144

Проведенный анализ нескольких образцов молочных продуктов (кефир нежирный, производство Казанского моточного комбината "ВАМИН" и ООО "Эдельвейс-М", г Казань, молоко пастеризованное 2 5% - Казанский молочный комбинат "ВАМИН",

Аналитические возможности концентрирования при определении мнкроколичеств гербицидов (п = 6, Р = 0 95)

Концентрация Объем Концентрация Найдено, Эг Степень Коэффициент

исходного исходного раствора после концентрация концентри концентри

раствора, моль/л раствора, мл концентририрования раствора после

(теоретическая), мл концентрирования рования* рования, К

( х±8), моль/л

Симазин 25 5x10"9 (4 8±0 7)хЮ"9 0 138 5 230

атразин 35 7x10"9 (7 1±0 9)х109 0 120 7 327

1 1 100 2x108 (2 5+0 4)х10"8 0 152 20 948

1х1(Г9 500 1x108 (1 2+0 2)х10~8 0 158 100 4692

1000 2х10"7 (1 8±0 4) хЮ7 0211 200 9493

Симазин- 25 5x10'10 (4 6±0 7)хЮ"10 0 144 5 23 7

1x10"!0 35 7x10"'° (6 7+0 9)х10,с 0 126 7 33 2

100 2х 10"9 (2 4±0 4)х10'9 0 158 20 95 1

500 1х109 (1 1±0 2)х109 0 172 100 470

1000 2x10 8 (2 3±0 5)хЮ"8 0 206 200 950

2,4-Д 25 5x10"'° (5 3+0 7)хЮ"10 0 125 5 1 8

1x10 10 35 7x10'° (6 7+0 9)х10 10 0 127 7 26

100 2хЮ9 (2 2±0 4)х10~9 0 173 20 72

500 1x10 9 (1 4±0 3)х10~9 0 203 100 35 8

1000 2x108 (1 8±0 5)хЮ"8 0 264 200 71 6

* Степень концен грирования Спосле концетрирования / Сисходного раствора

не пастеризованное - Верхнеуслонский район, Татарстан) показал практическое отсутствие в них триазиновых гербицидов (< 10 11 М)

По такому же алгоритму проводилось определение триазиновых гербицидов в виноградном соке

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В НИТРАТ ЦЕЛЛЮЛОЗНУЮ МАТРИЦУ ПОЛИМЕРОВ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

В последнее десятилетие проявляется все возрастающий интерес к новому классу материалов - полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО), что связано с наличием в составе ПМО высокоспецифических центров связывания, комплементарных по размеру, форме, структуре и физико-химическим свойствам различным органическим молекулам

Представляло интерес оценить возможность использования вместо иммобилизованных антител ПМО для определения некоторых пестицидов, на примере определения производных хлорфеноксиуксусной кислоты

Для решения поставленной задачи были получены образцы иммобилизованных в нитрат целлюлозную матрицу ПМО 2,4-Д на основе акриламида путем включения полимеров в состав матричного материала Согласно литературным данным, используемые ПМО обладают селективной сорбционной способностью по отношению к 2,4-Д Наилучшие условия получения иммобилизованных ПМО (ИПМО) представлены в табл 5

Таблица 5

Условия получения иммобилизованных ПМО_

Используемые реагенты Количество реагента

НЦ 0 05 г

Растворители Бутилацетат 1 2 мл

Толуол 0 7 мл

Количество ПМО 0 028 г

Принцип предлагаемого способа определения гербицида основан на процессах сорбции, концентрирования и десорбции определяемого соединения с помощью иммобилизованных ПМО с последующим определением 2,4-Д амперометрическим холинэстеразным биосенсором, поскольку 2,4-Д имеет способность изменять (уменьшать) величину каталитической активности иммобилизованной ХЭ, входящей в состав хочинэстеразных биосенсоров

Сорбцию 2,4-Д проводили в кислой среде (рН=2) при комнатной температуре в течение 60 мин Согласно литературным данным, десорбцию лучше всего проводить в присутствии того растворителя, в котором осуществляли синтез ПМО, а именно, в метаноле Однако было установлено, что НЦ пленка с иммобилизованным ПМО частично растворялась в метаноле,

поэтому десорбцию проводили в растворе 0 01 - 0 1 М КаОН в течение 20 мин

Наблюдается практически полное извчечение 2,4-Д из анализируемого раствора даже при однократной сорбции Степень извлечения гербицида составляет в этих усчовиях не менее 96±3 % Было установлено, что максимальная концентрация, которая может быть сорбирована и, соответственно, определена с помощью полученных образцов ИПМО в наших условиях не превышает 1x10"8 моль/л (табл 6)

Максимальная сорбционная емкость ИПМО составляет 68,3+0,8 мкг/см2 (см рис 4) Некоторые характеристики процессов сорбции, десорбции представлены в таблице 6

Таблица 6

Степень извлечения, % 96±3

Максимальная сорбционная емкость ИАт, мкг/см2 68 3±0,8

Процент перекрестных реакций ПМО 2,4 -Д, % для бензойной кислоты 0 96+0 04

для ацетилсалициловой кислоты <05

для дофамина 1 00+0 02

3 4 5 6

Сг^дхЮ^мг/мя

Рис 4 Зависимость сорбционной емкости ИПМО от концентрации 2,4 - Д, рН 9 05

В работах Дмитриенко С Г с сотр показано, что ПМО 2,4 - Д лучше всего сорбируют то соединение, в присутствии которого они были синтезированы, а также некоторые структурные аналоги этих веществ, в число которых входили другие производные дихчорфеноксиуксусной кислоты, а также фенол и его хлорпроизводные Представляло интерес рассмотреть в этом плане другие структурные аналоги 2 4-Д, а именно бензойную кислоту, ацетилсалициловую кислоту, дофамин (см табл 6) Исходя из структуры этих соединений, нельзя исключить возможность их сорбции на ПМО 2,4-Д Судя по наблюдаемым эффектам, ПМО незначительно сорбируют указанные соединения

Сопоставление свойств иммобилизованных ПМО и полимеров сравнения (ПС) показало, что при использовании иммобилизованных ПС в области концентраций 108-10"пМ 2,4-Д, заметная неспецифическая сорбция наблюдается только при концентрации 10"8 М и выше, которая не превышает 11 % По-видимому, это связано с тем, что ПС не содержат высокоспецифических центров связывания (сайтов мочекулярного распознавания)

Таким образом, неспецифическое связывание 2,4-Д ПС примерно в 10 раз меньше, чем специфическое связывание ПМО с соответствующими отпечатками

Весьма удобно использовать ИПМО и для концентрирования определяемого соединения В частности, показана возможность концентрирования 2,4-Д на уровне концентраций 1x10"'° моль/л в 5 -200 раз (см табл 3)

Область рабочих концентраций в определении 2,4-Д с использованием ИПМО и холинэстеразным биосенсором составила 10 8-10"п М Правильность определений оценена

способом "введено - найдено" (табл 7)

Таблица 7

Определение 2,4-Д с помощью ИПМО и холинэстеразного биосенсора (п -б, Р =0 95)

Введено, моль/л Найдено, моль/л Бг

5x10 8 (5 1±0 6)х10"8 0 112

5x10 9 (4 9±0 7)х10~9 0 136

5x10 ю (5 3±0 8)хЮ'10 0 143

В качестве примера практического использования ИПМО, показана возможность определения 2,4-Д в молоке (табл 8)

Таблица 8

Определение 2,4-Д в модельных растворах и в молоке с помощью иммобилизованных

ПМО и амперометрического холинэстеразного биосеисора __(п=6, Р=0.95) _

Введено, моль/л Найдено, моль/л вг

5x10у (5 1±0 6)х10 9 0 112

5x10 10 (4 8±0 6)х10 10 0 119

5x10 " (5 2+0 7)х10 11 0 128

Молоко" Эдельвейс" не обнаружено

Молоке не пастеризованное не обнаружено

Не обнаружено - < 10 11 М

Полученные результаты показывают, что ИПМО могут быть использованы для селективного извлечения 2,4-Д Их применение в ряде случаев может оказаться предпочтительнее, чем использование ИАт В частности, ИПМО более устойчивы при высокой температуре, отличаются механической и химической устойчивостью в органических растворителях Их получение - это чисто химический путь, который для химиков во многих случаях более удобен и предпочтителен МОНОАМИНООКСИДАЗНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ПОЛИСПЕЦИФИЧНОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ Методические приемы и подходы группового и индивидуального иммунохимического определения, разработанные на примере гербицидов триазинового ряда и хлорфеноксиуксусной кислоты, нашли дальнейшее развитие при разработке иммунохимического способа определения некоторых лекарственных соединений

Согласно литературным данным, лекарственные соединения, относящиеся к классу антидепрессантов, обладают способностью избирательно ингибировать каталитическую активность такого жизненно важного фермента, как МАО На этом основано их терапевтическое действие Это создает предпосылки для разработки способов их определения с помощью соответствующих биосенсоров, в основу функционирования которых могут быть положены как раз эти процессы

Продуктами реакции окислительного дезаминирования различных субстратов в присутствии МАО явтяются соответствующий альдегид (1), пероксид водорода (2) и аммиак (3) Электрохимическая активность, некоторых из них (1,2) может быть использована в аналитических целях для разработки амперометрических устройств, позволяющих регистрировать физиологически активные концентрации биогенных аминов (уравнение 1) ОН ОН

1 МАО |Г\--0Н П)

