Амперометрический холинэстеразный биосенсор в анализе биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В.И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЙ БИОСЕНСОР В АНАЛИЗЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00. 02 - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

ЛИ Фа-шень

и

КАЗАНЬ - 1992

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамею государственного университета имени В.И.Ульянова-Ленина

Научные руководители: доктор химических наук, профессох

член-корреспондент Академии естес венных наук Российской Федерации Г.К.Будников

кандидат химических наук, доцент Э.П.Медянцева

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессо

В.С.Цивунин

кандидат химических надгк, доцент Г.А.Боос

Ведущая организация: Башкирский государственный

университет (г.Уфа)

Защита состоится "/¿МЯМЬ/ 1992 г. в /4/час, на заседании специализированного Сойета К 053.29.02 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина (ул.Ленина, 18,.химический факультет, Бутлеровская аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просьба присылать по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18, КГУ, Научная часть.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного

Совета, кандидат химических наук^ир^т,/Ы.Р. Федотова

Актуальность темы. В последнее время наблюдается тенцен-;ия бурного развития биохимических сенсоров (биосенсоров) на снове различных биоматериалов. Это связано, прежде всего с ем, что биосенсоры, в отличие от других видов датчиков, способны давать непосредственную информацию и контролировать состояние как объектов окружающей среды, так и живых организ-юв. Все большее значение приобретает необходимость анализа ю типу on tine, и ¿n Cine . Все это нашло отражение в поя-швшихся в последние годы на мировом рынке коммерческих био-:енсорных устройств для использования в медицине, сельском :озяйстве, промышленности и т.д.

На кафедре аналитической химии Казанского государствен-гого университета в течение ряда лет проводятся разработка и «следование амперометрических биохимических сенсоров, в 1астности, на основе иммобилизованной холинэстеразы (ХЭ). В соде предварительных исследований была показана перспектив--гость использования такого рода устройств для определения потенциальных загрязнителей окружающей среды.

Совершенствование и модификация подобных биосенсоров с целью получения оптимального аналитического сигнала, упрощения методик анализа л расширения областей применения этих цатчиков, несомненно, является актуальной задачей в настоящее время.

Разработка новых более эффективных способов иммобилизации Ферментов, изучение механизмов действия их эффекторов и эбеспечение условий повышения избирательности их действия -все это способствует появлению новых более современных биохимических устройств, отвечающих все возрастающим требованиям , современного аналитического контроля.

Сделать определение, по-существу, уникальным по селективности позволяет новый тип модификации биосенсоров, основанный на использовании реакции биоспецифического взаимодействия антиген - антитело. Такие иммуносенсоры весьма перспективны как для разработки новых методов диагностики заболеваний, так и избирательного определения биологически актизных соединений в

сложных по составу многокомпонентных смесях. В частности, это один из реальных путей решения задач, стоящих перед современной аналитической химией по разработке чувствительных, экспрессных и избирательных способов определения экотоксикантов. И холинэстераза относится как раз к тем ферментам, которые еще недостаточно изучены в этом плане.

Цель .исследования заключалась в усовершенствовании амперо метрического холинэстеразного биосенсора и выявлении возможностей и оптимальных условий определения ингибиторов ХЭ, а так же сочетании разработанного ферментного датчика с иммунологическими реакциями для более эффективного проведения иммунофер-ментного анализа (ИФА).

Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН СССР по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7 по теме № 01.86.0106158, согласно приказу Государственного Комитета СССР по народному образованию № 59 от 31.01.89г. и на основании приказа Миннауки РФ № 133 ф от 04.02.92г.

