Ферментативные методы анализа: определение эффекторов гидролаз и оксидоредуктаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ШЕХОВЦОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ ГИДРОЛАЗ ИОКСИДОРЕДУКТАЗ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Будников Г.К. доктор биологических наук, профессор Егоров A.M. доктор химических наук, профессор Тихонова Л.П.

Ведущая организация: Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева

Защита состоится а заседании

диссертационного совета по химическим наукам Д.053.05.60 при Московском государственном университете им.МВ.Ломоносова в ауд. 337 химического факультета в 16 час по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ

Ученый секретарь диссертационного совета,

Автореферат разослан

кандидат химических наук

Торочепщикова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Необходимость эколого-аналитического мониторинга, контроля

примесей в объектах пищевой и фармацевтической промышленности, решения ряда" ~ медицинских ~ И- биохимических задач обусловливает актуальность проблемы, стоящей перед аналитической химией, - проблемы "" -разработки высокочувствительных и селективных методов определения биологически активных веществ: ионов метхчлов, неорганических анионов, органических соединений.

Для решения этой проблемы в последние годы все шире применяют ферментативные методы. Использование биологических катализаторов, отличающихся высокими активностью и избирательностью действия, позволяет значительно повысить чувствительность и селективность методов анализа. Эти качества в сочетании с простотой аппаратурного оформления и методики эксперимента, экспрессностью обосновывают широкое внедрение ферментативных методов в заводские, агрохимические, клинические лаборатории, научно-исследовательские институты, природоохранные службы. Актуальность исследований в области ферментативных методов повышается в связи с расширением круга промышленно выпускаемых ферментов и разработкой способов их иммобилизации, благодаря чему ферменты становятся доступными и более дешевыми реагентами.

В настоящее время ферментативные методы используют в основном для определения самих ферментов, а также их субстратов, то есть соединений, превращение которых катализируют ферменты. Известно весьма ограниченное число работ, посвященных определению неорганических и органических соединений, являющихся эффекторами - активаторами или ингибиторами - ферментов. В то же время методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Кроме того, число эффекторов ферментов гораздо больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.

Все сказанное дает основание считать развитие методов определения эффекторов ферментов актуальным и перспективным направлением.

Одними из наиболее дешевых, достаточно устойчивых в водных растворах и выпускаемых отечественной промышленностью ферментов являются представители классов оксидоредуктаз - пероксидаза из корней хрена, супероксипдисмутаза - и гидролаз - щелочная и кислая фосфатазы, неорганические пирофосфатазы, выделенные из различных источников. Ранее влияние различных соединений на скорость реакций, катализируемых этими ферментами, изучали, в основном, в целях выяснения механизма их действия. Систематическое исследование действия неорганических и органических соединений на каталитическую активность указанных ферментов не проводилось. Практически не разработаны методы определения эффекторов этих ферментов; возможности использования в аналитических целях супероксиддисмутаз, пероксидаз другого (не из корней хрена) происхождения, пирофосфатаз вообще не изучались.

Целью настоящей работы было научное обоснование использования гидролаз и оксидоредуктаз (щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз и пероксидаз различного происхождения, супероксиддисмутазы) в химическом анализе для определения их эффекторов - биологически активных ионов металлов, неорганических анионов, органических соединений различных классов.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

- выявление неорганических и органических эффекторов щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз и пероксидаз различного происхождения, супероксщщисмутазы;

- изучение кинетических особенностей ферментативных процессов и механизма действия эффекторов на указанные ферменты для направленного выбора классов неорганических и органических соединений, которые могут проявлять активирующее либо ингибирующее действие на ферменты и, следовательно, могут быть определены с их использованием;

- развитие ферментативных методов определения биологически активных неорганических и органических соединений - активаторов и ингибиторов различных пероксидаз, щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, супероксиддисмутазы;

- поиск и разработка новых способов иммобилизации пероксидазы;

- развитие тест-методов и создание тест-устройств для определения неорганических и органических токсикантов в объектах окружающей среды.

Научная новизна заключается в том, что

- развито - одно из направлений ферментативных методов анализа -определение эффекторов ферментов на примере " представителей -.классов гилролаз и оксидоредуктаз;

- выявлены неорганические и органические эффекторы ферментов: шелочной и гатслой фосфатаз животного и растительного происхождения; неорганических пирофосфатаз из пекарских дрожжей и кишечной палочки Е.соН, пероксидаз из корней хрена, клеток люцерны, ксилотрофного гриба РкеШта ¡-¡гиагшн: супероксютисмутазы из молочной сыворотки, в результате систематического исследования действия на их каталитическую активность широкого круга ионов металлов, неорганических анионов, органических соединений различных классов;

- выявлены причины активирующего либо ингибирующего действия неорганических и органических соединений на каталитическую активность шелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, пероксидаз и супероксиадисмутазы на основании изучения механизма их действия, установленных закономерностей и обобщений;

- показаны возможности и перспективы использования в химическом а/шизе шелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, пероксидаз, выделенных из различных источников, а также супероксидяисмутазы для определения их эффекторов;

- показана возможность повышения чувствительности и селективности методик определения неорганических и органических эффекторов за счет использования их совместного действия на каталитическую активность фермента (на примере реакции окисления ароматических диаминов, катализируемой пероксидазой);

- установлено, что совместное действие двух эффекторов не является аддитивным и в зависимости от природы серосодержащего органического эффектора изменяется характер и степень действия другого эффектора (иона металла или ртутьорганического соединения): он может либо оказывать более значительное ингибирующее действие на пероксицазу, либо менять

кинетические параметры ферментативного процесса; ртутьорганические соединения могут оказывать также либеративное действие на пероксидазу, ингибированную серосодержащими веществами;

- предложен новый способ иммобилизации пероксидазы из хрена, основанный на ее модификации полимером хигозаном, обеспечивающий повышение устойчивости ферментного препарата, облегчающий его хранение и транспортировку;

- расширены возможности использования пероксидазы хрена в химическом анализе: на основе пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозана на различных носителях, разработаны тест-методики и создано тест-устройство для определения ртути на уровне и ниже ПДК и ртутьорганических соединений.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработаны ферментативные методики определения

• ионов металлов:

- ртуги(Н) (с,¡=0,5 пг/мл), кадмия (Сн=0,1 нг/мл), висмута(Ш) (Cj,= 0,5 нг/мл), и свинца (сн =3 нг/мл) по их ингабирующему действию на пероксидазу хрена;

- свинца(Н) (сн= 0,7 нг/мл) по ингибирующему действию на щелочную фосфатазу животного происхождения;

- редкоземельных элементов (сн= 008 - 0,4 нг/мл) по ингибирующему действию на пирофосфатазы, выделенные из пекарских дрожжей и E.coli;

- железа(Ш) (с,[=10 пг/мл) по реактивирующему действию на пероксидазу хрена, ингибированную салициловой кислотой;

• неорганических анионов:

- фторид- (сн = 2 нг/мл) и цианид-ионов (сн = 10 пг/мл) по ингабирующему действию на пероксидазу хрена;

- фторид- (сн = 5 пг/мл), вольфрамат- (сн = 0,02 нг/мл) и молибдат-ионов (сн = 0,6 нг/мл) по ингибирующему действию на кислые фосфатазы растительного происхождения;

- цианид- (сн= 0,05 мкг/мл), тиосульфат-ионов (сн — 5 мкг/мл) по ингибирующему действию на супероксиддисмутазу из молочной сыворотки;

• органических соединений:

- Р-содержащих комплексонов (сн = 0,01-1 мкМ) по активирующему действию на щелочную фосфатазу;

- алифатических аминов (сц = 10 мкМ) по ингибирующему действию на супероксиддисмутазуГ ~ ~~ - ------- -------

- Б-содержащих соединений (сн = 0,02-500 мкМ), органических кислот (сн= 20 пМ - 20 мкМ), N-00держащих соедтшений (сн = 0,2 - 40 мкМ) по ингибирующему либо активирующему действию на пероксидазу хрена;

- фенолов и аминофенолов (с„ = 0,2 - 50 мкМ) по ингибирующему действию на пероксидазы из хрена, люцерны, гриба РИеШпм (^апиз;

- ртутьорганцческих соединений (метил-, этил-, фенилртути с сн = 0,05 - 1 мкМ) по их либеративному действию на пероксидазу хрена.

Разработаны также тест-методики и созданы тест-устройства для определения различных форм ртути - неорганической и ртутьорганических соединений на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной в пленке хитозана на различных носителях.

Разработанные методики определения неорганических и органических эффекторов ферментов нашли применение при решетя» следующих практических задач: для определения бензотриазола в охлаждающей воде теплообменников в лаборатории водных режимов и коррозии Уральского филиала ВНИИ теплотехники; для определения фосфорсодержащих комплексонов на фоне их комплексонатов при контроле процесса удаления гипсовых отложений в вакуум-испарительных установках на Усть-Каменогорском свинцово-цинковом комбинате; для определения ртути в речных, морских и подземных водах, крови человека, белковом витаминном концентрате; кадмия, вольфрамат-иона - в почвах; цинка - в крови человека в НЦ хирургии РАМН; для определения высокотоксичных фторорганических соединений.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на III Всесоюзной конференции по аналитической химии (Минск, 1979), IV-VI Всесоюзных конференциях по применению органических реагентов в аналитической химии (Москва, 1980; Киев, 1983; Москва, 1984), Всесоюзном симпозиуме по получению и

применению иммобилизованных ферментов (Ленинград, 1980), Всесоюзных конференциях по методам анализа объектов окружающей среды (Тбилиси, 1983; Москва, 1983; Санкт-Петербург, 1991; Краснодар, 1994), Уральской конференции "Современные методы анализа и исследования материалов металлургии и машиностроения (Устинов, 1985), II, III Региональных конференциях "Аналитика Сибири" (Красноярск, 1986; Иркутск, 1990), V-VII Всесоюзных симпозиумах по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985; Вильнюс, 1988; Москва, 1991), VI Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991), Всесоюзной конференции "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе биологически активных веществ" (Пенза, 1993), IV и V Международных симпозиумах "Кинетика в аналитической химии" (Эрланген, Германия, 1992; Москва, 1995), VI Российско-японском симпозиуме по аналитической химии (Санкт-Петербург, 1992), II Международном симпозиуме по аналитической химии (Монтре, Швейцария, 1994), Международном симпозиуме "Пероксидазы. Биотехнология и применение" (Пущино, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, получено 4 авторских свидетельства СССР и патента РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 335 стр. машинописного текста, содержит 61 рисунок, 66 таблиц. Состоит из введения, 3 частей, 14 глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиография включает 397 наименований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявление неорганических и органических ингибиторов и активаторов щелочной и кислой фосфатаз, пирофосфатаз, пероксидаз различного происхождения, супероксиддисмутазы, а также результаты изучения механизма действия неорганических и органических эффекторов указанных ферментов.