+ о2 + н2о -|| I +н2о2+нн3 ^

I

:н —сн2 —кн2 сн—сС.н

1 2 3

Сочетание реакции окислительного дезаминирования и электрохимической активности 1 и 2 продуктов реакции позволили разработать несколько новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной МАО для определения антидепрессантов В роли электрохимически активной детектирующей системы выбрали фермент-субстратную систему МАО типа А - дофамин В качестве физического преобразователя использовали стационарный ртутно-пленочный электрод (биосенсоры 1 типа), стеклоуглеродный (биосенсоры 1 типа), и платиновые птанарные электроды (биосенсоры 3 типа)

В случае биосенсора 1 типа на осцилловольтамперограммах растворов дофамина в присутствии иммобилизованной МАО на фоне ацетатного буферного раствора рН 5 5 наблюдается аналитический сигнал при потенциале -1 55 В, который относится к восстановлению соответствующего альдегида до спирта (рис 5)

-ОН

+2е + 2Н+ = | (3)

сн2он

На вольтамперограммах раствора дофамина на печатном платиновом и стеклоуглеродном электродах на фоне ацетатного буферного раствора при потенциалах + 04 и + 0 45 В (рис б, кривая 2, рис 7, кривая 1) наблюдается пик, высота которого зависит от концентрации дофамина в области концентраций 5x103 - 1x10^ моль/л Очевидно, в рассматриваемых условиях наблюдается электроокисление дофамина В присутствии же иммобилизованной МАО в растворах дофамина можно наблюдать появление дополнительного аналитического сигнала при потенциале + 0 75 Ви + 08В для биосенсоров 2 и 3 типов соответственно, что соответствует пику окисления пероксида водорода (рис 6, 7 кривая 3,2 соответственно) Н2О2 ~ 02 + 2Н+ + 2е (2)

Большая разница в потенциалах (больше чем 0 3 В) позволяет получать аналитические сигналы достаточно хорошо различимые по потенциалам, что не мешает фиксированию каждого сигнала отдельно в присутствии другого

Е мВ

Рис 5 Вольтамперограчмы ацетатного буферного раствора с рН 5 5, в присутствии раствора дофамина с концентрацией 1x103 М, и ИМАО (Биосенсор 1 типа)

Е, мв

Рис 7 Вольтамперограммы растворов дофамина с концентрацией 1x103 М на фоне ацетатного буферного раствора с рН 5 5 в отсутствие (1) и в присутствии иммобилизованной МАО (2) V = 20 мВ/с Биосенсор (3 типа)

Рис б Вольтамперограммы ацетатного буферного раствора с рН 5 5 (1), в присутствии растворов дофамина с концентрацией 1x10"3 М (2), в присутствии ИМАО(З) (Биосенсор 2 типа)

Известно, что кислород воздуха легко окисляет гидрохиноновый фрагмент молекул катехоламинов В щелочных средах окисление значительно ускоряется а иммобилизованная МАО проявляет наибольшую каталитическую активность именно в слабощелочной среде При рН 5 5 не наблюдается окисления самого дофамина, в то же время как иммобилизованный фермент проявляет еще достаточную

каталитическую активность Именно поэтому все дальнейшие измерения проводились при этом значении рН фонового электролита В результате изучения процесса электроокисления дофамина при различных концентрациях этого субстрата и пероксида водорода установлено, что наиболее удобный для расчетов аналитический сигнал (по величине и форме) наблюдался при концентрации субстрата 1x103 М Выбранное значение концентрации субстрата использовали при всех измерениях и определениях с использованием моноаминооксидазных биосенсоров Принципиальное устройство предлагаемых биосенсоров, характеристика их составных частей и условия их функционирования представлены в табл 9

Таблица 9

Амперометрические моноачиноксидазные биосенсоры и условия их

Условия функционирования Биосенсор 1 типа Биосенсор 2 типа Биосенсор 3 типа

Трансдьюсер Ртутно-пленочный электрод Стеклоуглеродный электрод Платиновые планарные электроды

Матричный компонент биочувствительной части сенсора Бычий сывороточный альбумин Пищевой желатин Пищевой желатин

Потенциал аналитического сигнала -1 55 В +0 8 В +0 75 В

Удельная каталитическая активность ИМАО 0 06±0 01 мкмоль/мин мг

Концентрация субстрата(дофамина) (5x103 - 1x10"4) М

Фоновый электролит Ацетатный буферный раствор рН 5 5±0 05

К соединениям, оказывающим влияние на каталитическую активность МАО, можно отнести например, трициклический антидепрессант дезипрамин, а также тетра- (пиразидоч) и дициклические (флуоксетин) антидепрессанты (табл 10)

Показано, что в присутствии дезипрамина, пиразидола и флуоксетина наблюдается уменьшение аналитического сигнала окисления пероксида водорода для биосенсоров 2 и 3 типов, и сигнала восстановления альдегида в случае биосенсоров 1 типа

Согласно результатам кинетических исследований, на примере дезипрамина, в присутствии его различных концентраций наблюдается двупараметрически рассогласованное ингибироваяие, т е воздействие антидепрессанта ведет к снижению сродства субстрата и фермента и уменьшает скорость окислительного дезаминирования (табл 11)

Объекты исследования

Антидепрессанты

I /снз сн,— СН2-СИ2-N С ^ н Дезипрамин (Ы-(З-Метиламинопропил)-иминоди бензил)

ссг::::о Г /СН3 СИ,- сн2-СН2- N С Имипрамин (М-(З-диметиламшюпропил)-иминодибензила гидрохлорид)

сСо н Нортриптилин (3-(10,11-дигидро-5Н-дибензо[а,с1]-циклогептен-5-илиден)-М-метил-1-пропанамин)

"схх О'^г™' Флуоксетин ((±)-М-Метил-гамма-[4-(трифторметил)фенокси], бензолпропиламин)

""сор I к^кн Пиразидол (2,3,3а,4,5,6-Гексагидро-8-метил-1 Н-пиразино-[3,2,1 -.},к]-карбазола гидрохлорид)

Аналитические возможности предлагаемых биосенсоров рассмотрены на примере определения этих антидепрессантов (табл 12, 13) Полученные результаты были использованы для разработки методики определения содержания пиразидола и флуоксетина в фармпрепаратах (табт 14,15)

Таблица 11

Кинетические параметры окислительного дезаминирования дофамина в присутствии

иммобилизованной МАО и различных концентраций дезипрамина __ Концентрация дофамина 1x10 3. рН = 5.5__

Концентрация КтхЮ5, УтаххЮ7, Соотношение

дезипрамина. моль/л мочь/лхс параметров Тип ингибирования К,,

моль/л Кт и Утах моль1

0 4 9±0 3 7 5+0 3

10"4 1 2+0 1 4 8±0 3 К'т< Кт Двупараметрически (1 1+0 1) х10^

10"6 4 0±0 2 4 4+0 2 У'тах< Утах рассогласованное

Таблица 12

Аналитические возможности определении антидепрессантов с помощью

Антидепрессант Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение градуировочной зависимости 1* = А + В10Си коэффициент корреляции г

А±5 (В±8)х(-16С), г

Дезипрамин 1хЮ4-Ы0-1 (2 37±0 07) (-(0 32±0 01))(-^С) 0 9984

Пиразидол 1Х10"4- 1 х 10"7 (-8±1) (8 5±0 3)(-1ёС) 0 9997

Флуоксетин 1х104- 1х109 (25±1) (-14±0 2)(-1йС) 0 9821

*1 =(1А)хюо%

Таблица 13

Аналитические характеристики ачперочетрических моноаминоксидазных биосенсоров

Антидепрессант Диапазон определяемых концентраций, моль/л с„ моль/л

Биосенсоры 1и 2 типа

Дезипрамин 1х1(И-1х10 ' 8x10"8

Пиразидол 1x10"" -1Х10"6 8x107

Флуоксетин 1Х10"4 -1x10 ' 8x108

Биосенсор 3 типа

Дезипрамин то-Мхю 2 8x10"

Пиразидол 1Х10"1 -1x10 ' 8x108

Флуоксетин 1х10ч -1*юу 8х10'|и

Результаты определения флуоксетина сопоставлены с данными о содержании активного компонента лекарственного препарата, полученными с помощью биосенсоров 1 и 3 типов Результаты эксперимента, представленные соответствующими выборками равноточны, а их дисперсии однородны в диапазоне определяемых концентраций (Ррасч < Ртабл), расхождения между средними результатами незначимы (1расч < 1табП)

Для повышения селективности определения ингибиторов МАО проводили иммуноэкстракционное определение дезипрамина и нескольких трициклических антидепрессантов (дезипрамина, имипрамина и нортриптилина), включающее стадию твердофазной экстракции с помощью иммобилизованных полиспецифичных Ат, с последующим определением извлеченного из анализируемого раствора соединения амперометрическим моноаминооксидазным биосенсором (табл 16)

Показано, что использование таких ИАт позволяет извлечь из анализируемого раствора сразу несколько веществ, обладающих сходным строением, т е после инкубирования раствора содержащего одновременно дезипрамин, имипрамин и нортриптилин (суммарная концентрация 10"7 моль/л) с ИАт, раствор уже не оказывал ингибирующего действия на ИМ АО В то же время присутствие в исследуемом растворе дополнительно к трициклическим антидепрессантам соизмеримых концентраций двуциклического

