Иммуноэкстракция остаточных количеств пестицидов различных классов с амперометрическим детектированием тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕСТИЦИДОВ 12 1.1. Биосенсоры как устройства для анализа биологически активных соединений

1.1.1. Применение холинэстеразных биосенсоров для определения пестицидов

1.1.2. Холинэстеразные биосенсоры на основе печатных электродов

2. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ЕГО МЕСТО СРЕДИ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА

2.1. Иммунохимические методы определения пестицидов

2.1.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.1.2. Методы флуоро- и люминисцентного иммуноанализа для определения пестицидов

2.1.3. Иммуносенсоры для определения пестицидов

2.2. Использование антител в методах разделения

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

3.1. Постановка задачи

3.2. Объекты исследования и приготовление растворов

3.3. Приборы и техника измерений

3.3.1. Устройство амперометрического холинэстеразного биосенсора

3.3.2. Изготовление двухканальных холинэстеразных биосенсоров на основе планарных платиновых электродов

3.4. Иммобилизация антител

3.5. Обработка экспериментальных данных

4. ОЦЕНКА АНАЛИТИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ РАЗЛИЧНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ПЕСТИЦИДОВ

4.1. Природа формирования аналитических сигналов 62 4Л.1. Холинэстеразный биосенсор на основе стационарного ртутно-пленочного электрода 63 4Л.2. Холинэстеразные биосенсоры на основе планарных платиновых электродов

4.2. Изучение влияния параоксона и пропанила на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы в составе АХЭБ

4.3. Двухканальные холинэстеразные биосенсоры на основе печатных планарных электродов для определения пестицидов

4.3.1. Выбор рабочих условий функционирования двуканальных холинэстеразных биосенсоров

4.3.2. Оценка изменения величин откликов двухканальных холинэстеразных биосенсоров

4.4. Аналитические возможности холинэстеразных биосенсоров для определения пестицидов разных классов

5. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ АНТИТЕЛА КАК АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ

5.1. Получение иммобилизованных антител

5.2. Иммунохимическое определение пестицидов разных классов в воде

5.2.1. Выбор условий иммунохимического определения пестицидов

5.2.2. Константы связывания иммунных комплексов Ат-пестицид

5.2.3. Оценка специфичности иммунохимических определений пестицидов

5.3. Иммунохимическое определение пестицидов разных классов в водно-огранических средах 108 5.3.1. Влияние различных растворителей на иммунологические взаимодействия Ат-пестицид

5.3.2. Константы связывания иммунных комплексов Ат-пропанил в водно-органических растворах

5.4. Некоторые характеристики процесса иммуноэкстракции 121 6. ИММУНОЭКСТРАКЦИОННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

6.1. Определение параксона в винограде и апельсинах

6.2. Определение пропанила в рисе

6.3. Определение симазина в молоке и молочных продуктах

6.4. Определение атразина в воде и апельсиновом соке 136 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 141 ВЫВОДЫ 143 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 145 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ХЭ - холинэстераза АХЭ - ацетилхолинэстераза

АХЭ (эу) - ацетилхолинэстераза электрического угря

АХЭ (ч) - ацетилхолинэстераза человека

БуХЭ - бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади

АХЭБ - амперометрический холинэстеразный биосенсор

БТХИ - бутирилтиохолин иодид

АТХИ - ацетилтиохолин иодид

БСА - бычий сывороточный альбумин

САЧ - сывороточный альбумин человека

ГА - глутаровый альдегид

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПрО - предел обнаружения

ИХА - иммунохимический анализ

Ат - антитело

Аг - антиген

ИАт - иммобилизованные антитела

ИК - иммунный комплекс Ат-Аг

ИЭ - иммуноэкстракция

НЦ - нитратцеллюлоза

АД - ацетатцеллюлоза

ТФЭ - твердофазная экстракция

Разработка эффективных способов определения следовых количеств пестицидов является актуальной задачей современной аналитической химии. Пестициды и их метаболиты как вещества, способные проявлять физиологическую активность, могут представлять опасность для здоровья человека, присутствуя в воде, пищевых продуктах. Для выявления уровня загрязненности пестицидами тех или иных объектов и их потенциальной опасности с точки зрения возможного воздействия на живые организмы необходимы чувствительные и селективные методы, характеризующиеся в то же время экспрессностью и простотой в эксплуатации.

Одним из перспективных направлений создания новых аналитических методов для определения пестицидов является разработка биосенсорных устройств. Достижения последних лет в области создания электрохимических сенсоров, связанные с появлением и внедрением новых технологических и конструкционных решений, способствуют совершенствованию биосенсоров. Все более широко в практику использования входят планарные электроды, изготовленные с помощью печатных технологий, которые предназначаются для одноразового или многоразового использования. Создание новых био- и иммуносенсоров на их основе с использованием различных вариантов модификации электродной поверхности находится в русле мировых тенденций развития электроаналитической химии. Однако наряду с тем, что амперометрическое детектирование характеризуется низкими пределами обнаружения и может обеспечить достаточную чувствительность для определения следовых количеств загрязняющих веществ, в то же время при использовании электрохимических датчиков не всегда можно достичь необходимой селективности.

Проблему обеспечения специфичности определений можно решить путем комбинирования электрохимического детектирования с методом разделения, основанным на использовании иммунохимических реакций. Весьма перспективным в этом плане может быть использование иммунохимических экстрагирующих реагентов, иммобилизованных на подходящих носителях. Значительного улучшения эксплуатационных характеристик метода иммуноэкстракции можно достичь при использовании в качестве носителя промышленно изготавливаемых материалов, имеющих стандартизированные параметры качества и доступных по цене. В целом, использование простых и экономичных подходов в рамках иммуноэкстракционного метода определения пестицидов может позволить осуществлять надежный экомониторинг остаточных количеств пестицидов в реальном масштабе времени.