2. Обоснование целесообразности и перспективности применения в химическом анализе щелочной и кислой фосфатаз животного и растительного происхождения, неорганических пирофосфатаз из пекарских дрожжей и Е.соЦ, пероксидаз из корней хрена, клеток люцерны,

ксилотрофного гриба Phellinus igniarius, супероксиддисмутазы из молочной сыворотки для определения их эффекторов.

3. Результаты изучения совместного действия на процесс пероксидазного окисления диаминов ионов металлов (ртути(П), кадмия, свинца, висмута (III)), ртутьорганических соединении" и"" серосодержащих органических веществ и предположения о причинах их совместного неаддитивного действия.

4. Обоснование использования совместного действия двух эффекторов -ионов металлов, ртутьорганических и серосодержащих органических соединений - для направленного повышения чувствительности и селективности методик их определения.

5. Новый способ иммобилизации пероксидазы из корней хрена, основанный на ее модификации полимером хитозаном,

6. Комплекс высокочувствительных, селективных, простых и экспрессных методик ферментативного определения неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (серо-, азот-, фосфор-, кислород- и ртутьсодсржаших) соединений.

7. Тест-методики и тест-устройства для определения неорганической ртути и ртутьорганических соединений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Использованы лиофилизированные препараты щелочной фосфатазы из кишечника теленка и цыплят (Boehringer Mannheim GmbH и Reanal, с удельной активностью 33 и 0,4 Е/мг соответственно); кислой фосфатазы из проростков пшеницы (Sena), клубней картофеля (Sigma) и простаты человека (Merck) с удельной активностью 15, 2,9 и 5,0 Е/мг соответственно; неорганических пирофосфатаз из пекарских дрожжей и E.coli (с удельной активностью 240 и 625 Е/мг соответственно); суперокстешисмугаза (СОД), выделенная из молочной сыворотки и предоставленная ВНИИСинтезбелок; пероксидазы из корней хрена (Reanal, Венгрия и ДИАМ, Москва; с удельной активностью 300 и 250 Е/мл и RZ = Аадз / = 3,3 и 1,4 соответственно), а также из культуры клеток люцерны Medicago sativa и ксилотрофного гриба Phellinus igniarius (уд. активность 450 и 150 Е/мг соответственно),

выделенные на биологическом факультете и кафедре химической энзимологиии химического факультета МГУ.

При изучении эффекторов щелочной и кислой фосфатаз и разработке методик их определения ферментативным методом в качестве индикаторной использована реакция гидролиза л-нитрофенилфосфата, протекающая в присутствии этих ферментов при рН 9,8 и 5,0 соответственно. Эффекторы пирофосфатаз исследованы в реакции гидролиза пирофосфата натрия; роль активатора этих металлозависимых ферментов выполняли ионы магния. Для выявления эффекторов супероксиддисмутазы в качестве индикаторной была выбрана реакция автоокисления пирогаллола. Реакции окисления пероксидом водорода о-дианизидина, о-фенилендиамина (ФДА) и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) использованы для выявления эффекторов пероксидаз.

Скорость реакций контролировали спектрофотометрическим методом и характеризовали либо тангенсом угла наклона начальных прямолинейных участков кинетических кривых в координатах оптическая плотность - время (способ тангенсов), либо величиной оптической плотности растворов, измеренной через определенное время после начала реакции (способ фиксированного времени).

При выборе потенциальных неорганических и органических эффекторов ферментов исходили из имеющихся в литературе данных о строении их активных центров и влиянии на их каталитическую активность ряда веществ; учитывали биологическую активность изучаемых соединений и потребность в достаточно простых и чувствительных методах их определения.

Влияние всех соединений на активность ферментов изучено в широких интервалах их концентраций (неорганических - 1 нг/мл - 100 мкг/мл, органических - 1 пмоль/л - 1 ммоль/л) в установленных нами оптимальных для проведения индикаторных реакциях условиях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ ГИЛРОЛАЗ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ ЩЕЛОЧНОЙ И КИСЛОЙ

ФОСФАТАЗ

Фосфатазы катализируют """пиролиз" моноэфиров ортофосфорной--------

кислоты. Заметные различия в значениях рН, при которых проявляют активность различные виды фосфатаз, обусловили их деление на кислые (активные при рН 3,0-5,8) и щелочные (рН 8,0-10,5). Эти ферменты имеют сложную четвертичную структуру, их активными формами являются димеры и тетрамеры. Это металлозависимые ферменты, то есть содержат в активном центре ионы металлов (щелочная - цинк, кислая - Мп(И) или Ре(Ш) в зависимости от происхождения).

1.1. Органические и неорганические эффекторы кислых фосфатаз

Среди изученных нами в качестве потенциальных эффекторов фосфатаз 14-, 8- и Р-содержащих органических соединений разных классов ингибирующее действие на каталитическую активность кислых растительных

фосфатаз в реакции гидролиза п-шггрофенилфосфата оказывают иминодиуксусная и циклогексантетрауксусная кислоты в диапазоне концентраций 1 мкМ - 1 мМ.

Из изученных неорганических катионов и анионов наибольшим ингибирующим действием на кислые фосфатазы обладают фторид-, вольфрамат- и молибдат-ионы.

Нами устаноатено. что влияние эффекторов на ферменты может быть различным в зависимости от происхождения последних. Так, ни один из изученных анионов (за исключением фторид-иона при концентрации не менее 1 мкг/мл) не влияет на активность кислой фосфатазы, выделенной из простаты человека. Минимальные концентрации, при которых анионы ингибируют активность кислых фосфатаз из клубней картофеля и проростков пшеницы, существенно различаются (табл.1). Разное действие анионов на кислые фосфатазы различного происхождения объясняется, по-видимому, разным строением активных центров ферментов и разной природой ионов металлов в них.

Таблица 1

Нижние границы определяемых содержаний анионов по реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата, катализируемой кислыми фосфатазами из картофеля (I) и пшеницы (II), и константы ингабирования этих фосфатаз анионами (п=3, Р=0,95)

Анион ст нг/мл Кинг, мкМ

I II I II

Фторид 0,005 ± 0,001 0,20 ± 0,04 0,0022 8600

Вольфрамат 0,20 ± 0,03 0,020 ± 0,003 1,1 0,0045

Молибдат 1,0 ±0,2 0,060 ± 0,002 32 0,2

Результаты изучения типа ингибирования кислых фосфатаз фторид-, вольфрамат- и молибдат-ионами методом линеаризации кинетических кривых в координатах Лайнуивера-Берка (1/У - ¡/[в] ) свидетельствуют о полном неконкурентном ингибировании ферментов указанными анионами, то есть ингибитор (анион) и субстрат (я-нитрофенилфосфат) взаимодействуют с ферментом независимо. Можно предположить, что ингибирование связано со взаимодействием анионов с металлом в активном центре ферментов, что приводит к понижению его активности. Константы ингибирования, характеризующие сродство ингибитора к ферменту, определенные по методу Диксона (в координатах 1 /V - [ ) и с использованием зависимости в координатах Лайнуивера-Берка, приведены в табл.1.

На основании полученных данных (величин КцнГ и сн разработанных нами методик определения анионов) сделан вывод о том, что для определения фторид-ионов следует использовать кислую фосфатазу из картофеля, которую фторид-ион ингибирует при значительно меньших концентрациях. Для определения малых концентраций вольфрамат- и молибдат-ионов предпочтительнее применение фосфатазы из пшеницы.

1.2, Неорганические и органические эффекторы щелочной фосфатазы

Из всех изученных нами многочисленных катионов и анионов -потенциальных неорганических эффекторов щелочных фосфатаз животного

происхождения наибольшее ингибирующее действие проявляют ионы свинца, магния и цинка.

Наиболее эффективными органическими ингибиторами являются

соединения, имеющие в своем составе 5Н-группу. При этом степень

ингибирующего действия меркаптанов существенным образом зависит от

строения органического радикала; алифатические меркаптаны не оказывают

заметного влияния на фермент, а эффективность ингибирующего действия

ароматических меркаптанов связана с наличием и положением заместителей

в бензольном кольце. Так, о-тиокрезол ингибирует щелочную фосфатазу

лишь при концентрациях не менее I мМ, а л-тиокрезол - при 0,1 мкМ.

Наличие ярко выраженной зависимости степени ингибирующего действия

меркаптанов от их строения свидетельствует о возможности селективного

определения этих соединений.

Ингибирующее действие на щелочную фосфатазу оказывают

фосфоновые кислоты и природные эфиры фосфорных кислот. При этом

влияние на активность фермента производных фосфоновых кислот -

фосфорсодержащих комплексонов (ФСК), широко используемых в

народном хозяйстве, носит сложный характер: в различных интервалах их

концентраций они проявляют либо активирующее либо ингибирующее

действие (рис.1)._ 2 tga•10

16

12

-8 -7 -6 -5 -4 -3 ^(Сфск,моль/л) Рис.1. Зависимость скорости гидролиза 0,3 мМ л-нитрофенилфосфата в присутствии 0,4 мкМ щелочной фосфатазы от концентрации ФСК (рН 9,8)

1.3. Причины влияния неорганических и органических эффекторов на активность щелочной фосфатазы

При выяснении причин влияния изученных неорганических и органических эффекторов на активность щелочной фосфатазы с помощью кинетического метода и метода дифференциальной спектроскопии исследована термоинактивация фермента в отсутствие и в присутствии наиболее эффективных его ингибиторов - ионов металлов (магния и цинка), меркаптанов и фосфорсодержащих комплексонов. Такой метод исследования весьма информативен, поскольку воздействие повышенной температуры на фермент связано как с нарушением его четвертичной структуры, так и со структурными изменениями в отдельных субъединицах - их денатурацией. Были исследованы препараты щелочной фосфатазы разной степени очистки, чтобы выяснить, не обусловлено ли действие эффекторов наличием в ферменте примесных белков или ионов металлов.

