Электрохимичские биосенсоры на основе некоторых гидролаз и оксидаз для определения биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 ОД

На правах рукописи УДК 543: Е53

КРЕМЛЕВА НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НЕКОТОРЫХ ГИДРОЛАЗ

И ОКСИДАЭ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ - 1997

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета и в лаборатории ВТНК "Биосенсорьг" института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН г. Лущино.

Научные руководители:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Э.П. МЕДЯНЦЕВА

кандидат физико-математических наук, с.н.с. А.Н. РЕШЕТИЛОВ

академик МАВШ, член-корр. РАЕН, доктор химических наук, профессор Г.К.' БУДНИКОВ

доктор химических наук, профессор В.Н. БАСОВ

кандидат химических наук с.н.с. В.М. ГОРОХОВСКИЙ

Ведущая организация: Башкирский государственный

медицинский университет, г.Уфа

Защита состоится ^97 г

на заседании диссертационного Совета К 053.29.09 по химическим наукам Казанского государственного университета, ул. Кремлевская, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

им. Н. И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, научная часть

Автореферат раз ос лан У^ 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета .

кандидат химических наук (¡рХ^^Гч^ Н.Р.Федотова

Актуальность теш. Последние 20 лет биосенсоры (БС) как новое средство получения информации занимают видное место среди подобных устройств, используемых для аналитических целей при определении различных физиологически активных веществ в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и при контроле загрязнителей окружающей среды. Все чаще химики-аналитики обращаются при решении конкретных задач к биохимическим методам анализа, предполагающим использование БС в том или ином варианте. Причина привлекательности БС заключается в высокой селективности отклика биоматериала Сферментов, антител, рецепторов и т.д.}, используемых в создании сенсоров практически на любой субстрат. Кроме того, современные БС в той или иной мере моделируют функции живых организмов (отдельных частей), поэтому их применение обеспечивает получение результатов, позволяющих сделать более адекватные выводы о состоянии объектов окружающей среды. Одно из направлений разработки БС в настоящее время - использование тканей растений и млекапитающих в качестве биочувствительной части, что позволяет с легкостью создавать естественное окружение для представляющего интерес фермента и удобно при конструировании БС. Использование свойств ферментов, а также регистрация отклика в электрических единицах, позволяют создавать аналитические устройства, обладающие высокой селективностью, чувствительностью, быстродействием. На сегодняшний день наибольшее распространение получили электрохимические БС. Среди зтих БС можно выделить две основные группы: амперометрические системы, регистрирующие ток, и потенциометрические приборы, основанные на измерении потенциала. Успешное развитие БС подготовлено как достижениями современной биохимии, иммунологии с одной стороны, так и микроэлектроники, аналитической химии и электрохимии с другой. Среди электрохимических преобразователей наибольшее распространение получили преобразователи типа электрода Кларка. На втором месте, как коммерчески доступные, так и описанные в литературе находятся потенциометрические датчики, связанные с использованием ионселективных электродов С ИСЭЭ. В последнее время все чаще в роли трансдьюсеров выступают ионселективные полевые транзисторы (ИСПТ) в связи с их миниатюрностью, а также технологичностью изготовления. Большие потенциальные возможности электрохимических БС, дающих отклик на широкий спектр физиологически активных веществ создают условия для

использования их в скрининге на токсичность широкого круга сое динений. Именно электрохимические БС считаются перспективными при проведении экспрессного биотестирования и мониторинга объекти эколого-аналитического контроля. Поэтому разработка подобных диах ностируодих устройств с привлечением новых трансдьюсеров и биолоп ческих материалов весьма актуальна.

Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с координационным планом РАН по направлению 2.20.1 С разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7) и грантом Российского фонда фундаментальных исследовани! "Реакции биоспецифического взаимодействия в вольтамперометрическо» анализе" Сномер проекта 94-03-09265)

Цель исследования заключалась в поиске, обосновании подходов и в разработке новых электрохимических биосенсоров с использованием различных биологических препаратов, в том числе, тканевых материалов, и изучении аналитических возможностей разработанных биосенсоров в анализе биологически активных соединений.