Сопоставление результатов определения флуоксетина в фармпрепарате «Флуоксетин» с помощью моноаминоксидазных биосенсоров 1 и 3 типов (п=6, Р=0 95), _ (Грасч (2.04) <Гтабл(б 39), 1расч(1 33)<1табл(2.78))_

Фармпрепарат (таблетки) Содерж по прописи, мг/мл Амперометрические МАО биосенсоры

Стационарный ртутно-пленочный электрод Платиновый планарный электрод

Найдено, моль/л Бг Найдено, моль/л вг

Флуоксетин (Канада) 1x10' (0 96+0 06)*103 0 059 (0 98±0 07)х103 0 068

Таблица 15

Определение пиразидола с помощью МАО биосеисора 2 типа (п=6, Р=0 95)

Фармпрепарат (таблетки) Содержание, (по прописи), мг/мл Найдено, мг/мл Эг

Пиразидол (ОАО "Дальхимфарм") 992x10' (9 8±0 9) хЮ3 0 087

Таблица 16

Рабочие условия иммуноэкстракционного определения

нескольких трициклическнх антидепрессантов_

Разведение Ат 1 20

Среда для образования иммунного комплекса рН =7 0±0 2

Время образования иммунного комплекса Ат -Аг 20 мин

Раствор для разрушения иммунного комплекса 0 02 М НС1 + 0 15 М №С1 (рН=4)

Время разрушения иммунного комплекса 15 мин

антидепрессанта флуоксетина, являющегося ингибитором МАО, позволяет наблюдать ингибирующий эффект раствора после иммуноэкстракции трициклическнх антидепрессантов ИМАО

Все это указывает, с одной стороны, на возможность выделения с помощью иммуноэкстракции именно нескольких структурно родственных антидепрессантов (дезипрамин, имипрамин, нортриптилин), а с другой стороны - на практически полное извлечение трициклическнх антидепрессантов с помощью соответствующих Ат

Характеристики процесса иммуноэкстракции представлены в табл 17 Максимальную сорбционную емкость определяли из зависимости, аналогичной представленной на рис 4

С целью разработки методов контроля за содержанием антидепрессантов в биологических жидкостях нами была предпринята попытка их определения в сыворотке

Характеристики процесса иммуноэкстракции

Степень извлечения изучаемых антидепрессантов, % 90±1

Коэффициент распределения 8-10

Максимальная сорбционная емкость ИАт, мкг/см2 47+0,3

Процент перекрестных реакций Ат к дезипрамину, % для имипрамина 10

для нортриптилина 3

для флуоксетина Взаимодействия не наблюдается

Константы связывания для иммунного комплекса [Ат-дезипрамин], моль 1 (2 6±0 1) х108 (4 0±0 2)х109

крови с помощью иммобилизованных Ат против трициклических антидепрессантов и моноаминооксидазного биосенсора 3 типа

Методом "введено-найдено" установлено, что определение трициклических антидепрессантов в образцах сыворотки крови возможно с использованием градуировочного графика для его определения в воде Это говорит о том, что в исследуемых условиях влияние матричных компонентов образца практически не сказывается В качестве модельных образцов использовали сыворотку крови с введенной определенной концентрацией смеси антидепрессантов Предварительными исследованиями было установлено, что используемая сыворотка не содержала других ингибиторов МАО Для проведения иммуноэкстракции кровь для анализа разбавляли в 100 раз для уменьшения влияния матричных компонентов образца(табл 18)

Табчица 18

Иммунохимическое определение дезипрамина в сыворотке крови с помощью

моноаминооксидазного биосенсора 3 типа и иммобилизованных антител (п=5, Р=0.95)

Введено, мочь/л Найдено, моль/л Бг

7x10'7 (6 7±0 3)х107 0 036

5x10"7 (4 8±0 2)х 107 0 036

2х10"7 (2 3±0 1)х107 0 035

Анализируя полученные результаты можно отметить, что для практического определения антидепрессантов как в виде лекарственных препаратов, так и их содержания в биологических жидкостях, возможно использование всех трех типов разработанных амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров

Полученные результаты служат основой для разработки соответствующих тест-систем, состоящих из наборов для получения ИАт для групп-специфичного и индивидуального

определения биологически активных веществ по типу производимых в настоящее время коммерческих иммунотестов, наборов для получения соответствующих амперочетрических биосенсоров и любого регистрирующего устройства для измерения тока при заданном потенциале Предлагаемые тест - системы могут служить для скрининга объектов анализа и определения широкого круга биологически значимых веществ по разработанному для этих целей алгоритму

Выводы

1 Предложен комбинированный способ анализа, основанный на сочетании иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов или нескольких антидепрессантов с применением соответствующих иммобилизованных Ат (групп-специфичный, полиспецифичный анализ), а также отдельных представителей определяемых классов соединений (индивидуальный анализ) с последующим детектированием амперометрическичи холинэстеразным или моноаминооксидазными биосенсорами

2 Опредетение группы триазиновых гербицидов и их отдельных представителей с помощью иммобилизованных Ат возможно в области концентраций 1х10"6-1х10 "М, 2,4-Д с использованием иммобилизованных в нитрат целлюлозную мембрану полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО) - 1х108-1хЮиМ Рабочие условия сорбции (иммобилизованные ПМО) рН=2, время 1 час и десорбции 0 01 М N8011, 20 мин

3 Концентрирование триазиновых гербицидов с помощью ИАт и гербицида 2,4 -Д с помощью ИПМО в области концентраций от 109 до 1010 М возможно в 5 -200 раз Коэффициент концентрирования для смеси триазиновых гербицидов изменяется от 230 до 9500

4 Разработаны амперометрические биосенсоры на основе платинового печатного и стеклоуглеродного электродов и иммобилизованной МАО для определения антидепрессантов

- предложен способ иммобилизации МАО,

- выбраны условия формирования аналитического сигнала и функционирования биосенсоров субстрат - раствор 1x103 М дофамина на фоне ацетатного буферного раствора с рН 5 5, потенциал регистрации аналитического сигнала 0 75 и 0 8 В соответственно

5 Тетра- , три- и дициклические антидепрессанты оказывают ингибирующее действие на иммобилизованную МАО Рассчитаны кинетические параметры реакции окислительного дезачинирования дофамина в присутствии ингибиторов МАО Почиспецифичное определение трициклических антидепрессантов (дезипрамина, имипрачина, нортрипитилина) с помощью моноаминоксидазного биосенсора возможно в области рабочих

концентраций lxlO"4 -1x10 8 Нижние границы определяемых содержаний составляют ВхЮ"9 (дезипрамин), 8x10 8(пиразидол) и 8x10 ш(флуоксетин) моль/л

6 Разработаны способы иммобилизации ПМО и Ат к тршшклическим антидепрессантам, оценены параметры, характеризующие их физико-химические свойства

степень извлечения триазиновых гербицидов составляет 9б±4 % в области концентраций от lxlO"6 моль/л и ниже, степень извлечения 2,4 - Д - 96±3 % в диапазоне концентраций от 1x10"8 моль/л и ниже, степень извлечения трициклических антидепрессантов - 90±1% в диапазоне концентраций от lxlO"4 моль/л и ниже,

максимальная сорбционная емкость иммобилизованных Ат 54,б±0,9 мкг/см2 и 47+0,3 мкг/см2 (триазиновые гербициды и антидепрессанты) соответственно, максимальная сорбционная емкость иммобилизованных ПМО 2,4-Д составляет 68,3+0,8 мкг/см2,

константы связывания Ат к трициклическим антидепрессантам равны (2 6+0 1)х108 и (4 0±0 2)х109 моль ' (на примере дезипрамина)

7 Предложены методики иммунохимического определения группы триазиновых гербицидов, их отдельных представителей и гербицида 2,4-Д в пищевых продуктах, флуоксетина в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови Sr не более 0 14

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях' Статьи-

1 Медянцева Э П Иммуноэкстракционное концентрирование и определение симазина как представителя гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов / Э П Медянцева, Р M Варламова, Д Р Биккенина, Г К Будников // Журнал прикладной химии -2005 - Т 78, вып 7 -С 1122-1126

2 Медянцева Э П Возможности группового ичмуноэкстракционного определения триазиновых гербицидов с амперометрическим детектированием / Э П Медянцева, Р M Варламова, Д Р Биккенина, Г К Будников // Заводская лаборатория Диагностика материалов -2006 -Т72, №10 - С 3-9

3 Медянцева Э П Условия функционирования амперометрического биосенсора на основе моноаминоксидазы / Э П Медянцева, Р M Варламова, Д А Гималетдинова, А H Фатгахова, Г К Будников // Ученые записки Каз гос ун - та Естественные науки -Т 148,кн 2 -2006 -С 21-29

4 Медянцева Э П Возможности группового и индивидуального иммуноэкстракционного определения триазиновых гербицидов с амперометрическим детектированием / Э П Медянцева, Р M Варламова, Д Р Биккенина, Г К Будников // Аналитика и контроль -Т 10, №2 -2006 - С 159-167

5 Медянцева Э П Аналитические возможности иммобилизованных в нитроцеллюлозную матрицу полимеров с молекулярными отпечатками дихлорфеноксиуксусной кислоты / Э П Медянцева, Р M Варламова, О Г Плотникова, Г К Будников, С А Попов, С Г Дмитриенко//Ученые записки Каз гос ун-та Естественные науки -Т 149, кн 1 -2007 - С 41-50

Сборники научных трудов.