Установлено, что введение ионов магния или цинка в растворы

очищенной фосфатазы не влияет на характер ее термоинактивации, которая,

как известно, описывается схемой:

^ кд Е4«> 2Е2 -» 4Е1>ден , к-1

(где Е4 - активные тетрамеры, Е2 - менее активные димеры, Е1>ден -неактивные мономеры). В то же время изменение вида кинетических кривых термоинактивации неочищенного фермента, а также уменьшение рассчитанных нами констант скорости диссоциации кх и кд в присутствии ионов металлов свидетельствуют о том, что необратимый в их отсутствие процесс диссоциации олигомера становится обратимым.

Подобная регуляторная роль магния и цинка свидетельствует о возможности существования "конформационного замка", важного для структурной организации молекулы фермента. При этом низкомолекулярный эффектор играет роль "ключа", определяющего величину энергии связи и свойства межбелкового контакта.

Участие ионов магния в процессах сгруктурообразования молекулы щелочной фосфатазы подтверждено нами при изучении в его присутствии зависимости удельной активности неочищенного фермента от начальной

концентрации белка. Удельная активность фермента уменьшается с увеличением [Е)о , что связано, очевидно, с образованием неактивных ассоииатов: ПЕ4 ** Е4П. Присутствие более 10 мкМ вызывает резкое

увеличение Касс и эффективной константы скорости прямой реакшпг.

Таким образом, влияние ионов магния на активность неочищенной щелочной фосфатазы обусловлено его воздействием как на активность отдельных олигомерных форм фермента, так и на состояние четвертичной структуры фосфатазы. При этом воздействие магния на структуру фосфатазы является сложным процессом: ионы магния, с одной стороны, участвуют в организации межбелкового контакта при формировании активных димеров и тетрамеров фермента; с другой стороны, присутствие больших количеств магния способствует образованию неактивных ассоциатов фосфатазы. Очищенная фосфатаза обладает очень стабильной третичной и четвертичной структурой и вследствие этого маловосприимчива к воздействию низкомолекулярных эффекторов.

Изучение термоинактивации щелочной фосфатазы в присутствии п-тиокрезола показало, что тиолсодержащие органические соединения дестабилизируют четвертичную структуру фермента, но стабилизируют третичную структуру. По-видимому, ингибирующее действие содержашпх соединений на активность щелочной фосфатазы обусловлено реакцией тиол-дисульфидного обмена между меркаптаном и межцепочечной дисульфидной связью в молекуле фермента:

Я'Б-БЯ' + Я"5- Я'Е-БЯ" + Я'5-Я^-БЯ" + Я'^" « Я'^-БЯ" + Я'Б-Скорость реакшш увеличивается при повышении рН и зависит от нуклеофильности ЯБ'-иона и природы дисульфида. Наличие вблизи 8-8-связи отрицательных групп, отталкивающих ЯБ'-ионы, или разветвленных углеводородных цепей значительно затрудняет реакцию, Этим фактом, вероятно, объясняется ярко выраженная зависимость степени ингибируюшего действия меркаптанов на активность щелочной фосфатазы от строения органического радикала.

При исследовании влияния ФСК на активность щелочной фосфатазы установлено, что они активируют фермент только с низкой степенью

очистки, а их ингибирующее влияние наблюдается в случае как очищенного, так и неочищенного фермента. Для проявления активирующего действия необходим непосредственный контакт ФСК с молекулой фермента; взаимодействие носит необратимый характер, обусловлено комплексообразующими свойствами комплексонов, характеризуется высокой константой связывания (10 нМ), дестабилизирует третичную и четвертичную структуру фосфатазы. Полученные экспериментальные данные позволили предложить следующую схему взаимодействия ФСК с неочищенной щелочной фосфатазой:

(Ме + >)

Балласт Активный Неактивный фермент ассоциат

+ ФСК « | (Ме=ФСК

Активный фермент

Наличие примесных белков и ионов металлов в неочищенном препарате фермента способствует образованию неактивных ассоциатов фермент-белок, в которых межбелковая связь осуществляется, вероятно, через ион металла. При добавлении малых концентраций комплексона он взаимодействует со связывающим ионом металла, в результате чего неактивный ассоциат разрушается и выделяется активный фермент. Это приводит к дестабилизации молекулы фосфатазы, которая становится чувствительной к термоинакгивации. При добавлении больших количеств ФСК наряду с этим процессом идет образование комплексов с ионами металлов в активном центре фермента, что вызывает снижение активности и структурной стабильности щелочной фосфатазы. Ингибирующее действие комплексонов на очищенную фосфатазу также обусловлено комплексообразованием с ионами металлов (вероятно, с N^(11)) в металлосвязывающих' центрах фермента. Полученные нами данные о влиянии эффекторов на состояние третичной и четвертичной структуры щелочной фосфатазы открывают возможности направленной регуляции активности и стабильности этого

фермента, а также направленного выбора неорганических и органических соединений, которые могут оказывать активирующее или ингибирующее действие на щелочную фосфатазу, и, следовательно, могут быть определены с ее применением.

1.4. Определение эффекторов щелочной и кислой фосфатаз --------

На основе ингибирующего (либо активирующего в случае ФСК) действия на щелочную и кислую фосфатазы ионов металлов, анионов и органических соединений разработаны ферментативные методики их определения. Метролопиеские характеристики методик определения наиболее эффективных ингибиторов и активаторов щелочной фосфатазы приведены в табл.2.

Таблица 2

Метрологические характеристики методик определения ряда эффекторов щелочной фосфатазы (п=3)

Определяемое Диапазон

с мин определяемых

соединение концентраций

нг/мл нг/мл

РЬ(Н) 0,5 1 - 1000 0.03

гп(И) 0,3 1 - 1000 0,04

мкмоль/л мкмоль/л

л-Тиокрезол 0,08 0,2 - 20 0,05

Тиосалициловая 0,04 0,1 - 1 0,02

кислота

НТФ 0,05 0,1 - 1 0,04

ДТПФ 0,01 0,03 - 1 0,08

Следует отметить, что методика определения фторил-иона с использованием кислой фосфатазы из картофеля (табл.1) превосходит по чувствительности известные физико-химические методы его определения, отличаясь при этом высокой селективностью, поскольку определению фторида не мешают другие, как правило, сопутствующие ему в промышленных и природных объектах анионы (галогенид-, силикат-ионы). Разработанные методики определения тиолов сравнимы или несколько превосходят по чувствительности электрохимические и флуоресцентные методы, наиболее часто используемые для определения тиолсодержащих

органических соединений. Важным достоинством разработанных методик является то, что они не требуют предварительной минерализации органических веществ, позволяют определять лишь 5Н-содержащие соединения, а среди них ароматические меркаптаны на фоне алифатических, пара-изомеры - в присутствии орто-изомеров. Предложенные методики определения фосфорсодержащих комплексонов несколько уступают по чувствительности только кинетическим методам их определения, в то же время они позволяют определять содержание свободных ФСК в присутствии комплексонатов металлов.

Таблица 3

Результаты использования разработанных методик для анализа конкретных объектов (п=3, Р=0,95)

Определяемый компонент Объект Найдено, нг/мл

фермент.метод ат.-абс. метод

Н8(И) Морская вода 0,65 ± 0,05 0,68

Речная вода 0,21 ± 0,03 0,19

Подземн. вода 0,82 ± 0,02 0,76 ± 0,04

Кровь 0,77 ± 0,03 0,75

Белков, витам. концентрат 0,089 ± 0,005 0,091 (мкг/кг)

гп(И) Кровь 4700 4500

Сс!(Н) Почва 3,2 ± 0,2 3,5 (мкг/г)

\\ю42- Почва 2,9 ± 0,4 Метод добавок

Р Перфторбензол 0,26 ± 0,01 Метод добавок

Контроль технологических процессов

НТФ Р-оксиИДФ (1.2 ±0,1)% 0,3-80%

Промыв, воды вакуумиспарит. установок (17 ± 4) мкМ (34 ± 2) мкМ [НТФ]/[Са2 НТФ] 1:3 1 : 1

Бензотриазол Охлаждающая вода теплообмен. (20 ± 2) мкМ

Возможность и целесообразность использования щелочной и кислой фосфатаз в химическом анализе показана на примере разработки методик определения их неорганических (2п(И), \¥042" и Р) и органических эффекторов в различных объектах (табл.3). Следует отметить, что благодаря выявленной возможности определения несвязанной в комплекс НТФ на фоне ее комплексонатов кальция и цинка, которые не влияют на активность

щелочной фосфатазы, была решена весьма сложная задача - разработан метод контроля процесса растворения гипсовых отложений с поверхности

промышленного оборудования. Метод внедрен на Усть-Каменогорском свинцово-цинковом комбинате.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПИРОФОСФАТАЗ

Пирофосфатазы гидролизуют кислотные ангидриды, катализируя расщепление пирофосфатных связей. Они являются металлозависимыми ферментами, функционируют только в присутствии катионов двухвалентных металлов - магния и цинка.

При исследовании возможности и целесообразности использования в аналитических целях пирофосфатаз из пекарских дрожжей и Е. coli нами изучено влияние на их каталитическую активность ряда редкоземельных элементов - Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Er, Tu, Yb. Установлено, что все указанные РЗЭ ингибируют оба фермента в различных диапазонах их содержаний. Наиболее эффективным ингибитором пирофосфатаз является празеодим(Ш), его предел обнаружения минимален в случае обоих ферментов. В ряду РЗЭ от празеодима к иттербию, то есть с уменьшением их ионного радиуса, понижается ингибируюшее действие элементов, повышаются пределы их обнаружения (табл.4). Исключение составляют ионы самария и европия, на аномальное поведение которых в ряду РЗЭ указано в литературе. Пирофосфатаза из E.coli оказалась более чувствительной к действию РЗЭ, в ее присутствии достигаются более низкие пределы их обнаружения.