Научная новизна. Предложен новый вариант иммобилизации ХЭ путем последующей обработки готовых Ферментсодержащих образцов глутаровым альдегидом (ГА). Изготовленные предложенным способом пленки с иммобилизованной ХЭ (ИХЭ) использованы в ам-перометрических биосенсорных устройствах с более высокими эксплуатационными характеристиками. Исследовано ингибир$ощее действие ряда фосфор-, серо- и хлорсодержащих пестицидов на иммобилизованную ХЭ и показано, что эти эффекты могут быть использованы для их количественного определения с нижней границей определяемых содержаний на несколько порядков ниже ПДК. Количественно описаны некоторые характеристики ферментативных реакций с участием ИХЭ в присутствии ряда органических ингибиторов данного фермента. Установлен тип ингибирования некоторых ингибиторов ХЭ с помощью разработанного датчика. Разработана" методика определения ряда ионов тяжелых металлов (цинк, медь, хром, железо, цирконий, титан, гафний, ниобий и тантал) с использованием биосенсора на основе ХЭ. Данные методики применены для оценки степени коррозии соответствующих материалов, предназначенных для имплантации. Показана возможность использования модифицированного холинэстеразного биосенсора для качествен-

ной и количественной оценки содержания вируса крапчатости гвоздики в растительных экстрактах. Подобраны условия количественного определения микроколичеств белка. Определены константы связывания иммунного комплекса антиген - антитело по данным вольтамперометрических измерений.

Практическая значимость. Предложенный способ получения ИХЭ может быть использован в лабораториях и на предприятиях аналитического, биохимического и медицинского профилей для применения в различных типах аналитических систем для изготовления на их основе высокочувствительных анализаторов. Способ икгмобилизации защищен авторским свидетельством. Разработанные методики определения ряда пестицидов и тяжелых металлов позволяют устанавливать содержание этих соединений в реальных объектах на концентрационных уровнях ниже ПДК. Полученные результаты о возможности использования холинэстеразного биосенсора в определении вируса растений могут служить основой для разработки методов диагностики заболеваний как растений, так и животных.

На защиту выносятся:

- способ получения иммобилизованной ХЭ для использования ее при изготовлении холинэстеразного биосенсора;

- данные по кинетическим параметрам реакции гидролиза субстрата ХЭ;

- способы определения некоторых (Босфор-, серо- и хлорсодержа-щих пестицидов;

- результаты оценки содержаний тяжелых металлов в их водных вытяжках из тканей организмов;

- новый вариант определения одного из компонентов"биоспецифического взаимодействия (антигена) с использованием модифицированного биосенсора на основе ИХЭ на примере вируса крапчатости гвоздики;

- возможность определения констант связывания иммунокомплек-сов антиген - антитело по вольтамперометрическим данным на примере [иммуноглобулины £ - вирус крапчатости гвоздики].

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждены на У1 Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (г.Москва, 1991г.), Всесоюзной конфе-

ренции "Современные методы контроля качества окружающей среды и пищевых продуктов" (г.Краснодар, 1991г.), конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды" (г.Санкт-Петер-бург - Сочи, 1391г.), научно-техническом семинаре " Химический анализ пищевых продуктов и загрязнений окружающей среды" (г. Москва, 1992г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ. Из них I авторское свидетельство на изобретение, 2 стать и тезисы 3 докладов на Всесоюзных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков (из них 4 в приложениях), 21 таблицу и список литературы из 129 наименований. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводоб и списка литературы, а также 3 приложений. В первой главе рассмотрен механизм действия холинэстеразы как жизненно важного фермента, проанализированы литературные сведения по иммобилизации ферментов и созданию электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных Ферментов, а также обобщены некоторые закономерности кинетики ферментативного катализа и кинетики взаимодействия антигенов (Аг) с антителами (Ат).-Во второй главе формулируются поставленные задачи, описываются изученные объекты, экспериментальные условия и техника эксперимента. Третья глава посвящена получению ИХЭ и изучению активности и устойчивости во времени изготовленных предложенным способом препаратов. В четвертой главе представлены экспериментальные данные по определению пестицидов и тяжелых металлов и описанию количественных характеристик кинеть ки холинэстеразного катализа. Пятая глава посвящена новому варианту Шк с использованием биохимически модифицированного ферментного электрода, в сенсорную часть которого входит ХЭ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ- ЧАСТЬ