Научная новизна:

Показана и обоснована возможность вольтамперометрическог< контроля за ходом ферментативных реакций: гидролиза цистеина : присутствии Ь-цистеиндесульфгидролазы и окислительного дезамиров. ния моноаминов с помощью моноаминооксидазы. Найдены условия и< пользования в качестве биочувствительной части амперометрически: сенсоров гомогенатов растительных и животных тканей, а также с; мих растительных тканей. Разработаны новые способы иммобилизаци: холинэстеразы в комбинированные пленки из хитозана и желатин; Разработаны и предложены новые амперометрические сенсоры: на о> нове тканевых растительных материалов, гомогенатов для определ ния активности 1,-цистеиндесульфгидролазы и ионов тяжелых мета лов; амперометрический сенсор на основе иммобилизованной моноам нооксидазы для определения биогенных моноаминов на концентрацио ных уровнях п*10~® - моль/л. Найдены условия функционир

вания систем на основе иммобилизованных биологических препаратов электрохимических трансдьвсеров, позволяющих получить стабильны аналитический сигнал.

Разработан потенциометрический холинэстеразный биосенсор дл определения обратимых и необратимых ингибиторов холинэстеразы ра

личной природы. Подобраны условия, позволяющие снизить нижние границы определяемых концентраций ингибиторов на фоне металлов-активаторов.

Практическая значимость:

Предложены новые электрохимические биохимические сенсоры с аналитическими характеристиками, позволяющими определять широкий круг биологически активных веществ на уровне и ниже ПДК. Показана возможность практического использования этих сенсоров для высокочувствительного и селективного определения адреналина, норадре-налина в лекарственных препаратах; метафоса, трихлорметафоса, фо-залона, прозерина, эзерина; свинца и кадмия в почвах.

Способы получения биочувствительной части как для ампероме-трического так и потенциометрического сенсоров могут быть использованы в лабораториях и на предприятиях аналитического, биохимического и медицинского профилей для получения образцов иммобилизованных биологических материалов, для применения в различных типах аналитических систем и изготовления на их основе высокочувствительных анализаторов.

На защиту выносятся:

- Устройство электрохимических биосенсоров на основе стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и рН-чув-ствительного полевого транзистора

- Результаты исследования электрохимического поведения субстратов и продуктов ферментативных реакций гидролиза цистеина в присутствии Ь-цистеиндесульфгидролазы и окислительного дезаминирования биогенных моноаминов в присутствии моноаминооксидазы

- Способы иммобилизации и подготовки к работе гомогенатов биологических тканей и холинэстеразы

- Способы определения ионов свинца и кадмия по каталитической активности Ь-цистеиндесульфгидролазы в составе амперометрического биосенсора

- Способы определения биогенных моноаминов с помощью моноаминоок-сидазного биосенсора

- Методы определения обратимых и необратимых ингибиторов холинэстеразы с помощью биосенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора

-6- Рабочие условия, определяющие величину аналитического сигнала при работе с амперометрическими и потенциометрическиыи биосенсорами

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Итоговой научной конференции Казанского государственного университета С1995 г), конференции "Экоаналитика - 1994" СКраснодар, 1994 г), на 5-ом симпозиуме по кинетике в аналитической химии Сг.Москва, 1995 г). Международном симпозиуме по экологической химии С Кишинев, 1995 г), 6-той Европейской конференции по электроанализу (Дарем, 1996 г), 9-той городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1996), на 3-ей сессии по микросистемам и мониторингу окружающей среды ( г.Москва, 1996), на Всероссийской конференции с международным участием " Химическое разору-жение-96. Экология и технология. СНЕМОЕТ -96" Сг.Ижевск, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (г.Москва,1997).

Основное содержание диссертации отражено в 11 публикациях, одна статья принята к печати.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и содержит 14 рисунков, 38 таблиц и список литературы из 147 наименований. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы.

В первой главе обсуждена информация об амперометрических и потенциометрических биосенсорах и использовании различных типов трансдьюсеров (первичных преобразователей) при создании этих биосенсоров на основе различных ферментативных систем.

Во второй главе формулируются поставленные задачи, описывается аппаратура, объекты исследования, условия эксперимента и обработка экспериментальных данных.

В третьей главе представлены экспериментальные данные по разработке нового амперометрического биохимического сенсора на основе тканевых материалов растительного происхождения. Показана возможность его использования для определения тяжелых металлов.

В четвертой главе приведены результаты разработки нового амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной моноаминок-сидазы. Оценены его аналитические возможности в определении некоторых биогенных аминов.

Лятая глава посвящена разработке холинэстеразного ¿иосенсора 1а основе рН-чувствительного полевого транзистора. Показаны его возможности в определении ингибиторов холинэстеразы.