Следует также отметить, что до недавнего времени основное внимание уделялось разработке иммунохимических методов анализа для определения пестицидов в воде, тогда как аналитические возможности иммунохимических реакций в органических и водно-органических средах практически не изучались. Тем не менее, такие исследования имеют несомненную теоретическую ценность, а кроме этого могут позволить расширить горизонты практического применения методов иммуноанализа.

Работа проводилась при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (номера проектов № 97-03-33232а, № 00-03-32389а) и международного гранта INCO Copernicus (номер проекта ERBIC 15 СЕ-98-0910).

Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов иммуноэкстракционного определения пестицидов разных классов с использованием иммобилизованных антител и холинэстеразных биосенсоров различной конструкции, выборе рабочих условий его проведения на основе изучения характеристик электрохимических, ферментативной и иммунохимических реакций.

Научная новизна и практическая значимость. Показана возможность определения пестицидов различных классов (фосфорорганического инсектицида параоксона, анилидного гербицида пропанила, сульфонилмочевинного гербицида хлорсульфурона, триазиновых гербицидов атразина и симазина), используя эффекты ингибирования и активации на холинэстеразы разного происхождения, входящие в иммобилизованном состоянии в состав холинэстеразных бисосенсоров. Впервые установлено и исследовано активирующее действие анилидного пестицида пропанила на иммобилизованную холинэстеразу. Определены кинетические параметры реакции холинэстеразного гидролиза (кажущиеся константы Михаэлиса, максимальные скорости реакции) в присутствии пропанила. Установлено влияние различных факторов на характер протекания ферментативного процесса.

Разработаны два типа холинэстеразных биосенсоров на основе планарных систем с использованием ацетилхолинэстераз электрического угря и сыворотки крови человека и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади.

Разработаны два способа иммобилизации антител на промышленно выпускаемых ацетатцеллюлозных и нитратцеллюлозных мембранных фильтрах. Определены константы связывания иммунных комплексов антитело-антиген, как характеристики полученных иммуноэкстрагентов. Изучена способность иммобилизованных антител к иммунохимическим взаимодействиям в водно-органических растворах. Оценены константы связывания иммунных комплексов антитело-антиген в водно-органических растворах.

Предложены варианты иммуноэкстракционного определения пестицидов с использованием иммобилизованных антител как иммуноэкстрагентов в водных и водно-органических средах для осуществления контроля пищевых продуктов на наличие их остаточных количеств. Разработаны методики иммуноэкстракционного определения пестицидов с использованием амперометрических холинэстеразных биосенсоров в различных пищевых продуктах.

На защиту выносятся: -результаты изучения действия пестицидов различных классов (фосфорорганического инсектицида параоксона, анилидного" гербицида пропанила, сульфонилмочевинного гербицида хлорсульфурона, триазиновых гербицидов атразина и симазина) на каталитическую активность холинэстераз различного происхождения, входящих в состав разработанных холинэстеразных биосенсоров;

-совокупность факторов, определяющих величину аналитических сигналов при работе с различными амперометрическими холинэстеразными биосенсорами;

-использование кинетических параметров ферментативной реакции для выбора рабочих условий определения;

-результаты исследований, проведенных с целью получения антител, иммобилизованных на различных промышленно выпускаемых мембранных фильтрах, для использования в качестве иммуноэкстрагентов; -оценка и сопоставление значений констант связывания иммунных комплексов антитело-пестицид, полученных в различных условиях;

-влияние некоторых растворителей на иммунологические реакции антитело-пестицид;

-варианты иммуноэкстракционного определения пестицидов пропанила, параоксона, атразина и симазина с помощью иммобилизованных антител как иммуноэкстрагентов и амперометрических холинэстеразных биосенсоров; -иммуноэкстракционные методики определения пестицидов в пищевых продуктах: параоксона в апельсинах и винограде, пропанила в рисе, симазина в молоке и молочных продуктах, атразина в воде и апельсиновом соке.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000), IV Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2000" с международным участием (Краснодар, 2000), Поволжской региональной конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Симпозиуме по высокоэффективным методам разделения (Сиофок, 2001), Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 2001), Международной конференции "Биокатализ-2002" (Москва, 2002), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (2002г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 16 работ. Из них 3 статьи и 13 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 18 рисунков (из них 6 в приложении). Работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы, включающем 181 ссылку, и приложения.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность иммуноэкстракционного определения остаточных количеств пестицидов различных классов (фосфорорганического инсектицида параоксона, анилидного гербицида пропанила, триазиновых гербицидов симазина и атразина) с помощью иммобилизованных антител и разных видов холинэстеразных биосенсоров.

2. Установлены рабочие условия определения пестицидов пропанила и параоксона с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора о рН фосфатного буферного раствора 7.50±0.05; Сбтхи^ 1x10" М для параоксона и Сбтхи~2хЮ" М для пропанила). Динамические области концентраций составили для параоксона 5хЮ"10 - lxlO"6 М, для пропанила 1х ю-12 - 1 х10"9 М. Активирующее действие пропанила на холинэстеразу установлено впервые.

3. Разработаны холинэстеразные биосенсоры на основе планарных печатных платиновых электродов для определения пестицидов пропанила, атразина и симазина. Подобраны рабочие условия определения пестицидов с использованием этих биосенсоров (рН фосфатного буферного раствора 7.50+0.05; Сагхи=1хЮ"3 М; рабочий потенциал Е=+500 мВ). В области изученных концентраций от 1x10"12 до lxlO"6 М установлены рабочие диапазоны определения пестицидов разных классов.

