Кинетико-термодинамические закономерности стабилизации растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I.Общие сведения о глюкоамилазе.

1.1.Строение и физико-химические свойства глюкоамилаз.

1.2.Субстратная специфичность глюкоамилаз.

1.3.Структура активных центров глюкоамилаз.

1.4.Механизм действия глюкоамилаз.

2.Стабилизация глюкоамилаз.

2.1.Факторы, влияющие на термостабильность растворимой г люко амилазы.

2.2.Иммобилизация глюкоамилазы и ее влияние на термостабильность фермента.

2.3.Влияние субстратов и продуктов ферментативной реакции на термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы.

Выводы из литературного обзора и постановка основных задач работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I .Материалы.

2. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I .Термостабилизация глюкоамилазы.

1.1.Влияние субстрата и продукта ферментативной реакции на скорость термоинактивации фермента.Кинетический анализ.

1.2.Иммобилизация глюкоамилазы.Влияние субстрата на термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы.

1.3.Влияние глюкозы на термостабильность глюкоамилазы

1.4.Температурные зависимости термоинактивации растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы.

1.5.Влияние химической модификации на активность и термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы.

1.6.Инактивация глюкоамилазы в ходе реакции.

1.7.0 возможном пределе термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы.

ВЫВОДЫ.ПО

В последние годы наряду с поиском новых источников кормового и пищевого белка, значительный интерес проявляется к расширению сырьевых источников сахаристых веществ и более рациональным спосабам их использования. Одно из основных направлений этой проблемы - получение глюкозы ферментативным путем из природного сырья (крахмал,целлюлоза). В настоящее время для получения пищевой глюкозы наиболее широко применяется крахмал. Процесс получения глюкозы из крахмала при помощи растворимой глюкоамилазы широко используется в промышленности многих стран. В связи с хорошо известными преимуществами иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми, большой интерес вызывает применение в крупнотоннажном производстве глюкозы иммобилизованной глюкоамилазы. Это позволило бы значительно упростить процесс гидролиза крахмала, который целесообразно проводить при повышенной температуре (б0°-б5°). Благодаря этому увеличивается скорость ферментативной реакции, происходит пастеризация образующегося раствора глюкозы и уменьшается опасность микробного заражения реактора. Однако, при этом увеличивается скорость тер' моинактивации фермента. Таким образом, возникает необходимость поиска путей повышения термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы.

Несмотря на большое количество работ по модификации или иммобилизации глюкоамилазы с целью ее стабилизации, термостабильность полученных препаратов остается неудовлетворительной. Время полуинактивации наиболее стабильных препаратов иммобилизованного фермента при 65° не превышает 5-7 дней. Характеризует ли эта величина определенный предел термостабильности глюкоамилазы при данных условиях, до последнего времени оставалось неизвестным. Таким образом, как с теоретической, так и с практической точки зрения представляется важным изучение принципов термостабилизации глюкоамилазы и выявление реальных возможностей повышения устойчивости данного фермента к тепловым воздействиям.

Как показано в наших исследованиях, глюкоамилаза представ* ляет довольно необычный пример для изучения кинетики ферментативных реакций. При связывании со специфическими субстратами, термостабильность глюкоамилазы резко возрастает по сравнению с термостабильностью свободного фермента. Кинетические закономерности подобных реакций в литературе практически не изучались, хотя они представляют большой интерес как для развития формальной кинетики ферментативного действия, так и для описания термоинактивации реальных систем с участием глюкоамилазы. Для описания подобных систем в настоящей диссертационной работе впервые проведено формально-кинетическое рассмотрение скорости термоинактивации фермента в зависимости от концентрации субстрата, а также полных кинетических кривых процесса с учетом термоинактивации фермента в ходе реакции. Экспериментально подтверждена справедливость разработанных кинетических подходов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Общие сведения о глюкоамилазе

Глюкоамилаза - амилолитический фермент, катализирующий последовательное отщепление о<-глюкозидных остатков от невос-станавливающего конца о<-(1;4)-поли- или олигоглюкозидов. Кроме того, фермент способен гидролитически расщеплять ио*-(1;6) глюкозидную связь. Характерной особенностью глюкоамилаз различного происхождения является увеличение скорости гидролиза концевой глюкозидной связи с увеличением степени полимеризации субстрата. По рекомендации Международного биохимического союза глюкоамилазам присвоен кодовый номер 3.2.1.3. и систематическое названиеы-(-1;4)-Б -глюкан-глюкозидаза /I/.

В литературном обзоре будут рассмотрены вопросы, связанные в основном с глюкоамилазами, продуцируемыми микроскопическими грибами и дрожжами, так как в настоящее время они имеют наиболее широкое применение и наиболее глубоко изучены.

Основным источником глюкоамилаз служат микроскопические мезофильные грибы рода Aspergillus /2-12/. и Rhizopus /12,13/ а также дрожжи рода Enâomycopsis /14-17/ и Endomyces /18,19/. Кроме того глюкоамилаза была выделена из термофильных грибов Humicola lanuginosa /20/,Thorula thermophilia /21/ и ряда других грибов, таких как Pénicillium oxalycium /22/,Monaseus caoliang /23/, Cophalosphorum carticola /24/,Trichoderma viride /25/,Coniophora ceret>rella/26/. В последние годы глюкоамилаза была обнаружена в семенах сахарной свеклы /27/ и плодовых телах Lentinus endodes /28/. Одной из важнейших задач в поиске новых продуцентов этого фермента является выделение высокопродуктивных штаммов, способных синтезировать глюкоами-лазу с минимальным количеством таких сопутствующих ферментов, как Ы-, р-амилазы, трансглюкозидазы и протеазы.

выводы

1. Разработан новый кинетический метод изучения влияния субстрата и других эффекторов на скорость термоинактивации ферментов, позволяющий определить константу скорости инактивации свободного фермента, комплекса фермент-эффектор и константы связывания фермента с эффектором. Метод впервые использован для изучения влияния субстрата (мальтоза,мальтодекстрины) '.и продукта ферментативной реакции (глюкозы) на кинетику термоинактивации растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы.

2. Показано, что связывание субстрата (мальтозы или мальто декстринов) с активным ценрром глюкоамилазы приводит к значительному увеличению термостабильности фермента, стабилизация в большей степени выражена по отношению к растворимому ферменту, чем к иммобилизованному и не зависит от степени полимеризации субстрата.