6 Варламова Р M Иммуноэкстракционное концентрирование и определение триазиновых гербицидов с амперометрическим детектированием групповое и отдельных представителей / Р M Варламова, ЭП Медянцева, ДР Биккенина // Современные

проблемы теоретической и экспериментальной химии межвузовский сборник научных трудов V Всероссийской конференции молодых ученых / Научная книга - Саратов,

2005 - С 110-112

7 Варламова Р М Амперометрические моноаминоксидазные биосенсоры разных типов в анализе фармацевтических препаратов и биологических жидкостях / Р М Варламова, Э П Медянцева, Д А Гималетдинова, Г Г Фазульзянова, А Н Фаттахова, Г К Будников // Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии сб ст - Тула-Пущино, 2006 - С 31-33

8 Медянцева Э П Антидепрессанты пиразидол и флуоксетин как объекты анализа С помощью моноаминооксидазных биосенсоров / Э П Медянцева, Р М Варламова, Д А Гималетдинова, Г Г Фазульзянова, А Н Фаттахова, Г К Будников // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / ГФА, СПбГХФА - Пятигорск, 2007 -вып62 -С 260-261

Тезисы докладов*

9 Варламова Р М Использование иммунохимических реакций в водно-органических средах и концентрирование микроколичеств пестицидов / Р М Варламова, Н Ю Ильичева, Э П Медянцева, Г К Будников // Тез докл Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России 2004" - Москва, 2004 - С 349-350

10 Варламова РМ Применение различных типов амперометрических биосенсоров для оценки иммуноэкстракционных характеристик и концентрирования на примере пестицида симазина / Р М Варламова, Э П Медянцева, Д Р Биккенина, Г К Будников // Тез докл Всероссийской научной конференции с международным участием "Электроаналитика-2005" - Екатеринбург, 2005 -С 75

11 Варламова Р М Иммуноэкстракционное концентрирование и определение симазина как представителя гербицидов группы сим-1,3,5- триазинов / Р М Варламова, Э П Медянцева, Д Р Биккенина, Г К Будников // III Международная конференция "Экстракция органических соединений" ЭОС-2005 Каталог докладов - Воронеж, 2005 - С 391

12 Медянцева ЭП Количественные характеристики процесса иммуноэкстракционного концентрирования как стадии электроиммуноанализа пестицидов / Э П Медянцева, Р М Варламова, Д Р Биккенина, Г К Будников // Материалы И Международного симпозиума "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" -Краснодар, 2005 - С 214-215

13 Е Р Medyantseva Determination of some antidepressants using antibodies and amperometric monoaminooxidase biosensor / E P Medyantseva, R M Varlamova, D A Gimaietdinova, A N Fattakhova, H С Budni''ov // ICAS - 2006, International congress on Analytical Science -Moscow, Rossia, 2006 -P 565-566

14 Варламова P M Групповое и специфическое иммунохимическое определение некоторых биологически значимых соединений с использованием амперометрических биосенсоров / Р М Варламова, Э П Медянцева // VI Республиканская школа студентов и аспирантов "Жить в XXI веке", материалы конкурса "На лучшую студенческую работу"" - Казань,

2006 - С 80-82

15 Гималетдинова ДА Амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной моноаминооксидазы для определения некоторых антидепрессантов /ДА Гималетдинова, Р М Варламова, Э П Медянцева // VI Республиканская школа студентов и аспирантов "Жить в XXI веке", материалы конкурса "На лучшую студенческую работу" - Казань, 2006 - С 132-134

16 Варламова РМ Амперометрические моноаминоксидазные биосенсоры для определения антидепрессантов / Р М Варламова, Д А Гималетдинова, Г Г Фазульзянова // VI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века", Тез докл - Казань,2006 -С 26

17 Медянцева Э П Аналитические возможности амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминооксидазы / Э П Медянцева, Р М Варламова, Д А Гималетдинова, Г Г Фазульзянова, А Н Фаттахова, Г К Будников // Материалы Международной научной конференции "Химия, химическая технология и биотехнологичя на рубеже тысячелетий" -Томск, 2006 -Том 2 - С 260-261

Отпечатано в ООО «Печатный двор» г Ktuaith,yi Журналистов, 1/16, оф 207

Tel 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51 Лицензия ПД№7-0215 от Ol II 2001 г Выдана Пово чжскш1 межрегиона ihiit.1 и территоршпынт \npaeienue\i МПТР РФ Подписано в печать 26 04 2007г Уел п л 1,56 Заказ №К-6379 Тираж 100экз Формат 60x84 1/16 1>\ мага офсетная Печать - ризографая

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 14 ПЕСТИЦИДОВ

1.1. Методы определения триазиновых и хлорорганических 14 пестицидов

1.1.1 Хроматографические методы определения

1.1.2. Варианты определений с использованием твердофазной 15 экстракции

1.1.3. Иммунохимический анализ и его место среди современных 24 методов анализа

1.1.3.1. Сущность и некоторые особенности иммунохимических 24 методов анализа

1.1.3.2. Иммунохимическое определение пестицидов

1.1.4. Другие методы определения триазиновых и 31 хлорорганических пестицидов

1.1.4.1. Полимеры с молекулярными отпечатками для 31 селективного определения отдельных пестицидов

1.1.4.2. Биосенсоры как устройства для определения некоторых 36 пестицидов

2. АНТИДЕПРЕССАНТЫ КАК КЛАСС ЛЕКАРСТВЕННЫХ 41 СОЕДИНЕНИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

2.1. Моноаминоксидаза и ее свойства

2.1.1. Моноаминоксидаза

2.1.2. Биогенные амины как субстраты моноаминоксидазы

2.1.3. Антидепрессанты как эффекторы моноаминоксидазы

2.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ 46 ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

2.2.1 Биосенсоры в определении лекарственных препаратов

2.2.2. Биосенсоры, предназначенные для определения моноаминов и эффекторов моноаминоксидазы

2.2.3 Другие методы определения антидепрессантов

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ 5 8 ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

3.1. Постановка задачи

3.2. Объекты исследования

3.3. Аппаратура и техника измерений

3.4. Устройство амперометрических биосенсоров

3.4.1. Изготовление холинэстеразного биосенсора на основе 65 планарных платиновых электродов

3.4.2. Получения биочувствительной части 66 моноаминоксидазного сенсора

3.5. Получение иммобилизованных антител

3.6. Условия получения аналитического сигнала 66 амперометрического холинэстеразного биосенсора на основе планарных платиновых электродов

3.7. Обработка экспериментальных данных

4. ВОЗМОЖНОСТИ ГРУППОВОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО 72 ИММУНОЭКСТРАКЦИОННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЗИНОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

4.1. Холинэстрезные биосесоры в определении триазиновых 72 гербицидов

4.1.1. Атразин и симазин как представители гербицидов 72 триазинового ряда

4.1.2. Групповой анализ триазиновых гербицидов

4.2. Характеристики процесса иммуноэкстракции и 75 концентрирования

4.2.1. Факторы, влияющие на процесс экстракции триазиновых 75 гербицидов

4.2.2. Аналитические возможности концентрирования 78 триазиновых гербицидов

4.3. Иммуноэкстракционое проведение группового и 80 индивидуального анализа

4.4. Анализ пищевых продуктов на содержание триазиновых 82 гербицидов

4.4.1. Определение триазиновых гербицидов в молоке и 83 молочных продуктах

4.4.2. Определение триазиновых гербицидов в виноградном соке

5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ 89 ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В НИТРАТ ЦЕЛЛЮЛОЗНУЮ МАТРИЦУ ПОЛИМЕРОВ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ 2,4 - ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

5.1. 2,4 -Д - неспецифический ингибитор холинэстразы

5.2. Характеристики процесса сорбции-десорбции и 90 концентрирования с помощью иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками

5.2.1. Получение иммобилизованных полимеров с 91 молекулярными отпечатками

5.2.2. Факторы, влияющие на процесс экстракции 2,4-Д

5.2.3. Выбор рабочих условий проведения сорбции и десорбции

5.2.4. Оценка селективности действия иммобилизованных 95 полимеров с молекулярными отпечатками

5.2.5. Оценка сорбционной способности 2,4-Д 96 иммобилизованными полимерами сравнения

5.2.6. Аналитические возможности концентрирования 2,4-Д с 97 помощью иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками

5.3. Определение 2.4 -Д в молоке

6. МОНОАМИНОКСИДАЗНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ 100 ПОЛИСПЕЦИФИЧНОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ

6.1. Разработка амперометрических моноаминоксидазных 100 биосенсоров

6.1.1. Условия формирования аналитического отклика 100 биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминоксидазы

6.1.2. Разработка моноаминоксидазного биосенсора на основе 104 печатного платинового электрода

6.2. Кинетические параметры реакции окислительного 107 дезаминирования дофамина в присутствии дезипрамина

6.3. Оценка каталитической активности иммобилизованной 109 моноаминоксидазы

6.4. Аналитические возможности моноаминоксидазного 109 биосенсора в определении антидепрессантов

6.4.1. Определение эффекторов иммобилизованной 109 моноаминоксидазы

6.4.2. Определение содержания антидепрессантов в 111 фармпрепаратах

6.4.3. Рекомендации по применению моноаминоксидазных 112 биосенсоров разного типа

6.5. Получение и характеристики иммобилизованных антител 113 против антидепрессантов

6.5.1. Получение иммобилизованных антител

6.5.2. Определение констант связывания иммунных комплексов

6.5.3. Оценка специфичности иммунохимического определения 115 дезипрамина

6.6. Характеристики процесса иммуноэкстракции

6.7. Иммунохимическое определение некоторых 117 антидепрессантов

6.7.1. Иммуноэкстракция нескольких (группы) трициклических 118 антидепрессанов

6.7.2. Иммунохимическое определение отдельного 120 антидепрессанта на примере дезипрамина

6.7.3. Иммунохимическое определение дезипрамина в биологических жидкостях 7. ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ГРУППОВОГО И

ИНДИВИДУАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

7.1. Особенности функционирования предлагаемых тест- 123 систем

7.2. Этапы практической реализации предлагаемых тест-систем

7.3. Перспективы использования предлагаемых тест-систем

7.4. Разработка алгоритма иммуноэкстракционного 129 определения биологически активных соединений различных классов в образце неизвестного состава с помощью предлагаемых тест-систем

ВЫВОДЫ

Разработка простых, экспрессных и в то же время чувствительных и селективных способов определения широкого круга биологически активных соединений различной природы и происхождения - задача, которая была, есть и будет актуальной еще долгое время.