Экспериментальная часть Часть экспериментальной работы выполнена на осциллографическом толярографе П0-5122, модель 03 с ячейкой, термостатированной при 25+0,сРе с помощью термостата ТС-50. Рабочим электродом служил био-шшческий сенсор, состоящий из стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и иммобилизованных ферментов: 1-цкстеиндесульфгидролазы СЬ-ЦДГ) из листьев огурца и пшеницы и мо-зоаминоксидазы СМАО). Площадь рабочей поверхности биочувствительной тасти сенсора 7,95+0,5 см*". Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод. Использовали Ь-ЦДГ листьев огурца сорта Изящный, МАО митохондрий печени крыс линии "Вистер" СКФ 1.4.3.4). В качестве матричных материалов для получения образцов иммобилизованных ферментов использовали нитроцеллюлозу, желатин, хитозан и их различные комбинации. Б качестве субстратов 1-11ДГ использовали - Ь-цистеин; субстратов МАО - адреналин, норадреналин, тирамин, серотонин.

Часть работы выполнена с использованием рН-чувствительных полевых транзисторов СПТ), изготовленных по п-канальной МДП-технологии с применением кремниевых пластин типа КДБ ЮС 100]. Использовали бу-тирилхолинэстеразу сыворотки крови лошади СКФ 3.1.1.8) с активность» 110 АЕ/мг, которую иммобилизовали в нитроцеллюлозные пленки и ацетат-целлюлозные мембраны типа "Миллипор" 1,2/м. В качестве субстрата применяли бутирилхолин иодид СБТХЮ и ацетилхолин САЮ. Объекты исследования: обратимые (эзерин, прозерин) и необратимые (фосфорсодержащие: метафос, трихлорметафос, фозалон) ингибиторы.

1-ЦИСТЕИНДЕСУЛЬФГВДР0ЛАЭНЫИ БИ0СЕНС0Р И ЕГО АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ Гидролиз цистеина в растительных тканях, протекает в присутствии фермента класса гияролаз - Ь-ЦДГ по схеме:

ь-цдг

Ь-цистеин + Н20------> пируват + ИН3 + Н2Б

Оценить активность данного фермента и скорость ферментативного

процесса можно по изменению концентрации субстрата данного фермента. Цистеин в определенных условиях обладает электрохимической активностью , т.е. способностью восстанавливаться на ртутно-капель-ном электроде. На осцилловольтаыперограммах растворов цистеина на фоне фосфатных буферных растворов при рН 4,0-9,0 на СРПЭ с серебряной подложкой на катодной ветви наблюдается хорошо выраженный пик при потенциале -0,56В. Треугольная форма пика, положение на оси потенциалов, значение коэфициента Семерано 0,78-0,8 указывает на адсорбционную природу пика. Наблюдаемый сигнал можно отнести к электровосстановлению образующегося в анодном цикле соединения цистеина с ртутью (материалом электрода). Высота тока пика при потенциале -0,56В зависящая как от концентрации субстрата, так и от активности фермента, использована в качестве аналитического сигнала. Присутствие в растворе цистеина модифицированных листьев огурца приводило к спаду величины тока при данном потенциале, что позволило оценить величину каталитической активности 1.-ЦДГ используемой растительной ткани. Таким образом, сочетание ферментативной реакции гидролиза цистеина и электрохимической реакции его восстановления было положено в основу функционирования соответствующего амперометрического БС. Наибольший каталитический эффект наблюдается в области рН 7,4-7,6 на фоне фосфатного буферного раствора, при времени инкубации биочувствительной части с раствором субстрата 15-20мин, площади листа растения 8,0-12,0 см^Стабл. 1] Из данных таблицы 1 следует, что каталитическая активность используемой биочувствительной части сенсора невелика, что связано, вероятно, с трудностями доступа субстрата к ферменту, находящемуся в клетках ткани. Подобные ограничения снимаются при использовании гомогенатов из растительных тканей. Иммобилизация гомогената в ни-троцеллюлозную пленку позволила получить образцы с более высокой каталитической активностью С0,65+0,05 мкмоль/мин'мг), кроме того, увеличить срок службы биочувствительной части сенсора (каталитическая активность сохранялась без существенных изменений в течении недели и более).