3. Термостабильность комплекса фермент-продукт близка к термостабильности фермент-субстратного комплекса, однако на практик ке глюкоза не оказывает заметного действия на фермент из-за плохого связывания с активным центром глюкоамилазы.

4. Иммобилизация на неорганических носителях и связывание с субстратом приводит к противоположным эффектам изменения энергии активации термоденатурации (Е ) глюкоамилазы. Инактивация иммобилизованного фермента характеризуется меньшей, а инактивация его фермент-субстратного комплекса - большей величиной Е , чем инактивация свободной растворимой глюкоамилазы. Носитель и способ иммобилизации не оказывают существенного влияния на величину Е термоинактивации фермент-субстратного комплекса.

5. Показано, что термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы при больших концентрациях субстрата в основном обусловлена термостабильностью фермент-субстратного комплекса.Суммарный эффект стабилизации глюкоамилазы за счет ее иммобилизации и связывания субстрата по отношению к растворимому ферменту ограничен практически одним и тем же пределом, достигающим 200 раз при 75°.

6. Изучено влияние химической модификации и количества ко-валентных связей между молекулой глюкоамилазы и носителем на пкг активность и термостабильность фермента. Показано, что увеличение степени модификации глюкоамилазы и количества связей фермент-матрица приводит к дестабилизации и потере активности фермента.

7. Впервые показана возможность теоретического расчета полных кинетических кривых ферментативной реакции в условиях взаимного истощения фермента и субстрата (инактивация фермента в ходе реакции). Метод использован для изучения кинетики действия глюкоамилазы на мальтозу при 65°.

В заключение кратко сформулируем основные выводы, вытекающие из рассмотренного материала: а) Температурные зависимости эффектов стабилизации за счет иммобилизации и связывания субстрата имеют противоположный характер. При понижении температуры влияние иммобилизации уменьшается, а эффект стабилизации субстратом возрастает. В интервале температур 75-65° суммарный эффект стабилизации возрастает в 2 -2,5 раза. б) Нарушение структуры углеводной части фермента приводит к резкому уменьшению величины Е^ и снижению стабилизирующего действия субстрата.

1.5.Влияние химической модификации на активность и термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы

Наряду с хорошо известными преимуществами неорганические носители!-обладают и некоторыми недостатками, одним из которых является ограниченная возможность образования большой концентрации функционально активных групп на поверхности. Кроме того, "жесткая" сруктура неорганияеских носителей исключает возможность комплементарности между поверхностью матрицы и глобулы фермента. Следовательно, при их использовании, вряд ли можно ожидать образования максимально возможного количества связей между ферментом и носителем. В последнее время успешно развивается концепция, что общий принцип стабилизации ферментов при их иммобилизации состоит в закреплении нативной конформации белковой глобулы /112/. В частности этого можно достичь при многоточечном ковалентном связывании молекулы биокатализатос ра с носителем. Чем больше количество связей, тем "жетче" закрепляется белковая глобула и тем труднее проходит ее разворачивание под действием температуры, приводящее к инактивации фермента. Примером тому служит многоточечная иммобилизация химотрипсина в полиакриламидном и полиметакрилатном гелях, благода

3 12 0 ря чему увеличивается его термостабильность при 60 в 200 и

1000 раз соответственно./112/.

Как было показано в предыдущем разделе, иммобилизация глю-коамилазы на неорганических носителях приводит к весьма незначительной термостабилизации (см.табл.1). В связи с этим возникает вопрос, - возможно ли повысить термостабильность этого фермента путем многоточечной иммобилизации. Решение этого вопроса тесно связано с изучением влияния химической модификации на глюкоамилазу, поскольку образование связи между ферментом и носителем вызывает модификацию белковой глобулы. Термостабильность ковалентно иммобилизованного фермента определяется вкладом двух факторов - химической модификации его реакционноспо-собных групп и многоточечной сшивкой его с матрицей.

Таким образом, постановка эксперимента определялась следующими задачами: а) выяснить, как влияет степень химической модификации аминогрупп глюкоамилазы на активность и стабильность растворимого фермента; б)определить зависимость между термостабильностью глюкоамилазы и количеством химических связей фермент-матрица; в) сопоставить масштабы относительного влияния химической модификации растворимого фермента и его многоточечной иммобилизации на термостабильность глюкоамилазы.

Для реализации многоточечного способа иммобилизации глюкоамилазы, необходимо создать поверхность носителя возможно более строго комплементарную "поверхности" молекулы фермента.

Подход, позволяющий решить эту проблему, заключается в модификации фермента аналогом мономера с последующей сополимериза-цией препарата с собственно мономером. В итоге получается фермент, химически вшитый в сетку полимерного геля посредством центров модификации белковой глобулы, причем микроповерхность геля вокруг вшитого фермента может быть достаточно комплементарной поверхности белка. Именно такой метод был выбран в настоящей работе для многоточечной иммобилизации глюкоамилазы с целью увеличения ее термостабильности

В качестве матрицы для иммобилизации фермента использовали полиакриламидный гель, который, как показали наши исследования, практически не оказывал влияния на термостабильность глюкоамилазы. Константы скоростей инактивации нативного и физически включенного в гель фермента равны соответственно (4,5+0,3) .Ю"2 мин"1 и (3,9+0,4) .Ю'2 мин"1 при 65°. В качестве аналога мономера использовали акрилоилхлорид, образующий прочную связь с с.-аминогруппами лизина, входящего в состав белка. Кроме того, акрилоилхлорид,благодаря наличию двойной связи, способен далее встраиватся в полимерные цепи матрицы, что, в свою очередь, позволяет считать количество ацилированных аминогрупп фермента практически равным количеству точек ковалентно-го присоединения фермента к матрице. В связи с тем, что в настоящее время отсутствуют методы титрования активных центров карбогидраз, невозможно определить истинную концентрацию глюкоамилазы в растворе. Следовательно невозможно определить и абсолютное количество модифицированных аминогрупп в молекуле фермента, а также количества связей между глюкоамилазой и матрицей. Вместо этого можно использовать относительную величину - степень модификации, прямо пропорциональную количеству модифицированных аминогрупп.

