Кинетика и механизм действия ферментов амилазного комплекса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА', ОРДЕНА ОКТЯбРЬСКОй РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.154 1

ШЕВЕЛЬКОВА Ангелина Николаевна КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ АМШ1АЗНОГО КОМПЛЕКСА

(Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

/

Москва - 1993

Работа выполнения на кгфздрз знзкмологии 2ишк©шзго факультета 'ШГ

( <.

Научный руководитель: доктор химических вззж Сшищн А.П.

Официальные оппоненты; д.х.н., проф. Ямшш

к.х.н. Черноглазов В.й.

Ведущее учреждение: Московский технологачесгай ггнетитут пищевой промышлености

Защита состоится " " 1993 г. в ас аза заседании

специализированного совета Д,053.Сб.76 по жишяэгазм наукам при Химическом факультете МГУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан " " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

¿ост О.А.

Актуальность проблемы. Необходимость исследования механиз ма ферментативного гидролиза природных полисахаридов обусловлена дефицитом невозобновляе.мых источников энергии и материалов. Решение порождаемых этим проблем в значительной мере определяется возможностью эффективного использования биомассы растения, образующихся в процессе фотосинтеза, в том числе крахмала и его продуктов. Гидролиз крахмалопродуктов осуществляется вод действием ферментов амилазного комплекса, вклгяащего о-, р- и глюкоамилазы. Поэтому исследование механизма действия этих ферментов представляется весьма актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение механизма гидролиза растворимой и нерастворимой амилозы под действием р- и глюкоамилаз. основные задачи работы были следуадие:

- Разработка методов для изучения механизма действия амилаз, выработка количественного критерия для оценки различий в степени упорядоченности действия ферментов. •

- Выявление причин судесгвуадих различий в механизмах действия амилолитических ферментов, в том числе ферментов одного типа действия.

- Изучение адсорбционных процессов амилаз при гидролизе нерастоворимой амилозы, выявление взамосвязп адсорбционных и гидролитических процессов.

- Изучение эффекта синергизма в действии ферментов амилазного комплекса.

Научная новизна. I) Разработаны экспериментальные подходы для изучения степени упорядоченности действия ферментов-деполимераз; предложен количественный критерий для оценки степени упорядоченности действия амилаз. 2) Определены причины различий в степени упорядоченности действия различных амилаз. 3) Установлена взамосвязь кинетики адсорбции амилаз и кинетики и механизма гидролиза ими нерастворимой амилозы, предложен механизм гидролиза нерастворимой амилозы с учетом адсорбционных процессов. 4) Установлены причины эффекта сянергизма в действии амилазшх полиферментных комплексов на полисахаридные субстраты, определено влияние на количественное проявление синергизма таких факторов, как со стаз шлифе рентного комплекса, концентрация и степень полимеризации субстрата, глубина пиролиза и

механизм действия эндо-деполимераа.

Практическая значимость работа. I) Разработан метод определения активности амилолитических фзрменгов различного механизма действия, основанный на измерении величины поляризации Флуоресценции амиозы, меченной флуоресцентной меткой. 2) Предложен метод контроля, основанный на использовании высокоэффективной гель-прошкаадей хроматографии крахмала и амилозы, поз-в&.'ящий целенаправленно контролировать механизм фзрыектатиБНо-го пиролиза полисахаридных субстратов с целью получения продуктов с заданннм молекулярно-массовым распределением.

Публикации. По материалам диссертации имеется 3 публикации.

Структура л объем диссертации. Диссертация состоит из sas-Л5Ш1Я, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части, вклхгсанцей описаниэ объектов исследования и методики эксперимента (I глава), изложения результатов исследования к их обсуждения (4 главы), выводов, списка ислользуемой литература, включающего 115 ссылок, вз них 78 работ зарубежных авторов.

Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, 41 рисунок.

05НЖШ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Объекты исследования. В работе использовали препараты ферментов производства *sigLa", США: а-амилаза слюны и панкреатической железы, е-амилаза из сладкого картофеля,- глшоамилаза

Aspergillus niger. ЙСПОЛЬЗОВаЛИ ТЭХЖв ß-ЭМИЛазУ Bacillus poly-

nixa, гомогеннув по данным электрофореза в ПАЯ", прздоставлен-ну» Р.Fasan (НПО "£еркент", г.Вильнюс).

Субстраты. Использовали высокомолекулярную амилозу (средняя молекулярная касса 150 кДА, "servaM.$PD, низкомолекулярную амилозу (молекулярная масса 4068 Да, " Aidrich" ,СШ.) и мальто-олигосахарщи "sign**,CU&.