4. Разработаны 2 способа иммобилизации антител с использованием ацетатцеллюлозных и нитратцеллюлозных мембранных фильтров промышленного изготовления, отличающиеся простотой выполнения и позволяющие сохранять иммунологические свойства в течение не менее месяца.

5. Значения констант связывания иммунных комплексов Ат-пестицид,^. как -характеристики полученных иммуноэкстрагентов составляют для параоксона KAi = (5.8±0.3)хЮ10, КА2= (5.3±0.2)х109; для пропанила

144

Kai=(1-4+0.1)x1014, Ka2=(6.4±0.2)x1012, для атразина Kai=(5.8±0.2)xl09, Ка2=(4-0±0. 1 )х 108, для симазина KAi = (1.5±0.2)х 1011, КА2=(4.3±0.2)х 108.

6. Найдены условия иммуноэкстракционного определения пропанила, атразина и симазина в водно-органических средах (10% водно-органический раствор ацетонитрила, ацетона и этанола). Значения констант связывания иммунных комплексов Ат-пропанил в присутствии этанола составили КА1 = (1.2±0.3)х10и, КА2= (8.3±0.4)х108, в присутствии ацетона Kai = (1.4±0.1)хЮ10, КА2= (1.7±0.5)х108, в присутствии ацетонитрила Kai = (6.3±0.4)х1014, КА2= (1.4±0.3)х10п.

7. Предложены иммуноэкстракционные методики определения пестицидов в пищевых продуктах: симазина в молоке и молочных продуктах, параоксона в винограде и апельсинах, пропанила в рисе, атразина в воде и апельсиновом соке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований позволяют сделать заключение о перспективности практического применения иммуноэкстракционного способа определения следовых количеств веществ с использованием холинэстеразных биосенсоров в качестве детектирующих устройств. Высокая чувствительность как амперометрического детектирования, так и ферментативной и иммунологической реакций, в целом обеспечивают в этом комбинированном методе возможность оценки содержания низких концентраций определяемых веществ. Дополнительным фактором, позволяющим говорить о перспективности предлагаемого метода, является возможность регистрации на предлагаемых биосенсорах активирующих эффектов со стороны некоторых из изученных пестицидов по отношению к ХЭ, которые не только обеспечивают получение хорошо выраженных аналитических сигналов, но и расширяют динамическую область концентраций.

Как показывают результаты проведенных исследований, использование планарных печатных электродов в качестве детектирующих устройств является весьма перспективным в области создании биосенсоров на основе ферментов, а также Ат или других биоматериалов. Применение таких трансдъюсеров делает процесс получения биосенсоров более технологичным, менее трудоемким и создает предпосылки для разработки новых методов анализа с элементами миниатюризации.

Использование антител, иммобилизованных на носителях промышленного изготовления, в рамках предлагаемого варианта иммуноэкстракционного определения может быть предложено как новый способ твердофазной экстракции. В результате проведенных нами исследований уже продемонстрирована возможность применения ИАт для эффективных разделительных операций анализируемых образцов. Кроме этого, при изменении соответствующих условий представляется возможным проведение не только специфичной экстракции, но и концентрирования анализируемых веществ на мембранах, содержащих ИАт.

Согласно результатам проведенных исследований, разработанные способы получения ИАт позволяют получать иммунореагенты, способные к иммунологическим взаимодействиям не только в водной среде, но и в присутствии органических растворителей. Проблема изучения иммунологических реакций в органических и водно-органических растворах на сегодняшний день остается открытой и интересной многим исследователям. Осуществленное на данном этапе изучение иммунологических реакций в водно-органических средах охватывает лишь небольшую часть этой области и позволяет сделать выводы о необходимости дальнейшего развития ИХА в данном направлении. Наряду с важностью таких теоретических исследований в них, несомненно, превалирует прикладной аспект. Такие исследования позволят в полной мере реализовать возможности иммунохимического анализа пестицидов и многих других веществ, в частности предлагаемого метода иммуноэкстракционного определения.

Таким образом, предложенный метод иммуноэкстракционного определения пестицидов с амперометрическим детектированием характеризуется определенными достоинствами. Наряду с тем, что в процессе простой по выполнению иммуноэкстракции обеспечивается селективность определения, а в качестве детектирующих устройств могут использоваться различные по конструкции биосенсоры, область использования этого варианта ИХА охватывает как водные, так и водно-органические среды. Анализ результатов практического применения разработанного варианта иммунохимического анализа определения пестицидов различных классов с амперометрическим детектированием с помощью холинэстеразных биосенсоров, в частности результатов международного межлабораторного анализа атразина в пищевых продуктах, позволяет рекомендовать его для практического использования в таких областях как организация и проведение экомониторинга, анализ пищевых продуктов и сельскохозяйственной продукции.

1. Евгеньев М.И., Евгеньева И.И. Экологический мониторинг. Биоаналитическая химия. -Казань: Изд-во "КГТУ", 1996.-160с.

2. АН I., Jair С.К. Ground water contamination and health hazards by some of the most commonly used pesticides // Current Science. -1998. -V.75, №10. -P.1011-1014.

3. Munshi A.B., Jamil K., Zuberi R. Pesticide residues in food available for human consumption // Journal of the Chemical Society of Pakistan.-2001.-V.23,№2,-P.95-97.

4. Occurence of triazine herbicides and metolachlor in the Niagara River and other major tributaries draining into Lake Ontario / Zaruk D. Alaee M., Sverko E., Сomba M. // Anal.Chim.Acta.-1998.- Y.3 76,№ 1.■-P. 113 -117.