Таблица 4

Ионные радиусы и пределы обнаружения РЗЭ по их ингибирующему действию на неорганические пирофосфатазы из пекарских дрожжей (I) и

E.coli (И)

Элемент Рг Nd Sm Eu Tb [ Er Tin Yb

Ионный радиус, нм 0,116 0,115 0,113 0,113 0,109 0,104 0,104 0,100

с мин, нг/мл I 0,015 0,11 0,73 0,93 0,53 0,64 0,67 0,70

II 0,008 0,06 0,39 0,49 0,26 0,31 0,33 0,37

Результаты изучения типа ингибирования пирофосфатаз РЗЭ свидетельствуют о том, что их действие осуществляется по типу полного конкурентного ингибирования, то есть РЗЭ конкурируют с ионами магния, присутствие которых необходимо для проявления каталитической активности фермента, за места связывания с активным центром пирофосфатазы, понижая при этом ее активность.

Полученные нами данные свидетельствуют о целесообразности использования неорганических пирофосфатаз в химическом анализе.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ ОКСШОРЕЛУКТАЗ

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

СОД катализирует разложение активных форм кислорода, в частности, супероксидрадикала, осуществляя тем самым антирадикальную защиту живых систем. СОД существует в трех формах, отличающихся наличием в активном центре фермента в качестве простетической группы ионов различных металлов: Cu/Zn, Mn(III), Fe(III). СОД, выделенная из молочной сыворотки, - фермент мало изученный, данные о нем в литературе практически отсутствуют. Высказано предположение, что свойства этого фермента аналогичны свойствам СОД, содержащих в активном центре Си и Za и выделенных из других источников. Известно, чтог,Си/2п-СОД атомы металлов, находящиеся в активном центре, соединены между собой остатком имидазола, являющимся донором протона, который участвует в реакции попеременного окисления-восстановления меди:

Е-Си2+ + 02~ -» E-Cu+ + 02 (1)

Е-Си+ + 02~ + 2Н+ - Е-Си2+ + Н202 (2)

Таким образом, медь играет основную роль в ферментативном процессе, обусловливая каталитическую активность СОД. Zn(II) оказывает стабилизирующее действие на конформацию димерной молекулы фермента.

В результате изучения влияния на каталитическую активность СОД из молочной сыворотки неорганических катионов и анионов, а также представителей различных классов органических соединений удалось выявить лишь небольшое число ингибиторов этого фермента. Неорганическими неконкурентными ингибиторами СОД является ряд

анионов, образующих устойчивые комплексы с Си(1), образующейся в индикаторной системе на первой стадии превращения фермента, и препятствующие таким образом дальнейшему участию СОД в каталитическом процессе. При этом ингибирующее действие тем сильнее, чем более устойчив комплекс аниона с медью(1). Так,- наиболее эффективным ингибитором СОД оказался цианид-ион, образующий самый прочный комплекс (^р)=24,0). Тиосульфат-ион, образующий комплексные соединения как с Си(1), так и с Си(Н) = 10,3 и 12,3 соответственно), и тем самым тормозящий превращение фермента и по I и по II стадиям, также является ингибитором фермента, но более слабым. Ингибирующим действием на СОД обладают также стерически незатрудненные алифатические амины, такие как этилендиамин, диэтилентриамин, образующие достаточно прочные комплексы с Си(Н), и гидразин, влияние которого объясняется, по-видимому, его взаимодействием не столько с ионами меди, сколько с карбоксильными группами аминокислотных остатков, входящих в активный центр фермента.

На основании всей совокупности полученных нами данных можно предположить, что действие ингибиторов СОД обусловлено несколькими факторами: образованием комплексных соединений эффекторов с медью, находящейся в активном центре фермента; взаимодействием ингибиторов с аминокислотными остатками, расположенными в области активного центра; стерическими факторами, связанными со строением и размерами молекулы эффектора.

Основным итогом этого раздела работы следует считать то, что впервые предпринята попытка провести систематическое исследование с целью выявления эффекторов ранее неизученного фермента - супероксиддисмутазы го молочной сыворотки. Полученные нами данные важны для изучения строения, физико-химичесхих свойств и механизма действия этого фермента, а также для выяснения того, какие соединения и в каких концентрациях могут влиять на каталитическую активность супероксиддисмутазы, являющейся одним из ключевых ферментов микробиологических производств.

Обнаруженное ингибирующее действие на СОД цианид-, тиосульфат-ионов, а также гидразина и этилендиамина положено в основу ферментативных методик их определения с нижними границами определяемых содержаний 0,02, 500, 50 нг/мл и 10 мкмоль/л и sr 0,15, 0,15, 0,08 и 0,03 соответственно (п=3).

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ ПЕРОКСИДАЗ

Пероксидазы катализируют окисление пероксвдом водорода различных неорганических и органических соединений. В центре порфиринового кольца гема пероксидазы находится железо(Ш).

4.1. Определение фенолов с использованием пероксидаз различного происхождения

Установлено, что несмотря на определенную гомологию строения пероксидаз, выделенных из различных источников, имеются различия в их аминокислотном составе, термостабильности, субстратной специфичности. Для выяснения их физико-химических свойств, механизма действия, сопоставления каталитической активности, а также применения ферментов различного происхождения в анализе целесообразно изучать влияние на разные пероксидазы одних и тех же соединений-эффекторов.

Одними из наиболее опасных токсикантов являются фенолы, о влиянии которых на пероксвдазу хрена имеются сведения в литературе.

Нами проведено сравнительное изучение влияния различных фенолов (фенола, пирокатехина, резорцина, гидрохинона, пирогаллола, п-аминофенола, n-крезола) на активность пероксидаз, выделенных из корней хрена, а также культуры клеток люцерны Medicago sativa и ксилотрофного гриба Phellinus igniarius. Следует отметить, что пероксидазы, выделенные из люцерны и гриба, в аналитических целях до сих пор не использовали, эффекторы их не выявлены.

Установлено, что фенолы оказывают различное действие на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина и по характеру влияния их можно разделить на две группы. В первую входят сам фенол и резорцин. В присутствии этих соединений скорость реакции существенно понижается с повышением концентрации фенолов. Кинетические кривые в присутствии

фенолов второй группы - гидрохинона, пирокатехина, пирогаллола, п-крезола, и-аминофенола - характеризуются наличием индукционного периода (тШ1Д), величина которого пропорциональна их концентрации. По окончании индукционного периода реакция протекает с несколько меньшей скоростью, чем в отсутствие^феноловгАналогичная-картина наблюдается в присутствии всех трех пероксидаз.

Анализ полученных данных дает основание предположить, что при введении фенолов II группы в индикаторную реакцию, катализируемую пероксидазами, происходит совместное окисление о-диангогешна и соответствующего фенола, т.е. в системе присутствуют два субстрата-восстановителя фермента. Об этом же свидетельствуют результаты спектрофотометрического изучения индивидуального и совместного пероксидазного окисления о-дианизидина и фенолов.

Для объяснения влияния фенолов на пероксидазное окисление о-дианизидина предложена схема, учитывающая как индивидуальное пероксидазное окисление каждого субстрата: о-дианизидина (Б]) и фенола ("Ят). так и взаимодействие промежуточного продукта окисления о-дианизидина (ЕзЗ']) с фенолом:

к,

Е + Н20, ~ Е1 (1)

к-1

кт кз к4

Е, + « Е)5{ - — Е + Р] (2)

к_2

кЧ к'з (Схема 1)

Е! + « ЕД Е + Р? (3)

к'.2

к'4

Е^,' + Б2 - ЕД + Р2, (4)

Вследствие того, что константа скорости образования промежуточного

фермент-субстратного комплекса Е^з (к'2) для фенолов II группы существенно превышает аналогичную константу к2 образования комплекса фермента с о-дианизидином (Е^) (например, к'2 в случае л-крезола - 1,30 . 108 , и-аминофенола - 2,26 ,108 , к2 для о-дианизидина - 4,80.107), на начальном этапе в основном протекает реакция, описываемая уравнением 3. Кроме того, при больших концентрациях второго субстрата Б2 превращение

комплекса ЕгБ'] проходит преимущественно по стадии 4 (к'4 [Бг ] » к4) и продукт: индивидуального окисления о-дианизидина Р] практически не образуется. В результате на кинетических кривых окисления о-дианизидина в присутствии фенолов наблюдается индукционный период. Затем по мере окисления субстрата-фенола указанное соотношение изменяется и одновременно начинают протекать три процесса: превращение промежуточного комплекса ЕгЗ'] по уравнениям 2 и 4, а также окисление Е^г до Е и Р2 по уравнению 3. Таким образом, скорость окисления о-дианизидина по окончании индукционного периода уменьшается за счет того, что в продукт Р] превращается только часть образовавшегося комплекса ЕгЗ'!. Предложенная схема позволяет объяснить зависимость продолжительности индукционного периода от природы и концентрации фенолов. При увеличении к'2 от 1,30 . 108 для п-крезола до 2,26.108 для п-аминофенола индукционный период возрастает с 30 сек до 2 мин при одной и той же концентрации 2-го субстрата, т.е. чем выше константа к'2 , тем предпочтительнее и продолжительнее на первом этапе реакции окисление фенола (уравнение 3). Кроме того, при увеличении концентрации фенола возрастает соотношение к'4 [82 ] > к4 и, как следствие этого, увеличивается индукционный период.

Отсутствие индукционного периода на кинетических кривых в присутствии фенола и резорцина, а также уменьшение скорости окисления о-дианизидина в их присутствии, пропорциональное увеличению их концентрации, можно объяснить тем, что поскольку значения к'2 для них ниже, чем для о-дианизидина (к'2 = 1,76.106 для фенола и 8,00.10б для резорцина), то при совместном окислении фенола и о-дианизидина процессы, описываемые уравнением 2, с самого начала вносят больший вклад в суммарный процесс. Однако параллельно протекает и окисление фенола (или резорцина), что приводит к снижению скорости окисления о-дианизидина.

Сопоставление полученных нами данных о влиянии фенолов на каталитическую активность пероксидаз из люцерны, гриба и хрена в реакции окисления о-дианизидина, а также метрологических характеристик разработанных нами методик их определения (табл.5) свидетельствует о том,

что наибольшей чувствительностью к действию фенолов отличается пероксидаза из гриба РИеШпш ¡^мапиз.

