Оптические биосенсоры для определения фенольных соединений и органических пероксидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Малинина Любовь Игоревна

ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 б ПАП

Москва-2013

005059630

005059630

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Шеховцова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Бабкина Софья Сауловна

Московский Государственный Открытый Университет имени В.С. Черномырдина, Москва

кандидат химических наук, доцент Осипов Александр Павлович Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Защита состоится 29 мая 2013 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, Ломоносовский проспект, д.27.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан/У апреля 2013 г. Учепый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

г.

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной аналитической химии является создание простых средств контроля качества разнообразной продукции и мониторинга состояния окружающей среды. Включение в такие аналитические средства биологических компонентов - ферментов, антител, ДНК - позволяет повысить чувствительность и селективность анализа и расширяет его возможности за счет высокой избирательности биохимических взаимодействий. В последние 20 лет во всем мире активно проводятся исследования, направленные на создание ферментативных сенсоров для определения биологически активных неорганических и, особенно, органических веществ в объектах окружающей среды, продуктах питания, фармацевтических препаратах, физиологических жидкостях. Тем не менее, остается актуальной проблема совершенствования предложенных и создания новых биосенсоров в результате внедрения новых типов конструкций, индикаторных систем, оригинальных способов иммобилизации ферментов, обеспечивающих их активность и стабильность при хранении и проведении каталитических процессов в неблагоприятных для белков условиях и средах. Кроме того, важными аспектами таких разработок является расширение области возможного применения сенсоров для анализа различных реальных объектов (в том числе нерастворимых или ограниченно растворимых в воде) и определение в них соединений, которым ранее было уделено недостаточное внимание.

Подавляющее большинство существующих ферментативных сенсоров основано на электрохимической регистрации аналитического сигнала, и с их помощью успешно определяют органические соединения многих классов. Значительно меньшее внимание уделяется созданию и развитию биосенсоров с оптическим детектированием. При этом новые индикаторные системы и приемы регистрации оптического сигнала способны расширить возможности ферментативных методов за счет увеличения числа определяемых веществ и анализируемых объектов и в дальнейшем позволят упрочить место оптических биосенсоров среди современных средств анализа.

Для создания новых биосенсоров целесообразно использовать такие ферменты, которые катализируют превращение либо только одного какого-либо соединения (примеры таких узко специфических ферментов крайне малочисленны), либо группы близких по свойствам веществ; особый интерес представляют ферменты, одновременно катализирующие превращение разных по свойствам и строению соединений, например, субстратов-восстановителей и субстратов-окислителей. В этой связи чрезвычайно перспективно применение пероксидазы из корней хрена (ПХ). Этот хорошо изученный высокоактивный коммерческий фермент катализирует превращение разных групп органических веществ, определение которых представляет значительный интерес; в частности, субстратами-восстановителями пероксидазы являются фенольные соединения различного строения, а в роли субстратов-окислителей могут выступать органические пероксиды. К первым

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии МГУ им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.

относятся многие важнейшие экотоксиканты, гормоны, антиоксиданты природного и промышленного назначения, вторые могут исполнять роль маркеров качества пищевых продуктов, а также являются важным техническим и фармацевтическим сырьем. Следовательно, определение перечисленных классов органических соединений является актуальной задачей химического анализа, решение которой особенно важно при анализе реальных объектов со сложной для спектрофотометрического и ферментативного анализа матрицей (например, мазей, кремов, продуктов питания) без предварительной пробоподготовки. Следует отметить, что этим проблемам функционирования оптических ферментативных сенсоров посвящены лишь единичные публикации.

Цель работы-создание оптических ферментативных сенсоров для определения фенольных соединений и органических пероксидов в объектах различной природы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- предложить такие индикаторные системы и дизайн* биосенсора для определения фенольных соединений и органических пероксидов, которые бы позволили регистрировать оптический сигнал вне анализируемого раствора для того, чтобы исключить отделение матрицы образца и, кроме того, упростить анализ сред, содержащих органические растворители;

- изучить влияние различных органических растворителей на отклик биосенсора и его зависимость в водных и водно-органических средах от содержания веществ с разными свойствами и структурой: растворимых и нерастворимых в воде фенольных соединений и органических пероксидов;

- продемонстрировать возможности использования разработанного биосенсора для определения фенольных соединений и органических пероксидов: апробировать его в анализе разных типов реальных объектов (водорастворимых, нерастворимых в воде и несмешивающихся с ней) без предварительной подготовки.