Экспериментальная работа выполнена на осциллографическо полярографе ЦЛА модели 03 с ячейкой, термостатированной при 25 + 0,2°С. Рабочим электродом служил биохимический сенсор, состоящий из стационарного ртутно-пленочного электрода (СРПЭ с серебряной подложкой и иммобилизованной ХЭ. Электрод срав-

нения - насыщенный каломельный электрод. Использовали бутирил-холинзстеразу сыворотки крови лошади (КФ 3.1Л.8) с активностью НО АЕ/мг. В качестве субстрата ХЭ применяли бутирил-тиохолин иодид (БТХИ). Объекты исследования - пестициды: тио-дан, банкол, Фозалон, глифосат, волатон, паратион и хлорофос; иоиы тяжелых металлов: ф> (II), Qu (II), С г (III), Те (III) .Ti-M Zz (1У), Hf (1У), (У) и Та (У). Использовали водные вытяжки материалов, предназначенных для имплантации. Применяли также очищенные кроличьи иммуноглобулины , специфичные к вирусу крапчатости гвоздики; лиофилизированные растительные экстракты здоровой и больной гвоздик; очищенный препарат вируса крапчатости гвоздики (Carnation тоШе vtius - CAZ MV ) (2мг/мл).

Кинетические параметры ферментативной реакции определяли путем интегрального анализа полной кинетической кривой при определенной концентрации субстрата и путем анализа начальных скоростей реакции при различных концентрациях субстрата.

.ИММОБИЛИЗОВАННАЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗА КАК СЕНСОРНАЯ ЧАСТЬ БИОХИМИЧЕСКОГО ДАТЧИКА

Действие биохимического сенсора, состоящего из трансдью-сера, в качестве которого служит стационарный ртутно-пленоч-ный электрод, и иммобилизованной ХЭ, основано на реакции ферментативного гидролиза БТХИ. Аналитическим сигналом служит высота катодного пика при потенциале -0,55 В, относящегося к обратимому восстановлению продукта взаимодействия тиола, образовавшегося при гвдролизе БТХИ, с материалом электрода -ртутью. К числу факторов, от которых зависит величина тока пика, относятся активность иммобилизованного фермента и наличие эффекторов ХЭ.

Для разработки амперометрического холинэстеразного биосенсора с лучшими эксплуатационными характеристиками была сделана попытка проводить иммобилизацию ХЭ путем первоначального включения Фермента в пленку из нитрата целлюлозы (НЦ) с последующей обработкой готовых пленок раствором глутарового альдегида (ГА).

Долучение ИХЭ. Навеску НЦ типа коллоксилин растворяли в смеси толуола и бутилацетата (1:1,6), добавляли вод-

ный раствор ХЭ и гексан для коагуляции. На ровной стеклянной поверхности получали пленку. Высушенную мембрану обрабатывали водным раствором глутарового альдегида. Оптимальный состав сенсорной части: ХЭ - 26,5$, НЦ - остальное, Срд - 5%.

Удельную активность полученных образцов ИХЭ оценивали путем титрования щелочью (ЫаОН)кислоты, выделяющейся при ферментативном гидролизе БТХИ, и по данным, полученным из кинетической кривой ферментативной реакции (анализ начальных скоростей реакции). Удельные активности измеренные этими двумя методами незначительно отличаются друг от друга ((1,05+0,08) и (1,19+0,05) мкмоль/мин.см^ соответственно). Ферментсодержа-щие образцы, полученные предлагаемым способом , обладают каталитической активностью примерно в 3 - 4 раза большей, чем те, что получали ранее известными методами. Кроме того, предлагаемый способ иммобилизации ХЭ позволяет получить образцы ИХЭ с высокой устойчивостью во времени. Изготовленные пленки с ИХЭ сохраняют свою активность в течение не менее 5 месяцев практически без изменения.