Таблица 5

Метрологические характеристики методик определения фенолов с применением пероксидаз из гриба (I), хрена (II), люцерны (III)

Определяемое I II III

соединение Сн> мкмоль/л Сн, мкмоль/л мкмоль/л «я

Фенол 14 0,28 - - 530 0,24

Резорцин 3,2 0,14 5,4 0,17 13 0,16

Гидрохинон 0,8 0,19 4,5 0,12 7,2 0,08

Пирогаллол 0,4 0,20 0,6 0,30 0,8 0,13 I

Таким образом, на примере пероксидаз, выделенных из трех различных источников, показана целесообразность проведения систематического сравнительного изучения влияния одних и тех же эффекторов на ферменты разного происхождения.

4.2. Влияние органических и неорганических кислот на активность пероксидазы хрена

При проведении систематического исследования с целью выявления органических и неорганических эффекторов пероксидазы хрена - наиболее известного и доступного представителя пероксидаз - нами было изучено влияние на ее каталитическую активность ряда кислот (щавелевой, винной, салициловой, сульфосалициловой, фтористоводородной,

цианистоводородной), образующих устойчивые комплексные соединения с железом(Ш).

Установлено, что все исследованные соединения ингибируют активность

пероксидазы в реакции окисления о-яиашоилина в разных диапазонах концентраций после предварительного выдерживания их с ферментом. При этом наблюдается следующая зависимость: с повышением константы устойчивости комплекса железо(Ш) - ингибитор понижается предел обнаружения ингибитора по разработанным нами методикам (табл.6). Эта закономерность проявляется при близких размерах лигандов и отсутствии

стерических затруднений вследствие сложного строения в ряду органических кислот: винная, щавелевая, сульфосалициловая и салициловая, а также для НР и НСК

Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирующее действие изученных кислот связано с образованием ими прочных комплексов с железом(Ш) гема пероксидазы, что позволяет отнести их к ингибиторам пероксидазы I рода (согласно классификации Сандерса), однако нельзя исключить при этом и их одновременное взаимодействие с ферментом за счет связывания в неполярной области белка, характерное для ингибиторов II рода.

Таблица 6

Характеристики методик ферментативного определения ряда кислот-ингибиторов пероксидазы (п=3)

Кислота ШРеЬпГ тинк! мин Смин> моль/л Сн, моль/л %

Фтористоводородная 16,1 (п=5) 5 2-ю-7 5-Ю-7 0,20

Цианистоводородная 43,9 (п=6) 0 510-1° 8-10-1° 0,15

Винная 11,9 (п=2) 60 6-Ю"« 2-Ю-5 0,16

Щавелевая 20,2 (п=3) 60 610-7 но-6 0,17

Сульфосалициловая 33,1 (п=3) 30 610-1° 810-1° 0,16

Салициловая 36,3 (п=3) 30 9-10-12 210-И 0,16

где у - ■ 102, х . Сингибитора-10к, М (к=5-12)

Разработанные нами ферментативные методики определения цианистоводородной и салициловой кислот превышают по чувствительности известные из литературы методы их определения.

4.3. Влияние азотсодержащих органических соединений на активность пероксидазы

Установлено, что среди М-содержащих органических соединений эффективными активаторами фермента при рН не менее 6,5 являются стерически незатрудненные азотсодержащие нуклеофилы, обладающие высокой основностью - имидазолы, 4-аминопиридин, 1,2,3-бензотриазол, значения рКа которых лежат в интервале 6-9.

Наиболее вероятным представляется механизм активирования, заключающийся в следующем. Активность пероксидазы в реакции окисления о-дианизидина контролирует ионогенная группа белка с рК 6,5. При связывании активаторов с какой-либо электрофильной группой фермента, возможно, локально"" меняется " рН вблизи этой -ионогенной -группы, что приводит к смещению ее рК в более щелочную область. В результате этого максимальная активность пероксидазы сохраняется в более широком интервале рН. Эффективность взаимодействия активаторов с пероксидазой зависит от их основности и структуры.

Обнаруженные зависимости скорости индикаторного процесса от концентрации азотсодержащих соединений позволили разработать методики их ферментативного определения, сравнимые, а в ряде случаев превосходящие по чувствительности электрохимические и хроматографические методы их определения. В качестве примера можно привести нижние границы определяемых содержаний 4-аминопиридина, имидазола, 1,2,3-бензотриазола, которые составляют 0,2, 2 и 2 мкмоль/л соответственно (бц = 0,1; 0,04; 0,08; п=3).

4.4. Влияние серосодержащих органических соединений на активность

пероксидазы

При изучении влияния на активность пероксидазы из корней хрена органических соединений, содержащих группы =5, -БН и гетероциклическую серу, установлено, что они яатяются ингибиторами фермента при рН 4,0-5,0. В зависимости от степени и характера их действия изученные серосодержащие соединения (ССС) можно условно разделить на 2 группы. К I группе (табл.7) относятся соединения, роль которых заключается только в ингибировании пероксидазы, при этом скорость индикаторной реакции окисления о-дианизидина понижается с увеличением концентрации серосодержащего соединения. Во II группу объединены вещества, действие которых проявляется не только в ингибировании фермента, но и в том, что на кинетических кривых в их присутствии появляется индукционный период (рис.2). При этом продолжительность индукционного периода возрастает с увеличением концентрации серосодержащего соединения, а тангенс угла наклона второго участка

Таблица 7

Влияние серосодержащих органических соединений на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина

Группа Название соединения Формула Интервал концентраций, мкмолъ/л Е,*В

ИНГИБИТОРЫ

Тиомочевина 0,1 - 1000 0,29

Аллил-тиомочевина СН2=СНСН2МН-^Ш2 100 - 1000 0,78

Ацетил-тиомочевина СНз 500 - 10000 0,83

Фенил -тиомочевина С6Н5МН<^Н2 50 - 1000 0,84

Э-Бензил-тиомочевина С6Н3СН21\Н(||М"Н3 1000 - 10000 1,27

I Диортотолил-тиомочевина Н2^КНС6Н3Ш(^1НСНз 100 - 1000 1,30

Тиофенол Н5С6 - БН 0,01 - 1 —

Пиридилтиоамид КС5Н5 -1 - мн2 50 - 1000 —

Рубеановодо-родная к-та 1 -10 —

1,4-Дитиотреитол сн2 qн сн сн2 ¿н ононкн 0,1 -100 —

1,2,4-Триазолтиол ?гт 1 - 100 —

СУБСТРАТЫ

Висмугал 1 НЫ—ЫН 1 - 10 —

Бензилвисмутол с6н5сн2-нк—гш 1 - 10 —

II Тионалид СбН4С4Н4КН^СН25Н 1 - 10 —

Тиосалициловая к- та НООССбНдБН 0,5 -100 0,08

Цистеин не сн2сн:чн2(|:=о 1-50 -0,20

Хлортиофенол НЭ С 6Н 4С1 0,01 - 50 -1,13

ДЭДТК (С2Н5)2Ы ^ БИа 5 - 100 -1,68

» - величина, характеризующая способность соединения к окислению в оптимальных условиях проведения индикаторной реакции;

-----данные отсутствуют; Е о-дианизидинан 0,85 В

кинетических кривых, характеризующего скорость окисления о-дианизидина, уменьшается.

Объяснение полученных зависимостей стало возможным лишь при более

детальном исследовании процесса пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии разных ССС. -----------------------

4.5. Механизм действия серосодержащих органических соединений на активность пероксидазы

Установлено, что производные тиомочевины - ацетил-, аллил-, фекилтиомочевины, 1,4-дитиотреитол, 1,2,4-триазолтиол ингибируют пероксидазу по смешанному типу, который предполагает, что ингибитор действует и на центр связывания о-дианизидина в молекуле пероксидазы, ответственный за взаимодействие субстрата с ферментом, и на каталитический центр биокатализатора, способствующий превращению уже связанного субстрата в молекуле белка. Образующиеся при этом комплексы {фермент-ингибитор} и {ингибитор-фермент-субстрат} каталитически неактивны. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в присутствии ССС протекает обратимая реакция образования неактивного комплекса фермента с ингибитором.

Более детально механизм действия ССС изучен на примере представителей I и II групп - тиомочевины и висмутола.

4.5.1. Ингибирование и инактивация пероксидазы тиомочевиной

Установлено, что ингибирование пероксидазы тиомочевиной протекает в две стадии: одна из них быстрая, другая - медленная (рис.3).

Кинетика пероксидазного окисления о-дианизидина подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен как в отсутствие, так и в присутствии тиомочевины. Зависимости начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации в присутствии различных концентраций тиомочевины спрямляются в координатах Лайнуивера-Берка. С увеличением концентрации тиомочевины константа Михаэлиса для о-дианизидина увеличивается, а ккат не изменяется (табл.8).

Рис.2. Кинетические кривые пероксидазного окисления 0,3 мМ о-дианизидина в присутствии висмутола I (концентрации: Н2О2-1 ммоль/л, пероксидазы - 0,05 нмоль/л, висмутола, мкмоль/л: 1-й, 2-10, .3-20, 4-40, 5-60, 5-100)

Уо

Рис.3. Быстрая (1) и медленная (2) стадии падения активности 0,05 нМ пероксидазы в присутствии 0,65 мМ тиомочевины (концентрации: о-дианизидина-0,12 мМ, Н2О2-1 мМ; рН 5,0)

Таблица 8

Значения констант Михаэлиса (Км) и к^ для пероксицазного окисления о-дианизидина при различных концентрациях тиомочевины и висмугола

Концентрация тиомочевины, мкмоль/л 0 50 100 200 300

Км. мкМ 28 35 41 48 56

kkat. С"1 3150 3250 3250 3200 3300

Концентрация висмутола, мкмоль/л 0 20 40 60 100

Км» мкМ 59 116 129 236 790

klab С"1 j 41 42 36 37 42

Следовательно, на первой, быстрой, стадии протекает обратимое конкурентное ингибирование фермента тиомочевиной (Кинг=0,22 мМ), описываемое, очевидно, следующей схемой:

Ь к3 к4 Е] + S « EjS -» E2S' - E + P (5)

K^ »Î+ I k-2

E11 (Схема 2)

где E]I - комгсгекс тиомочевины с промежуточным соединением Еь остальные обозначения те же, что и в схеме 1.