По литературным данным, количество аминогрупп, принадлежащих остаткам лизина в молекуле глюкоамилазы из Asp.rn.ger , варьирует от 9 до 12,в зависимости от молекулярной формы фермента /35/. При проведении последовательной химической модификации глюкоамилазы с помощью акрилоилхлорида нами было найдено, что две трети от общего количества доступных аминогрупп фермента легко вступают в химическую реакцию, на что указывает близкий к прямолинейному начальный участок кривой на рис.6. По-видимому, эти аминогруппы находятся на поверхности молекулы фермента. Модификация последней трети доступных аминогрупп затруднена,и сопряжена с существенной потерей активности . (рис.7) и дестабилизацией глюкоамилазы (рис.8,кривая I). Наиболее очевидным представляется здесь тривиальное объяснение, что последняя треть аминогрупп пренадлежит внутриглобулярным остаткам аминокислот, и их модификация приводит к определенным нарушениям внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих молекулу фермента по отношению к тепловым воздействиям. В любом случае, наиболее резкое изменение активности и термостабильности растворимой глюкоамилазы происходит при высокой степени ацилирования аминогрупп фермента. Характерно, что ковалентная вшивка акрилоилглюкоамилазы в полимерный гель,не зависимо от степени ее модификации, не приводит к дополнительному изменению ферментативной активности (рис.7). Это означает, что структурная организация активного центра и его микроокружение практически не изменяются при переходе от растворимой акрилоилглюкоамилазы к ковалентно связанному с матрицей ферменту.

Для выяснения влияния степени модификации аминогрупп на термостабильность растворимой глюкоамилазы, кроме аналога

Объем добавленного Й^СН'СОС!, мкл

Рис.б. Влияние количества акрилоилхлорида, введенного в реакционную смесь на степень модификации аминогрупп растворимой глюкоамилазы.

Титрование незамещенных аминогрупп проводили при помощи тринитробензолсульфокислоты.

Степень модификации аминогрупп, п

Рис.7. Влияние степени модификации аминогрупп на активность растворимой (-о-) и вшитой в полиакриламидный гель (-•-) глюкоамилазы.

0,1 М ацетатный буфер, рН 4,5, 25°, субстрат - 1%-ный раствор мальтодекстринов)

Степень модификации аминогрупп, П.

Рис.8. Влияние степени модификации аминогрупп на величину константы скорости первого порядка термоинактивации растворимой глюкоамилазы, модифицированной акрилоил-хлоридом (-о-),глутаровым альдегидом (-•-) и акрилоилглюкоамилазы, вшитой в 25%-ный полиакриламидный гель (-е-), (0,1 м ацетатный буфер, рН 4,5, 65°) мономера - акрилоилхлорида, применяли глутаровый альдегид, который, благодаря наличию двух альдегидных групп, широко используется в качестве сшивающего агента при иммобилизации ферментов. Оказалось, что модификация £-аминогрупп остатков лизина в молекуле глюкоамилазы глутаровым альдегидом дестабилизирует растворимый фермент в значительно меньшей степени, чем их модификация акрилоилхлоридом при той же степени замещения (рис.8, кривые 2 и I). Можно полагать, что относительная стабилизация модифицированного, фермента бифункциональным альдегидом ( по сравнению с акрилоилглюкоамилазой) обусловлена дополнительным образованием внутри— и межмолекулярных сшивок, приводящих к увеличению жесткости белковых глобул по отношению к денатурирующим воздействиям.

Для получения препаратов вшитой в полиакриламидный гель глюкоамилазы, использовали фермент до разной степени предварительно модифицированныйакрилоилхлоридом. Однако, увеличение относительного количества связей между молекулой глюкоамилазы и носителем не дало ожидаемого результата. Повышение термостабильности препаратов иммобилизованного фермента наблюдалось только по сравнению с растворимой акрилоилглюкоамилазой, в то время как относительно нативного фермента наблюдалось понижение их термостабильности (рис.8,кривые 3 и I). Максимальный эффект термостабилизации глюкоамилазы за счет ее многоточечной иммобилизации оказался весьма незначительным (всего 2 раза) и был достигнут при степени ее модификации равной 0,95.Дальнейшая модификация глюкоамилазы приводила практически к полной ее инактивации.

Причины уменьшения термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы относительно нативного фермента при многоточечном связывании с носителем остаются пока неизвестными. Возможно, в случае глюкоамилазы, основной причиной термоинактивации является не только разворачивание белковой глобулы, на предотвращение которого и направлен в первую очередь метод многоточечного связывания фермента с носителем, но более тонкие структурные и химические перестройки биокатализатора.Возможно и другое объяснение этого явления. Содержание лизина в молекуле глюкоамилазы составляет 12 остатков, при молекулярной массе фермента 75000 /35/. По-видимому, образование 12-ти связей между белковой глобулой и носителем недостаточно для жесткого закрепления молекулы глюкоамилазы. Кроме того, модификация остатков лизина заметно нарушает взаимодействия между отдельными элементами полипептидной цепи, ответственными за поддержание третичной структуры. Об этом свидетельствует резкое уменьшение ферментативной активности и термостабильности глюкоамилазы при ее модификации (рис.7 и 8). Можно предположить, что нарушение третичной структуры фермента столь сильно дестабилизирует его молекулу, что этого невозможно компенсировать при помощи иммобилизации.

Данные, изложенные в этом разделе, позволяют заключить, что наиболее широко применяемый метод иммобилизации глюкоамилазы через ее свободные аминогруппы не может привести к существенному повышению термостабильности фермента, независимо от применяемых носителей (органических или неорганических).

I.6.Инактивация глюкоамилазы в ходе реакции

В связи с использованием глюкоамилазы, а также других ферментов на практике, возникает потребность заранее знать необходимое количество фермента, нужного для достижения определенной степени конверсии субстрата за определенное время. Особенно остро эта проблема встает в случае применения растворимой глюкоамилазы в реакторах периодического действия, в условиях, когда на ряду с гидролизом субстрата происходит термоинактивация фермента. Использование избытка фермента приводит к неизбежной потере части ферментативной активности. Определе/ ние же оптимальных условий ферментативной реакции часто требует продолжительного эксперимента. Теоретический подход, позволяющей решит эту проблему, был предложен в работе /137/. В его основе лежит предположение, что образование фермент-субстратного комплекса полностью предохраняет фермент от инактивации, а свободный фермент теряет активность со скоростью, описываемой константой первого порядка. Кинетическую схему такого процесса можно записать в следующем виде: к кат аз) кии неактивный фермент Трудно предположить,что термоинактивация фермента реально может происходить по такому механизму. Однако, некоторые допущения позволяют использовать схему (13).для описания кинетики термоинактивации глюкоамилазы в присутствии субстрата.