5. Thurmann E.M., Bastian K.C., Mollhagen T. Occurence of cotton herbicides and insecticides in playa lakes of the High Plains of West Texas // The science of the Total Enviroment.-2000.- V.248,-P. 189-200.

6. Revathy K., Murthy B. A household servey of dietary intake of pesticides: Book Abstr. of Pittsburgh Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc Orlando (Fla), 1999.-P.2325.

7. Vanderhoff G.R., Vanzoonen P. Trace analysis of pesticides by gas chromatography // Journal of Chromatography.-1999,- V.843,№l-2.-P.301-322.

8. Quantification of phenylurea pesticides by HPLC/ECD and photolysis / Goger B,. Kunert O., Seger C., Rinelli R., Wintersteiger R. // Electroanalysis.-2001.-V.13,№16.-P.1335-1341.

9. Intercalibration of chromatographic methods in multiresidue pesticide determination / Gennaro M.C., Angelino S., Maurino V., Aigotti R., Liberatori A. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.-1999 V.22,№5.-P.721-734.

10. Liquid chromatographic-mass spectrometric determination of postharvest fungicides in citrus fruits / Fernandez M., Rodrigues R., Pico Y., Manes J. // Journal of Chromatography.-2001. V.912, №2. -P.301-310.

11. Determination of atrazine herbicides in foods with liquid chromatography mass spectrometry / Okihashi M., Akutsu K., Obana H., Hori S. // Analyst.-2000.-У. 125,№ 11 .-P. 1966-1969.

12. Ahmed F.E. Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks // Trends in Analytical Chemistry-2001.- V.20,№11.-P.649-661.

13. Kataoka H., Lord H.L., Pawliszyn J. Applications of solid-phase microextraction in food analysis // Journal of Chromatography A.-2000.-V.880.-P.35-62.

14. Penalver A. Trends in solid-phase microextraction for determining organic pollutants in environmental samples // Trends in Anal.Chem.-1999.-V.18,№8.-P.557-568.

15. Barker S.A. Applications of matrix solid-phase dispersion in food analysis // Journal of Chromatography A.-2000.-V.880.-P.63-68.

16. Ferrer I., Barcelo D. Determination and stability of pesticides in freeze-dried water samples by automated on-line solid-phase extraction followed by liquid chromatography with diode-array detection // Journal of Chromatography A.-1996.-V.737.-P.93-99.

17. Quantification of phenylurea herbicides and their free and humic acid-associated metabolites in natural waters / Dicorcia A., Costantino A., Crescenzi C., Samperi R. // Journal of Chromatography A.-1999.-V.852.-P.465-474.

18. Pinto G.M.F., Jardim I.C.S.F. Use of solid-phase extraction and HPLC determinaion of herbicide multiresidue recoveries in water // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.-2002.- V.25,№7.-P. 1093-1101 .

19. Tanabe A. Developments of simultaneous analytical methods of hazardous chemicals and their applications to environmental monitoring // Bunseki Kagaku.-2001.- V.50,№12.-P.915-916.

20. Baglio D., Kotzias D., Larsen B.R. Atmospheric pressure ionization multiple mass spectrometric analysis of pesticides // Journal of Chromatography. 1999. -V.854, №1-2. -P.207-220.

21. Dennison M.J., Turner A.P.F. Biosensors for environmental monitoring // Biotech. Adv.-1995-V.13.-P.l-12.

22. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Э.Тернера, И.Карубе, Дж.Уилсона.-М.:Мир, 1992.-616 с.

23. Barcelo D. Biosensors for environmental monitoring: Monitoring in real environment // Anal.Chim.Acta.-2002.-V.456,№ 1 .-P. 1.

24. КагиЬе I., Nomura Y. Biosensors for environmental control // Trends in Anal. Chem. -1995 .-V. 14,№7. -P .295 -3 01.

25. Ascorbate oxidase based amperometric biosensor for organophosphorous pesticide monitoring / Rekha K.B., Gouda M.D.B., Thakur M.S.B., Karanth N.G.B. // Biosensors & Bioelectronics B.-2000.- V.15,№9-10.-P.499-502.

26. A novel amperometric sensor for organophosphotriester insecticides detection employing catalytic polymer mimicking phosphotriesterase catalytic center / Yamazaki Т., Meng Z., Mosbach K., Sode K. // Electrochemistry.-2001.-V.69,№12.-P.969-972.

27. Conductometric sensor for atrazine detection based on molecularly imprinted polymer membranes / Sergeyeva T.A., Piletsky S.A., Brovko A.A., Slinchenko E.A., Sergeeva L.M., Panasyuk T.L., El'skaya A.V. //Analyst-1999.- V.124,№3.-P.331-334.

28. Marazuela M.D., Morenobondi M.C. Fiber-optic biosensors an overview // Anal, and Bioanal. Chem.-2002.-V.372,№5-6.-P.664-682.

29. Andreou V.G., Clonis Y.D. Novel fiber-optic based on immobilized glutathione S-transferase and sol-gel entrapped bromcresol green for the determination of atrazine // Anal.Chim.Acta.-2002.- V.460.-P. 151-161.

30. Multibiosensor based on enzyme inhibition analysis for determination of different toxic substances / Arkhypova V.N., Dzyadevych S.V., Soldatkin A.P., El'skaya A.V., Jafferic-Renault N., Jafferic H., Martelet C. // Talanta.-2001.-V.55.-P.919-937.

31. Strike D.J., Meijerink M.G.H., Koudelkahep M. Electronic noses A mini-review // Fresenious Journal of Anal. Chem. - 1999.-V.364, №>6.-P.499-505.