Получен® субстратов с флуоресцентной меткой. Шли получена два производных амилозы - меченное флуоресцентной меткой статистически, а такке меченное по восстанавливающему концу полимерной молекулы. Статистически меченый субстрат получали в результате следующей реакции (здесь Ф - флуоресцккн):

OH H О-, уЛ. ölhv (-0--+S=C=N-'5

к? и

ся2он

Для получения субстрата с концевой меткой был получен реактив таосеюжарбазвда:

ф- n=c=s + т;-тг х2 н2о ф - im - ст-Щ )=s

который далее пришивали к полуацеталъной группе восстанавливающего конца молекул амилозы:

S

9®_? N.-HH-i

Kj ^

К4?-ОН Â Ь

сн он2

Аналитические метода. Глюкозу определяли гликозооксидазно-лероясидазным мзгодом (березин И.В.,Рабинович М.Л. .1980), восстанавливающие сахара (ВС) - методом Шомоди-Нельсона (Клесов A.A., Рабинович М.Л., 1980).

Анализ олигосахаридов со степенями полимеризации (СП) меньше или равными 7 проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на привитой аминофзвэ (колонка с носителем Sii&sorb - КН2). используя смесь ацетонитрила и воды (70:30) в качестве элювнта. Анализ распределения полисахаридов по молекулярным массам проводили с помощь» высокоэффективной гель-хроматографии на колонке bîo-sh tsk 125, используя в качестве элюента 0,01 M натрий-ацетатный буфер, [Ca2*1 - 0,015 К. Хроматографичесхие анализы проводили на хроматографе фирмы "Bio-Rad",США, в качестве детектора использовали дофференциаль-ннй рефрактометр той хз фирмы.

Измерение интенсивности поляризации флуоресценции амилозн, меченной флуоресцентной меткой, проводили на приборе "твх ап&-

-0-

/С-NH - Ф ' СГ H

i ôK

i—Л

сн„он

он

Ï

+Н*

¡+Ф—N—C=S

;Н20Н

ОН

 1н-

•NH

lyser" фирма "Abbott".Англия. Интенсивность светорассеяния из меряли на".спектрофлуориметре фирмы "Hitachi ".Япония.

Определение активности ферленгов. Активность амилаз определяли по начальной скорости образования ВС в процессе гидролиза амилозы. Активность выражали в г/л ВС, образованных за I мин.

Ферментативный гидролиз проводили при 40°С в 0,01 Ц натрий - ацетатном буфзре, рН 6. Гидролиз нерастворимой амилозы осуществляли при перемешивании. Для стабилизации ферментов в'реакционную сргду добавляли лолиэтнленгликоль в концентрации 0,2 г/л.

Определение адсорбционных характеристик амилаз. Для определения кинетики адсорбции амилаз на нерастворимой амилозе из реакционной смеси через определенные промежутки времени после смешивания фермента.и субстрата отбирали пробы, центрифугировали и определяли активность фермента в супернатанте. Зная исходную активность, расчитывали относительное количество адсорбированного фермента по убыли фермента в супернатанте. Для изучения гидролиза нерастворимой амилозы под действием только адсорбированных ферментов не адсорбированные ферменты удаляли из реакционной среды в виде супернатанта посла центрифугирования, а осадок ре суспендировали в буферном растворе эквивалентном по объему супернатанту. Для проведения реакции под действием только не адсорбированных ферментов к каБеске субстрата добавляли раствор фермента, находящегося в супернатанте.

Результаты и их обсуждение

I. Разработка критерия степени упорядоченности действия амилаз па основе изучения деструкции растворимой амилозы. Для экспресс-контроля за протеканием реакции гидролиза растворимой амилозы -была ийаользоЕаны методы поляризации флуоресценции ДО) и светорассеяния (CP). В первом методе в ходе гидролиза под действием е-, в- и глшоэяиаз следа® за изменением величины интенсивности I® аналозы, меченной флуоресцентной меткой статистически или с конца полимерной молекулы. Подученные зависимости интенсивности ПФ от степени деструкции меченой амалозв представлены на рис.1.

В случае метода CP определяли изменение величины интенсив-

нос га светорассеяния в процессе гидролиза амилазами немеченой амилозы. 'Лри использовании методов ЛФ п СР активности всех исследуемых амилаз по скорости образован« ВС были равны. Полученные зависимости интенсивности светорассеяния от глубины гидролиза амилозы представлены на рис.2.

Kai: величина интенсивности ПФ, так и интенсивности СР оп-

Qf-

Рис.1. Зависимость величины поляризации флуоресценции от степени деструкции а) статистически меченой амилозы, 6} меченной с конца полимерной молекулы при гидролизе I - глвкоакилазой, 2 -растительной э-амидазой, 3 - бактериальной р-амилазы, 4 - панкреатической а-амилазы, 5 - слюнной а-амилазы.

ределявтся размером молеул: изменеше этих величин характеризует изменение средне числовой молекулярной массы полимерной молекулы. Поэтому по скорости уменьшения величины П® и СР можно сладить за протеканием реакций, связанных с изменением молекулярной массы, в том числе, реакций деполимеризации.