Реальному процессу термоинактивации глюкоамилазы в ходе реакции , с учетом инактивации комплексов фермент-субстрат и фермент-продукт, соответствует следующая кинетическая схема: & /С* *«г „

ВР^= Е + —-я + р ос/си„ (14) неактивный фермент кип г

В разделе 1.2. было показано, что фермент-субстратный комплекс растворимой глюкоамилазы при 75° инактивируется в 40 раз медленнее свободного фермента. Кроме того, эффект стабилизации субстратом увеличивается при понижении температуры. В разделе 1.3. также было показано, что термоинактивация комплекса фермент-продукт происходит со скоростью, близкой к скорости инактивации фермент-субстратного комплекса ( схягуЗ ). Таким образом, при математической обработке кинетической схемы (14) величины <х кин и £кин можно не учитывать, так как сх кш Л|Ькин ^кин. Следовательно, "минимальная" схема термоинактивации глюкоамилазы в присутствии субстрата должна соответствовать схеме (13).

Если обозначить общую текущую концентрацию активного фермента как [е]0 , то уравнение материального баланса по ферменту можно записать в следующем виде:

В таком случае скорость инактивации фермента равна:

- = кт(т'0-№)

- П"Ч (16)

Из приведенной схемы реакции (13) следует, что скорость превращения субстрата равна:

- = к«* ею at учитывая соотношение и JIML

Ks ~ [ES]

17) имеем:

Если разделить уравнение (16) на (19), получим: dt Ell = Ks кин с/CS] knartSJ (20)

Интегрируя уравнение (20) при начальных условиях [е]0 = [eJq и N = И о fdtal fjrn

J J rsj получаем: г- £SJ

СЕ1° ш0 ks к

21) еГ0 =/н]0 - Ь и к каг

S «и* р £SL LS]

22)

Из выражения (22) следует, что количество непрореагировав-шего субстрата в системе после полной инактивации фермента ( [e]q = 0 ) равно: ккс г L£]0 s] = [s] е кин ks

L J L J° (23)

Учитывая, что ккатМ0 = 7мах ' УРавнение (23) можно преобразовать к следующему виду:

Ума у Р CS]0

ЧГьГ (24)

При помощи уравнения (24) можно расчитать любую из трех констант ( К , kv ), если известны две остальные. Комби-мах' s ' ин ' " нируя выражения (15), (16) и (18) можно получить дифференциальное уравнение скорости ферментативной реакции: kKarLVjLS] di ~ K« +CSJ

Подставляя уравнение (22) в (25) получим: ¿7 ¿7 У„ах КькинЩ р [3]о

4* 1 СП£§] (2б)

При помощи вспомогательной переменной ъ , связанной с концентрацией субстрата зависимостью

- »"А" выражение (26) можно привести к более простому виду с/г ЪкингЬг.

ОН ~ К5 (27)

Если проинтегрировать уравнение (27) при начальных условиях, г = 6е1 при -ыо , получим следующее выражение: - ±[*£^ * Ь-Ш'-У

Зная значения констант К , к ин , а также[з]0 и V мах при помощи уравнения (28) можно расчитать полную кинетическую кривую ферментативной реакции в условиях, когда одновременно происходит инактивация фермента.

Чтобы убедит ься-лв применимости уравнения (28) для рас-чета^полной кинетической кривой гидролиза субстрата:; в условиях, когда одновременно происходит термоинактивация глюкоами-лазы, были выбраны следующие условия: рН 4,5, температура 65°, субстрат - мальтоза. По данным отдельного эксперимента в координатах Лайнуивера - Берка были определены величины Км и умах равные соответственно

3,5.10"° М и 15000мкМр/шн".гфис.9) При этом начальные скорости ферментативного расщепления мальтозы

1 /|>]0 , г Хл

Рис.9. Определение К^ и 7 мах растворимой глюкоамилазы по отношению к мальтозе в координатах Лайнуивера-Берка (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,5, 65°) мин

Рис.10. Теоретическая кинетическая кривая гидролиза мальтозы растворимой глюкоамилазой расчитанная по уравнению (28) для значений Км = 3,5.10"^ М, Vuax =4,6.Ю"5 М/мин, кш =0,05 мин- . (—о—) и (-•-) экспериментальные точки,полученные в повторных экспериментах.

Условия эксперимента: начальная концентрация мальтозы 0,58.10 М, концентрация фермента 3.10~^г/л, 0,1 М ацетатный буфер, рН 4,5, 65°. определяли таким образом, чтобы избежать возможной термоинактивации глюкоамилазы в ходе эксперимента. По этой причине интервалы времени, через которые отбирались пробы при определении начальных скоростей гидролиза мальтозы не превышали 2-х мин. Полученные данные показали, что в присутствии 2,78. о

10 - 5,5.10 М мальтозы в течение 5-10 мин термоинактивация пдакшамидазы шракФически не происходит. Величина константы термоинактивации первого порядка кш для глюкоамилазы тоже определена из независимого эксперимента при 65° равна 4,51+ 0,ЗЛО"2 мин"1.

На рисунке 10 приведена теоретическая кривая гидролиза мальтозы растворимым ферментом в указанных условиях. Точки на кривой соответствуют экспериментальным данным. Хорошое совпадение теории и эксперимента показывает, что кинетическая схема (13) достаточно точно описывает процесс термоинактивации глюкоамилазы в ходе реакции, а уравнение (28) применимо для математического моделирования кинетических кривых этого процесса.

1.7. 0 возможном пределе термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы

Анализ литературных данных и результатов настоящей работы позволяет предположить, что термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы имеет определенный предел.

Во-первых, в нстоящее время не известно ни одного случая повышения термостабильности глюкоамилазы хотя бы в десять раз за счет ее иммобилизации ( в интервале температур 50°-70°) (см.лит.обзор,разд2.2.). В присутствии субстрата, кажущаяся термостабильность иммобилизованного фермента обусловлена главным образом термостабильностью фермент-субстратного комплекса. Во-вторых, увеличение количества химических связей фермент-носитель в случае иммобилизированной глюкоамилазы приводит к дестабилизации фермента (см.разд.I.5.). Вывод о пределе термостабильности глюкоамилазы представляется весьма важным как с теоретической, так и с практической точек зрения, поскольку позволяет выявить реальные возможности повышения устойчивости глюкоамилазы к тепловым воздействиям. В таблице 3 приведены данные по термостабильности глюкоамилазы, иммобилизованной с применением различных сшивающих агентов на различных носителях Как видно, константы скорости термоинактивации препаратов являются близкими и в любом случае не выявляют принципиально значимых эффектов в стабилизации иммобилизованного фермента.