Зачастую, на стадии предварительных испытаний, отсутствует необходимость определять конкретное соединение, что всегда сопряжено с дополнительными материальными и временными затратами, и можно ограничиться информацией о наличии соединений определенного класса, т.е. получить сигнал «есть-нет», например, относительно потенциальных загрязнителей в объекте анализа. Это может послужить основанием для оперативного принятия соответствующих природоохранных мер и лишь затем, при необходимости, выявить конкретный загрязнитель.

Концепция обобщенных показателей и группового анализа, характеризующих состояние анализируемых объектов, которые в ряде случаев предшествуют определению индивидуальных соединений, находит все больше сторонников среди исследователей. При гораздо меньших затратах групповой анализ, зачастую, позволяет получить результат, который можно использовать в практических целях и который, в целом, определяет общую стратегию дальнейшего исследования.

Один из путей решения этой проблемы - разработка новых способов анализа, новых тест-систем. Они в зависимости от принципа действия, используемых химических реагентов, состава, условий проведения определений и способа получения информации, могут позволить найти подходы к анализу объектов неизвестного состава, что по-прежнему составляет одну из сложнейших и нерешенных задач аналитической химии. Все это и обуславливает актуальность проводимых в рамках диссертационной работы исследований.

В качестве таких способов для селективного определения группы (класса) соединений и последующего определения индивидуальных конкретных соединений в сложных по составу объектах, предлагается определение биологически активных веществ с применением иммобилизованных антител разной специфичности действия или полимеров с молекулярными отпечатками с последующим определением амперометрическими биосенсорами.

Возможности таких вариантов анализа, преимущества предлагаемых подходов и приемов показаны на примере определения классов триазиновых и хлорорганических гербицидов, лекарственных соединений, относящихся к классу антидепрессантов и их отдельных представителей.

Применение предлагаемого способа определения биологически активных соединений, в том числе ксенобиотиков, может обеспечить с одной стороны, принятие своевременных природоохранных мер, а с другой стороны, обеспечит проведение лекарственного мониторинга в режиме реального времени, что должно способствовать повышению качества жизни населения.

Работа проводилась при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 03-03-33116.

Цель исследования заключалась в разработке подходов и методических приемов для создания комбинированного способа определения класса (группы) биологически активных веществ (пестициды, лекарственные препараты) и последующего определения индивидуальных конкретных соединений в сложных по составу объектах, путем иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (сорбентов) с последующим определением амперометрическими биосенсорами.

Научная новизна

Предложен методический подход, основанный на иммуноэкстракции сначала группы соединений одного класса (групп-специфичный анализ), а затем иммуноэкстракции отдельных представителей этого класса соединений (индивидуальный анализ), осуществляемый за счет сочетания специфичности действия иммобилизованных сорбентов различной природы (антитела и полимеры с молекулярными отпечатками) и амперометрических биосенсоров. Рассчитаны количественные характеристики иммуноэкстракции пестицидов и антидепрессантов разных классов с помощью иммобилизованных антител.

Оценена возможность использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками как альтернатива иммобилизованным антителам для определения гербицида 2,4-Д. Показана возможность концентрирования, исходя из максимальной сорбционной емкости иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками и величины отклика холинэстеразного биосенсора.

Для реализации предлагаемого способа определения антидепрессантов разработаны новые амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной моноаминоксидазы, печатных и стекоуглеродного электродов, в основу функционирования которых положены сочетание реакции окислительного дезаминирования биогенных аминов и электрохимического окисления продуктов их ферментативной реакции. Показана возможность оценки количественного содержания антидепрессантов разных классов по их ингибирующему действию на иммобилизованную моноаминоксидазу. Рассчитаны кинетические параметры окислительного дезаминирования дофамина в отсутствие и в присутствии различных концентраций ингибиторов моноаминоксидазы. Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров.

Предложен алгоритм проведения иммуноэкстракционных определений биологически значимых веществ в образце неизвестного состава с помощью иммобилизованных антител разной специфичности действия и амперометрических биосенсоров.

Практическая значимость

Предложен комбинированный способ анализа, представляющий собой новое решение задачи селективного и высокочувствительного определения группы соединений и (или) отдельного соединения в сложной по составу смеси, в присутствии родственных по структуре и свойствам соединений, что невозможно с использованием других приемов и подходов. Разработана методика иммунохимического определения как группы триазиновых гербицидов, так и их отдельных представителей в молоке, молочных продуктах и в соках, гербицида

2,4 - Д в молоке с использованием полимера с соответствующими молекулярными отпечатками.

Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров. Проведена апробация разработанных биосенсоров при определении лекарственных соединений (пиразидола и флуоксетина) в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови.

Показаны перспективы практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем для группового и индивидуального иммуноэкстракционного определения пестицидов, лекарственных соединений с амперометрическим детектированием.

На защиту выносятся:

• Результаты изучения сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов, нескольких антидепрессантов с помощью соответствующих иммобилизованных Ат разной специфичности действия, а также отдельных представителей определяемых классов соединений с последующим детектированием амперометрическими биосенсорами (холинэстеразным, моноаминооксидазным).

• Количественные характеристики и аналитические возможности процессов иммуноэкстракции (сорбции-десорбции) и концентрирования с помощью иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками.

• Модели амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе различных физических преобразователей - платиновых печатных и стеклоуглеродного электродов для определения антидепрессантов разных классов.

• Кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в присутствии антидепрессантов.

• Константы образования иммунных комплексов и оценка перекрестной реактивности используемых антител к антидепрессантам.

• Методики определения группы триазиновых пестицидов (отдельных представителей гербицидов триазинового ряда), гербицида 2,4 - Д в пищевых продуктах, антидепрессантов в лекарственных формах (пиразидол, флуоксетин) и в биологических жидкостях (дезипрамин).

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И.П. Алимарина "Аналитика России" (Москва, 2004), II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием "Электроаналитика-2005" (Екатеринбург, 2005 г.), Международной научной конференции "Химия, химическая технология и биотехнологичя на рубеже тысячелетий" (Томск 2006), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (2006), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно - образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века", Российской школе - конференции молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино 2006).

Публикации: По теме диссертации публиковано 17 работ. Из них 5 статей (2 из них включены в перечень ВАК) и 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях. 2 статьи приняты к печати.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 25 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы, включающего 163 ссылки.

132 ВЫВОДЫ

1. Предложен комбинированный способ анализа, основанный на сочетании иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов или нескольких антидепрессантов с применением соответствующих иммобилизованных Ат (групп-специфичный, полиспецифичный анализ), а также отдельных представителей определяемых классов соединений (индивидуальный анализ) с последующим детектированием амперометрическими холинэстеразным или моноаминооксидазными биосенсорами.

2. Определение группы триазиновых гербицидов и их отдельных представителей с помощью иммобилизованных Ат возможно в области концентраций 1х 10'6-1х10"пМ, 2,4 - Д с использованием иммобилизованных в нитрат целлюлозную мембрану полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО) -1х10'8-1х10"пМ. Рабочие условия сорбции (иммобилизованные ПМО): рН=2, время 1 час и десорбции: 0.01 М ЫаОН, 20 мин.

3. Концентрирование триазиновых гербицидов с помощью ИАт и гербицида 2,4 -Д с помощью ИПМО в области концентраций от 10" до Ю'10 М возможно в 5 -200 раз. Коэффициент концентрирования для смеси триазиновых гербицидов изменяется от 230 до 9500.

4. Разработаны амперометрические биосенсоры на основе платинового печатного и стеклоуглеродного электродов и иммобилизованной МАО для определения антидепрессантов: предложен способ иммобилизации МАО;

- выбраны условия формирования аналитического сигнала и функционирования биосенсоров: субстрат - раствор 1х10'3 М дофамина на фоне ацетатного буферного раствора с рН 5.5, потенциал регистрации аналитического сигнала 0.75 и 0.8 В соответственно.

5. Тетра- , три- и дициклические антидепрессанты оказывают ингибирующее действие на иммобилизованную МАО. Рассчитаны кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в присутствии ингибиторов МАО. Полиспецифичное определение трициклических антидепрессантов (дезипрамина, имипрамина, нортрипитилина) с помощью моноаминоксидазного биосенсора возможно в области рабочих концентраций 1x10"4 -1хЮ"8. Нижние границы определяемых содержаний составляют 8x10'9

А |Л дезипрамин), 8x10 (пиразидол) и 8x10" (флуоксетин) моль/л.