На второй стадии происходит необратимая инактивация фермента.

Обнаружена корреляция между рассчитанными нами содержанием апофсрмента и величинами констант скорости инактивации rteроксидазы при различных концентрациях тиомочевины и фермента. Кроме того, методом дифференциальной спектроскопии установлены спектральные изменения для гемина в присутствии различных количеств тиомочевины при 380 и 442 нм, что указывает на связывание гемина с тиомочевиной. Константы диссоциации образующихся комплексов составляют Кдзво •» Кд442 = 30 мМ Возможно, образование комплекса с гемом ускоряет окисление тиомочевины с образованием свободных радикалов, модифицирующих гем, что приводит к инактивации фермента.

Общая схема процесса взаимодействия тиомочевины с пероксидазой при инкубировании их смеси включает несколько последовательно-параллельных стадий: 1) окисление тиомочевины кислородом воздуха, катализируемое пероксидазой, с образованием промежуточных свободно-радикальных продуктов, которые взаимодействуют с ферментом и вызывают его модификацию; 2) при малых концентрациях фермент диссоциирует на гем и белок; гем образует комплекс с тиомочевиной, в котором окисление тиомочевины и последующая модификация фермента ускоряются; 3) модификация пероксидазы при взаимодействии с исходной тиомочевиной или промежуточными продуктами ее окисления снижает активность фермента; 4) при высоких концентрациях пероксидазы константа инактивации снижается за счет того, что уменьшается доля фермента, диссоциированного на гем и апофермент, а молекулы белка также выступают в роли ингибитора свободно-радикального процесса окисления тиомочевины.

4.5.2. Кинетика и механизм индивидуального и совместного пероксидазного окисления о-дианизидина и висмутом I

Появление индукционного периода на кинетических кривых и уменьшение скорости стационарного пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии висмутола после завершения индукционного периода (рис. Л ) позволили предположить, что висмутол I наряду с о-дианизидином является субстратом фермента. Нами показано, что пероксидаза катализирует окисление висмутола, то есть он действительно является первым обнаруженным серосодержащим субстратом пероксидазы.

Как видно из рассчитанных нами значений Км и к^ (табл.8), висмутол существенно замедляет стационарную скорость окисления о-дианизидина после окончания индукционного периода, увеличивая Км. но не изменяет кки, то есть действует как конкурентный ингибитор.

Для объяснения влияния висмутола (Бг), являющегося субстратом пероксидазы наряду с о-дианизидином (81), но действующего и как конкурентный ингибитор фермента, можно воспользоваться той же кинетической схемой (1), которая была предложена для обоснования причин аналогичного действия на пероксвдазу фенолов.

Из экспериментально полученной зависимости индукционного периода от концентрации висмутола при различных концентрациях о-дианизидина были определены константы скорости отдельных стадий и с их использованием рассчитана константа Михаэлиса для индивидуального пероксидазного окисления" о-дианизилина: к? = (6,0+0,5).107 М^с1; к-2 = (1,0+0,5). 103 с-1; к3 = (12+1).103 с"1; к4 = (5,5+0,5).Ю3 с"1 (п=3, Р=0,95); Км = 94 мкМ.

Идентичность поведения висмутола и других исследованных нами серосодержащих соединений II группы, а также сопоставление их способности к окислению в оптимальных условиях проведения индикаторной реакции (табл. 7) позволяют предположить, что они также являются вторыми субстратами пероксидазы в реакции окисления о-дианизидина.

4.6. Влияние ионов металлов и ртутьорганических соединений на активность пероксидазы

Обнаружено, что из всех изученных многочисленных ионов металлов наибольшее ингибируюшее действие на каталитическую активность

пероксидазы оказывают ионы Нв(Н), РЬ(И), Сё(П) и В1 (Ш) при их минимальных концентрациях 0,02, 0,05, 1 и 1 мкг/мл соответственно.

Методами разбавления и диализа показано, что процесс взаимодействия пероксидазы с ионами ртути, свинца и кадмия обратим, а висмута -необратим. Кроме то то установлено, что ртуть(П) и свинец являются конкурентными, а кадмий - неконкурентным ингибиторами фермента. Константы ингибирования для указанных ионов составляют (1,1+0,3), (43+1) и (71 ±20) мкМ (п=3, Р=0,95) соответственно.

Известно, что еще более опасными, чем неорганическая ртуть токсикантами являются ртутьорганические соединения. Нами было изучено влияние метил-, этил- и фенилртути на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина. Установлено, что эти соединения не влияют на активность пероксидазы в указанной индикаторной реакшга при концентрации, меньшей 0,1 ммоль/л.

В целях повышения чувствительности и селективности ферментативного определения указанных выше ионов металлов и ртутьорганических

соединений было исследовано их совместное с серосодержащими органическими соединениями I и II групп действие в реакции пероксидазного окисления о-дианизидина.

4.7. Влияние ионов металлов и ртутьорганнческих соединений на активность пероксцаазы в присутствии серосодержащих соединений

Обнаружено, что одновременное действие двух эффекторов - иона металла или ртутьорганического соединения и какого-либо

серосодержащего вещества не является аддитивным, а приводит к проявлению различных эффектов, например, к усилению ингибирующего действия ионов металлов: ртути(П), свинца, кадмия и висмута(Ш) в присутствии тиомочевины; висмута(Ш) - в присутствии дитиотреигола (ДТТИ) (табл.9).

Причины этого явления, заключаются, очевидно, в том, что серосодержащие соединения модифицируют фермент (как было показано на примере тиомочевины) и, обладая достаточно сильными восстановительными свойствами, способны восстанавливать Б-Б-связи в молекуле фермента. Происходящее в результате этого частичное разворачивание белковой глобулы способствует взаимодействию ионов металлов с образовавшимися БН-группами, а также многочисленными карбоксильными группами фермента.

Правильность этого предположения подтверждает сопоставление восстановительной способности ССС I группы (табл.7) со степенью их ингибирующего действия на пероксидазу и усиления влияния ионов металлов: чем выше потенциал, тем меньше ингибирующее действие и влияние на ион металла.

Совместное присутствие ртутьорганических соединений с феншггиомочевиной и ДТТИ приводит к подавлению ингибирующего влияния последних и повышению вследствие этого каталитической активности фермента, то есть ртутьорганические соединения оказывают либеративное действие на пероксидазу (рис. 4).

Совместное присутствие ионов металлов или ртутьорганических соединений и ССС II группы приводит к изменению действия второго субстрата: свинец, висмуг(Ш) и метилртугь сокращают индукционный

Таблица 9

Характер влияния ионов металлов и метилртути на скорость пероксидазного окисления о-дианизидина и продолжительность

индукционного периода (т1ШЯ) в присутствии серосодержащих органических

соединений

Ион Н8(Н) Сй(Н) РЬ(П) В1(Ш) СН3Н8+

Диапазон конц., нг/мл 0,01 - 1 1 - 100 I - 100 1 - 10 200-2000

Ингибиторы Ингибирующее действие

Тиомочевина усиливает усиливает усиливает усиливает —

Ацетилтио-мочевина слабо усиливает — — — —

Фенилтио-мочевина — — — — либерат. действие

Дитиотреитол — — — усиливает либерат. действие

Субстраты XV тинд XV гинд W Тинд \У ^инч XV Тцлд

ДЭДТК - ~ умен — — умен. - умен. - умен.

Хлортиофенол увел умен. ув. умен.

Цистеин - увел.

Тиосалицило-вая кислота — умен.

----влияние отсутствует

период в присутствии ДЭДТК (рис.5а); ртуть(Н) увеличивает его продолжительность в присутствии цистеина и повышает скорость пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии хлортиофенола; кадмий понижает ее в присутствии ДЭДТК (табл.9, рис.56).

Влияние ионов металлов на продолжительность индукционного периода связано, по-видимсму, с образованием ими комплексных соединений с серосодержашими субстратами. Например, висмут(Ш) и свинец, изменяющие продолжительность индукционного периода в присутствии ДЭДТК, образуют с этим соединением прочные комплексы <1ерВг =35,42, 1§рРс1=20,80). Индукционный период либо сокращается, если образующийся комплекс обладает меньшими восстановительными свойствами по

А 0.2

0.15 -

0.1 •

0.05 -

0 -'—>-1-1-—-

30 60 90 120 t,C

Рис.4. Кинетические кривые пероксидазного окисления о -дианизидина в

отсутствие ингибиторов (1) и в присутствии 50 мкМ фенилтио-мочевины (2), 50 мкМ фенилтиомочевины и 1 мкМ метилртуга (3)

А.

30 60 90 120 i,с "

А

0.2

0.1

о

30 60 90 120

Рис.5. Кинетические кривые пероксидазного окисления о-дианизидина

при совместном присутствии 10 мкМ ДЭДТК и Ш(П1) (а); ДЭДТК и С<1(11) (б) (концентрации, мкг/мл; В1(Ш) - 7-0, 2-0,05, 3-0,5, 4-1; С<3(И) - /-0, 2-0,05, 3-0,1, 4-0,5)

сравнению с самим лигандом, либо увеличивается в случае усиления восстановительных свойств комплекса. Очевидно, разной способностью

различных ССС II группы образовывать комплексы со ртутью, а также изменением __ восстановительных свойств образующихся комплексов по сравнению со свободными органическими лигандами объясняется различное влияние ртути(П) на индикаторный процесс в их присутствии.

Аналогичное предположение о том, что индукционный период в присутствшг ДЭДТК изменяется при введении метилртути вследствие образования комплекса между' ними, подтверждено нами при спектрофотометрическом изучении индикаторной системы в присутствии двух субстратов и ртутьоргаштческого эффектора.

Таким образом, характер действия одного и того же эффектора (иона металла или ртутьорганического соединения) может быть различным в зависимости от природы (строения, окислительно-восстановительных свойств, способности образовывать комплексы и т.д.) второго эффектора (серосодержащего вещества).

Использование совместного действия ионов металлов (ртути(И), кадмия, свинца, висмута(Ш)) или ртутьорганических соединений и серосодержащих веществ позволило расширить круг определяемых эффекторов (ртутьорганические соединения), разработать методики определения указанных соединений, отличающиеся не только более высокой чувствительностью, но и селективностью.