Измерение аналитического сигнала при действии тяжелых металлов на примере ионов РЬ(П) и СсКП) показывает, что величина удел] ной активности ферментов может изменяться в их присутствии. Это-показатель был использован для оценки содержания данных экотоксика]

тов в реальных объектах, в частности, в почвах.

При добавлении солей свинца и кадмия к исследуемому раствору, наблюдалось меньшее изменение величины аналитического сигнала по сравнению с контрольным опытом в их отсутствии. Таким образом, соли свинца и кадмия вызывают уменьшение скорости реакции гидролиза субстрата - цистеина т.е. являются ингибиторами данного фермента. Чем большая концентрация тяжелого металла используется, тем в большей степени уменьшается удельная активность фермента. Линейная зависимость показаний Ь-ЦДГ БС от концентрации тяжелых металлов наблюдается в интервале концентраций 1*10~2- 1*10~8моль/л, нижняя

—А

граница определяемых концентраций составила для кадмия 1x10 моль/л, для свинца 3*10~8 моль/л.

Таблица 1.

Определение удельной активности Ь-ЦДГ листьев огурца Сп = 5, Р = 0.95).

Образец Площадь,см2 Концентрация Активность, Бг

цистеина,М мкМ/минхмг

1 12 1*10"4 0,18 + 0,03 0,12

5*10"4 0,19 + 0,03 0,11

1*10"3 0,23 + 0,02 0,09

2*10-3 0,26 + 0,03 0,08

2 10 1*10~4 0,14 + 0,03 0,14

5*10~4 0,12 + 0,02 0,13

1*10"3 0,19 + 0,03 0,10

2*10_3 0,20 + 0,02 0,08

3 8 1*1О-4 0,10 + 0,02 0,15

5*10"4 0,12 + 0,02 0,12

1*10"3 0,15 + 0,01 0,09

2*1О-3 0Д6 + 0,02 0,09

Обработка почвы нитратами свинца и кадмия в дозах 100 и 1000 раз превышавших ПДК позволила оценить содержание данных ионов с помощью разработанного БС по изменению величины удельной активности Ь-ЦДГ С табл. 2).

Реакция растений на действие тяжелых металлов при обработке почвы нитратами свинца и кадмия зависела от концентрации и продолжительности действия. Ингибирующее действие ионов РЬСП) и СсКП), как показывает расчет удельной активности фермента, усиливается с увеличением длительности обработки и концентрации, причем, эффект ионов СсКП) проявляется быстрее. Токсическое действие тяжелых металлов связано с их способностью вызывать денатурацию метаболичес-

Таблица 2.

Определение удельной активности иммобилизованной Ь-ЦДГ листьев огурца, выращенных в почве, обработанной РЬ и Сё*

Сп = 4, Р=0,95)

Время Активность, Активность, Зг

обработки, мкмоль/ыин мг мкмоль/мин мг

в сутках (почва со 100-кр. (почва с 1000-кр.

избытком ионов избытком ионов

металлов) металлов)

ионы с в и н ц а ( II )

1 0,42 + 0,04 0,05 0,36 + 0,05 0,10

7 0,33 + 0,04 0,10 0,31 + 0.03 0,11

14 0,30 + 0,05 0,13 0,20 + 0,04 0,16

ионы к а д м и я ( II )

1 0,36 + 0,02 0,05 0,33 + 0,03 0,09

7 0,34 + 0,04 0,09 0,31 + 0,04 0,09

14 0,33 + 0,05 0,12 0,30 + 0,06 0,14

*удеяьная активность образца в отсутствие обработки почвы тяжелыми металлами (0,65 + 0,04) мкмоль/мшьмг

ки важных белков. Высокое содержание свинца приводит к нарушению метаболизма прежде всего в клетках корней, достижение высокого содержания уровня данного металла в надземной части не происходит в связи с барьерами, возникающими на пути транспорта свинца; кадмий проникает более легко. Содержание свинца в листьях растений, определенное с помощью L-ЦДГ БС, колеблется в интервале 1*10~8-

—8 7 ft

- 5*10 моль/л, кадмия 1*10 - 1*10"° моль/л.

Таким образом, данный амперометрический БС позволяет оценить каталитическую активность L-ЦДГ - фермента,, участвующего в реакции тиолдисульфидного обмена, а также сделать выводы о содержании свинца и кадмия в почвах, используемых для выращивания растений. Предлагаемый способ оценки содержания тяжелых металлов, особенно в варианте с использованием листьев растений, прост в исполнении, не требует длительной пробоподготовки почвы для анализа т.е. этот способ в определенных условиях может быть использован для экспрессного биотестирования загрязненности почв.