6. Разработаны способы иммобилизации ПМО и Ат к трициклическим антидепрессантам, оценены параметры, характеризующие их физико-химические свойства: степень извлечения триазиновых гербицидов составляет 96±4 % в области концентраций от 1х10'7 моль/л и ниже, степень извлечения 2,4 - Д - 96+3 % в диапазоне концентраций от 1x10"8 моль/л и ниже, степень извлечения трициклических антидепрессантов - 90+1% в диапазоне концентраций от 1x10"4 моль/л и ниже;

-у максимальная сорбционная емкость иммобилизованных Ат 54,6±0,9 мкг/см

-у и 47±0,3 мкг/см (триазиновые гербициды и антидепрессанты) соответственно; максимальная сорбционная емкость иммобилизованных ПМО 2,4-Д составляет 68,3±0,8 мкг/см2; константы связывания Ат к трициклическим антидепрессантам равны (2.6±0.1)х108 и (4.0±0.2)х109 моль"1 (на примере дезипрамина).

7. Предложены методики иммунохимического определения группы триазиновых гербицидов, их отдельных представителей и гербицида 2,4-Д в пищевых продуктах, флуоксетина и пиразидола в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови. 8г не более 0.14.

134

1. Евгеньев М.И. Экологический мониторинг. Биоаналитическая химия / М.И. Евгеньев, И.И. Евгеньева.- Казань: Изд - во "КГТУ", 1996. - 160с.

2. Нормативные данные по предельно допустимым уровням загрязнения вредными веществами объектов окружающей среды. Справочный материал. С-Пб, 1994.- 46 с.

3. Hogendoorn Е. Recent and future developments of liquid chromatography in pesticide trace analysis / E. Hogendoorn, P. van Zoonen // J. of Chromatogr. A. -2000. V. 892, № 1-2. - P. 435-453.

4. Vicente A. Determination of pesticides and their degradation products in soil: critical review and comparison of methods / A. Vicente, Y. Pico // TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2004. - V. 23, № 10-11. - P. 772-789.

5. Nuflez O. LC-MS/MS analysis of organic toxics in food / O. Nuftez, E. Moyano, M.T. Galceran // TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2005. - V. 24, № 7. - P. 683-703.

6. Rial-Otero R. Chromatographic-based methods for pesticide determination in honey: An overview / R. Rial-Otero, E.M. Gaspar, I. Moura, J.L. Capelo // Talanta. 2007. - V. 71, № 2. - P. 503-514.

7. Ильичева Н.Ю. Холинэстеразные биосенсоры для определения гербицида пропанила / Н.Ю. Ильичева, P.M. Бейлинсон, Э.П. Медянцева, Г.К. Будников, О.Н. Ванягина // Вестник МГУ. 2003. - Т. 43, № 6. - С. 408-411.

8. Теория и практика иммуноферментного анализа. / A.M. Егоров и др.. М.: Высш. шк., 1991.-288с.

9. Prado A.G.S. Adsorption and preconcentration of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid on a chemically modified silica gel surface / A.G.S. Prado, C. Airoldi // Fresenius J. Anal.Chem. - 2001. - V. 371. - P. 1028 - 1030.

10. Poole C.F. New trends in solid phase extraction / C.F. Poole // Trends in Anal. Chem. - 2003. - V. 22, № 6. - P. 362 - 373.

11. Martinez D. Solid-phase extraction coupling to capillary electrophoresis with emphasis on environmental analysis / D. Martinez, M.J. Cugat, F. Borrull, M. Calull // J.Chromatogr. A. 2000. - V. 902, № 1 - P. 65 - 89.

12. Colume A. Evaluation of an automated solid-phase extraction system for the enrichment of organochlorine pesticides from waters / A. Colume, S. Cardenas, M Callego / Talanta. 2001. - V. 54, № 5. - P. 943-951.

13. Moreira V.J. Fast screening determination of some ubiquitous pesticides with SPME in water samples / V.J. Moreira, E. Komatsu // Anal. Lett. 2004. - V. 37. -P. 1427-1436.

14. Bermejo E. Multiresidue analysis of S-triazine herbicides in environmental water by micellar electrocinetic capillary chromatography / E.Bermejo, J.A.Perez, M.Moreno // J. Liq. Chromatogr and Reiat. Technol. 2001. - V. 24, № 4. - P. 461-478.

15. Gfrerer M. Occurence of triazines in surface and drinking water of Lianing Province in Eastern China / M. Gfrerer, T. Wenz, X. Quah, B. Platzer, E. Lankmayr // J. Biochem. Biophyz. 2002. - V. 53, № 1-3. - P. 217-228.

16. Nogueira J.M.F. Multiresidue screening of neutral pesticides in water samples by high performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry / J.M.F. Nogueira, S. Tom, S. Pat // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 505, № 2. - P. 209-215.

17. Shang-Da H. Analysis of triazine in water samples by solid-phase microextraction coupled with highperformance liquid chromatography / H. Shang-Da, H. Hsin-I., S. Yu-Hsiang // Talanta. 2004. - V. 64, № 4. - P. 887-893.

18. Ho W.-H. Solid-phase microextraction associated with microwave assisted extraction of orgonochlorine pesticides in medicinal plants / W.-H. Ho, S.J. Hsief //Anal. Chim. Acta. 2001. - V. 428, № l.-P. 111-120.

19. Weidong Q. Determination of acidic herbicides in surface water by solid-phase extraction followed by capillary zone electrophoresis / Q. Weidong, P. Wei Hon, S. Li, Y. Fong .// J. Chromatogr. Sci. 2002. -V. 40, №7. P.387-391.

20. He F. Biological monitoring of exposure to pesticides: current issues / F. He // Toxicol. Lett. 1999. - V. 108. - P. 277 - 283.

21. Zheng Y. Определение остатков хлорорганических пестицидов в девяти растениях твердофазной экстракцией и капиллярной газовой хроматографией / Y. Zheng, F. Di, L. Shenjie, Z. Yakui, Y. Hui // Chin. J. Chromatogr. 2005. - V. 23, № 3. - P. 308-311.

22. Huang S.-D. Analysis of triazine in water samples by solid-phase microextraction coupled with highperformance liquid chromatography / S.-D. Huang, H.-I. Huang, Y.-H. Sung // Talanta. 2004. - V. 64, № 4. - P. 887-893.

23. Liu L.-L. Применение различных способов твердофазной экстракции при пробоподготовке и аналитические методы для определения хлорорганических пестицидов / Li-L. Liu, S. Chen, R. Ren // J. Beijing Univ. Technol. 2003. V.29, №1.- P.68-72.

24. Roos C. Bestimmung von Pestiziden Flusswasser im ng/1 und sub-ng/l-Bereich mittels Flussigchromatographie-Tandem-Massenspectrometrie (LC-MC/MC) / C. Roos // GKSS. 2003. - № 29. - P. 1-204.

25. Lord H.L. In vivo study of triazine herbicides in plants by SPME / H.L. Lord, M. Moder, P/ Popp, J.B. Pawliszyn // Analyst. 2004. - V. 129, № 2. - P. 107-108.

26. Lee.H.K. Determination of triazines in soil by microwaveassisted extraction followed by solid-phase microectraction and gas chromatography-mass spectrometry / H.K. Lee, G. Shen // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 985, № 1-2. -P. 167-174.

27. Walorczyk S. Evaluation of a method for the analysis of triazine herbicides and their metabolites in water by SPE on a carbon-based adsorbent then GC-MC determination / S. Walorczyk // Acta. Chromatogr. 2001. - № 11. - P. 42-50.

28. Moreira V.J. Fast screening determination of some ubiquitous pesticides with SPME in water samples / V.J. Moreira, E. Komatsu // Anal. Lett. 2004. - V. 37. -P. 1427-1436.

29. Hernandez-Mendez J. Determination of herbicides, including thermally labile phenylureas, by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass-spectrometry / J. Hernandez-Mendez , R. Carabias-Martnez , E. Rodrguez

30. Gonzalo, С. Garca-Hemida, F.E. Soriano-Bravo // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 1002, № 1-2.-P. 1-12.

31. Moreira V. J. Fast screening determination of some ubiquitous pesticides with SPME in water samples /V.J. Moreira, K. Emy // Anal Lett. 2004. V.37, № 7. -P. 1427-1436.

32. Bermejo E. Multiresidue analysis of S-triazine herbicides in environmental water by micellar electrocinetic capillary chromatography / E. Bermejo, J.A. Perez, M. Moreno // J. Liq. Chromatogr and Reiat. Technol. 2001. - V. 24, № 4. - P. 461478.

33. Geerdink R.B. Trace-level determination of pesticides in water, by means of liquid and gas chromatography / R.B. Geerdink, W.M.A. Niessen, U.A.Th. Brinkman // J. Chromatogr. AJ 2002.-V. 970, №1-2. - P. 65-93.

34. Gfrerer M. Occurence of triazines in surface and drinking water of Lianing Province in Eastern China / M.Gfrerer, T. Wenz, X.Quah, B. Platzer, E. Lankmayr // J. Biochem. Biophyz. 2002. - V. 53, № 1-3. - P. 217-228.

35. Kot-Wasik A. Simultaneous determination of selected phenoxyacid herbicides and chlorophenols in surface and seawater by HPLC coupled to DAD / A. Kot-Wasik, D. Dabrowska, R. Kartanowicz, J. Namiesnik // Ana. Lett. 2004. V.37, №3. - P. 545-560.

