Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических и неорганических субстратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ



МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

Фирсова Юлия Николаевна

Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических и неорганических субстратов

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель Доктор химических наук, профессор А. Д. Рябов

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1 ГЛЮКОЗООКСИДАЗА: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ 7

1.1.1 Глюкозооксидаза как окислитель глюкозы 7

1.1.2 Физические свойства 7

1.1.3 Структура 8

1.1.4 Стабильность 11

1.1.5 Ингибиторы 12

1.1.6 Восстанавливающие субстраты 12

1.1.7 Механизм реакции окисления Б-глюкозы 14

1.1.8 Влияние рН на механизм реакции 16

1.1.9 Практическое применение _ 17

1.2 ОРГАНИЧЕСКИЕ, НЕОРГАНИЧЕСКИЕ И МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ КАК МЕДИАТОРЫ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В БИОСИСТЕМАХ 18

1.2.1 Дикислород, как окисляющий субстрат глюкозооксидазы 19

1.2.2 Органические субстраты глюкозооксидазы 20

1.2.3 Неорганические субстраты глюкозооксидазы 23

1.2.4 Металлоорганические соединения как медиаторы электронного транспорта 25

1.2.5 Способы модификации фермента, поверхности электрода и медиаторов электронного транспорта 28

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ 32

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 33

2.1 .ПРИБОРЫ И РЕАГЕНТЫ 33

2.2 МЕТОДЫ 34

2.2.1 Синтез солей феррициния 34

2.2.2 Кинетические исследования реакции окисления В-глюкозы солями феррициния, катализируемое глюкозооксидазой 35

2.2.3 Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой реакции глюкозоокси-дазного восстановления Рс+РРб в присутствии Б-глюкозы 36

2.2.4 Определение активности глюкозооксидазы 36

2.2.5 Влияние этанола на каталитическую активность фермента 36

2.2.6 Влияние рН на кинетику глюкозооксидазного восстановления Рс+РРб"

под действием Б-глюкозы 37

2.2.7 Приготовление растворов феррициния для изучения эффекта катионных, анионных и неионогенных ПАВ на каталитическую активность фермента. Кинетические измерения 37

2.2.8 Приготовление растворов н-бутилферрициния, содержащих тритон X-

100 и ДСН. Кинетические измерения 38

2.2.9 Приготовление растворов н-бутилферрициния в присутствии ЦТАБ 38

2.2.10 Влияние различных ПАВ на скорость поглощения дикислорода 38

2.2.11 Приготовление растворов катионов Я-, 8- энантиомеров 2-метилферроценкарбоновой кислоты и спектрофотометрические измерения 39

2.2.12 Приготовление растворов комплексов 08(111) и Яи(Ш). проведение спектрофотометрических измерений 39

2.2.13 Влияние гистидина и глутаминовой кислоты на скорость глюкозооксидазного восстановления [Оэ^^-МегЬру^СЩО под действием Э-глюкозы 40

2.2.14 Эффект пиридина на пероксидазное восстановление комплекса Цифруюсь под действием Н2О2 41

2.2.15 Получение апо-пероксидазы 41

2.2.16 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод А) 42

2.2.17 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод Б) 43

Глава 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44

3.1 ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ И МЕХАНИЗМА ОКИСЛЕНИЯ Б-

ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКО-

ЗООКСИДАЗОЙ 44

3.1.1 Формальная кинетика и механизм реакции 44

3.1.2 Поведение замещенных солей феррициния 51

3.1.3 Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой 54

3.1.4 Влияние этанола на каталитическую активность глюкозооксидазы 5 8

3.1.5 Влияние рН на кинетику глюкозооксидазного восстановления НГс+РГб" 58

3.1.6 Обсуждение результатов на основании модели "шар-воронка" 60

3.1.7 Энантиоселективное восстановление ионов феррициния, катализируемое глюкозооксидазой 60

3.2 РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ ПАВ В КИНЕТИКЕ КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ Б- ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ И Н-БУТИЛФЕРРИЦИНИЯ 65

3.2.1 Влияние ПАВ на скорость ферментативного поглащения кислорода 67

3.2.2 Влияние концентрации феррициния на скорость его ферментативного восстановления в присутствии ПАВ 67

3.2.3 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона феррициния под действием Б-глюкозы 71

3.2.4 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона н-бутилферрициния под действием Б-глюкозы 73