БИОХИМИЧЕСКИЙ СЕНСОР В АНАЛИЗЕ СОЕДИНЕНИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ИНГИБИТОРАМИ ХОЛИНЭСТЕРАШ

Использование биосенсора при определении пестицидов

Уменьшение каталитической активности ИХЭ, выражающееся в снижении величины тока при потенциале -0,55 В, вызывают не только такие фосфорорганические соединения (ФОС), которые можно сразу отнести к ингибиторам ХЭ, исходя из их строения, как хлорофос и глифосат, но и соединения с ? =5 связью (фоза-лон, фталофос, волатон, паратион), а также некоторые серо-(банкол) и хлоросодержащие (тиодан) соединения. Причем торможение каталитической активности наблюдается в широком концентрационном интервале (в общем случае от 1.10" до п ,10~^моль/л) что позволило разработать методики определения этих пестицидов с помощью биосенсора на основе ИХЭ, полученной предлагаемым способом. Наиболее низкие нижние границы определяемых концентраций наблюдаются в случае таких фосфорсодержащих пестицидов.

ак глифосат и хлорофос (табл.1). Это связано со спецификой заимодействия этих ФОС с ферментсодержащей частью биосенсо-ia. Такие же соединения, как тиодан и банкол, не обладают пецифическим сродством к ХЭ и сн их несколько выше. Исполь-ование в составе биосенсора ИХЭ, обладающей более высокой :аталитической активностью, позволило снизить сн> не прибегая : действию активаторов, например, ионов Ca(II), что применяли 1анее для достижения этого эффекта, и тем самым упростить процедуру анализа.

Таблица I

Аналитические возможности определения пестицидов с помощью биосенсора на основе ИХЭ (я =4, рН=9,05 - боратный буферный раствор, CBTXif2'^ моль/л)

Соединение

Интервал определяемых концентраций, моль/л

т

мг/л

ПДК для воды (гигиенич.),

мг/л

Тиодан I.I0"7- 5. ICf10 2,04.IO-4 -

Банкол I.I0"6- 3. io"n I,29.IO"5 -

Фозалон 1.1СГ5- I. io-12 I,84.I0"6 0,1

Фталофос I.I0-6- I. IO"12 1,59.IO-6 0,2 *

Глифосат I.IO"6- I. IO"13 3,38.IO-8 0,1

Волатон I.I0"7- 4. IO"13 I,I9.I0~7 0,002

Паратион I.IO"6- I. IO-9 n

I.IO"9- 8. IO"13 2,33.10 ' 0,4

Хлорофос I.IO"4- I. IO-13 2,45.IO-8 0,01

Экспериментальные данные показывают, что практически во зсех случаях возможно определение пестицидов на концентрацион-шх уровнях ниже ПДК, что создает условия для использования шперометрического биосенсора на основе ИХЭ для контроля оста-ючщк количеств пестицидов как в продуктах питания и сельскохозяйственной продукции, так и в объектах окружающей среды.

Для выяснения закономерностей действия определяемых орга нических ингибиторов на ИХЭ, по данным вольтамперометрических измерений определены некоторые характеристические параметры Ферментативной реакции гидролиза БТХИ, такие, как кажущаяся константа Михаэлиса, максимальная скорость и каталитическая константа. Установлено, что кинетика гидролиза БТХИ в присутствии ИХЭ и изучаемых ингибиторов подчиняется уравнению Ми-хаэлиса-Ментен. Анализ данного уравнения в виде двойных обратных координат Лайнуивера-Берга в присутствии и в отсутствие ингибиторов позволил оценить также и тип ингибирования. Серия прямых, пересекающихся в одной точке на оси ординат, указывает на конкурентный характер ингибирования хлорофоса, глифоса-та и банкола. Пересечение прямых в точке во втором квадранте (в случае фталофоса) характерно для.смешанного типа ингибирования, а серия прямых, пересекающаяся в первом нвадранте в точке, лежащей правее оси ординат, но левее оси абсцисс, указывает на псевдоингибирование (тиодан). Знание типа ингибирования в ряде случаев позволяет подобрать оптимальные условия для определения самого ингибитора. Например, уменьшение концентрации субстрата в 10 раз позволило снизить сн примерно на порядок для банкола (2.10" ^моль/л), а для фталофоса до 6. Ю-"' моль/л-. Величины констант ингибирования и указывают на тс что антихолинэстеразная активность исследуемых соединений уменьшается в ряду глифосат >фталофос > банкол>тиодан, что согласуется со строением этих ингибиторов, а также подтверэвда-ет данные о том, что фосфорорганические ингибиторы обладают большей способностью тормозить каталитическую активность ИХЭ, чем, например, серо- и хлорсодержащие.