Научная новизна. Разработан способ получения прозрачных, каталитически активных, стабильных в водной и водно-органической средах биочувствительных пленок на основе пероксидазы хрена (ПХ), тирозиназы и лакказы, иммобилизованных в матрицу природного полимера хитозана. Предложена новая индикаторная система, основанная на реакции взаимодействия хитозана с продуктами ферментативного окисления фенольных соединений, с использованием которой на основе полученных биочувствительных пленок, закрепленных на стеклянной пластинке, созданы простые оптические сенсоры для определения фенольных соединений и органических пероксидов, позволяющие регистрировать оптический сигнал вне анализируемого раствора, что исключает необходимость отделения матрицы образца и его предварительной пробоподготовки.

Установлены отличия в селективности чувствительных слоев на основе оксидоредуктаз ПХ, тирозиназы и лакказы по отношению к простейшим ди- и три-фенолам в предложенной индикаторной системе. Впервые выявлено взаимодействие хитозана с флавоноидами после их ферментативного окисления.

* термин заимствован из англоязычной литературы, поскольку он наиболее полно соответствует всему комплексу характеристик сенсора: конструкции, составу и закреплению чувствительного слоя, способам проведения индикаторной реакции и регистрации сигнала

Показано, что изменение параметров среды (pH и природы буферного раствора, биокатализатора, содержания ДМСО, температуры) позволяет регулировать эффективность присоединения к хитозану продуктов ферментативного окисления фенолов различной структуры.

Обнаружено, что введение /?-циклодекстрина в реакцию пероксидазного окисления кверцетина приводит к 20% увеличению скорости этой реакции.

Практическая значимость работы. На основе полученных пленок {пероксидаза/хитозан}, {лакказа/хитозан}, {тирозиназа/хитозан} разработаны простые оптические ферментативные сенсоры для определения фенольных соединений и пероксидов в мутных и непрозрачных растворах. Показано, что индикаторное соединение в пленке настолько стабильно, что аналитический сигнал может быть измерен месяцы спустя после проведения анализа. Разработаны методики определения веществ различной структуры (гидрохинона, пирокатехина, кверцетина, рутина, эскулетина, 2-бутанонпероксида, бензоилпероксида) с помощью оптического биосенсора в водной и водно-органической среде (в присутствии ДМСО). Методики апробированы для анализа реальных объектов (в том числе, водонерастворимых) в водных и водно-органических растворах с минимальной пробоподготовкой, заключавшейся в суспендировании образца в водной среде или полярном органическом растворителе.

Автор выносит на защиту:

- способ получения биочувствительных прозрачных пленок состава {фермент (пероксидаза хрена, грибная тирозиназа или лакказа) - природный полиэлектролит хитозан} на стеклянных (кварцевых) пластинках, которые сохраняют прозрачность и механическую прочность после выдерживания в водной и водно-органической средах, и проявляют каталитическую активность в реакциях превращения фенольных субстратов указанных ферментов, а в случае пероксидазы - и пероксидов;

- индикаторную систему (реакцию взаимодействия хитозана с продуктами ферментативного окисления фенольных соединений), положенную в основу простого оптического сенсора для определения фенольных соединений и органических пероксидов, позволяющего регистрировать аналитический сигнал вне анализируемого раствора, без отделения матрицы сложного образца и его предварительной пробоподготовки;

- результаты изучения кинетики окисления кверцетина пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой, в присутствии и в отсутствие макроциклического комплексообразователя ß-циклодекстрина;

- данные о влиянии на эффективность взаимодействия между хитозаном и продуктами ферментативного окисления фенольных соединений различной структуры параметров среды (pH, природы буферного раствора, биокатализатора, температуры, содержания полярного органического растворителя ДМСО);

- методики определения субстратов-восстановителей (простейших фенольных соединений, флавоноидов и кумаринов) и субстратов-окислителей (органических пероксидов), апробированные в анализе фармацевтических препаратов.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 20 международных и всероссийских конференции, включающих 10th International Conference of the European Chitin Society (St.-Petersburg, Russia, 2011), Euroanalysis XV