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МАО Моноаминооксидаза СМАОЗ - фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий реакции окислительного дезаминирования моноаминов по схеме (2): ^q

R-CH2"NH2 + 02 + Н20-----> R-CH0 + NH3 + Н202 С 23

Как видно из приведенной схемы, продуктами ферментативной реакции являются альдегид и Н202, которые согласно литературным данным при определенных условиях проявляют электрохимическую активность, что было использовано в аналитических целях для разработки устройств, позволяющих регистрировать физиологически активные концентрации биогенных аминов. Поскольку альдегиды на РКЭ восстанавливаются в достаточно отрицательной области потенциалов, в роли тран-сдьюсера мог выступать только такой электрод, который обеспечивал эту область потенциалов для водных сред. Для этих целей хорошо подходит СРПЭ с Ag-подложкой, позволяющий работать в водных системах в области потенциалов от +0,35 до -2,0В.

Поэтому была предпринята попытка разработать амперометрический биохимический сенсор на основе СРПЭ с Ag-подложкой и иммобилизованной различными способами МАО.

На осцилловольтамперограммах растворов субстратов МАО в присутствии иммобилизованной МАО на фоне фосфатного буфера с рН8,2 наблюдается 3 волны: при Ер= -0,6В, -1,2В, -1,8В, которые можно отнести к процессам восстановления 0% С-0,б В и -1,2 В), Я^О^. образовавшегося в ходе ферментативной реакции С-1,2 В) и в ходе реакции электровосстановления кислорода и восстановления соответствующего альдегида до спирта С-1,8 В).

Величина тока пика при Ер= -0,6 В со временем уменьшается, что связано с участием в реакции окислительного дезаминирования (2), пик при Ер = -1,2 В почти не изменяется со временем, пик Ер= -1,8 В увеличивается, достигая постоянного значения через 30-40-50 мин в зависимости от концентрации субстрата. Пик при потенциале -1,2В с одной стороны увеличивается за счет восстановления образующегося с другой стороны уменьшается/в результате потребления 0^ в ходе реакции(2). В результате его высота почти не изменяется. Третий пик растет за счет увеличения концентрации соответствующего альдегида, образовавшегося в результате реакции С2). Величина третьего пика зависит не только от времени протекания реакции, но и от рН раствора. Максимальное значение токов наблюдается при рН 8,2. Следует отметить, что данное значение рН несколько выше, чем оптимальное значение рН для нативной МАО СрН оптим 7,2). Коэффициент Семерано, вычисленный независимости 1р от V указывает, что электродный процесс контролируется преимущественно диффузией деполяризатора к поверхности электрода. Некоторые вольтампе-рометрические характеристики наблюдаемых процессов электровосстановления продуктов дезаминирования изучаемых биогенных аминов приведены в табл 3. Линейная зависимость между величиной тока и концентрацией субстратов сохраняется в широком интервале концентраций. Аналитические возможности МА0-БС в определении субстратов данного фермента представлены в табл 4.

Полученные результаты показывают, что биогенные амины можно определять с помощью разработанного сенсора на основе иммобилизованной МАО и СРПЭ с Ад подложкой. Определения с таким биохимическим сенсором выгодно отличаются от способов, используемых в настоящее время. В частности, по сравнению со способом определения биогенных аминов с помощью электрода с газовым зазором данный вариант имеет ряд преимуществ. Ход анализа значительно упрощается,

Таблица 3,

Некоторые характеристики процесса восстановления продуктов реакции дезаминирования биогенных аминов. СрН 8,2 фосфатный буферный раствор)

Субстрат Концентрация Потенциал а1д1р/д1дУ

субстрата,моль/л пика, В

Тирамин 5*10~4 1,80 0,61

1*10~8 1,90 0,56

Норадреналин 5*10~4 1,85 0,64

1*10~8 1,88 0,59

Адреналин 5*10~4 1,84 0,52

1*10~8 1,89 0,46

Таблица 4.