3.3 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ОКИСЛЕНИЯ Б-ГЛЮКОЗЫ КОМПЛЕКСАМИ [МШ (Ш)2С12]+, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗОЙ ( М=Об, Ыи, 1Х=2,2'-БИПИРИДИН И 1,10-ФЕНАНТРОЛИН) 80

3.3.1 Определение стехиометрии и кинетических порядков реакции глюкозооксидазного восстановления комплексов осмия, рутения по разным реагентам 80

3.3.2 Влияние рН на скорость реакции окисления Б-глюкозы, катализируемого глюкозооксидазой в присутствии комплексов [08(р11еп)2С12]С1

3.3.3 Эффект ПАВ на кинетику восстановления [ОэСрЬеп^СуС! под действием Б-глюкозы 88

3.3.4 Влияние ¿-аминокислот на скорость реакции ферментативного восстановления комплекса [Оз(4,7-Ме2Ьру)2С12]С1 90

3.3.5 Эффекты аскорбиновой и глюконовой кислот на глюкозооксидазное восстановление комплексов Оэ111 под действием Б-глюкозы 92

3.3.6 Сравнение реакционной способности комплексов и ИРс в реакции окисления Б-глюкозы, катализируемой глюкозооксидазой 94

3.4 ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ RU(II) ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА 95

3.4.1 Изучение кинетики пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 и Ru(phen)2Cl2 под действием пероксида водорода 97

3.4.2 Эффект хлорид ионов на реакцию пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 под действием пероксида водорода 97

3.4.3 Эффект пиридина на кинетику реакции пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 под действием пероксида водорода 100

3.5 ПЕРОКСИДАЗА ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕМИНОМ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ 104

ВЫВОДЫ 110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 126

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 129

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 131

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФАД - флавинадениндинуклеотид ФАМ - флавинаденинмононуклеотид

ФАДН2 - восстановленная форма флавинадениндинуклеотида

ФАДФ - флавинадениндинуклеотидфосфат

ГО - глюкозооксидаза

Gl - глюкоза

HFc+ - соли феррициния

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ДСН - додецилсульфат натрия

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид

ABTS - 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония MES - 4-морфолинэтансульфоновая кислота ПХ - пероксидаза из корней хрена

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время для решения практических и фундаментальных задач широко изучается участие искусственных субстратов в ферментативных окислительно-восстановительных процессах. Особую роль в этих превращениях начали играть ме-таллоорганические и неорганические субстраты оксидоредуктаз, так как именно эти молекулы представляются сегодня особо перспективными при создании амперометри-ческих биосенсоров с медиаторным транспортом электронов. Выбор нужных субстратов с заданными гидрофобными, стерическими и электронными характеристиками целесообразно искать на основе широкого спектра кинетических данных, касающихся взаимодействия металлоорганических и неорганических молекул с оксидоредуктазами. В связи с этим в данной работе выполнено детальное изучение кинетики и механизма восстановления металлоорганических и неорганических субстратов под действием Б-глюкозы, катализируемого глюкозооксидазой и окисления неорганических субстратов пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой из корней хрена.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ГЛЮКОЗООКСИДАЗА: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

1.1.1. Глюкозооксидаза как окислитель глюкозы

Известно несколько ферментов, окисляющих глюкозу. Наиболее специфичным является глюкозооксидаза ((З-В-глюкоза: кислород-1- оксиредуктаза, ЕС 1.1.3.4.), которая окисляет В-глюкозу в 8-В-глюконолактон в присутствии дикислорода (схема 1.1.1).

°2 К?И /=° + Н202

Схема 1.1.1.

Этот фермент широко используется в глюкозных биосенсорах и может применяться для определения общего количества сахара в системе [1].

Глюкозооксидаза впервые была обнаружена в 1928 году. Описано выделение глюкозооксидазы из таких источников как красные водоросли, цитрусовые фрукты, насекомые, бактерии и плесени (Aspergillus niger, Pénicillium notatum, Phanerochaete chrysosporum, Talaromyces flavus) [2]. Наиболее хорошо изучены свойства глюкозооксидазы из Aspergillus niger.

1.1.2. Физические свойства

Глюкозооксидаза из Aspergillus niger представляет собой слегка удлиненную ферментативную глобулу с осевым соотношением 2.5:1 и средним диаметром 8 нм [3]. При 20 °С в 0.1 М растворе хлорида натрия коэффициенты диффузии и седиментации равны 4.94x10*7 см^ с"1 и 8.0 С при рН 5.5 соответственно. Молекулярный вес глюкозооксидазы колеблется от 151 до 183 кДа, однако большинство ислледователей сходятся на цифре 155±5 кДа. Спектр поглощения глюкозооксидазы имеет максимумы при 278, 382 и 452 нм при соотношении величин поглощения 12.7:0.92:1.0 Коэффици-

ент экстинкции глюкозооксидазы в ацетатном буфере pH 5.5 на длине волны 450 нм равен 1.31х 104М-! см"1 [4].