4.8. Определение ионов металлов

С использованием ингибируюшего действия ртути(Н) на пероксидазу в реакциях окисления о-дианизидина, о-фенилендиамина (ФДА) и 3,3,'5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в присутствии тиомочевины разработаны методики ее определения с пределами обнаружения 10, 0,8 и 0,3 пг/мл

соответственно.

Разработанные методики определения ртути(П), особенно с использованием реакции пероксидазного окисления ТМБ, по чувствительности сопоставимы только с атомно-абсорбционным и атомно-флуоресцентным методами с холодным паром. При этом они отличаются простотой и экономичностью.

На основе различного действия на индикаторный процесс ионов кадмия в присутствии тиомочевины и ДЭДТК; висмута(Ш) в присутствии ДТТИ и ДЭДТК, свинца в присутствии ДЭДТК разработаны методики их определения с пределами обнаружения 0,6; 5; 0,2; 5 и 1 нг/мл соответственно.

Введение в индикаторные системы тиомочевины позволяет определять 10 пг/мл ртути(Н) в присутствии 600-кратных количеств кадмия, 104-кратных количеств висмута и свинца. В присутствии ДЭДТК определению 0,05 мкг/мл кадмия не мешает висмут в концентрации 0,005 - 0,1 мкг/мл, а определению 2 нг/мл свинца не мешает 0,1 нг/мл ртути. Кроме того, только ртугь(И) из всех изученных ионов металлов способна повышать продолжительность индукционного периода в присутствии цистеина. Введение этого серосодержащего вещества в индикаторную реакцию позволяет определять 10 пг/мл ртути в присутствии 105-кратных количеств всех остальных ионов.

Разработанные ферментативные методики определения ртути(Н) и кадмия использованы для анализа на их содержание различных объектов окружающей среды и медицины (табл.3).

4.9. Тест-методики определения ртути(П) и ртутьорганических соединений

Преимущества иммобилизации пероксидазы были объединены с ее аналитическими возможностями, обнаруженными при использовании нативного фермента, при разработке тест-методик определения неорганической и органической ртути.

Нами установлено, что оптимальным способом иммобилизации пероксидазы является ее модифицирование хитозаном, а наилучшими носителями - полистирольный планшет и хроматографическая бумага. Для контроля активности иммобилизованных препаратов пероксидазы и разработки тест-методик в качестве индикаторных использованы реакции окисления о-дианизидина, ФДА, ТМБ и о-толидина. В зависимости от природы используемого субстрата-восстановителя при введении в реакционную систему пероксида водорода наблюдали различный переход

окраски раствора в ячейках планшета или на бумаге, содержащих иммобилизованный фермент (табл.10).

На основе пероксидазы, иммобилизованной по предложенной нами методике .на. различных носителях, и ингибируюшего действия ртути(Н) на пероксидазное окисление указанных выше субстратов" в присутствии тиомочевины разработаны тест-методики определения ртути с метрологическими характеристиками, представленными в табл.И. При визуальном контроле скорости реакции фиксировали время появления соответствующей окраски продукта индикаторной реакции.

Таблица 10

Переход окраски растворов в ячейке планшета и на бумаге, содержащих иммобилизованную пероксидазу, в различных индикаторных реакциях

Субстрат-восстановитель Полистирольный планшет Бумага

о-Дианизидин Зеленый-»бурый-»краеный Переход неконтрастен

о-ФДА Бледно-желтый -»оранжевый Коричневый-»зеленый

о-Толидин Голубой-»зеленый-»желтый-» розовый Переход неконтрастен

Т.МБ Голубой-» зсдсный-»желтый -»вишневый Голубой-»коричневый

Таблица 11

Метрологические характеристики тест-методик определения ртути (И) с использованием иммобилизованной пероксидазы (п=3)

Субстрат Визуальная детекция скорости Фотометрическая детекция

сн> сн, пг/мл «и

пг/мл нг/мл.

Планшет Бумага Планшет Бумага Планшет

о - ФДА 50 0,04 0,10 0,06 5,0 0,11

о-Дианизидин 10 — 0,17 — 0,8 0,11

о-Толидин 0,1 — 0,29 — 0,1 0,29

ТМБ 0,1 0,1 0,19 0,14 0,1 0,19

зе

На основе пероксидазы, иммобилизованной в ячейках планшета, создано и промышленно выпускается тест-устройство, рекомендованное ЦСИ Минэкологии России к использованию в природоохранной деятельности в качестве средства первичного контроля природных вод (циркулярное письмо № ЦС 20/15-80 от 6.02.92).

На основе иммобилизованной пероксидазы разработаны также тест-методики определения ртутьорганических соединений (табл.12). При использовании в качестве носителя полистирольного планшета оптимальной индикаторной реакцией оказалась реакция окисления о-дианизидина в присутствии фенилтиомочевины (ФТМ), в которой окраска изменялась из зеленой в красную. При проведении определения на бумаге наиболее контрастный переход окраски (голубая - бурая) в присутствии ДЭДТК наблюдали в реакции окисления ТМБ, а в присутствии ФТМ -окисления о-дианизидина (зеленая - красная).

Таблица 12

Нижние границы определяемых содержаний (мкмоль/л) и воспроизводимость (вй) тест-методик определения ртутьорганических соединений с использованием иммобилизованной пероксидазы

Носитель Планшет Бумага Бумага Силуфол

^\§-сод.соед. соединение"-^. ФТМ ДЭДТК ФТМ ФТМ

Метилртуть 0,024 (0,02) 5,0 (0,31) 1,0 (0,19) 9,0 (0,26)

Этилртуть - 120 (0,26) 11 (0,18) 8,0 (0,25)

Фенилртуть - 100 (0,23) 12 (0,18) 7,5 (0,23)

Для разработки селективной тест-методики определения ртутьорганических соединений использовано сочетание предварительного разделения их методом двумерной тонкослойной хроматографии с последующим ферментативным определением непосредственно на силикагеле с визуальной детекцией. В качестве неподвижной фазы был выбран силуфол, а подвижной - смесь гексана и этанола. Для проявления хроматограмм оптимальной оказалась реакция пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии ФТМ (переход окраски зеленая - красная).

Для определения неорганической ртути (с„=1,1 пг/мл, Бд = 0,14) после ее отделения от ртутьорганических соединений на силуфоле использована реакция окисления о-дианизидина в присутствии тиомочевины.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено систематическое исследование и обобщение результатов в области теории и практики применения ферментов - гидролаз и оксидоредуктаз - в химическом анализе для определения их неорганических и органических эффекторов.

2. Выявлено большое число (более 100) новых неорганических и органических активаторов и ингибиторов щелочной и кислой фосфатаз, неорганических пирофосфатаз, пероксидаз различного происхождения, супероксиддисмутазы.

3. На основе изучения механизма действия обнаруженных эффекторов ферментов установлено, что

- для щелочных фосфатаз животного происхождения ингибиторами являются тиолсодержащие органические соединения, взаимодействующие с ферментом по реакции тиол-дисульфидного обмена и стабилизирующие третичную структуру фермента; ионы метамов (свинец, цинк, магний), стабилизирующие четвертичную структуру фермента и связывающие его функциональные группы: активаторами служат органические соединения (комшексоны), взаимодействующие с примесными ионами металлов, связывающими фермент в неактивный ассоциат;

- для кислых фосфатаз растительного происхождения ингибиторами являются неорганические анионы (фторид-, вольфрамат-, молибдат-ионы) и органические соединения (например, комшексоны), способные связываться с ионами металла в активном центре фермента;

- для неорганических пирофосфатаз из пекарских дрожжей и Е.соИ ингибиторами служат ионы металлов (РЗЭ), способные конкурировать за места связывания на активном центре пирофосфатазы с ионами магния, присутствие которых необходимо для проявления каталитической активности фермента;

- для супероксиддисмутазы из молочной сыворотки ингибиторами являются неорганические анионы (цианид-, тиосульфат-ионы), алифатические

амины, способные образовывать устойчивые комплексные соединения с ионами меди, входящей в активный центр фермента;

для пероксидазы хрена активаторами служат стерически незатрудненные азотсодержащие гетероциклические соединения, обладающие высокой основностью, такие, как аминопиридины, имидазолы, триазолы; ингибиторами являются органические соединения, обладающие восстановительными свойствами, обусловливающими либо их взаимодействие с промежуточными продуктами окисления субстрата -диамина (индолы), либо модификацию фермента продуктами окисления ингибиторов и восстановление дисульфидных связей в молекуле фермента, (тиомочевины, тиолы); органические и неорганические соединения (например, кислоты), образующие устойчивые комплексные соединения с железом(Ш), входящим в активный центр фермента; ионы металлов (ртуть(И), свинец, кадмий, висмут(Ш)); способные образовывать устойчивые комплексные соединения с функциональными группами фермента и обладающие сродством к 8Н-группам;

субстратами пероксидаз хрена, ксилотрофного гриба РИеШпш щи/опт и клеток люцерны - служат фенолы и их производные (гидрохинон, пирогаллол, пирокатехин, п-крезол, п-аминофенол); субстратами пероксидазы хрена является также ряд серосодержащих органических соединений (висмугол I, тионалид, ДЭДТК, цистеин, тиосалициловая кислота, хлортиофенол).

4. Установлено, что совместное действие двух эффекторов (ионов металлов или ртутьорганических соединений и серосодержащих органических соединений) на активность пероксидазы хрена в реакциях окисления ароматических диаминов не является аддитивным и в зависимости от природы серосодержащего соединения характер действия иона металла или ртутьорганического соединения может быть различным. Так, серосодержащие органические ингибиторы усиливают ингибирующее действие ионов металлов и ртутьорганических соединений; ионы металлов и ртутьорганические соединения могут уменьшать или увеличивать продолжительность индукционного периода, а также повышать или понижать скорость пероксвдазного окисления диаминов в присутствии

серосодержащих субстратов фермента; ртугьорганические соединения проявляют либеративное действие на пероксидазу, ингибированную

серосодержащими соединениями, повышая ее активность.

- - - - - ..Обнаруженное явление использовано в аналитических целях для напра&ченного повышения чувствительности и селективности определения эффекторов ферментов.