Попытка повысить термостабильность глюкоамилазы путем иммобилизации в присутствии субстрата (иммобилизация фермент-субстратного комплекса) тоже не привела к повышению ее термоста бильности (табл.3). Термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы пытались повысить путем ее химической модификации. В с/;-, связи с тем, что в кислой среде основание Шиффа, образующееся во время иммобилизации между е -аминогруппами белка и глутаро-вым альдегидом может гидролизоватся, было проведено восстановление -ияСН- связи боргидридом натрия. Как видно из табл.3, и в этом случае константа скорости инактивации препарата практически не изменилась. Повышение гидрофобности глобулы глюкоамилазы (модификация акролеином) или изменение структуры поверхности глобулы за счет замены положительно заряженных функциональных групп на отрицательно заряженные (модификация янтарным ангидридом) привело к увеличению скорости термоинактивации в 6 и 3 раза соответственно.

1. Номенклатура ферментов, Под.ред. Браунштейна А.Е.,М.5 1979.

2. Каган С.Ф.,Фролова Н.Ф.,0решенко Л.Н., Некоторые свойства кристалического препарата глюкоамилазы II. Тез.докл. II Всесоюзного совещания по ферментам микроорганизмов.,Минск, 1978, часть I,c.I92.

3. Yoshmo Е., Hayashida S. Enzymatic modification of glucoa-mylase of Aspergillus awamori var. kawachi. J.Ferment.Теchn., 1978, v. 56, p. 289 - 295.

4. Razzague A., Ueda S. Glucoamylase of Aspergillus oryzae. -J. Ferment. Теchn., 1978, v. 56, p. 296 302.

5. Miah M.N.N. , Ueda S. Multiplicity of glucoamylase of Aspergillus oryzae. Part 2. Enzymatic and physicochemical properties of three forms of glucoamylase. Starke, 1977, v. 29,p. 235 239.

6. Jansz E.R., Pieris N. , Jeya Raj E.E., De Silva N. Cultivation, isolation, purification and some properties of the enzyme glucoamylase from Aspergillus niger. J.Nat.Caun.Sri lanca, 1977, v. 5, p. 59 - 74.

7. Hayashida S., Nomura Т., Yoshirio E., Hongo M. The formation and properties of subtilisin modified glucoamylase. Agr. Biol. Chem., 1976, v. 40, p. 141 - 146.

8. Lineback D.R., Baumann W.E. Properties of glucoamylase from Aspergillus phoenicus. Garboh. Res., 1970, v. 14, p. 341 - 353.

9. Lineback D.R., Rusell I.E., Rasmussen J. Two forms of the glucoamylase of Aspergillus niger. Arch. Biochem. Biophys., 1969, v. 134, p. 539 - 553.

10. Ohga M., Shimiru K., Morita Y. Studies on amylases of Aspergillus oryzae cultured on rice.II.Some properties of glu- из coamylases. Agr. Biol. Chem., 1966, v. 30, p. 967 - 972.

11. Watanabe K., Pukimbara T. Studies on saccharogenic amylase produced by Aspergillus awamori. VI. Purification and general properties of less acid stable saccharogenic amylase. -J. Perm. Technol., 1966, v. 44, p. 392 399.

12. Pukumoto J. The properties and commercial application of gluc-amylase. Sci. and Ind., 1962, v. 36, p. 483 - 491.

13. Takahashi Y., Irie M. Purification and some propeties of three forms of glucoamylase from Rhisopus species. J. Biol. Chem., 1978, v. 84, p. 1183 - 1194.

14. Грачева И.М.,Лищук Т.А.Дырсин Ю.А.,Пинчукова Е.Е. Очистка и свойства глюкоамилазы из Endomycopsis sp. 20-9- Биохимия, 1977, т.42, с.1602-1609.

15. Kato К., Kuswanto К., Banno I., Harada Т. Identification of Endomycopsis fibuligera isolated from Ragi in Indonesia and properties of its cristalline glucoamylase. J.Perm. Technol., 1976, v. 54, p. 831 - 837.

16. Sukhumavashi I., Kato K., Harade T. Glucoamylase of a strain of Endomycopsis fibuligera isolated from mould brain of Thailand. J.Perm. Technol., 1975, v. 53, p. 559 - 565.

17. Rutloff H., Priese R., Kupke G., Taefel A. Das Unterteilung die Glucoamylase Isozymen aus Endomycopsis bispora. Z. Allg. Microbiol., 1977, v. 9, p. 39 - 47.

18. Hattori Y., Takeuchi J. Studies on amylolytic enzymes produced by Endomyces sp. Part II. Purification and general properties of amyloglucosidase. Agr. Biol. Chem., 1961, v. 25, p. 895 - 901.

19. Pukui Т., Uikuni Z. Preparation and properties of cristalline glucoamylase from Endomyces sp. IPO 0111. Agr. Biol. Chem., 1969, v. 33, p. 884 - 891.- 114

20. Taylor P.M., Napier E.I., Fleming I.D. Some properties of a glucoamylase produced by the thermophilic fungus Humicola lanuginosa. Carbohydr. Res.,,1978, v. 61, p. 301 - 308.

21. Subrahmanyan A., Mangallam S., Gopalkrishnan R.S. Amylo-glucosidase production by Torula termophilia. Indian J. Exp. Biol., 1977, v. 15, p. 495 - 496.

22. Yamasaki Y., Susuki Y. , Ozawa J. Purification and properties of two forms of glucoamylase from Penicillium oxalycium-Agr, Biol. Chem., 1977, v. 41, p. 755 762.

23. Iizuki H., Mineki S. Studies on the Genus Monascus. I.Purification and properties of two forms of glucoamylase from Monascus Kaoliang lov. sp. F-1. J.Gen.Appl. Microbiol., 1977, v. 23, p. 217 - 230.

24. Krzechowska M., Urbanek H. Isolation and some properties of glucoamylase from Cophalosporus charticola Lindau. Appl. Microbiol., 1975, v. 30, p. 163 - 166.

25. Okada G. Glucoamylase from Trichoderma viride . J.Jap. Soc. Starch Sci., 1977, v. 24, p. 120.- 126.

26. King H.J. The glucoamylase from Coniophora cerebrella. -Biochem. J., 1967, v. 105, p. 577 583.

27. Chiba S., Inomota S., Matsui H., Shimomura T. Purification and properties of an o<-glucosidase (glucoamylase) in sugar beet seads. Agr. Biol. Chem., 1978, v. 42, p. 241 - 245.