32. Применение холинэстераз в аналитической химии / Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А. //Журн. аналит. химии.-1992.-Т.47,№8.-С.1358-1377.

33. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А., Шеховцова Т.Н. Проблемы и перспективы применения ферментов в анализе объектов окружающей среды И Журнал Аналит. Химии,-1994.-Т.49, №5.-С.452-461.

34. Skladal P. Biosensors based on cholinesterase for detection of pesticides / P.Skladal // Foodtechnol. biotechnol.-1996.-V.34,№i.p.43-49.

35. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества. Голиков С.Н., В.И.Розенгарт.-JI.: Изд-во "Медицина".-1964.-383с.

36. Pogacnik L., Franko М. Validation of different commercially available cholinesterases for pesticide toxicity test // Annali di Chimica.-2002.-V.92,№l-2.-P.93-101.

37. Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with an acetylcholinesterase amperometric biosensor using 4-aminophenyl acetate as substrate / La Rosa C., Pariente F., Hernandez L., Lorenzo E. // Anal.Chim.Acta.-1994.- V.295.-P.273-282.

38. Biosensors based on enzyme inhibition: Detection of organophosphorus and carbamate insecticides and dithiocarbamate fungicides / Noguer Т., Leca В., Jeanty G., Marty J.L. // Field Anal. Chem. and Techology.- 1999. V.3, №3 -P.171-178.

39. Pogacnik L., Franko M. Determination of organophosphate and carbamate pesticides in spiked samples of tap water and fruit juices by a biosensor with phototermal detection // Biosensors & Bioelectronics.-2002.-V.14.~P,569-578.

40. Fast response potenciometric acetylcholine biosensor / Gyurcsanyi R.E., Vagfoldi Z, Toth K, Nagy G. // Electroanalysis, 1999-V.l 1,№10-1 l-P.712-718.

41. The use of polyethyleneimine for fabrication of potentiometric cholinesterase biosensors / Reybier K., Zairi S., Jaffrezicrenault N., Fahys B. // Talanta.-2002.-V.56,№6-P. 1015-1020.

42. Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor / Lee H.-S., Kim Y.A., Cho Y.A., Lee Y.T. // Chemosphere.-2002.-V.46.-P.571-5 76.

43. Khavkin M.J., Khavkin J.A. A ferromagnetic biosensor for simple assay of organophosphate pesticides // Anal.lett.-1996.-V.29,№7.-P. 1041-1054.

44. Novel type cholinesterase sensor based on SPV measurement technique / Fedoseeva O.V., Uchida H., Katsube Т., Ishimaru Y., Iida T. // Sensors and Actuators B.-2000.-V.65.-P.55-57.

45. Amperometric flow-through biosensor for the determination of cholinesterase inhibitors / Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty L.J., Budnikov H.C. //Anal. Chim. Acta.- 1999. -V.385, №1-3-P.13-21.

46. Comparative assessment of electrochemical biosensors for determining inhibitors Environmental pollutants / Budnikov G.K., Evtugin G.A., Rizaeva G.A., Ivanov A.N., Latypova V.Z. // Journal of Anal. Chem. - 1999.- V.54, №9. -P.864-871.

47. Simonian A.L., Efremenko E.N., Wild J.R. Discriminative detection of neurotoxins in multi-component samples // Anal. Chim. Acta. 2000. V.444,№2. -P. 179-186.

48. Albareda-Sirvent М., Merkoci A., Alegret S. Configurations used in the design of screen-printed enzymatic biosensors. A review // Sensors and Actuators B.-2000.-V.69.-P. 153-163.

49. I.Hart A.L., Collier W.A. Stability and function of screen printed electrodes, based on cholinesterase, stabilised by a co-polymer/sugar alcohol mixture // Sensors and Actuators В. 1998.-Y.53. -P.l 11-115.

50. Determination of residual pesticide in plant materials using planar cholinesterase sensors modified with Nafion / Gogol E.V., Evtugin G.A., Suprun E.V., Budnikov G.K., Vinter Y.G. // Journal of Anal. Chem. 2001.- V.56, №10. -P.963-970.

51. Amperometric biosensors based on nafion coated screen-printed electrodes for the determination of cholinesterase inhibitors / Gogol E.V., Evtugin G.A., Marty J.L., Budnikov G.K., Winter V.G. // Talanta. 2000.- V.53. - P.379-389.

52. Skladal P., Pavlik M., Fiala M. Pesticide biosensor based on coimmobilized acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase // Anal. Lett.-1994.-V.27.-P.29-40.

53. Detection of carabamate pesticides in vegetable samples using cholinesterase-based biosensors / Skladal P., Nunes G.S., Yamanaka H., Ribeiro M.L. // Electroanalysis. 1997- V.9,№14 - P. 1083-1087.

54. Skladal P. Detection of organophosphate and carbamate pesticides using disposable biosensors based on chemically modified electrodes and immobilizedcholinesterase // Anal.Chim. Acta-1992.-V.269.-P.281-287.

55. Disposable cholinesterase biosensor for the detection of pesticides in water-miscible organic solvents / Montesinos Т., Perez-Munguia S., Valdez F., Marty J.L. //Anal. Chim. Acta.- 2001. V.431. -P.231-237.

56. Screen-printed electrode based on AchE for the detection of pesticides in presence of organic solvents / Andreescu S., Noguer Т., Magearu V., Marty J.L. // Talanta.- 2002. V.57, №1 - P.169-176.

57. A disposable multielectrode biosensor for rapid simultaneous detection of the insecticides paraoxon and carbofuran at high resolution / Bachmann T.T, Schmid R.D. //Anal. Chim. Acta.- 1999. V.401 - P.95-103.