Характер зависимостей 11Ф и СР от глубины гидролиза амилозы различаются для всех изучаемых амилаз, что свидетельствует о различиях в механизме действия этих ферментов. Более того, оказалось, что фермента одного типа действия (например, две сг-ашлазы идя две р-атлазы) различались по степени упорядоченности действия. Максимальной упорядоченностью действия обладала глюкоамилаза: она медленнее других ферментов изменяла сре-днечпсловую молекулярную массу амилозы, о чем свидетельствовало более медленное изменение величины ПФ и СР ачилозы под действием глжоамилазн, чем под действием других ферментов. Из двух

исследуемых р-амилаз (растительная и бактериальная) более упорядочение "действует растительная /з-авдлаза. По-видимому, ее механизм действия близок к "одноцепочечному", который характеризуется максимальным числом повторных атак фермента на молекулу субстрата в результате образования фермент-субстратного -комплекса (до диссоциации последнего),

Минимальной степень» упорядоченности обладала «-амилаза слюны: механизм ее действия, очевидно, близок к "многоцепочечному" , который в отличии от "одноцепочечного" характеризуется минимальным -числом повторных атак' на субстрат за время существования фермент-субстратного комплекса.

Таким образом, методы ПФ и СР позволили установить, что изучаемые ачялази различаются по степени упорядоченности действия. Кроме того, оказалось, что метод ПФ можно использовать для детекции амгаазной активности. Наш была разработана методика определения активности амилаз с помощью калибровочных зависимостей, представленных на рис.3. Это позволило определять активность амилаз, зная лишь величину ПФ исходного и гидролизо-ванного субстрата. Минимальное время анализа составило 10 мин, минимальная активность амилаз, которую можно измерить данным методом, составляет Ю"4 мМ ВС, образувдихся за I мин.

СР,отн.е Ъ.

ПЯР оги. ед

а з

5 6 С%%

Рис.2. Зависимость интенсивности светорассеяавя от степени дест-

Еис.З. Калибровочные зависимости Ш> от активности рукции амилозы. aí.шлaз.

Т-глшоамилзза, 2-растительная р-амилаза, 3-бактериальная Р-амилаза, 4-панкреатическая а-амилаза, 5 - слюнная «-амилаза.

Одно из достоинств методов ПФ и СР заключается в том, что

они являются экспрессными и позволяют следить за реакцией не прерывно. Однако, и в том и другом методе регистрируемый параметр связан лшь со средне числовой молекулярной массой. Поэтому результаты, касавдиеся определения механизма действия ферментов, полученные с помощью этих методов, становятся хорошо интерпретируемыми лишь в том случае,, если исследуется группа (ряд) ферментоз.

Наибольшую информацию об изменении амилозы в ходе гидролиза дает, на наш взгляд,, метод высокоэффективной жидкостной голь-хроматографии, так как получаемые гель-хроматограммы амилозы или ее гдцролизатов непосредственно отражают молекулярно-массовое распределение (МКР). На рис.4 представлены гель-хроматограммы исходной амилозы и ее гидролизатов под действием пяти исследуемых амилаз (глубина гидролиза по ВС была во всех случаях одинакова и составляла 4%).

Изменение ММР амилозы под действием различных амилаз происходило по-разному. Медленнее всего ММ? менялось под действием глюкоамилазы (рис.4.1). Изменение формы хроматограммы амилозы под действием растительной р-амилазы (рис.4.2) присходаю несколько быстрее, чем для глюкоамилазы (при их одинаковой активности по ВС). Бактериальная »-амилаза вела себя отлично от растительной (рис.4.3): при одинаковой активности по ВС скорость уменьшения высокомолекулярной фракции под действием бактериальной р-ачилазы была выше. Это свидетельствует о том, что бактериальная р-амллаза действует менее упорядоченно, чем растительная. Для двух «-амилаз гель-хроматограммы амилозы также менялись по-разному (рис.4.4 и 4.5). При действии а-ачилазы слюны быстрее исчезал высокомолекулярный пик и происходило его смешение в область средних, а затеи низких значешй СП (рис.4.5). Это свидетельствует о менее упорядоченном механизме действия «-ашлазы слюны по сравнению с панкреатической. Таким образом, с помощь» гель-хроматографии удалось наглядным образом проявить разли чия в механизме действия изучаемых ферментов и, кроме того, подтвердить результаты, полученные при использова-ШП5 методов ПФ и СР.

Для количественного определения стелем упорядоченности действия фермзнтоэ-деполимераз мы предложили использовать скорость уменьшения концентрации высокомолекулярной фракции амило-

зы (в методах Ш и .СР величина детектируемого сигнала определи-, ется именно высокомолекулярной фракцией субстрата). В методе ПФ измеряемым -параметром степени упорядоченности стала начальная, скорость уменьшения интенсивности ПФ (тангенс угла наклона касательной к начальном участку зависимостей, представленных на рис.1), в методе СР - начальная скорость уменьшения интенсивности светорассеяния (рис.2).