Определение моноаминов с помощью биохимического сенсора на основе иммобилизованной МАО (п=4,Р=0,95)

Субстрат Интервал Уравнение градуи- г СН'

определяе- ровочного графика моль/л

мых содер-

ний, М

Тирамин 10~4-10~9 у=С-0,06+ 0,01)х + 0,9867

+С1.00+ 0,09) 6,3*1О-10

Адреналин 1<Г4-10~9 у=(-0,05+ 0,01)х+ 0,9878 6,8*10~10

+С0,79+ 0,01)

Норадре- 10"4-10~9 у=С-0,07+ 0,01)х + 0,9998 6Д*10"10

налин +(1,1+0,1)

так как исключается целый ряд операций, необходимых при работе с электродом с газовым зазором Сне нужно вводить дополнительные реагенты и кислород в систему для удаления мешающих газов). Определение становится более экспрессным; даже для концентрации биогенных аминов на уровне Сн, это время не превышает 50 мин. В области концентраций 1*10"4 - 1*10-6 моль/л эта величина - 10-20 минут. Не требуется дополнительного времени для установления постоянного аналитического сигнала. Способ позволяет определять более низкие концентрации биогенных аминов на уровне п*10~®~ п*10-1® моль/л. С помощью биохимического сенсора можно определять суммарную концентрацию биогенных аминов, включая и адреналин, при дезаминировании которого выделяется не аммиак, а метиламин, что расширяет область применения данного биохимического сенсора. Предлагаемый вариант биохимического сенсора, таким образом, можно использовать при определении ряда биогенных аминов, продуктами дезамирования которых являются альдегиды. Разработанные методики использованы в контроле за содержанием адреналина и норадреналина в фармакопейных препаратах.

ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКШ БИОХИМИЧЕСКИЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ рН-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ПОЛЕВОГО ТРАНЗИСТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТОВ И ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЭ Возможность применения рН-чувствительного полевого транзистора для регистрации активности иммобилизованной ХЭ основана на образовании соответствующих кислот - бутановой и уксусной - при гидролизе БТХИ и АХ. БС на основе рН-чувствительного ПТ представлял собой иммобилизованную в матрицы из нитроцеллюлозы или на мембранах типа "Миллипор" ХЭ, которые крепились на затворной области транзистора с помощью миниатюрного держателя, обеспечивающего плотное прилегание пленки к измерительной поверхности транзистора. БС позволял регистрировать присутствие в исследуемом растворе субстратов ХЭ - БТХИ и АХ. Отклики характеризовались зависимой от концентрации субстрата скоростью нарастания выходного сигнала, а также величиной его установившегося значения. Время восстановления показаний БС после замены пробы с субстратом на контрольный раствор составляло 4-7 мин. Сенсор позволяет определять наличие БТХИ в среде, начиная с концентраций порядка 4*10"^ моль/л, в то же время

нечувствительность к АХ ниже 4*10"^ моль/л, независимо от способа иммобилизации ХЭ, что может быть обусловлено субстратной специфичностью фермента.

БС на основе рН-чувствительного ЛТ дает отклик на изменение концентрации протонов, что делает необходимым учет буферной емкости средырН исходных буферных растворов, их ионной силы.

Сопоставление выходного сигнала с шумом показало, что высокое отношение сигнала к ¡пуму (не менее 100 единиц для проб с концентрацией БТХИ в диапазоне бжЮ-4 -1*10~3моль/л) можно получить при концентрации бсратного буферного раствора 1-3 мМ. Оптимум рН для данного БС лежит в диапазоне 9,0-10,0 рН. Оценка стабильности БС, проведенная в режиме периодических измерений показала, что стабильность электрода достаточно высокая и указанное время снижения амплитуды ответа не превышало 40%.

В присутствии изучаемых ингибиторов ХЭ величина аналитического сигнала изменялась обратно пропорционально их концентрации, что указывает на их ингибируюадай эффект. Полученные данные показали, что необратимые ФОС оказывают более сильное ингибирующее действие, которое усиливается с увеличением времени инкубации (табл.5).

Таблица 5.

Зависимость степени ингибирования ИХЭ от времени инкубирования фермента ингибиторами (концентрация ингибиторов 1*10~6мояь/л, концентрация БТХИ 1*10~^моль/л)

Ингибитор 0*

10 мин 15 мин 20 мин

Прозерин 0,76 0,78 0,81

Эзерин 0,58 0,60 0,59

Метафос 0,71 0,82 0,86

Трихлорметафос 0,47 0,67 0,80

Фозалон 0,54 0,69 0,81

где <3 - степень ингибирования 0= У0 - У^ / где У0 и отклики БС в отсутствии и в присутствии ингибиторов соответственно.