28. Yamasaki Y., Suzuki Y. Purification and properties of ■glucoamylasetand <x-glucosidase from Lentinus endodes.

29. Agr. Biol. Chem. , 1978 v. 45, p. 971 980.

30. Грачева И.М.,Гернет M.B. Глюкоамилаза микроорганизмов. -Успехи микробиологии, М., 1979, № 14, с. 81-105.

31. Finch P., Leonard P.A. Comparative studies on glucoamyla- 115 ses isolated from a strain of Aspergillus. Starke, 1978, v. 30, p. 341 - 345.

32. Дурмишидзе C.B.,Квеситадзе Т.И.,Коконашвили Т.Н. Глюкоами-лаза Aspergillus awaraori . Докл. АН СССР,1974, т.217,с.470-71

33. Morita Y., Ohga М., Shimizu К. Studies on amylases of Aspergillus oryzae cultured on rice. Part III. Chemical composition:; of glucoamylase. Mem. Res. Inst. Pood Sei., Kyoto Univ., 1968, v. 29, p. 18 - 23.

34. Okada S., Further properties of Trichoderma viride glucoamylase . J. Jap. Soc. Starch Sei., 1976, v. 23, p. 143 -146.

35. Pazur J.H., Knull H.R., Cepure A. Glucoenzymes: structure and properties of the two forms of glucoamylase from Aspergillus niger. Carbohydr. Res., 1971, v. 20, p. 83 - 96.

36. Lineback D.R., Aira L.A., Horner R.L. Structural characterisation of the two forms of glucoamylase from Aspergillus niger. Cereal Chein., 1972, v. 49, p. 283 - 298.

37. Smiley K.L., Hensley D.E., Smiley M. J., Gasford Ivl.J. Kinetic patterns of glucoamylase isozymes isolated from Aspergillus species. Arch. Biochem. Biophys., 1971; v. 144; p. 694 - 699.

38. Yamasaki Y., Suzuki I., Ozawa J. Properties of two forms of glucoamylase from Penicillium oxalyciuru Agr. Biol. Cherri,, 1977, v. 419 p. 1443 - 1449.

39. Pazur J.PL , luiull H.Pl. ; Simpson D.L. Glycoenzymes: a note on tlie role for the carbohydrate moieties. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1970, v. 40, p. 110 - 116.

40. Vatanabe K., Fukimura T. The amino acid sequence and the peptide-carbohydrate linkage of GP-1a and GP-1b glycopepti-des from Rhisopus saccharogenicus amylase. Agr. Biol. Chem., 1974, v. 38, p. 1643 - 1647.

41. Vatanabe K., Fukimbara T. The structure of the carbohydrate moiety of a glycopeptide GP-1a from Rhisopus saccharoge-nic amylase. Agr. Biol. Chem., 1974, v. 38, p. 1973 -1980.

42. Matsumura Y., lakanishi Т., .Izuka M., Yamamoto T. Hydrolysis of proteins by succesive incubation with proteinase and aminopeptidase. Agr. Biol. Chem., 1975, v. 39, p. 379 - 386.

43. Iizuka H., Mineki S. Studies on the Genus monascus II. Substrate specificity of two glucoamylases obtained from Monascus kaoliang P-1. J. Appl. Gen. Microbiol., 1978, v. 24, p. 185 - 192.

44. Рыжакова B.T.,Фениксова P.В. Получение высокоочищенной глюкоамилазы Aspergillus awamori . Биохимия, 1972, т. 37, c.IOI 1019 - 1022.

45. Розенфельд Е.JI.,Попова И.А. Глюкоамилаза ( |"-амилазы) животных и микроорганизмов. Успехи биол. химии, М., Наука, 1965, т.7, с. 210 - 224.

46. Грачева И.М.,Гернет В.М. Пути синтеза и регуляция образования глюкоамилазы. Выделение и очистка. Итоги науки и техники, Серия "Микробиология", М., 1978, т.9,

47. Mangellam S., Subrahmanyam A., Gopalkhrishnan К.S. Amylo-glucosidase production by Torula thermophila. Curr.Sci., 1977, v. 46, p. 16.

48. Pazur J.H., Ando T. The action of an amyloglucosidase of Aspergillus niger on starch and maltooligosaccharides. J. Biol. Chem., 1959, v. 234, p. 1966 - 1970.

49. Flyn A., Johnson D.B. Immobilized glucoamylase: studies on hornblende and enzacryl-T10. Int. J. Biochem., 1977, v. 8, p. 501 - 503.

50. Хорлин A.Я. Активные центры карбогидраз.~В кн. Сруктураи функции активных центров ферментов. Под ред. Торчинского Ю.М. М., Наука, 1974, с. 39 69.

51. Okada G., Genghof S.D., Hehre J.E. Reversion and trans-glycosylation by amylases. J. Jap. Soc. Starch Sei., 1978, v. 25, p. 113 - 123.

52. Okada G. Reversion machanism catalyzed by glucoamylase of Trichoderma viridae. J. Jap. Soc. Starch Sei., 1976, v. 23, p. H7 - 151.

53. Ebertova H. Amylolytic enzymes of Endomycopsis capsularis. II.A study of the properties of isolated «^-amylase, amyloglucosidase and maltase-transglucosidase. Folia microbiol., 1966, v. 11, p. 422 - 438.

54. Hehre E.J., Okada G., Genghof D.S. Configurational Specificity: unappretiated key to understanding enzymic reversion and de novo glycosidic bond synthesis. I.Reversal of hydroanomeric form. Arch. Biochem. Biophys., 1969, v. 135, p. 75 - 89.

55. Pazur E.J., Ando T. The hydrolysis of glucosyl oligosacand glucoamylases with donors of correct- 118 charides with o<-D-(1 ;4) and c*-D-(1;6) bonds by fungal amylo-glycosidase. J. Biochem., 1960, v. 235, p. 297 - 302.

56. Kawamura S., Vatanabe Т., Matsuda K. Hydrolysis of gluco-bioses by glucoamylase from Endomyces sp. Tohoku J. Agr. Res., 1969, v. 20, p. 143 - 149.

57. Pazur J.H., Kleppe K. The hydrolysis of<x-D-glucosides by amylöglucosidase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem.,1963, v. 237, p. 1002 1006.

58. Бендецкий K.M.,Яровенко В.JI.,Корчагина Г.Т.,Сенаторова Т. П.Даханова Т.С. Амилолитические ферменты из Asp. batatae.- Биохимия, 1974, т. 39, с. 968-974.