В методе гель-хроматографяи концентрацию высокомолекулярной фракции субстрата определят как площадь под пиком, соответствующим этой фракции (в интервале времен удерживания 10-15мин, рис.4, за это время элщруются молекулы с молекулярной массой более 20 кДа). На рис.5 представлена завиеямость концентрации высокомолекулярной фракции субстрата от степени деструкции амилозы. Критерием степени упорядоченности в данном случае стал тангенс наклона касательной к зависимостям на рис.5. Значения критерия степени упорядоченности действия, определенные с помощью грех описанных выше методов, представлены в табл.1. Они позволяют расположить исследуемые ферменты в следующий ряд по уменьшению упорядоченности действия: глюкоамилаза, растительная р-амилаза, бактериальная р-амилаза, панкреатическая а-амилаза и а-амилаза слюны. Данные табл.1 позволяют также сделать вывод о том, что любой из трех методов может быть использован индивидуально для определения степени упорядоченности действия амилаз (хотя результаты, полученные с помощью всех трех методов, взаимно дополняют и подтверждают друг друга).

2. Причины различий амилаз по степени упорядоченности действия.

Для выяснения причин различий в механизме действия амилаз (осо бенно амилаз одного типа действия) мы использовали подход, заключающийся в проведении ферментативной реакции в присутствии ингибитора амилаз. В качестве ингибитора был выбран даметплами-нометилферроцен (1й1й), который ингибировал амилазы по конкурентному механизму. Оказалось, что степень ингиСнрупцего влияния ДЛАШ различается для разных амилаз. Это можно проиллюстрировать сравнением гель-хроматограш гадролизатов амилозы, полученных в присутствии и в отсутствии ДМАМФ. Наиболее заметно присутствие ДМАМФ сказывалось на изменении ММР амилозы под

действием глюкоамилазы (рис.ба). Из двух р-амилаз ДМАМФ сильнее шгвЗирсвал растительную р-амидазу (рис.66), а из двух «-амилаз - сильнее панкреатическую e-амилазу (рис.бг).

Рис.4. Гель-хроматограммы Рис.5. Зависимость концентра-

гидролизатов амялозн при ции высокомолекулярной фракции

степени деструкции 4%. ашлозн от степени деструкции

1-глшоашлаза. 2-растительная е-амилаза, З-бактериалькая р-ами-лаза, 4-панкреатическая а-амилаза, 5 - слитная о-амилаза.

Таблиш I.

Значения критерия степени упорядоченности действия.

Фермент Светорассеяние Поляризация фл-ции Гель-хроматография

Статист. Концевой

ГЛЮКО- амилаза (Asperg. niger) 0.19 0.15 0.1 0.22

р-амилаза (Sweet ' Potato) 0.28 0.3 0.21 0.15

Р-амилаза (Bacter. Polimyxs.) 0.54 0.51 0.28 0.37

а-амилаза (Porcine Pancreas) 0.69 0.60 0.40 0.63

«-амилаза (Human Saliva) 1 .4 1 .15 1.1 1 .12

дапе, объяснить как свясьташжм его с полимерией :.:олзкулоЯ ами-

лозы, которая в растворе якеет форму окраса и мозвт образовывать комплексы включения с ЖАМФ ;ло аналогия с комовехсадш

включения с цихлодехстринаш (Рябов А.Д., Тяпочкин З.М., 1590), циклической вольгамперометрии было показано, что связывания ДМАМФ с амилозой не происходило, л, следовательно, влияние ДОАМФ на скорость гидролиза амилозы можно объяснить только его влиянием на фермента.

Более наглядно влияние ДМАМФ проявлялось при пиролизе ашлазами тзксмолекулярного субстрата, так как в этом случае можно было проследить за изменением концентрации каждого из промежуточных продуктов (что невозможно сделать при пиролизе высокомолекулярной амилозы). В качестве низкомолекуляркого аналога амилозы нами была выбрана мальтогексаоза.

При гидролизе мальтогехсаозы глюсоашлазой в присутствии Л?.!АМФ скорость образования и расходования промежуточных продуктов уменьшалась, причем, чем меньше была их СП, тем медленнее изменялась его концентрация в присутствии пнгабитора (рис.7). Аналогично ДМАМФ влиял и на а- и р-амилазы, причем в большей степени на растительную р-амилазу и панкреатическую а-акилазу. Это проявлялось как в уменьшении скорости накопления и расходования промежуточных продуктов под действием этих ферментов, так и в уменьшении предельного уровня накопления конечного продукта.