Линейная зависимость величины аналитического сигнала от логарифма концентрации изученных ингибиторов в широком концентрационном интервале позволяет разработать методики их определения с помощью БС на основе рН-чувствительного ПТ. .

Определение ингибиторов иммобилизованной холинэстеразы на фоне ионов магния позволило снизить нижние границы определяемых содержаний для прозерина 1,2*1О"8 моль/л, ззерина 5,0*10"8 моль/я, метафоса 1,2*10~8 моль/л, трихлорметафоса 1,3*10"® моль/л.

Анализ данных табл. 6. показывает, что возможно определение ингибиторов на уровне ПДК Сметафоса) и ниже Стрихлорметафоса, фоза-

Таблица 6.

Аналитические возможности определения ингибиторов ХЭ с помощью потенциометрического биохимического датчика на основе ИХЭ и рН-чувствительного ПТ

Ингибитор Интервал Уравнение градуи- г Сн ПДК

определяемых ровочного графика моль/л ВОДЫ

концентраций, У = а 1д X + Ь (мг/л) гигиен»

моль/л мг/л

Прозерин 1*10"5-1*10"7 У=(2,3+0,1)Х- 0,9995 7,2*10~8

-(7,2+0,8) (2,18*1О-®)

Эзерин 2*10~3-5*10~7 У=(1,7+0,7)Х-

-(3,6+0,8) 0,9763 1,0*10"7

(2,75*10"5)

Метафос 1*Ю"3-8*10~8 У=(1,96+0,04)X- 0,9999 6,1*1О"8 0,002

-(5,1+0,2) (1,61*1О"6)

Трихлор- 1*10"3-1*10"7 У=С1,95+0,07)X- 0,9997 7,5*1О"8 0,02

метафос -(4,6+0,4) (2,41*10"®)

Фозалон 1*10~3-9*10~8 У=(1,81+0,09)X- 0,9996 8,2*10~8 0,1

-(2,9+0,5) (2,98*10"®)

лона), что создает условия для контроля остаточных количеств этих соединений в различных объектах эколого-аналитического контроля, в том числе, в продуктах питания и сельскохозяйственной продукции.

В рассматриваемой модели БС ХЭ иммобилизовали путем ковален-тной пришивки на мембранах типа "Миллипор", имевшие стандартизированные параметры. Сравнительная оценка двух способов иммобилизации показала, что к особенностям мембран типа "Миллипор" можно отнести более медленное реагирование на субстраты и ингибиторы ХЭ, чем в случае с нитроцеллюлозшии- мембранами, меньшее время хранения образцов с сохранением каталитической активности. В тоге время, наблюдается более равномерное распределение фермента на рабочей площади биочувствительной части, что позволяет уменьшить погрешности определений эффекторов ХЭ.

ВЫВОДЫ

1) Предложены новые амлерометрические биосенсоры на основе стационарного ртутно-плсночного электрода с серебряной подложкой: Л-цистеиндесульфгидролазный биосенсор, биочувствнтельной частью которого служили модифицированные листья огурца или иммобилизованные гомогенаты растительных тканей; биосенсор на основе иммобилизованной моноаминооксидазн. Изучены условия получения их максимального аналитического сигнала (природа буферных растворов, рН, рабочая область концентраций субстратов, время отклика).

2) Разработаны способы иммобилизации растительных гомогена-тов, позволяющие получить ферментсодержащие образцы, обладающие высокой каталитической активностью СО,65 мкмоль/мин.мг), которая сохраняется без изменения в течение недели. Предложен новый способ иммобилизации холинэстеразы в комбинированную матрицу из желатина и хитозана.

3) Предложены способы оценки каталитической активности-1-цис-теиндесулъфгидролазы и моноаминооксидазы, основанные на вольтампе-рометрическом контроле концентрации субстрата (цистеина) для Ь-цис-теиндесульфгидролазного биосенсора и образующегося продукта реакции ферментативного дезаминирования биогенных моноаминов (альдегидов) для моноаминооксидаэного биосенсора.

4) Разработан потенциометрический биосенсор на основе рН-чув-ствительного полевого транзистора и холинэстеразы, иммобилизован-

ной в нитроцеллюлозную мембрану и на мембране "Миллипор". Найдены оптимальные условия его функционирования С площадь рабочей поверхнос ти 3-5 состав фонового электролита: 1-3 мМ боратный буферный раствор с рН 9,15, 15 мМ NaCl; рабочая область концентраций субстрата 4*10~5 - 1*10"2 моль/л Сдля бутирилтиохолин иодида), 1*1О-4 ■ - 5*10~^моль/л (для ацетилхолина).