5

(Innsbruck, Austria, 2009), Euroanalysis XIV (Antwerp, Belgium, 2007), International Conference Chimia 2009 "New Trends in Applied Chemistry" (Constanta, Romania, 2009), 9th International Symposium on Polyelectrolytes - ISP 2012 (Lausanne, Switzerland, 2012), XIX International Conference on Bioencapsulation (Amboise, France, 2011), BIT'S 3rd Symposium on Enzymes and Biocatalysis (Xian, China, 2012), E-MRS 2010 Spring 1 Meeting (Strasbourg, France, 2010), Всероссийскую конференцию по аналитической

химии «Аналитика России-2009» (Краснодар, Россия, 2009), Международный форум по нанотехнологиям (Москва, 2009), III Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 2010), Международную конференцию студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов -2009" (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 20 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 142 источников. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 17 таблиц.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 2 главы. В первой главе обсуждены ферментативные сенсоры для определения фенольных соединений. Подробно рассмотрены различные типы индикаторных систем, варианты детектирования, подходы к иммобилизации ферментов и влияние перечисленных факторов на чувствительность, селективность и стабильность биосенсоров. Отдельное внимание уделено биосенсорам для определения фенолов, предназначенным для работы в органических и водно-органических средах. Вторая глава посвящена биосенсорам для определения органических пероксидов; в ней рассмотрены особенности биосенсоров на основе пероксидаз и каталаз, их функционирование в органических и водно-органических средах.

Экспериментальная часть работы представлена шестью главами (3-8). В

третьей главе перечислены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование, а также приведены методики приготовления растворов, проведения реакций и обработки результатов. Четвертая глава посвящена разработке дизайна оптического биосенсора, иммобилизации реагентов в чувствительном слое и изучению возможности применения в качестве индикаторной системы следующих реакций: взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенольных соединений с З-метил-2-бегоотиазолин гидразоном (МБТГ), 4-аминоантипирином (4-ААП) и хитозаном с образованием соединений, поглощающих в видимой и УФ-областях. В пятой главе описаны исследования по подбору оптимальных условий определения водорастворимых фенольных соединений (на примере гидрохинона, пирокатехина, пирогаллола, флороглюцина и резорцина) с помощью оптического биосенсора по реакции взаимодействия продуктов ферментативного окисления фенольных соединений с хитозаном с образованием поглощающего свет соединения; изучение возможности применения для создания оптического биосенсора не только ПХ, но и грибной тирозиназы и лакказы, а также изучение влияния pH, состава и концентрации буферного раствора, температуры, концентраций компонентов

системы. Описаны ■ разработанные методики определения пирокатехина и гидрохинона, их аналитические характеристики, обсуждены особенности и преимущества предложенных оптических ферментативных сенсоров. Шестая глава посвящена разработке методики определения нерастворимых в воде фенольных соединений (кверцетина, рутина, эскулетина) в присутствии полярного органического растворителя ДМСО. В седьмой главе описана разработка методики определения бутанонпероксида и бензоилпероксида в присутствии ДМСО с помощью пероксидазного сенсора. В восьмой главе приведены примеры практического применения пероксидазного сенсора, демонстрирующие возможности анализа водонерастворимых объектов или определения нерастворимых в воде соединений с минимальной пробоподготовкой.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Среди объектов, содержащих фенольные соединения и органические пероксиды, есть большая группа образцов, которые нерастворимы в воде или не смешиваются с ней, например, косметические и фармацевтические препараты в виде мазей, гелей и суспензий или продукты питания, например, растительные масла. Вследствие этого для анализа таких объектов с помощью оптических методов (в частности, оптических биосенсоров) требуется либо предварительно отделять матрицу образца или экстрагировать определяемое соединение, либо создать условия, позволяющие измерять аналитический сигнал в негомогенных растворах или же вообще вне определяемого раствора. Возможным решением указанной проблемы представляется измерение аналитического сигнала в чувствительном слое биосенсора после сорбции в нем определяемого соединения из анализируемого раствора и проведения индикаторной реакции непосредственно в чувствительном слое. Насколько нам известно, до сих пор подобный подход не был реализован для создания оптических сенсоров для определения фенольных соединений и органических пероксидов.