Таким образом, в присутствии ДМАЫФ характер действия амилаз на мальтогексаозу изменялся. Такое влияние ДОШ можно объяснить с помощью теории субсайтного строения активного центра ферментов-деподимераз, в которой принимается, что каждый сайт активного центра имеет определенную величину сродства к мономерному глюкозидному звену молекулы субстрата (Ююша Л, 1963). Мы предположили, что ахтизный центр амилаз проявляет сродство и к молекуле ДМАМФ. Известно, что фермент-субстратное связывание в случае амилаз осуществляется главным образом в результате двух типов взаимодействий: за счет взаимодействия гидрофобного "кардана" активного центра фермеюа с гадрофобнши зонами субстрата, а так же за счет водородных связей между гидрашжльнымл группа® субстрата и актавным центром фермента (Клесов А.А., 1380). Молекула ДМАМФ более гидрофобна, чем глюкоза, и, следовательно, она предпочтительней для связывания с активным центром ферментов. Кроме того, ферроцен, клея недоделанные я-орбитали, может участвовать и в образовании водородных

связей. Наконец, молекула ДМШ и глжозноэ звено близки по размерам. ; сравнения отиегяы, что глюкоза ингибировала амилазы значительно в меньшей степени, чем ДМАЩ (К1 в случае глюкозы равнялась 1,4 мМ, в случае ДМАМФ - 0,8 мМ при использовании в качестве субстрата мальтогексаозы).

Наиболее вероятно, что, связываясь с сорбцконным участком активного центра фермента, ДМАМФ в первую очередь будет взаимодействовать с тем сайтом, у которого сродство к глюкозидному звену максимально. Для используемой нами глпкоамилазы А.nigcr таковым является второй сайт (Клесов A.A., 1980). Таким образом ДМАМФ затрудняет связывание молекул субстрата с активным центром глюхоамилазн, особенно коротких молекул (СП 2-3, рис.8а). При этом фермент нз может осуществить гидролитический акт со связанной молекулой субстрата, поскольку соседний с каталитическим участком сайт занят не. глксозиднкм звеном, а молекулой ЯШЙ. С увеличением концентрации ДМАМФ количество молекул фермента с незанятым эффектором сорбционным участком активного центра становится меньше, и скорость реакции уменьшается.

Точно так же с точки зрения субсайтной структуры активного центра можно объяснить и влияние ДШЗ на а- и в-змилазн. Для картофельной р-амилазы максимальным сродством к глккозному звену обладает первый сайт, и. если этот сайт занжает эффектор (рис.86), становится невозможным продуктивное фермент-

86-А-2-О -

6

2-о

t

Рис.8. Связывание ДИАМФ с актнвнны центром а) -глагкоамшаза,. б)-растительной ß-амилазн, в) -панхреатичэской а-ами-лаш, г)-слюнной а-аш-лазы.

ITDO!

6Y-]

4

2.

О—о—а-~о-о.

УШ

-г

субстратное связывание для молекул субстрата с любой•степенью полимеризации. Для бактериальной р-амшазы неизвестна конкретная диаграмма сродства сайтов в активном центре, однако, поскольку эффектор оказывает на бактериальную р-амилазу менее существенное влияние, чем на картофельную, можно предположить, что диаграмма у нее иная, чем у картофельной &-амилазы, и первый сайт характеризуется меньшей величиной сродства, чем в активном центре растительной р-амилазы". Аналогичное объяснение можно дать и для различного влияния 1М на а-амилазы, если сравнить энергетические диаграммы их активных центров (рис.8в и г).

Степень упорядоченности действия фермента определяется тем, сколько повторных атак он может совершить на одну молекул!' субстрата без диссоциации фермент-субстратного комплекса. После совершения гидролитического акта субстрат может либо покинуть фермент, либо "продвинуться" по активному центру, после чего фермент совершает повторный гидролитический акт. Продвижение субстрата вдоль активного центра фермента происходит с большей вероятность» в том случае, если в активном цонтре есть сайт с большим сродством к мономерному звену (как, например, в активном центре растительной &-амилазы или панкреатической а-амилазы, см.рис.8): после гидролитического акта и ухода молекулы продукта в раствор продвижение субстрата по активном!' центру становится энергетически выгоднее, чем диссоциация фермент-субстратного комплекса.

Видимо, ДМАМФ влияет сильнее на те фермента, для которых большее значение имеет продвижение субстрата. Когда оказывается заблокирован сайт с максимальным энергетически! сродством, который играет решааду» роль в передвижении субстрата пс активному центру, то функционирование активного центра затрудняется. Это характерно для растительной р-амилззн и панкреатической а-амилазы. Дня тех ферментов, у которых степень упорядоченности действия минимальна, то есть продвияение субстрата по активному центру маловероятно, присутствие ДМАШ> сказывается в меньшей степени, как, например, в случае бактериальной р-амилазы и а~амилазы слюны.