5) Разработанные биосенсоры использованы для определения биогенных моноаминов, обратимых и необратимых ингибиторов ХЭ, тяжелых металлов - свинца и кадмия -на уровнях 10"^- Ю-*® моль/л.

6) Оценены погрешности отклика, связанные со способом изготовления биочувствительной части потенциометрического БС. Наибольший вклад в ее величину вносит погрешность градуировочного графика (погрешность определения специфичного ингибитора ХЭ - прозерина меньше, чем погрешность определения неспецифичных к данному ферменту ингибиторов).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Babkina S.S., Medyantseva Е.Р., Fedoseeva O.V., Kremleva N.1 The evaluation of metrological characteristics of the procedures o: determination of some pesticides by means of cholinesterasi amperometric biosensor //Abstr. of the conference "Quality analytic; control and reference materials life science".- Rome, Italy. - 1994 P. 58.

2. Федосеева O.B., Кремлева H.В. Оценка метрологических характ' ристик методик определения некоторых пестицидов с помощью ампероме' рического холинэстеразного биосенсора//Тез. докл. "Электрохимически! методы анализа", Москва, 1994. - С.2147

3. Medyantseva Е. Р., Babkina S.S., Budnikov Н. С., Kremleva N.' Stationary mercury film-covered electrode as a versativ transducer for voltammetric biosensors // Abstr. the Thid Asie; Conference on Analytical Sciences "Asianalysis III", - Seoul, Kore. 1995.- P -26.

4 Kremleva N. V., hfedyantseva E.P., Budnikov H. C. Ne' amperometric biosensor for the determination activity of cystei: desulfhydrolase // 5th International Symposium on kinetics i; analytical chemistry: Proceeding abstracts. - Moscow, Russia, 1995. P. 50.

5. Н. С. Budnikov, S.S.Babkina, E.P. Medyantseva, N.V. Kremleva s analytical opportunities of the Cholinesterase biosensor in the termination of potential environmental pollutants //Abstr.of mposium on Ecological Chemistry. Chisinau, Moldova. 1995. - P. 197.

6. Medyantseva E.P., Budnikov H. C. , Babkina S.S., Kremleva N. V. alytical Possibility of voltammetric biosensors based on ationary mercury film-covered electrode // Abst. 6 th European nference on ElectroAnalysis "ESEAC 96". - Durham, England, A 30.

7. Медянцева Э. П., Будников Г.К. , Кремлева Н.В., Кутырева И. П. зможность применения холинэстеразных биосенсоров в контроле оста-|чных количеств некоторых отравляющих веществ // Тез.докл. «российской конференции с международным участием "Химическое ра-ружение - 96. Экология и технология. CHEMDET - 96".- Ижевск, 1996. с.56-57.

8. Кремлева Н. В., Решетилов А.Н., Хомутов С.М., Медянцева Э.П.

феделение некоторых пестицидов с помощью холинэстеразного биосен->ра на основе pH-чувствительного полевого транзистора // Тез. докл. ¡еросс.конф. "Экоаналитика-96" - 1996.-С.230-231

9. Кремлева Н. В. Эффективность потенциометрической детекции юфорорганических соединений при двух способах иммобилизации холин-:теразы // Тез. дскл. Городской научной конференции молодых ученых, одно - 1996.-С.41

10. Kremleva N. V. , Medyantseva Е.Р., Budnikov Н. С. , Asafova V. , Bormotova У. I. Determination of some heavy metals by nperometric biosensor based on plant tissues //Abstr. International Migress on Analytical Chemistry. -Moskau,Russia.- 1997.,V 2. y.10

11. Применение тканей растений для оценки загрязненности почвы зкоторыми тяжелыми металлами. Н.В.Кремлева, Э.П.Медянцева, Г.К.Буд-!ков, Е.В.Асафова // Вестник Российской академии сельскохозяйственен наук.-1997.-N6.-С. 1-8.

12. Амперометрический биосенсор на основе листьев огурца в опре-элении свинца и кадмия. Кремлева Н.В., Медянцева Э.П., Будников Г. К., эрмотова Ю.И. //Журн.аналит. химии. -1997. -per. N63.