58. Никитин B.M. Справочник методов иммунологии. -Кишинев: Штиинца, 1982.-304с.

59. Новые методы иммуноанализа / Под ред. Коллинза У.П. М.: Мир, 1992.280 с

60. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Под ред. Егорова A.M., Осипова А.П., Дзантиева Б.Б., Гавриловой Е.М. М.: Высш. шк., 1991. -288с.

61. Тривен М. Иммобилизованные ферменты.-М.: Мир, 1983.-С.20-21.

62. К. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ.-М.: Мир, 1987,-363с.

63. Hennion М.С., Barcelo D. Strengths and limitations of immunoassays for effective and efficient use for pesticide analysis in water samples: A review // Anal.Chim.Acta.-1998.- V.362, №l.-P.3-34

64. Development of an ELISA for the organophosphorus insecticide isofenphos / Park H.J., Park W.C., Jung Т., Rha C.S., Lee Y.T. // Bulletin of the Korean Chemical Society.-2002.-V.23, №4.-P.599-604.

65. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the pyrethroid insecticide fenpropathrin / Wengatz I., Stoutamire D.W., Gee S.J., Hammock B.D. // J.Agric.Food Chem.-1998 -V.46, №6.-P.2211-2221.

66. Goodrow M.H, Hammock B.D. Hapten design for compound-selective antibodies: ELISAs for environmentally deleterious small molecules // Analytica Chimica Acta.-1998.- V.376, №1.-P.83-91.

67. Watanabe E, Kubo H, Nakazawa H. Group-specific enzyme-linked immunosorbent assay for fenitrooxon and 3-methyl-4-nitrophenol in water samples based on a polyclonal antibody // Analytica Chimica Acta.-2002.- V.460, №1.-P.99-110.

68. Development of a class-specific immunoassay for the type I pyrethroid insecticides / Watanabe Т., Shan G., Stoutamire D.W., Gee S.J., Hammock B.D. //Analytica Chimica Acta.-2001.- V.444, №1.-P.l 19-129.

69. Immunoassay techniques for detection of the herbicide simazine based on use of oppositely charged water-soluble polyelectrolytes. / Yazynina E.V, Zherdev

70. A.V., Dzantiev B.B., V Izumrudov.A., Gee S.J., Hammock B.D. // Analytical Chemistry.-1999.- V.71, №16.-P.3538-3543.

71. Lee N., Skerritt J.H., McAdam D.P. Hapten synthesis and development of ELISAs for detection of endosulfan in water and soil // J.Agric.Food Chem.-1995.-V.43, №6.-P.1730-1739.

72. Разработка иммуноферментных методов определения гербицида хлорсульфурона / Язынина Е.В., Жердев А.В., Еремин С.А., Попова В.А., Дзантиев Б.Б. // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т.38,№1.-С.14-19.

73. High-sensitivity assay for pesticide using a peroxidase as chemiluminescent label / Dzgoev A.B., Gazaryan I.G., Lagrimini L.M., Ramanathan K., Danielsson

74. B. // Anal.Chem.-1999.-V.71, №22.-P.5258-5262.

75. Monitoring of insecticides and fungicides in water and sediment samples in the Brazilian / Oubina A., Martinez E., Gascon J., Barcelo D., De Alleluia I.E. // Intern. Journal of Environ. Anal. Chem.-1998.- V.70, №l-4.-P.75-91.

76. Evaluation of analytical methods for determining pesticides in baby food / Chuang J.C., Pollard M.A., Misita M., Vanemon J.M. // Analytica Chimica Acta.-1999.-V.399, № 1 -2.-P. 135-142.

77. Determination of carbaryl, carbofuran and methiocarb in cucumbers and strawberries by monoclonal enzyme immunoassays and high-perfomance liquid chromatography with fluorescence detection An analytical comparison / Abad

78. A., Moreno M.J., Pelegri R., Martinez M.I., Saez A., Gamon M., Montoya A. // Journal of Chromatography.-1999.- V.833, №1.-P.3-12.

79. Uwe S., Claudia В., Gunter G. Immunoanalytical techniques for pesticide monitoring based on fluorescence detection // Fresenius Journal of Anal Chem.-2000. V.366, №6-7. - P.646-658.

80. A polarization fluorescence immunoassay for the herbicide propanil / Krasnova A.I., Eremin S.A., Natangelo M., Tavazzi S., Benfenati E. // Analytical Letters. -2001. -V.34. P.2285-2301.

81. Aguilarcaballos M.P., Gomezhens A., Perezbendito D. Pesticide determination by stopped-flow fluoroimmunoassay using Cresyl Violet as label // Analytica Chimica Acta.-1999.-V.381, №2-3.-P.147-154.

82. Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay of bensulfuron-methyl by using terbium fluorescence energy transfer / Wang G.L., Yuan J.L., Matsumoto K., Hu Z.D. // Talanta.-2001.- V.55, №6.-P.l 119-1125.

83. Development of a heterogeneous chemiluminescent flow immunoassay for DDT and related compounds / Botchkareva A.E., Fini F., Eremin S., Mercader J.V., Montoya A., Girotti S. // Analytica Chimica Acta.-2002.-V.453, №1.-P.43-52.

84. Chemiluminescent multiassay of pesticides with horseradish peroxidase as a label / Samsonova J.V., Rubtsova M.Yu., Kiseleva A.V., Ezhov A.A., Egorov A.M. // Biosensors & Bioelectronics.-1999.-V.14.-P.273-281.

85. Immunosensors for pesticide determination in natural waters / Mallat E., Barcelo D., Barzen C., Cauglitz G., Abuknesha R. // Trends in Analytical Chemistry.-2001.-V.20, №3.-P.124-132.