Возможности аналитического определения тяжелых металлов

Поскольку все тяжелые металлы могут быть при определенных условиях и концентрациях биологически активными, то представляло интерес рассмотрение действия на биосенсорную часть электрода широкого круга ионов таких металлов, как2а, Си, Сг , Ре , 2г> Т\' » » .Кб и Та • Все исследуемые ионы оказывают на ИХЭ ингибирующее действие. Линейная зависимость между ве-

ичиной тока в пике и-^с^ сохраняется в широком диапазоне онцентраций (от п .10 до п. Ю"10моль/л). Некоторые из полу-енных результатов приведены в табл. 2. Все изучаемые ионы ¡еталлов являются неспецифическими ингибиторами ХЭ. При совестном присутствии ионов этих металлов в растворе в концен-рациях на уровне сн, наблюдается обычно больший ингибирующ-¡й эффект, чем в случае действия лишь одного из них. Большие :е концентрации этих металлов вызывают ингибирующий эффект, ¡лизкий к действию наиболее сильного из них.

Таблица 2

Результаты определения ионов металлов с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора ( Па 4, Р = 0,95)

Ион металла Введено, * моль/л Найдено, моль/л ¿г

Си (II) 5,0.Ю-9 1,0. Ю-8 1,оло-6 (3,5+0,6). Ю"9 (1,4+0,3). Ю"8 (0,8+0,1).10"^ 0,273 0,211 0,080

1,0. КГ9 1,0. КГ8 1,0. Ю"7 (1,8+0,5). Ю"9 (1,3+0,2). Ю-8 (1,1+0,1).Ю-7 0,145 0,106 0,005

т«. (У) 1,0. Ю-8 5,0. Ю-7 - 1,0. Ю"6 (0,6+0,3). Ю-8 (6,8+1,1). Ю"7 (1,2+0,1).Ю~б 0,290 0,121 0,005

Возможность определения изученных ионов была использована для оценки их содержания в водных вытяжках материалов, используемых для имплантации. При этом использовании биосенсор на основе ИХЭ имеет одно важное преимущество перёд всеми другими способами анализа, так как в этом случае условия

наиболее приближены к тем, в которых реагировал бы живой организм на имплантант.

В случае пластин из меди и титана наличие ионов металло! в растворе мокно заметить уже, начиная с 10-х суток хранения имплантируемых материалов (Си (II) - (8,00+1,68).10 моль/л, (5г=0,2Ю),Е(1У) - на уровне сн(7,90+1,87)Л0~10 (5Г=0,230)) Материалы из Та более устойчивы - ионы этого металла обнаруживаются в исследуемом растворе лишь через 2 месяца. Материалы на основе нитридов металлов (Сг,Т*,2г) не оказывают ин-гибирукщего действия на биосенсор даже через 3 месяца хранения.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО БИОХИМИЧЕСКОГО СЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА РАСТЕНИЙ

Модификация сенсорной части амперометрического холинэс-теразного биосенсора путем введения в ее состав одного из кои понентов биоспецифического взаимодействия - антигена (Аг) или антитела (Ат), в данном случае иммуноглобулинов! б, специфичных к вирусу крапчатости гвоздики, позволила получить иммуно-ферментный электрод (ШЪ) для качественного и количественного определения данного вируса растений. Оптимальный состав биосенсорной части: ХЭ - 26,5%; Ат - 5,88.Ю-"^; НЦ - остальное. Установлено, чтр включение помимо ХЭ в состав пленок, иммуноглобулинов незначительно сказывается на каталитической активности (удельная активность сенсорной части до модификации (1,15+0,06), а после модификации (1,03+0,06)мкмоль/мин.см^). Модифицированная таким образом сенсорная часть стабильна во времени.