1.1.3. Структура

До недавнего времени существовали лишь незначительные сведения о первичной структре глюкозооксидазы, несмотря на то, что аминокислотный состав был изучен достаточно давно [5, 6]. Однако, в результате последних исследований, в том числе анализа кристаллической структуры глюкозооксидазы, было показано, что фермент представляет собой гомодимер, содержащий две тесно связанные молекулы ФАДа. Каждая субъединица содержит 580 аминокислотных остатка, кофактор ФАД, шесть N-ацетилглюкозоаминных остатков, три остака маннозы и 152 молекулы растворителя. Мономерная молекула представляет собой компактный эллипсоид с соответствующими параметрами длины, ширины и высоты 60 Ах 52 Ах 37 Ä соответственно [7]. Молекула существует в виде двух доменов.Каждый домен образован небольшими сегментами аминокислотной последовательности и представляет собой глубокий карман. Первый домен состоит из пяти скрученных ß-структур и трех а-спиралей. Второй домен характеризуется шестью антипараллельными ß-структурами, которые поддерживаются шестью а-спиралями. Углеводная часть, связанная с Asn89, образует связь между двумя субъединицами димера [4]. ФАД располагается недалеко от поверхности димера. Однако расстояние более 27 А между фла-виновыми группами и более 22 А между адениновыми группами не позволяет осуществлять взаимодействия между простетическими группами в димере. Димер содержит два дисульфидных мостика и предполагается, что они и соединяют две субъединицы вместе. Это предположение подтверждается исследованиями, показывающими, что димер диссоциирует на мономеры только под действием денатурирующих агентов (например, додецилсульфата натрия) и сопровождается потерей ФАДа [8].

Глюкозооксидаза представляет собой гликопротеин. Большинство исследователей сходятся во мнении, что ферментативная глобула содержит 10-17% углеводов, причем их процентное содержание колеблется. Поэтому существует шесть различных форм глюкозооксидазы в зависимости от содержания углеводов. Этими причинами и объясняются различия в значении изоэлектрической точки от 3.9 до 4.3. По другим данным изоэлектрическая точка фермента равна 4.2 [4, 5], и это означает, что

при физиологических значениях рН глюкозооксидаза представляет собой отрицательно заряженную глобулу. Это делает возможным ингибирование глюкозооксида-зы полиаминами путем изменения ионного окружения аминокислот, принимающих участие в катализе. На каждом мономере потенциально существуют восемь участков, в которых белковая и углеводная части фермента могут быть соединены вместе, и по крайней мере два из них гликозилированы [9]. Углеводная часть фермента состоит в основном из Б-маннозы (14% от массы фермента), Б-глюкозоамина (2.3%) и Б-галактозы (0.3%). Ранее считалось, что углеводная часть фермента содержит также глюкозу, однако последующие исследования не подтвердили это предположение^ 0, 5, 7]. Углеводные фрагменты глюкозооксидазы не вовлечены в катализ, однако их частичное удаление с помощью периодата приводит к уменьшению стабильности фермента [11]. Напротив, увеличение содержания углеводов, имеющее место при клонировании глюкозооксидазы в дрожжах, приводит к увеличению стабильности [12]. Многие из характерных физических свойств фермента: устойчивость к осаждению трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония при концентрациях ниже 80%, очень высокая растворимость в воде, устойчивость к действию протеаз, могут быть объяснены наличием у глюкозооксидазы углеводной оболочки [4]. В то же время, эта углеводная оболочка в какой-то мере препятствует транспорту электронов между ферментом и электродом в амперометрических биосенсорах [13].

Глюкозооксидаза является одним из трех известных ферментов (два других фермента - молочная ксантиноксидаза и флаводоксин из Аго1оЬас1ег уте1апсШ), содержащих связанный белком неорганический фосфат [15].В глюкозооксидазе фосфат находится близко к поверхности белка, однако не может быть удален действием щелочной фосфатазы. В то же время, ортофосфат легко удаляется при щелочном гидролизе, что, вероятно, является причиной относительной нестабильности глюкозооксидазы в мягких щелочных условиях.