36. Weidong, Q. Determination of acidic herbicides in surface water by solid-phase extraction followed by capillary zone electrophoresis / Q. Weidong, P. Wei Hon, S.Li, Y. Fong // J. Chromatogr. Sei. 2002. -V. 40, №7. P.387-391.

37. Nelieu S. Tandem solid-phase extraction of atrazine ozonation products in water / S. Nelieus, M. Stobiecki, J. Einhorn // J. Chromatogr. A. 2000. V.866, №2. -P. 195-201.

38. Hinsmann P. Determination of pesticides in waters by automatic on-line solidphase extraction-capillary electrophoresis / P. Hinsmann, A. Rios, M.J. Valcarcel // J. Chromatogr.A. 2000. V.866, №1. - P.137-146.

39. Никитин B.M. Справочник методов иммунологии / B.M. Никитин.-Кишинев: Штиинца, 1982. 304с

40. Коллинз У.П Новые методы иммуноанализа / У.П. Коллинз М.: Мир, 1992.280 с

41. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен.- М.: Мир, 1983.-218 с.

42. Евтюгин Г.А. Основы биосенсорики / Г.А. Евтюгин, Г.К. Будников, Е.Е. Стойкова Казань: изд - во Каз. гос. ун -та, 2007. - 288с.

43. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ / К. Байерман М.: Мир, 1987.- 80с.

44. Морозова B.C. Определение пестицидов методом иммуноферментного анализа / B.C. Морозова, А.И. Левашова, С.А. Еремин // Журн. аналит. химии 2005. - Т.60, №3. - С.230-246.

45. Bhand S. Immuno arrays for multianalyte analysis of chlorotriazines / S. Bhand, I Surugiu, A. Dzgoev, K. Ramanathan, P.V. Sundaram // Talanta. 2005. V.65, № 2. - P.331-336.

46. Deng A.-P. Application of a multichannel electrochemical detector coupled wiyh an ELISA microtiter plate for immunoassay of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid / A.-P. Deng, H. - J. Huang // Talanta. 2005. - V.68, № 2. - P. 480 - 482.

47. Еремин С.А. Влияние структуры иммунореагентов на чувствительность и специфичность поляризационного флуоресцентного иммуноанализа пестицидов./ С.А. Еремин, В.Ф. Таранченко, М.Ю. Лебедев, Л.В. Журавлева,

48. B.C. Крикунова, Ю.Н. Яковлева: Тез. докл. 7 Всерос. конф "Органические реагенты в аналитической химии." Саратов, 1999. - С.69.

49. Feng J. Functionalized europium oxide nanoparticles used as a fluorescent label in an-immunoassay for atrazine / J. Feng, G. Shan, A. Maquieira, M. E. Koivunen, B. Guo, B.D. Hammock, I. M. Kennedy //Anal. Chem. 2003. - V. 75, №19. - P. 5282-5286.

50. Pileisky SA. Molecular imprinting: at the edge of the third millennium / SA. Pileisky, S. Alocock, A.P.F. Turner // Trends in Biotechology. 2001. - V. 19, № l.-P. 9-12.

51. Дмитриенко С.Г. Использование полимеров с молекулярными отпечатками в процессах разделения и концентрирования органических соединений / С.Г. Дмитриенко, В.В. Ирха, А.Ю. Кузнецов, Ю.А. Золотов // Журн. аналит. хим. -2004.-Т. 59, №9.-С. 902-912.

52. Kempe М. Molecular imprinting used for chiral separations / M. Kempe, K. Mosbach // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 694. - P. 3-13.

53. Sellergren B. Imprinted chiral stationary phases in high-performance liquid chromatography / B. Sellergren// J. Chromatogr. A. 2001. - V. 906. - P. 227 - 252.

54. Schweitz L. Molecular imprint-based stationary phases for capillary electrochromatography / L. Schweitz, L.I. Andersson, S. Nilsson // J. Chromatogr A. 1998.-V. 817.-P. 5-13.

55. Д. Гендриксон Молекулярно импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе / Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. // Успехи биологической химии. 2006. - Т.46. - С. 149-192.

56. Svenson J. The role of functional monomer template complexation on the performance of atrazine v molecularly imprinted polymers / J. Svenson, N. Zheng, U. Fohrman, I. A. Nicholls // Anal. Lett. - 2005. - V. 38, № 1. - P. 57-69.

57. Baggiani C. Molecularly imprinted solid-phase extraction sorbent for the cleanup of chlorinated phenoxyacids from aqueous samples / C. Baggiani, C. Giovannoli, L. Anfossi, C. Tozzi // J. of Chromatogr. A. 2001. - V. 938, №. 1-2. - P. 35-44.

58. Dennison M.J. Biosensors for environmental monitoring / M.J. Dennison, A.P.F. Turner // Biotech. Adv. 1995. - V.13. - P. 1-12.

59. Биосенсоры: основы и приложения / под ред. Э. Тернера, И. Карубе, Дж. Уилсона. М.: Мир. 1992. - 616 с.

60. Barcelo D. Biosensors for environmental monitoring: Monitoring in real environment / D. Barcelo // Anal.Chim.Acta. 2002. - V. 456, № 1. - P. 1.

61. Karube I. Biosensors for environmental control /1. Karube, Y. Nomura // Trends in Anal.Chem. 1995. - V. 14, № 7. - P. 295-301.

62. Feng J. Functionalized europium oxide nanoparticles used as a fluorescent label in an-immunoassay for atrazine / J. Feng, G.Shan, A. Maquieira, M. E. Koivunen, B. Guo, B.D.Hammock, I. M. Kennedy // Anal. Chem. 2003. - V. 75, № 19. -P.5282-5286.

63. Kalab T. A disposable amperometric immunosensor for 2,4 -dichlorophenoxyacetic acid / T. Kalab, P. Skladal // Anal. Chim. Acta. 1995. -V.304, P.361 - 368.

64. Navratilova I. The immunosensors for measurement of 2,4 -dichlorophenoxyacetic acid based on electrochemical impedance spectroscopy /1. Navratilova, P. Scladal // Bioelectrochemistry. 2004. - V. 62, № 1. - P. 11-18.

65. Vangelis G. A. Novel fiber-optic based on immobilized glutathione S-transferase and sol-gel entrapped bromcresol green for the determination of atrazine / A.G. Vangelis, Y. D. Clonis // Anal.Chim.Acta. 2002. - V. 460, №2. - P. 151-161.

66. Scladal P. Effect of methanol on the interaction of monoclonal antibody with free and immobilized atrazine studied using the resonant mirror based biosensor / P. Scladal // Biosensor and Bioelectronics. - 1999. - V. 14, №3. - P. 257-263.

67. Suleiman A.A. Recent developments in piezoelectric immunosensors / A.A. Suleiman, G.G. Guilbault // Analyst. 1994. - V. 19, № 11. - P .2279-2282.

68. Bunde R.L. Piezoelectric quartz-crystal biosensors / R.L. Bunde, E.J. Jarvi, J.J. Rosentreter // Talanta. 1998. - V. 46, № 6. - P. 1223-1236.

69. Катралл P.B. Химические сенсоры / P.B. Катралл. М.: Научный мир, 2000. -144 с.

70. Yokoyama К. Highly sensitive quartz crystal immunosensors for multisample detection of herbicides / K. Yokoyama, K. Ikebukuro, E. Tamiya, I. Karube, N. Ichiki, Y. Aricawa // Anal. Chim. Acta. 1995. - V .304. - P.139-145.

71. Нартова Ю.В. Тест способ определения ацетохлора в жидких средах / Ю.В. Нартова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Экол. ЦЧО РФ. - 2005.- №2.- С.35 -38.

72. Горкин В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине / В.З. Горкин.- М.: Медицина, 1981.-336с.

73. Ma . Structure of Rat Monoamine Oxidase A and its specific recognitions for substrates and inhibitors/ J. Ma, M. Yoshimura, E. Yamashita, A. Nakagama, Akio Ito, T. Tsukihara // J.Mol.Biol. 2004. - V. 338, № 1. - P. 103-114.

74. Глущенко H.H. Фармацевтическая химия / H.H. Глущенко, Т.В. Плетенева, В. А. Попков. М. - Academa, 2004,382с.

75. Энциклопедия лекарств / под ред. Вышковский Г.Л. ООО "PJ1C -2004", 1150 с.

76. Андреев С.В. Роль катехоламинов в здоровом и больном организме / С.В. Андреев, И.Д. Кобкова.- М.: Медицина, 1970. 296 с.

77. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. Т.1./ М.Д. Машковский М.: ООО " Новая Волна", 2002.- 540с.

78. Сафразбекян P.P. Особенности изучения активации моноаминоксидазы / Р.Р.Сафразбекян. Изд-во АН Армянской ССР., 1983.175 с.

79. Солдатенков А.Г., Основы органической химии лекарственных веществ / А.Г. Солдатенков, Н.М. Колядина, И.В. Шендрик М.: "Мир", 2003.- С. 192.

80. Химическая энциклопедия / под ред. И.Л. Кнунянц Т.1. М.: "Советская энциклопедия", 1988. - 623 с.

81. Мелихова Е.В Применение проточного пьезокварцевого иммуносенсора для определения сульфаметоксазола в объектах окружающей среды / Е.В. Мелихова, Е.Н. Калмыкова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Журн. аналит. хим. 2006. - Т. 61, № 7. - С. 744-750.