86. Gonzalez-Martinez M.A., Puchades R., Maquieira A. On-line immunoanalysis for environmental pollutants: from batch assays to automated sensors // Trends in Analytical Chemistry.-1999.-V. 18, №3.-P.204-217.

87. Skladal P., Deng A.P., Kolar V. Resonant mirror-based optical immunosensor: application for the measurement of atrazine in soil // Analytica Chimica Acta.-1999.-V.399, №l-2.-P.29-36.

88. Flow-through fluorescence immunosensor for atrazine determination/ Turiel E., Fernandez P., Perezconde C., Gutierrez A.M., Camara C. // Talanta.-1998.-V.47, №5.-P.1255-1261.

89. Part per trillion level determination of isoproturon in certified and estuarine water samples with a direct optical immunosensor / Mallat E., Barzen C., Abuknesha R., Cauglitz G., Barcelo D. // Analytica Chimica Acta.-2001.-V.426, №2.-P.209-216.

90. Integrated optical surface plasmon resonance immunoprobe for simazine detection / Harris R.D., Luff B.J., Wilkinson J.S., Piehler J., Brecht A., Gauglitz G., AbukneshaR.A. //Biosensors & Bioelectronics.-1999.- V.14. -P.377-386.

91. Immunosensor for the determination of the herbicide simazine based on an ion-selective field-effect transistor / Starodub N.F., Dzantiev B.B., Starodub V.M., Zherdev A.V. // Analytica Chimica Acta.-2000.-V.424, №l.-P.37-43.

92. Application of screen-printed electrodes as transducers in affinity flow-through sensor system / Fernandez Romero J.M., Stiene M., Kast R., Luque de Castro M.D., Bilitewski U. // Biosensors & Bioelectronics.-1998.- V.13.- P.l 1071115.

93. Zeravik J., Skladal P. Screen-printed amperometric immunosensor for repeated use in the flow-through mode // Electroanalysis.-1999 V.ll, №12.-P.851-856.

94. Dequaire M., Degrand C., Limoges B. An immunomagnetic electrochemical sensor based on a perfluorosulfonate-coated screen-printed electrode for the determination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid // Anal.Chem.-1999.- V.71, №13.-P.2571-2577.

95. Gerdes M., Spener F., Meusel M. Pseudo homogeneous amperometric immunosensor for the detection of 2,4-D based on a displacement format // Quimica Analitica.-2000.- V.19, Suppl.l.-P.8-14.

96. Highly sensitive quartz crystal immunosensors for multisample detection of herbicides / Yokoyama K., Ikebukuro K., Tamiya E., Karube I., Ichiki N., Arikawa Y. // Analytica Chimica Acta.-1995.-V.304.-P. 139-145.

97. Immunochemical array for the identification of cross-reacting analytes / Winklmair M., Schuetz A.J., Weller M.G., Niessner R. // Fresenius Journal of Anal. Chem.-1999.- V.363, №8.-P.731-737.

98. Highly parallel affinity sensor for the detection of environmental contaminants in water / Weller M.G., Schuetz A.J., Winklmair M., Niessner R. // Analytica ChimicaActa.-1999.-V.393, №l-3.-P.29-41.

99. Selection of hapten structures for indirect immunosensor arrays / Schuetz A.J., Winklmair M., Weller M.G., Niessner R. // Fresenius Journal of Anal. Chem.-1999.-V.363, №7.-P.625-631.

100. Van Emon J.M., Gerlach C.L., Bowman K. Bioseparation and bioanalytical techniques in environmental monitoring // Journal of Chromat. B- 1998.-V.715-P.211-228.

101. Immunoaffinity column clean-up for the determination of imazalil in citrus fruits / Watanabe E., Yoshimura Y., Yuasa Y., Nakazawa H. // Analytica Chimica Acta.-2001.-V.433, №2.-P.199-206.

102. Kramer P.M., Franke A., Standfussgabisch C. Flow injection immunoaffinity analysis (FIIAA) A screening technology for atrazine and diuron in water // Analytica Chimica Acta.-1999.-V.399, №l-2.-P.89-97.

103. Pichon V., Bouzige M., Hennion M.C. New trends in environmental trace-analysis of organic pollutants: class-selective immunoextraction and clean-up in one step using immunosorbents // Analytica Chimica Acta.-1998.-V.376, №1.-P.21-35.

104. Immunosorbents: natural molecular recognition materials for sample preparation of complex environmental matrices / Pichon V., Bouzige M, Miege C, Hennion M.C. // Trends in Anal.Chem.-1999.- V.18, №>3.-P.219-235.

105. Thordarson E, Jonsson J.A., Emneus J. Immunologic trapping in supported liquid membrane extraction // Anal.Chem.- 2000.- V.72, №21.-P.5280-5284.

106. Morais S, Maquieira A., Puchades R. Immunofiltration: A methodology for preconcentration and determination of organic pollutants // Anal.Chem.-1999.-V.71, №9.-P.1905-1909.

107. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы / Будников Г.К, Медянцева Э.П, Волков А.В. и др. // Журн.аналит.химии,-1983, Т.38, №7.-С.1283-1288.

108. Турьян Я.И. Окислительно-восстановительные реакции и потенциалы в аналитической химии.-М.Мир, 1989.-248 с.

109. Розенгарт В.И, Шерстобитов О.Е. Избирательная токсичность фосфорорганических инсектоакарицидов.-JI.: Наука, 1978.

110. Tougu V, Kesvatera Т. Role of ionic interactions in cholinesterase catalysis // Biochimica et Biophysica Acta.-1996.-№ 1298.-P.12-30.