3. Кинетика и механизм деструкция нерастворимой амилозы.

Адсорбция амилаз на амилозе.

Адсорбция на нерастворимой ашлозе изучалась только для <*-и глюсоамилаз, так как оказалось, что исследуемые р-амилазы не были способны адсорбироваться на нерастворимой амилозе и не гидролизовали ее. Отметим тагосе, что кинетика гиролиза и адсорбционные характеристики двух изучаемых а-амилаз очень близки, поэтому подробно мы приведем результаты только для панкреатической а-амилазы.

Кинетика адсорбции и десорбции как а-, так и глюкоамилаз взаимосвязана с кинетикой гидролиза ими нерастворимой амилозы. Например, в условиях эксперимента, результата которого приведены на рис.9а и б), адсорбция а-амилазы заканчивалась за 15-20 мин, далее а-яыилаза в течении 20 мин находилась в адсорбированном состоянии, после чего начиналась ее десорбция. На кинетических кривых накопления ВС под действием а-амилазы на нерастворимую амилозу (рис.9а, кривые 2 и 3) наблюдалось два участка. Бврзий (30 мин с начала реакции, т.е. то время, когда а-амкзгаза находилась в адсорбированном состояния) характеризовался большой скоростью образования ВС. На втором этапе (после начала десорбции а-амилазы) скорость гидролиза существенно уменьшалась. Адсорбция глюкоамилазы также заканчивалась за 1520 млн, однако, глюкоамнлаза, в отличии от а-амилазы, начинала десорбироваться через 3 часа и десорбировалась медленнее (рис.96, кривая I). Соответствующим образом изменялась и кинетика гкдрожза нерастворимой амялозы (рис.96, кривые 2 и 3).

Ркс.9. Кинетика здсгроцлй-десосбцлл (криж 1) панкреатической с-ауялазы (а) я глюкоамалазы (б), накоплю,ше ВС при гидролизе зтми нерастворимой амилозы (кривые 2 и 3).

^кт-тч &С

Максимальная глубина гидролиза нерастворимой амилозы под действием как а-, так и гликоамилазы составляла 285. Причем, при добавлении к гидролгоованному на 283 субстрату свежей порции ферментов не происходила ни их адсорбция, ни дополнительный гидролиз амилозы. Очевидно, что не все участки поверхности нерастворимого субстрата доступны для ферментов, и гидролизу подвергается лишь часть глшозвдяах звеньев (28%), причем ферменты десорбировалась после гидрсивда именно этих доступных связей (отметим, что этот же субстрат в растворимом состоянии гвдролизуется практически полностью). Гаки?.? образом, процессу десорбции предшествовал процесс окончания реакции гидролиза, причем характерно, что в условиях практически полного подавления гидролиза (например, при осуществлении гидролиза при температуре 3°С, рис.10), десорбции ферлентов не происходило в течении дательного периода времени.

Следует также подчеркнуть, что в условиях .равной активности а- и глккоаыилаз по отношению к растворимой амилозе скорости гидролиза ими нерастворимой амилозы различались. Это можно объяснить, по-видимому, тем, что а-амилаза, являвдаяся зндо-делолимеразой, быстрее "разрушает" нерастворимый субстрат, поставляя в раствор его олигомзрные фрагменты различной длины, которые в растворе "догидролизовнваотся" неадсорбированной -а-амнлазой. Глюкоамилаза (экзо-деполимераза) мозкет только последовательно отщеплять только глюкозные остатки, причем этот процесс, очевидно, затрудняется в случае нерастворимого субстрата.

Изотермы адсорбции а- и глюкоамилаз на нерастворимой амилозе приведены на рис.11. Согласно изотермам при гидролизе амилозы часть ферментов оставалась з растворе. Важно, однако, отметить, что гидролиз амилозы происходил под действием как адсорбированных, так н не аде орбированных ферментов. Например, индивидуальное действие адсорбированной и неадсорбированной а-амилазы приводило к гидролизу нерастворимой амилозы на 2 и 13%, соответственно, в то время, когда совместное их действие позволило гидролизовать амилозу на 28%. Таким образом, при совместном действии адсорбированного и неадсорбированного ферментов наблюдался аффект сверхаддитивного усиления действия друг друга. Этот эффект объясняется, на наш взгляд, тем, что кагади-

ттескал активность адсорбированиях амилаз ограничена в силу их незначительной подвижности по матрице нерастворимого субстрата. Фермент после адсорбции осуществлял гидролиз доступных глюко-зидных связей в зоне своей локальной дислокации и далее десор бировался в раствор (но не двигался по матрице субстрата в другую зону с доступными гликозидными связями). В то ке время не-адсорбированный фермент, действующий на субстрат из раствора, не испытывал подобных затруднений и гидролизовал субстрат на

большую глубину, чем адсорбированный фермент. Кроме того, не-адсорбированный фермент гидролизовал субстрат и в зонах дислокации адсорбированных ферментов, что могло приводить к появлению возможности для последних изменить свое положение на субстрате и оказаться на его более реакциошгоспособком участке.