59. Рыжакова В.Т. Гидролиз субстратов глюкоамилазы Aspergillus awamori . Докл.АН СССР, 1972, т. 204, с. 737 - 739.

60. Hiromi К., Kawai М., Ono S. Kinetic studies on glucoamylase. IV.Hydrolysis of isoamylose. J. Biochem., 1966, v.59, p. 476 480.

61. Ueda S., Kano S. Multiple forms of glucoamylase of Rhisopus sp. Starke, 1975, v. 27, p. 123 - 128.

62. Kobayashi M., Matsuda K. Action of the glucoamylase on dextranes as an exo-dextranase. Agr. Biol. Chem., 1978, v. 42, p. 181 - 183.

63. Gadorf H.J., Atthasampuna P., Dan P., Hensley D., Smiley Ii.- 119

64. Patterns of action of glucoamylases izozymes from Aspergillus sp. on glycogen. Carboh. Res., 1975, v. 42, p. 147 -156. '

65. Weill G.E., Bratt M. The use of 6-o-methylamylose as a substrate for amylases. Carbohydr. Res., 1967, v. 4, p. 230 - 238.

66. Бендецкий K.M.,Яровенко В.JI.,Лукьянова Л.Н. Механизм гидролиза олигоглюкозидов препаратами глюкоамилазы из Asp.awamori.- Биохимия, 1970, т. 35, с. 1099 1X04.

67. Hiromi К., Hamanzu Z., Takahashi К., Ono S. Kinetic studies on gluc-amylase. II. Competition between two types of substrates havingo< -1,4 ande*-1,6 glucosidic linkage. J. Biochem., 1966, v. 59, p. 411 - 418.

68. Hiromi K., Takahashi K., Hamanzu Z. , Ono S. Kinetic studies of glucoamylase. III. The influence of pH on the rates of hydrolysis of maltose and panose. J. Biochem., 1966, v. 59, p. 479 - 485.

69. Gray C. J., Jolley M.E. The role of carboxylic acid groups in the action of glucoamylase. FEBBS Lett., 1973, v. 29, p. 197 -200.

70. Hiromi K., ITitta Y., Humata Ch., Ono S. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite- 120 theory. Biochim. Biophys. Acta., 1973s v. 302, p. 362 -375.

71. Kanaya K., Chiba S., Shimomura T. Location of the modified subsites of buckvheat oC-glucosidase. Agr. Biol. Chem., 1979, v. 43, p. 781 - 786.

72. Hiromi K. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerisation of substrate in enzyme catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-en-zyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, v. 40, p. 1-6.

73. Ohnishi M., Kegao H., Hiromi K. Studies on the subsite structure of amylases. I. Interaction of glucoamylase with substrate and analogues, studied by difference-spectrophoto-metry. J. Biochem., 1975, v. 77, p. 695 - 703.

74. Ohnishi M., Yamashita T., Hiromi K. Studies on the subsite of amylase. III. Inhibition by gluconolactone on the hydrolysis of maltodextrine catalized by glucoamylase. J.Biochem. , 1976, v. 79, p. 1007 - 1012.

75. Jolley M.R., Gray C.J. Tryptophanyl and carboxylic acid residues in the active centre of glucoamylase I from Aspergillus niger. Carbohydr. Res., 1976, v. 49, p. 361 - 370.

76. Adachi S., Hakanichi K., Matsuno T. Effect of dextrane and dextrane sulfate on the glucoamylase-catalized reaction. Agr. Biol. Chem., 1977, v. 41, p. 1673 - 1678.

77. Ohnishi M., Hiromi K. Studies on subsite structure of amylase. IV. Tryptophan residues of glucoamylase from Rhiso-pus niveus studied by chemical modification with N-bromosuc-cinimide. J. Biochem., 1976, v. 79, p. 11 - 16.

78. Barker S.U., Gray C.J., Jolley M.F. Photooxidation of glu-amylase I from Aspergillus niger. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v. 45, p. 654 - 661.

79. Hamanzu Z., Hirorai K., Ono S. Quantitative determination of anomeric forms of sugar produced by amylase. J. Bio-chem., 1965, v. 57, p. 39-41.

80. Ono S., Hiromi K., Hamanzu Z. Quantitative determination of anomeric forms of sugar produced by amylases. I. Glucoamy-lase. Plienyl-oc-maltoside or maltose systeme. J. Biochem., 1965, v. 57, p. 34 - 38.

81. Reese E.T., Maguiri A.H., Parish F.W. Glucosidases and exoglucanases. Canad. J. Biochem., 1968, v. 46, p. 25 - 34.

82. Ohnishi M., Yamashita Т., Hiromi K. Static and kinetic studies by fluorometry on the interaction between gluconolac-tone and glucoamylase from Rhisopus niveus. J. Biochem., 1977, v. 8.1, p. 99 - Ю5.

83. Flytwood J., Weigel H. Substrate cleavage point with glucoamylase. Nature(Engl.), 1962, v. 186, p. 984.

84. Hiromi K., Ono S. Kinetics of the course of degradation of linear polymer substrate catalyzed by an exo-enzyme. J. Biochem., 1967, v. 61, p. 654 - 656.

85. Бендецкий K.M.,Яровенко В.A.,Лукьянова JI.H. Гидролиз глюко-зидо.в препаратами глюкоамилазы из Asp. awamori .Механизм гидролиза полиглюкозидов. Биохимия, 1971, т.36,с. 525 - 531.

86. Бендецкий К.М. Действие экзогидролазы на линейный гомопо-лимер.Математический эксперимент. Молек. Биол., 1969, т. 3, с. 322 - 327.

87. Hiromi К., Ohnishi М., Yamashida Т. Transient kinetics of glucoamylase catalyzed hydrolysis of maltodextrine studiesby the fluorescence stopped-flow method. J. Biochem., 1974, v. 76, p. 1365 - 1367.

88. Ohnishi M., Hiromi K.Kinetic studies on the interaction of Rhisopus glucoamylase with maltodextrine and maltotriose, utilising the absorbance change near 300 nm. Carboh. Res., 1978, v. 61, p. 335 - 344.

89. Dill K., Allerhand A. Studies of the carbohydrate residues of glycoproteins by natural abundance Carbon 13 nuclear magnetic resonance spectroscopy. Glucoamylase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, p. 4524 - 4531.