Холофермент глюкозооксидазы содержит две молекулы кофактора флавинаде-ниндинуклеотида (ФАД) (схема 1.1.2). Две молекулы ФАДа прочно связаны с апофер-ментом, однако не ковалентно, поэтому они могут быть легко удалены, не прибегая к денатурации фермента [15]. Лиофилизованная апо-глюкозооксидаза очень стабильна. В растворе стабильность фермента повышается в присутствии глицерина. Например, после хранения раствора фермента, содержащего 50% глицерина, наблюдается лишь 10% падение активности. Вне интервала рН 6-8 активность фермента быстро теряется.

и

3

о

а л л О к с

а 3 и н

Способность ФАДа восстанавливать ферменативную активность апофермента используется для детектирования пикомолярных количеств кофактора и служит основой для иммуноанализа. Реактивация глюкозооксидазы ФАДом исследовалась с использованием соединений, структура которых полностью или частично совпадает со структурой ФАДа. В результате выполненных исследований было высказано предположение, что аминогруппа аденина, гидроксильные группы рибозы и дифосфатный мостик играют существенную роль в реактивации глюкозооксидазы [15, 5]. Также было показано, что фосфорилирование ФАДа с образованием ФАДР (флавинадениндинуклеотидфосфата) делает невозможным реактивацию апо-фермента.

Нз4

СИ-

ОН

Г

N5 N те-г сн^- сн — сн— сн— сн2— О

ЛЮМИХРОМ

н

ЛЮМИФЛАВИН

ОН ОН ОН

Н

РИБОФЛАВИН ( ВИТАМИН В2 )

р —О—р—о —СН2 |С_/-МН2 о №

II

О

н

ФЛАВИНМОНОНУКЛЕОТИД ( ФМН )

ОН ОН

1М . 1\

н

ФЛАВИНАДЕНИНДИНУКЛЕОТИД ( ФАД )

Схема 1.1.2.

Сама по себе реакция реактивации апофермента очень сложна, так как апо-

глюкозооксидаза существует в двух формах. Одна из этих форм реагирует с ФАДом

б ,

очень быстро (¿=6.1x10 мин"1), в то время как другая должна пройти медленную стадию (к = 0.16 мин"1) перед тем как принять участие в быстрой реакции. Обе формы апо-фермента находятся между собой в равновесии. Повышение температуры смещает равновесие в сторону медленно реагирующей формы. Оптимум рН реакции реактивации равен 6.2, и, по-видимому, остаток гистидина, расположенный в активном центре фермента, оказывает влияние на эту величину [16].

За процессом реактивации апоглюкозооксидазы можно наблюдать флуоро-метрически, поскольку наблюдается тушение флуоресценции ФАДа при 365 и 520 нм за счет связывания с апоферментом.

1.1.4. Стабильность

Лиофилизованная глюкозооксидаза чрезвычайно стабильна. При 0 °С она сохраняет активность в течение двух лет, а при -15 °С - в течение восьми лет. В растворе стабильность фермента находится в зависимости от значения рН среды, причем наибольшая стабильность наблюдается при рН 5. Ниже рН 2 и выше рН 8 каталитическая активность фермента быстро теряется [2]. Например, при рН 8.1 только 10% ативности фермента сохраняется через десять минут, а при рН 9.1 инактивация идет гораздо быстрее [17]. Скорость инактивации глюкозооксидазы при высоких значениях рН понижается в присутствии глюкозы. Глюкозооксидаза устойчива к протеолизу, а так же к длительному воздействию трипсина, пепсина и папаина. Неионогенные ПАВ практически не влияют на активность глюкозооксидазы, однако ионные ПАВ, такие как до-децилсульфат натрия и гексадецилтриметиламмоний бромид инактивируют фермент. Анионные ПАВ, например додецилсульфат натрия (ДСН), инактивируют глюкозоок-сидазу при низких значениях рН, в то время как катионные ПАВ, например гексадецилтриметиламмоний бромид - при высоких значениях рН [18]. При рН 3.65 и высокой концентрации ДСН образуется нерастворимый комплекс глюкозооксидазы и ПАВ за счет специфического связывания детергента со 120 положительно заряженными аминокислотными остатками фермента [19]. Однако, уже при рН 4.3 и 6.0 комплексы (глюкозооксидаза-ДСН) становятся растворимыми. Кроме того при рН 6.0 не наблюдается диссициации димера глюкозооксидазы на субъединицы. Частичная диссоциация фермента начинается при рН 5.0, а уже при