5. Разработано более 40 высокочувствительных, в ряде случаев селективных, простых, экономичных и экспрессных ферментативных методик определения N-содержащих органических соединений (аминопиридинов, имидазолов, триазолов с ск= 0,2-40 мкМ); S-содержащих органических соединен: тй (тиомочевин, тиолов, тиокарбаминатов, тиоамида, аминокислот с сн = 20 н М - 0,5 мМ); Р-содержащих комплексонов (сн= 30 - 300 нМ); органических кислот (сн = 20 пМ - 20 мкМ); фенолов (сн = 0,2 - 20 мкМ); ионов металлов (ртути(Н), свинца, кадмия, висмута(Ш), РЗЭ с с,г = 0,1 нг/мл - 0,05 мкг/мл); неорганических анионов (фторид-, цианид-, вольфрамат-, молибдат-, тиосульфат-ионов с с,; = 5 пг/мл - 5 мкг/мл); ртутьорганических соединений (метил-, этил-, фенилртути с сн = 0,05 - 1 мкМ) на основе обнаруженного ингибирующего либо активирующего их влияния на активность щелочной и кислой фосфатаз животного и растительного происхождения в реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата, неорганических пирофосфатаз из пекарских дрожжей и E.coli в реакции гидролиза пирофосфата, супероксиддисмутазы из молочной сыворотки в реакции автоокисления пирогаллола, пероксидаз хрена, люцерны, ксилотрофного гриба в реакциях окисления пероксидом водорода о-дианизидина, о-фенилендиамина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, а также на основе совместного действия двух субстратов пероксидазы хрена - диамина и серосодержащего соединения.

Разработана методика определения железа(Ш) (с„ = 10 пг/мл) на основе его реактивирующего действия на пероксидазу, ингибированную салициловой кислотой.

6. Предложен новый способ иммобилизации пероксидазы хрена путем ее модифицирования полимером хитозаном.

7. Разработано И тест-методик определения неорганической ртути и ртутьорганических соединений (сн = 0,1 пг/мл - 0,05 мкг/мл) на основе пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозана в полистирольном планшете, на хроматографической бумаге и силикагеле "Силуфол", с визуальной и фотометрической детекцией скорости индикаторных процессов окисления о-дианизидина, о-фенил ендиамина, о-толидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина.

8. Создано и промьплленно выпускается тест-устройство для определения ргути(Н) в природных водах на уровне и ниже ЦДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозана в полистирольном планшете.

9. Разработаны методики определения рдда эффекторов ферментов в объектах окружающей среды, промышленных производств и медицины: ртути(Н) - в морских, речных, подземных водах на уровне и ниже ПДК, в крови, белковом витаминном концентрате; кадмия, вольфрамат-иона - в почвах; цинка - в крови; фторид-иона - во фторорганических соединениях; бензотриазола - в водах теплообменников АЭС и ГЭС; фосфорсодержащих комплексонов на фоне их комплексонатов - при контроле процесса удаления гипсовых отложений в вакуум-испарительных установках на промышленных предприятиях.

Основное содержание работы изложено в статьях:

1. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Ершова Е.В., Надь В.Ю. Кинетическое определение микроколичеств ртути с использованием фермента пероксидазы. //Журн. аналит. химии. 1979. Т.34. №34. С.1644-1647.

2. Долманова И.Ф., Попова И.М., Шеховцова Т.Н. Ферментативные методы определения серосодержащих органических соединений.//Журн. аналит. химии. 1980. Т.35. №8. С.1201-1205.

3. Угарова H.H., Попова И.М., Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н. Кинетика и механизм индивидуального и совместного окисления о-

дианизидина и висмугола 1 перекисью водорода, катализируемого пероксидазой хрена. //Биохимия. 1980. Т.45. №12. С.2256-2266.

4. Угарова H.H., Попова И.М., Долманова И,Ф„ Шеховдава Т.Н. - - Ингибирование и инактивация пероксидазы хрена в присутствии

тиомочевины. //Биохимия. 1981. Т.46. .4°6. С.1026-1034. "

5. Долманова И.Ф., Попова И.М., Шеховцова Т.Н., Угарова H.H. Кинетические методы определения азотсодержащих органических веществ с использованием фермента пероксидазы. //Журн. аналит. химии. 1981. Т.36. №6. С.976-980.

6. Долманова И.Ф., Попова И.М., Угарова H.H., Шеховцова Т.Н. Кинетический метод определения висмута с использованием фермента пероксидазы хрена. //Журн. аналит. химии. 1981. Т.36. №7. С.1347-1350.

7. Шеховцова Т.Н., Кучеряева В.В., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определен™ свинца с применением щелочной фосфатазы. //Журн. аналит. химии. 1985. Т.40. №10. С.1810-1814.

8. Долманова И.Ф., Золотова Г.А., Шеховцова Т.Н., Ушакова Н,М, Каталитические методы определения переходных металлов./В кн. Определение малых концентраций элементов. Москва. Наука. 1986. С. 144153.

9. Шеховцова Т.Н., Кучеряева В.В., Долманова И.Ф. Применение щелочной фосфатазы для определения ряда органических соединений. //Журн. аналит. химии. 1987. Т.42. №7. С.1131-1138.

10. Dolmanova I.F., Shekhovtsova T.N., Kutcheryaeva V.V. Assay of enzyme effectors. //Talanta. 1987. V.34. №1. P.201-205.

11. Шеховцова Т.Н., Стародумова H.H., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения ртути. //Журн. аналит. химии. 1987. Т.42. №10. С.1824-1828.

12. Долманова И.Ф., Кучеряева В.В., Шеховцова Т.Н., Волкова H.A. Определение нитрилотриметиленфосфоновой кислоты на фоне комплексонатов при химической очистке оборудования. //Заводск. лаборатория. 1988. .\fel2. С.16-18.

13. Долманова И.Ф., Кучеряева В.В., Попова И.М., Шеховцова Т.Н., Головин А.Н. Ферментативный метод оценки степени термической

обработки рыбных продуктов, /в сб. научных трудов ВНИРО. Современные проблемы рыбохозяйственных исследований. Москва. 1989. С.118-122.

14. Чухрай Е.С., Кучеряева В.В., Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н. Термоинактивация щелочной фосфатазы в присутствии ее эффекторов. // Журн. физ. химии. 1989. Т.63. №12. С.3354-3358.

15. Шеховцова Т.Н., Митюрева И.Л., Швецкая М.В., Долманова И.Ф. Использование кислых фосфатаз для определения микроколичеств анионов. //Журн. аналит. химии. 1991. Т.46. №3. С.571-577.

16. Shekhovtsova T.N., Dolmanova I.F., Baykov А.А. Assay of phosphatase effectors.//Biochemistry & Biotechnology. 1991. V.l. №2/3. P.72.

17. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения микроколичеств железа(Ш) и ряда ингибиторов пероксидазы. //Журн. аналит. химии. 1993. Т.48. №1. С.129-136.

18. Шеховцова Т.Н., Пирогова С.В., Федорова О.М., Долманова И.Ф., Байков А.А. Ферментативный метод определения РЗЭ с использованием пирофосфатаз. //Журн. аналит. химии. 1993. Т.48. №3. С.518-525.

19. Газарян И.Г., Решетникова И.А., Веревкин А.П., Фелин В.А., Лялюлин А.Л., Шеховцова Т.Н. Пероксидаза гриба Phellinus Igniarius 71-31. //Доклады АН. 1993. Т.329. №5. С.663-665.

20. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А., Шеховцова Т.Н. Проблемы и перспективы применения ферментов в анализе объектов окружающей среды. //Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №5. С.452-461.

21. Шеховцова Т.Н., Ремизова А.А., Чумакова А.И., Долманова И.Ф. Метод определения неорганических анионов - ингибиторов фермента супероксиддисмутазы. //Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №7. С.730-735.

22. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Использование иммобилизованных ферментов для определения ионов

металлов. //Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №8. С.789-795.

23. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Никольская Е.Б., Долманова И.Ф. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием иммобилизованной пероксидазы. //Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №8. С. 862-867.

24. Шеховцова Т.Н., Лялюлин АЛ., Кондратьева Е.И., Газарян И.Г., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения фенолов с использованием пероксидаз различного происхождения. // Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №12. С.1317-1323.

25. Shekliovtsova T.N., Cliertietskaya S.V. Determination of mercury-at the picogram per milüüter level using immobilized horseradish peroxidase. //Analyt. Letters. 1994. V.27. №15. P.2883- 2898.

26. Gazaryan I.G., Loginov D.B., Lialulin A.L., Shekhovtsova T.N. Detennination of phenols using various peroxidases. //Analyt. Letters. 1994. V.27. №15. P.2917-2930.

27. Шеховцова Т.Н., Чернецкая C.B., Долманова И.Ф. Ферментативный метод определения ртути в природной воде. //Журн. аналит. химии. 1995. Т.50. №3. С.309-311.

28. Шеховцова Т.Н., Чернецкая C.B., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной на бумаге. //Журн. аналит. химии. 1995. Т.50. №5. С.538-542. ...

авторских свидетельствах СССР и патентах РФ:

29. Авт. св-во СССР №1434366. Способ контроля удаления гипсовых отложений с поверхности оборудования. Волкова Н.В., Долманова И.Ф., Кучеряева В.В., Шеховцова Т.Н. Заявл. 07.07.1986. Опубл. 30.10.1988. Бюл. №40.

30. Авт. св-во СССР №1638918. Способ кинетического определения вольфрама. Долманова И.Ф., Кучеряева В.В., Шеховцова Т.Н. Заявл. 06.01.1989. Опубл. 30.03.1991. Бюл.№12.

31. Патент РФ №2013770. „ Способ ферментативного определения микроколичеств ртути. Долманова И.Ф., Никольская Е.Б., Чернецкая C.B., Шеховцова Т.Н. Заявл 29.05.1992. Опубл. 30.06.1994. Бюл.№10.

32. Положительное решение от 30.03.1995 о выдаче Патента РФ по заявке № 94-011562/13. Способ .ферментативного определения микроколичеств ртути. Шеховцова Т.Н., Чернецкая C.B., Долманова И.Ф.