82. Ермолаева Т.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы / Т.Н. Ермолаева, Е.Н.Калмыкова // Успехи химии. 2006. - Т. 75, № 5. - С. 445-458.

83. Velasco-Garcia М. N. Biosensor Technology addressing agricultural problems / M. N. Velasco-Garcia, T. Mottram // Biosystems Engineering. 2003. -V. 84, №1.-P. 1-12.

84. Crooks S. R. H. Immunobiosensor an alternative to enzyme immunoassay screening for residues of two sulfonamides in pigs / S. R. H. Crooks, G. A. Baxter, M. C. O'Connor, С. T. Elliott // Analyst. - 1998. - V. 123. - P. 2755-2757.

85. Torriero A.AJ. Penicillamine determination using a tyrosinase micro-rotating biosensor / A. A.J. Torriero, E. Salinas, E. J. Marchevsky, J. Raba, J. J. Silber // Anal. Chim. Acta. 2006. - V. 580, № 2. - P. 136-142.

86. Stefan R.-I. Determination of t- and -enantiomers of methotrexate using amperometric biosensors / R.-I. Stefan, R.G. Bokretsion, J.F. van Staden, H.Y. Aboul-Enein // Talanta. 2003. - V. 60, № 5. - P 983-990.

87. Stefan R.-I. Biosensor for the enantioselective analysis of S-captopril / R.-I. Stefan, C. Bala, H.Y. Aboul-Enein // Sensors and Actuators B: Chemical. 2003. -V. 92,№ 1-2.-P. 228-231.

88. Rittmannsberger A. Development of an enzyme-modified carbon paste electrode for determining inhibitors of lipoxygenase / A. Rittmannsberger, W. Likussar, A. Michelitsch // Biosensors and Bioelectronics. 2005. - V. 21, №. 4. -P. 655-660.

89. Jiang X. Voltammetry of the interaction of metronidazole with DNA and its analytical applications / X. Jiang, X. Lin // Bioelectrochemistry. 2006. - V. 68, №. 2.-P. 206-212.

90. Никольская Е.Б. Зависимость аналитических характеристик биоспецифических и газочувствитльных сенсоров от выбора потенциометрического датчика / Е.Б. Никольская, О.В. Ягодина, P.P. Искандеров // Журн. аналит. химии. 1995. - Т. 50, № 12. - С. 1275-1279.

91. Кузнецова Л.П. Характеристика ферментсодержащих мембран для биосенсоров / Л.П. Кузнецова, Л.И. Кугушева, Е.Б. Никольская, О.В.Ягодина //Журн. аналит. химии 1990.-Т. 45, №7.-С. 1426-1431.

92. Budantsev A.Yu. Biosensor for catecholamines with immobilized monoamine oxidase in tissue sections / A.Yu.Budantsev // Analyt. Chim. Acta. 1991.-V.249.- P.71-76.

93. Никольская Е.Б. Зависимость аналитических характеристик биоспецифических и газочувствитльных сенсоров от выбора потенциометрического датчика / Е.Б.Никольская, О.В.Ягодина, Р.Р.Искандеров // Журн. аналит. химии 1995. - Т. 50, № 12. - С. 1275-1279.

94. Dongping Z. Electrochemical investigation of dopamine at the water /1,2 -dichloroethane interface / Z. Dongping, M. Shuneng, Z. Qiang, C. Zhong, H. Hu, J. Ping, Z. Meigin, Z. Zhiwei, S. Yuanhua // Anal. Chem. 2004. - V. 76, № 14. -P. 4128-4136.

95. S(+) desmethylselegiline and its use to trest adhd: Пат. 6759053США: МПК7 A 61 F 13/00. / DiSanto A.R.; заявитель и патентообладатель Somerset Pharmaceuticals, Inc.- № 10/251727; заявл.20.09.2002; опубл. 06.07.2004; НПК 424/422. Бюл. № 6

96. Compounds to treat alzheimer's disease: Пат. 6846813 США: МПК A 61 К 31/33, A 61 К 31/495/ Beck J.P., Gailunas A., Horn R., Jagodzinska В., John

97. Varghese, Maillard M.; заявитель и патентооладатель Pharmacia & Upjohn Co., Pharmaceuticals, Inc.- № 09/895843; заявл. 29.10.2001; опубл. 25.01.2005; НПК 514/183. Бюл.№ 25

98. Piperidine derivatives as reuptake inhibitors: Пат. 6828332 США: МПК7 С 07D 401/02, А 61 К 31/ 445 / Eli Lilly and Co., D.T. Kohlman, S.X. Liang, Y.-C. Xu -. № 10/ 070130; заявл. 14.09.2000; опубл. 07.12.2004; НПК 514/ 332. Бюл. №7

99. Selective serotonin receptor antagonist and therapeutic applications thereof:

100. Пат. 6806283 США: МПК7 A 61 К 31/40, С 07 D 209/54/ Glennon R., Westkaemper R.; заявитель и патентообладатель Virginia Commonwealth Univ.- № 10/429970; заявл. 06.05.2003; опубл. 19.10.2004; НПК 514/409. Бюл. № 19

101. Keller J.-H. Determination of hyperforin in mouse brain by highperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry/ J.-H. Keller, M.

102. Karas, W.E. Muller, D.A. Volmer, G.P. Eckert, M.A. Tawab, H.H. Blume, T. Dingermann, M. Schubert-Zsilavecz // Anal. Chem. 2003. - V.75, № 22. - P. 6084-6088.

103. Agents with antidepressant action, containing pramipexol and second antidepressant: Пат. 6667329 США: МПК7 A 61 К 31/425, A 61 К 31/136№09/743190/ M.Jersy; заявитель и патентообладатель Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG.-НПК 514/367.

104. Lamas PJ. Solid Phase microextraction - gas chromatography - mass spectrometry for the water / P.J. Lamas, C. Salgado - Petinal, C. Garcia - Jares, M. Llompart, R. Cela, M.J. Gomez // Cromatogr. A. - 2000. - V. 1046, № 1-2. - P. 241-247.

105. Li F. Derivatives of tricyclic antidepressant / F. Li, Y Q. Pang, X - Q. Lin, H.Cui // Talanta. - 2003. - V. 59, № 3. - P. 627-636.

106. Fernandez-Sanchez С. AC voltammetric carbon paste-based enzyme immunosensors / С. Fernandez-Sanchez, M.B. Gonzalez-Garcia, A. Costa-Garcia // Biosens. Bioelectron. 2000. -V. 14, № 12. -P. 917-924.

107. Березин И.В. Практический курс химической и ферментативной кинетики / И.В. Березин, А.А. Клесов А.А. изд- во Московкого университета, 1976. - 320 с.

108. Крупянко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций / В.И. Крупянко. М.: Наука, 1990.-144с.

109. Медянцева Э.П. Амперометрический биохимический сенсор на основе иммобилизованной холинэстеразы в иммуноанализе пестицидов Э.П.Медянцева, М.Г.Вертлиб, Г.К.Будников, С.С.Бабкина, С.А.Еремин/ Журн.аналит.химии.- 1995.- Т.50, № 7.- С.782-786.

110. Медянцева Э.П.Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы в анализе потенциальных загрязнителей окружающей среды // Э.П.Медянцева, Г.К.Будников, С.С.Бабкина / ЖАХ. -1990. -Т.45, № 7.-С.1386-1389.

111. Санитарно-гигиенические методы исследования пищевых продуктов и воды. (Справочное пособие) / под ред. Г.С.Яцулы. Киев.: Здоровье, 1991. -288с.

112. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ // Приложение к журналу "Защита и карантин растений".-1998.-№5.

113. Каспаров В.А. Применение пестицидов за рубежом / В.А. Каспаров, В.К. Промоненков М.: ВО Агроиздат. - 1990.-224с.

114. Гидрохимические показатели состояния окружающей среды. Справочные материалы. / Т.В. Гусева и др.. Эколайн, - 2000 г., стр. 125

115. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю Кулис.- Вильнюс.: Мокслас, 1981. - 200с.

116. Майрановский С.Г. Полярография в органической химии / С.Г Майрановский., Я.П Страдынь., В.Д Безуглый. JI: Химия, 1975. - 352 с.

117. Никольская Е.Б. Ферментные электроды для определения некоторых азотсодержащих соединений / Е.Б. Никольская, О.В. Ягодина // Журн. аналит. химии 1985.- Т.40, №7.- С.1299-1307.

118. Venton B.J. Behaviour and Dopamine / B.J. Venton, R.M. Wightman // Anal.Chem. 2003.- V. 75, № 19. - P.414A-425A

119. Кугушева Jl.И. Применение ферментсодержащих мембран для определения органических соединений / Л.И.Кугушева, Л.П.Кузнецова, Е.Б.Никольская, О.В.Ягодина // Журн. аналит. химии 1992.- Т.47, №8.-С.1478-1482.

120. Варфоломеев С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич.-М.: Торг.дом Гранд, 1999. 716с.

121. Медянцева Э.П. Иммуноэкстракционное концентрирование и определение симазина как представителя гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов/ Э.П.Медянцева, Р.М.Варламова, Д.Р.Биккенина, Г.К.Будников // Журн. прикл. химии. -2005. Т.78, вып.7. - С. 1122-1126.

122. Ткачева Г.А. Радиоиммунологические методы исследования./ Г.А Ткачева, И.П Балаболкин, М.И. Ларичева -М.: Медицина, 1983.-192с.