111. Иммунохимический анализ гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора / Медянцева Э.П, Кутырева М.П, Фахреева Э.Р, Ильичева Н.Ю, Еремин С.А, Будников Т.К. // Агрохимия. 2000. №3. С. 72-80.

112. Березин ИВ, Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.- М.: Изд-во МГУ, 1976.-141с.

113. Крупянко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций.-М. :Наука, 1990.-141с.

114. Крупянко В.И. Метод Km V- системы координат в ферментативной кинетике.- Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987.-352с.

115. Ленинджер А. Основы биохимии. Т.1.-М.:.Мир, 1985.-С.367.

116. Иммобилизованные ферменты / Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. М.: Высш.шк., 1987.-С.108.

117. Шрадер Г. Новые фосфорорганические инсектициды. М.: Мир, 1965.-С.295.

118. Electrochemical oxidation of propanil and related N-substituted amides / Garrido E.M., Lima J.L.F.C., Delerue-Matos C., Borges F., Silva A.M.S., Oliveira- Brett A.M. //Analytica Chimica Acta. -2001. -V.434. -P.35-41.

119. Кузнецов Б.А., Шумакович Г.П. Полярографический анализ микроколичесвт белков / Методы современной биохимии: Сб науч. трудов.-М.: Изд-во "Наука", 1975.-С. 160-163.

120. Иммуносорбенты в очистке белков / под ред. Э. Руослахти. М.: Медицина.-1979.-128с.

121. Ткачева Г.А., Балаболкин И.П., Ларичева М.И. Радиоиммунологические методы исследования.-М.: Медицина, 1983 .-192с.

122. Санитарно-гигиенические методы исследования пищевых продуктов и воды. (Справочное пособие) / под ред. Г.С.Яцулы. Киев.:"Здоровье," 1991-288с.

123. Иммунохимические методы анализа определения гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов. / Еремин С.А., Самсонова Ж.В., Егоров A.M. П Успехи химии, 1994.-Т.:3, №7.-С.638-649.

124. Setford S.J. Immunosensing in organic and mixed aqueous-organic phase environments // Trends in Anal Chem.-2000.-V.19, №5.-P.330-339.

125. Russel A.J. Antibody-antigen binding in organic solvents / Russel A.J., Trudel L.J., Skipper P.L., Groopman J.D., Tannenbaum S.R., Klibanov A.M. //

126. Biochemical and Biophysical Research Communications.-1989.-V.158,№1.-P.80-85.

127. Stocklein W., Gebbert A., Schmid R.D. Binding of atrazine herbicides to antibidies in anhydrous organic solvents // Analytical Letters.-1990.-V.23,№8.-P.1465-1476.

128. Immunosensor for trace determination of Irgarol 1051 in seawater using organic media / Penalva J., Gonzalez-Martinez M.A., Puchades R., Maquieira A., Marco M.P., Barcelo D. // Anal.Chim.Acta.-1999.-V.387.-P.227-233.

129. Penalva J., Puchades R., Maquieira A. Analytical properties of immunosensors working in organic media // Analytical Chemistry.-1999.-V.71,№17.-P.3862-3872.

130. Horacek J., Skladal P. Effect of organic solvents on affinity interactions // Chem.Papers.-1998.-V.52.-P.294-295.

131. Horacek J., Skladal P. Effect of organic solvents on immunoassays of environmental pollutants studied using a piezoelectric biosensor // Anal.Chim.Acta.-2000.-V.412,№l-2.-P.37-45.

132. Skladal P. Effect of methanol on the interaction of monoclonal antibody with free and immobilized atrazine studied using the resonant mirror-based biosensor //Biosensors & Bioelectronics.-1999.- V.14.- P.257-263.

133. Stocklein W., Scheller F.W., Abuknesha R. Effects of organic solvents on semicontinuous immunochemical detection of coumarin derivatives // Sensors and Actuators.-1995.-V.24-25.-P.80-84.

134. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии.-М. Мир, 1991.-763 с.

135. Золотов Ю.А. Экстракция в неорганическом анализе М.:Изд-во МГУ,-1988.-С.12.

136. Carr R.L. Chambers JE. Kinetic analysis of the in vitro inhibition, againg, and reactivation of brain acetylcholinesterase from rat and channel catfish by paraoxon and chlorpyrifos-oxon // Toxicology & Applied Pharmacology.-1996.-V.139.

137. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Пылова Т.Н. Химические средства защиты растений. Справочник. // М.: Химия.- 1980.-288с.

138. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ // Приложение к журналу "Защита и карантин растений".—1998.-№5.

139. Mulchandani A., Mulchandani P., Chen W. Amperometric thick-film strip electrodes for monitoring organophosphate nerve agents based on immobilized organophosphorus hydrolase // Anal.Chem.-1999.-V.71,№ll.-P.2246-2249.

140. Development of solid-phase enzyme-linked immunoassay for detection of propanil in rice / Krasnova A.I., Krikounova V.S., Eremin S.A., Scekaca A. // Vestnik Moskovskogo Universiteta. Khimiya.-2000.-V.41,№6.

141. Клисенко M.A., Лебедева Т.А., Юркова З.Ф. Химический анализ микроколичеств ядохимикатов. М.: Медицина.-1972.-312с.

142. Гидрохимические показатели состояния окружающей среды. Справочные материалы. / Гусева Т.В., Молчанова Я.П., Заика Е.А., Виниченко В.Н., Аверочкин Е.М. Эколайн, - 2000 г.

143. Каспаров В.А., Промоненков В.К. Применение пестицидов за рубежом -М.:ВО"Агроиздат," 1990.-224с.