4. Явление синергизма в совместном действии а- и глюкоамилаз на растворимую и нерастворимую амилозу.

Полисахариды в природе гццролизуются под действием не отдельных ферментов, но полиферментных систем. Ферменты, входящие в состав таких систем, хактеризуются согласованностью функционирования, ^ В1фажахщейся в сверхадцитивном усилении действия друг друга (эффект синергизма). Этот эффект является ваанейпим характерным

свойством полиферментных систем и нуздается в детальном обосновании и изучении. Мы исследовали эффект синергизма в действии биферментных систем, состоящих из «-амилаз (как а-амилазы слюны, так и панкреатической а-амилазы) и глхжоамилазы, на растворимую и нерастворимую амилозу. Эффект синергизма' проявлялся в том, что скорость образования конечного продукта (гликозы, g) при совместном действии а- и глюкоамилазы <v"**e) превышает сумму скоростей образования глюкозы при индивидуальном действии этих ферментов (V"1(1,+Vgluc )• Для количественного выражения эффекта синергизма мы использовали величину Ксин:

Кг„„ = / (va, - vr, ) (I)

ОИп glue 9lu6 glue

Причина эффекта синергизма, на наш взгляд, заключается в. реализации кинетических закономерностей последовательно-параллельно функционирующей двухферментной системы, в которой продукт действия а-амилазы является субстратом для глгжоамила-

а-амилаза 7-амилаза

--+ H/I—;--- Si

у-амияаза J

Концентрация концевых групп в промежуточных продуктах гидролиза (сп/.х) существенно больше, чем в исходном полисахариде (в^). Таким образом, с точки зрения содержания концевых групп промежуточные продукты представляют для глюкоамилазы субстрат с более высокой реакционной способностью, чем исходная амилоза.

Нами была определена зависимость Ксш от соотношения концентраций (активностей) а- и глккоамилаз. На " рис.12 представлена зависимость Ксин от концентрации (активности) глюкоамилазы при фиксированном значении активности а-амилаз. Аналогичный колоколообразный вид имела зависимость Ксин и от концентрации а-амилаз (при фиксированном значении глшоамилаз-ной активности). Таким образом, существует оптимальное соотношение активностей а- и глккоамилаз, при котором Ксин имеет максимальное значение.

При концентрации глюкоамилазы, меньшей оптимальной, ее активности недостаточно для образования максимально возможного количества глюкозу. При слишком высокой концентрации (активности) глюкоамилазы (больше оптимальной) скорость образования глккозы при индивидуальном действии глюкоамилазы становилась

высокой, и значение Ксин уменьшалось (формула (I)). При концентрации а-амилазы, меньшей оптимальной, ее активности недостаточно, чтобы создать в результате гидролиза амилозы насыщающую концентрацию промежуточных продуктов для глюкоамилазы. В то же время, при избыточно большой концентрации (активности) а-амилазы СЕ промежуточных продуктов быстро уменьшалась до значений меньших 5-6, и вместе с этим уменьшалось значение Vy/f^ глюкоамилазы, и, следовательно, уменьшался Ксщ.

Возможный масштаб проявления синергизма зависел от началь-, ной концентрации концевых групп амилозы, представляющих "истинный" субстрат для глюкоамилазы (молярная концентрация концевых групп амилозы прямо пропорциональна ее весовой концентрации и обратно пропорциональна ее СП). Для высокомолекулярного субстрата (среднее значение СП=500) при начальной" концентрации концевых групп меньшей К^, глюкоамилазы Ксш имел большее значение. При начальной концентрации концевых групп субстрата, на-сыщапцей для глюкоамилазы (больше К^), Ксин был невелик, и при определенной концентрации субстрата становился равным единице (рис.13). Эффект же синергизма в действии а- и глюкоамилаз на низксмолекулярную амилозу (СП 17) был значительно ниже (максимальное значение Ксин равнялось 2,1), чем на высокомолекулярную (средняя молекулярная масса 150 тыс.).

Рис.1?. Зависимость К от кон- Рис.13. Зависимость К от центрация гдшоамилаз§и.и концзнтоации субстрата1."

1.2 - растворимая амилоза, 3,4 - нерастворимая амилоза,

1.3 - слюнная а-амилаза, 2,4 - панкреатическая а-амилаза.

Кроме перечисленных факторов величина Ксин зависила и от глубины гидролиза (времени реакции, рис.14). При очень малой глубине гидролиза (до 10%), а-ашшаза еще не создавала достаточной концентрации концевых групп для насыщения глюкоамилазы. Напротив, при очень высокой глубине гидролиза (более 50%) концентрация промежуточных продуктов становилась высокой, но СП промежуточных продуктов уменьшалась до 5-6, что приводило к уменьшению параметра V /K^ глюкоамилазы. Таким образом, максимальное значение KCJffl наблюдалось при глубинах гидролиза 10-50%.