90. Carvalio L.B. Action of amyloglucosidase on oxidised amy-lose. Carboh. Res., 1979, v. 75, p. 257 - 263.

91. Abe J., Takeda Y., Hizukuri S. Action of glucoamylase from Aspergillus niger on phosphorylated substrate. Biochim. Bio-phys. Acta, 1982, v. 701, p. 26 - 33.

92. Hayashida S., Kumisaka S., Nakao M., Evidence for raw starch affinity site in Aspergillus awamori glucoamylase I. - Agr. Biol. Chem., 1982, v. 46, p. 83 - 89.

93. PIor P.Q., Hayashida S. Production and characteristics of raw starch-digesting glucoamylase 0 from protease-negati-ve, glycosidase-negative Aspergillus awamori var. kawachi mutant. Appl. Environm. Microbiol., 1983, v. 3, p. 905 -912.

94. Hollo J., Laszlo E., Hoschke A., Hawary P., Banky B. Recent data on the active centre of amylolytic enzymes. -Starke, 1982, v. 34, p. 304 308.- 123

95. Савельев А.Н.,Фирсов JI.M. Карбоксильные группы в активном центре глюкоамилазы из Aspergillus awamori . Биохимия, 1982, т. 47, с. 1618 - 1620.

96. Tanaka A., Yamashita Т., Olinishi М., Hiromi К. Steady-state and transient kinetic studies on the binding of raalto-oligosaccharides to glucoamylase. J. Biochem., 1983, v. 93, p. 1037 - Ю43.

97. Johnson D.B. The stability of immobilized enzymes. -Biochem. Soc. Transac., 1979, v. 7, p. 7 10.

98. Schmid R.D. Stabilized soluble enzymes. In: Advances in Biochemical Engineering 12. Ed. Ghose K.T., Fiechter A., Blakebrough Ж., Springer-Verlag, Berlin, New York, 1972, p. 41 - 118.

99. Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В.Березина, В.К. Антонова,К.Мартинека, М., Изд. МГУ, 1967, т. 2, с. 7 8.109. Там же, т. 2, с. 121 137.110. Там же, т. 2, с. 282 283.111. Там же, т. I, с. 126-140.

100. Мартинек К. Стабилизация ферментов один из ключевыхфакторов при внедрении биокатализа в практику. В кн. Успехибиологического катализа. Под ред. И.В.Березина, К.Мартинека М.: Изд. МГУ, 1979, с. 105 157.

101. Caldwell K.D., Axen R., Bergwall M., Porath J. Demobilisation of enzymes based on hydrophobic interaction. II. Prepa-artion and properties of an amyloglucosidase adsórbate. -Biotechnol. Bioeng., 1976, v. 18, p. 1580 1604.

102. Solomon B., Levin Y. Adsorption of amyloglucosidase on inorganic carrier. Biotechnol. Bioeng., 1975, v. 17, p. 1323 - 1333.

103. Bachler M.J., Strandberg G.W., Smilley K.L. Starch conversion by immobilised glucoamylase. Biotechnol. Bioeng., 1970, v. 12, p. 85 - 92.

104. Smiley K.L. Continuous conversion of starch to glucose with immobilized glucoamylase. Biotechnol. Bioeng., 1971, v. 13, p. 309 - 317.

105. Solomon B., Levin Y. Studies on adsorption of amyloglucosidase on ion-exchange resins. Biotechnol. Bioeng., 1974, v. 16, p. 1161 - 1177.

106. Belial M., Bondrant J., Chefel C. Reacteur enzymatique turbulaire a glucoamylase adsorbec suijíme resine anionique application a l'hydrolyze de maltodextrines. Ann. tech-nol. Agr., 1978, v. 27, p. 469 - 498.

107. Kawashima K., Umeda K. Studies on the preparation of immobilized enzymes by radiopolimerisation. Part VII.Preparation of bead shaped glucoamylase and its characteristics. -J. Pood Sci. Technol., 1976, v. 23, p. 316 321.

108. Moeda H., Suzuki H., Yamauchi A., Sakimae A. Preparations of immobilized enzymes by K-vinylpirrolidone and the general properties of the glucoamylase gel. Biotechnol. Bio- 125 eng., 1974, v. 16, p. 1517 1528.

109. Rao 7.B., Sastri U.7.S., Rao P.V.S. Thermal stabilization of glucose oxidase and glucoamylase by physical entrapment.- Biochem. J., 1981, v. 193, p. 389 394. .

110. Kucera Y. Continuous hydrolysis of soluble starch by immobilized amyloglucosidase. Collect. Czech. Chem. Commun., 1976, y. 41, p. 2979 - 2986.

111. O'Ueil S.P. , Dunnil P., Lilly 2T.D. A comparative study of immobilized amyloglucosidase in a packed bed reactor anda continuous feed stirred tank reactor. Biotechnol. Bioeng., 1971, v. 13, p. 337 - 352.

112. Kucera Y., Hanus J. Preparation of carboxymethylcellulo-se-gelsjknd their use for immobilisation of amyloglucosidase.- Coll. Czech. Chem. Commun., 1975, v. 40, p. 2536 2543.

113. Solomon B., Levin Y. Studies on the binding of amyloglucosidase to inert proteins. Biotechnol. Bioeng., 1974, v. 16, p. 1393 - 1397.

114. Walton H.M., Eastman J.E. Insolubilized amylases. Biotechnol. Bioeng., 1973, v. 15, p. 951 - 962.

115. Svec P., Kalai J., Menyailova I.I., ITakchapetyan L.A. Immobilisation of amyloglucosidase on po^y(glycilmetacrylate) Co(ethylene dimetacrylate) carrier and its derivatives. -Biotechnol. Bioeng., 1978, v. 20, p. 1319 1328.

116. Иванова Л.А.,Ельгиц С.В. Свойства препаратов иммобилизо ванных глюкоамилаз. Укр.Биохим. Журнал, 1982, т. 54,с. 331 334.

117. Нахапетян Л.А.,Меняйлова И.И.,Жданов С.П.,Коромальди Е.В. Свойства глюкоамилазы, иммобилизованной на неорганических носителях. Ферм, и спирт, промышленность, 1976, т. 5, с. 35 -38.

118. Березин И.В.,Рабинович М.Л.,Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. - Биохимия, 1977, т. 42, с. 1631 - 1636.

119. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Полисахариды). М.: Изд.Высшая школа, 1978, с. 17 - 20.

120. Березин И.В.,КЛёсов А.А. Практический курс химической кинетики, М.: Изд. МГУ, 1976, с. 168 - 171.