Получение сенсорной части И$Э. На веску НЦ растворяли в смеси толуола и бутилацетата (1:1,6), добавляли водный раствор ХЭ и раствор иммуноглобулинов б с разными концентрациями. После перемешивания добавляли гексан в качестве коагулянта. Получали из этой смеси пленку, которую обрабатывали водным раствором глутарового альдегида. Затем мембрану обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина в физиологическом фосфатном буферном растворе.

При отсутствии в растворе вируса крапчатости гвоздики 5иосенсор работает в обычном режиме. При наличии г.е б исследуемом растворе вируса происходит быстрое связывание Аг со специфическими Ат, иммобилизованными в пленку из НЦ, с образованием иммунокомплекса Аг - Ат. Образующиеся имм.унокомплек-:ы создают стерические препятствия для подхода !.:олекул субстрата к активным центрам ИХЭ, что приводит'к спаду высоты катодного пика при потенциале -0,55 В. -Зависимость между величиной тока в пике и концентрацией вируса в растворе выражается уравнением У* -(0,64+0,07)х + (6,85+0,26) ( г=0,9970). Некоторые из полученных результатов представлены в табл. 3.

Растительные экстракты здоровой гвоздики не вызывают ^еньшения катодного пика. Нижняя граница определяемых содержаний вируса составляет 0,15 мкг/мл. Многократное использова-■ше ИФЭ возможно после реактиваций его биосенсорной части раз-птчными реагентами. Полная реактивация и близкая к ней наблю-щется при обработке растворами мочевины.

Таблица 3

Результаты определения вируса крапчатости гвоздики с помощью модифицированного холинэстеразногс б^оеенсора (П.= 4, Р= 0,95)

Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл 5г.10^

5,00 4,00 2,00 1,00 0,50 0,20

* - Найдено в одном из образцов растительного экстракта больной гвоздики.

Одним из факторов, определяющим чувствительность И^А, является значение констант связывания иммунного комплекса .г - Ат. На основе данных определения вируса были офнены кон-

5,10+0,15 1,9

4,30+0,17 4,0

2,20+0-, 10 5,2

0,90+0,06 6,4

0,40+0,06 14,7

0,25+0,05 24,5

0,60+0,07 * 9,3

- -

станты связывания иммунекомплекса[1д& - вирус Крапчатости гвоз-дик>р. Микрэколичество Аг, оставшееся в растворе после образо-

А„-Х

\

\

ю

ис.

2 <1 6 8

График Скэтчарда для наховдёния

констант связывания иммунного

комплекса £1дС-вирус крапчатости

гвоздики 3

А - общая концентрация Аг в сис-

теме; х - равновесная концентра-

ция иммунного комплекса.

'9 М-1

вания соответствующего комплекса, необходимое для расчета констант связывания, было определено с помощьв реакции Брдички т.е. реакции каталитического выделения водорода в присутствии ионов кобал] та (11,111) и белка на СРПЭ. Величины констант (К„), най-d

денные из граф» ка Скэтчарда, составляют Ка = Нелинейный xapai-

(3,29+0,53)ЛО10, К0 = (6,61+1,48).10

тер взаимодействия Аг - Ат в координатах Скэтчарда свидетел. ствует о возможности существования двух популяций Ат с более высокой и низкой специфичностью к определяемому вирусу.

вывода

1. Разработан новый способ получения иммобилизованной холинэстеразы, по которому ферментсодержащие образцы обладает высокой каталитической активностью (удельная активност 1,15 + 0,05 мкмоль/мин.

см2) и устойчивостью во времени (срок хранения не менее 5.месяцев), что позволяет использовать их в качестве составной части биохимического сенсора.