Мы установили, что величина КС1Ш зависела и от природы а-амилаз. На нал взгляд это связано с различием в степени упорядоченности действия слюнной и панкреатической а-амилаз (см. раздел 1). Промежуточными продуктами действия слюнной а-амилазы (с„/х) могут быть поли- и олигомеры с более высокой СП, чем в случае панкреатической а-амилазы, поскольку последняя характеризуется более высокой степенью упорядоченности действия и образует в процессе гидролиза и низкомолекулярныз продукты (СП 1-3). Поэтому промежуточные продукты действия слюнной «-амилазы являются более выгодным субстратом для глюкоамилазы, чем продукты действия панкреатической «-амилазы.

Мы исследовали эффект синергизма в действии как на растворимую (кривые 1,2 на рис. 12,13Л4), -так и на нерастворимую амилозу (кривые 3,4 на рис.12,13,14) и установили, что гидролиз

Рас.14. Зависимость К( от времени реакции.

■син

нерастворимой амилозы характеризуется меньшими значениями Ксш, чем растворимой. Это объясняется, во-первых, тем, что в нерастворимой амилозе для гидролиза доступна лишь часть глшозидных связей (28%), и во-вторых - эффективность гидролиза нерастворимой амилозы а- и глпкоамилэзой при прочих равных условиях меньше, чем растворимой.

ВЫВОДЫ

1. Разработан' экспериментальный подход для изучения степени упорядоченности действия ферментов-деполимераз на основе методов поляризации флуоресценции, светорассеяния и гель- хроматографии. Проведена оценка степени.упорядоченности действия ферментов амилазного комплекса. Установлено, что исследованные Ферменты можно расположить в следующий ряд по уменьшению степени упорядоченности действия: глшоамилгза Aspergillus niger, р-амплаза из сладкого картофеля, р-амилаза Bacillus poiymixs, а-амилаза панкреатической железа и «-амилаза слюны.

2. Предложен количественный критерий степени упорядоченности действия ферменгов-деполимераз (коэффициент степени упорядоченности), которым служит начальная скорость уменьшения концентрации высокомолекулярной фракции растворимой алшлозы. Коэффициент степени упорядоченности определен для исследованных амилолити-ческих ферментов. Экспериментально доказано, что различия в степени упорядоченности действия амилаз объясняются различиями в топографии сорбционного участка их активного центра.

3. Показана взаимосвязь кинетики адсорбции «- и, глюкоамилаз с кинетикой гидролиза ими нерастворимого субстрата. Адсорбция ферментов предаествует гидролитической стадии, десорбция же амилаз с повзрхности нерастворимой амилозы осуществляется после окончания гидролиза доступных для этого гляжозидаых связей. Предложен механизм деструкции нерастворимой амллозы, включащий совместное сикергетическое действие адсорбированных и неадсор-бировакных ферментов. Установлено, что исследованные р-амилазы не адсорбируются на нерастворимой амилозе и не гидролизувт ее.

4. Изучен эффект синергизма в совместном действии «-я глшоа-милаз на растворимую и нерастворимую аьилозу. Причина синергизма заключается в реализации кинетических закономерностей функционирующей последовательно-параллельно даухферментной онотс—

мы. в которой продукт действия а-амилазы является субстратом для глюкоамилазы. Показано, что на количественное проявление синергизма существенное влияние оказывают такие факторы, как соотнопенуе концентраций (активностей) а- и глюкоамилаз, степень упорядоченности действия а-амилаз, начальная концентрация субстрата, его степень полимеризации, растворимость, а так же глубина гидролиза,

5. Разработан экспресс-метод определения активности амилолитн-ческих ферментов различного механизма действия, основанный на измерении изменения величины поляризации флуоресценции амилозы, меченной флуоресцентной меткой, в процессе ферментативного гидролиза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

I.Глухих ¿.С., Шевельхова А.Н., Еремин С-.А., Синицын А.П. Применение метода поляризации флуоресценции для определения степени упорядоченности действия а\шаз. // Биохимия. - 1991. -Г.56. - вып.7. - С.1253-1258.

2.Stievel'k07a A.N., Glukhykh A.S., Slnitsyn А.P. Catalysis by amylases: a study of degree of randomness. // Russian Biochem. Biotecbnol. Express. - 1991. - V.l. - Ы. - P.207-217.

3.Глухих A.C., Шзвелькова A.H., Синицын А.П. Исследование степени статистичности действия некоторых ашлаз. // Прим. биохим. мшсробкол. - 1992. - Т.28. - вып.1. - С.37-43.