2. Значения кинетических параметров ферментативной реакции гидролиза бутирилтиохолин йодида (кажущиеся константы Михаэлиса,максимальная скорость реакции, каталитические константы) , вычисленные по данным вольтамперометрических измере-

1ий в присутствии и в отсутствие органических ингибиторов, ис-гользованы для определения ингибирующей способности и типа шгибирования. Ингибирующая способность уменьшается в ряду 'лифосат>фталофос> банкол> тиодан. Глифосат и банкол относят-:я к ингибиторам конкурентного типа, для фталофоса характерен ¡мешанный тип ингибирования, а тиодан действует по типу псев-^ингибирования.

3. Ингибирующее действие фосфор-, хлор- и серосодержащих пестицидов на иммобилизованную ХЭ использовано для их оп-)еделения по амперометрическому сигналу с нижней границей в феделах от 5,0Л0-11до 9,5.Ю~14моль/л. Ионы тяжелых метал-юв оказывают на ИХЭ ингибирующее действие в достаточно ши-юком интервале концентраций. Максимальный ингибирующий эффект жазывают ион Он (II) (сн=4.Ю~10моль/л) и 2Г (1У) (сн=5.Ю~10 юль/л).

4. Изготовлен иммуноферментный электрод путем модифика-щи биосенсорной части компонентами биоспецифического взаимо-(ействия (специфическими иммуноглобулинами кролика), позво-[яющий определять вирус крапчатости гвоздики с нижней грани-(ей определяемых содержаний 0,15 мкг/мл.

5. Реакция каталитического выделения водорода в присутст-1ии ионов Со (11,111) и микроколичеств белка позволяет опре-;елять концентрации антигена от 0,1 до 2,0 мкг/мл.

6. Значения констант связывания гетерогенного иммунного :омплекса [иммуноглобулины & - вирус крапчатости гвоздик^

К„ =(3,29+0,53).1010М_1, К =(6,61+1,48).Ю9 М-1), обеспечи-

ат ар

1ают высокую чувствительностБ иммуноферментного анализа и гказывают на наличие двух популяций антител в антисыворотке.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

I. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С., Каргина [.В., Ли Фа-тень. Определение биологически активных органичес-:их соединений с помощью вариантов биохимического сенсора на снове иммобилизованной холинэстеразы //Тез. докл. У1 Всесоюз. онф. по аналитической химии органических веществ. - М., 1991. С.119.

2. Медянцева Э.П., Ли Фа-шень, Каргина И.Ю., Будников

Г.К., Бабкина С.С. Амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной холинэстеразы в .биотестировании пищевых продуктов и объектов окружающей среды //Тез. докл. Всесоюз. конф "Современные методы контроля качества окружающей среды и пищевых продуктов" - Краснодар, 1991. - С.30.

3. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С., Ли Фа-ше. Каргина И.Ю. Амперометрический отклик холинзстеразного биосенсора в биотестировании природных объектов /Дез. докл. Всесоюз. кон$. "Аналитическая химия объектов окружающей среды". Сант-Петербург - Сочи, -1991. -С.229.

4. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Ли Фа-шень. Амперометрические биосенсоры в анализе пищевых продуктов и природных вод // Химический анализ пищевых продуктов и загрязнений окружающей среды . - М., 1992. - С.42-45.

5. Положительное решение от 03.01.92. по заявке №4929346, 13 от 17.04.91. Способ получения иммобилизованной холинэстеразы /Э.П.Медянцева, Ли Фа-шень, Г.К.Будников, Е.Б.Никольская А.В.Волков.

6. Аналитические возможности биосенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы при определении пестицидов /Э.П.Медянцева, Ли Фа-шень, О.В.Федосеева, Г.К.Будников //Казанский ун-т. - Казань, 1992. - Деп. в ОНИИТЭХИМ 22.04.92, № 187 -

хп 92.

Сдано в набор II.11.92 г. Подписано в печать 12.11.92 г. Форм.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л.1. Тирах 100. Заказ 618.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5