Реализация такого подхода требовала следующих этапов эксперимента:

> разработать способ получения оптически прозрачных и механически прочных биочувствительных пленок на стеклянных (кварцевых) пластинках как основы сенсорной системы;

> подобрать индикаторную систему, позволяющую регистрировать аналитический сигнал в матрице биочувствительного слоя, то есть вне анализируемого раствора;

> оптимизировать условия определения водорастворимых фенольных соединений и выяснить метрологические характеристики методик их определения с помощью сенсора;

> изучить поведение сенсора в водно-органических средах и возможности определения нерастворимых в воде фенольных соединений;

^ изучить возможности определения органических пероксидов;

> апробировать предложенные биосенсоры в анализе реальных объектов.

В качестве основного фермента для исследования выбрали пероксидазу из корней хрена, поскольку и фенольные соединения, и органические пероксиды являются ее субстратами, что позволяет на основе этого биокатализатора создать универсальный сенсор для определения сразу двух классов органических веществ. Кроме того, оценили возможность использования двух других оксидоредуктаз -

грибной тирозиназы и лахказы, которые также катализируют превращение некоторых фенольных соединений. Следует отметить, что дополнительными факторами, объясняющими наше внимание к ПХ являлась легкость варьирования концентрации субстрата-окислителя (органического или неорганического пероксида) в системе и поддержания его выбранного содержания, чего нельзя сказать о кислороде, который является субстратом-окислителем лакказы и тирозиназы. Последний фактор становится особо значимым при переходе к анализу водно-органических сред, поскольку растворимость кислорода в ДМСО в 6 раз выше, чем в воде, и, соответственно, может существенно зависеть от концентрации органического растворителя, что сужает возможности обеспечения оптимальных условий проведения индикаторной реакции.

Дизайн биосенсора н поиск индикаторной системы

Конструктивно простейшим вариантом реализации указанного выше подхода к анализу мутных и неоднородных образцов нерастворимых в воде объектов и веществ может быть оптический сенсор, представляющий собой пластину, покрытую чувствительным слоем, содержащим фермент и компоненты индикаторной реакции, для того, чтобы индикаторное соединение оставалось после проведения реакции в этом чувствительном слое. При условии прозрачности пластины и чувствительного слоя возможно измерение аналитического сигнала в режиме пропускания, что потенциально обеспечивает большую воспроизводимость результатов и чувствительность определения.

Рис. 1. Схема работы сенсора.

Сеим? вйжвдегм к Ч-дапвкяии! СЯй|

репзкянийркпсф о^ашямегс*

Создание оптического биосенсора, позволяющего работать с нерастворимыми в воде объектами и соединениями без предварительной подготовки образца предъявляет ряд требований к его конструкции и используемой индикаторной системе, а именно необходимы:

> прочное закрепление чувствительного слоя на поверхности прозрачной подложки - стекла; механическая стабильность покрытия в водных растворах различной кислотности и в присутствии по крайней мере некоторых органических растворителей;

> прозрачность чувствительного слоя для обеспечения возможности измерения аналитического сигнала в режиме пропускания; сохранение прозрачности слоя после воздействия водных и водно-органических сред;

> надежное удержание дериватизирующего агента, а позже индикаторного соединения в чувствительном слое для получения максимально высокого аналитического сигнала;

> стабильность индикаторного соединения и его поглощения в течение времени, необходимого для измерения, а по возможности, и дольше;

> сохранение каталитической активности фермента при хранении биосенсора перед использованием;

> сохранение каталитической активности фермента в присутствии органических растворителей.

В соответствии с этими требованиями на основании обзора литературы в качестве матрицы чувствительного слоя оптического биосенсора выбрали два природных полимера - хитозан и желатин, известные своей высокой совместимостью с белками и способностью к образованию пленок. Кроме того, хитозан, согласно литературным данным, может взаимодействовать с продуктами ферментативного окисления фенолов с образованием соединения, поглощающего свет, то есть потенциально может служить одновременно и матрицей, и реагентом.

В качестве подложки выбрали стеклянные пластинки размером 13x38 мм2, удобным для проведения измерений с помощь серийного спектрофотометра. Для возможного измерения аналитического сигнала непосредственно в пленке (толщина которой, таким образом, соответствовала оптическому пути), оценили, какое максимальное количество полимера способно образовывать механически прочную пленку на поверхности стекла в условиях эксперимента. Для этого проварьировали объем наносимого на пластинку 1% раствора хитозана и установили, что пленки с хорошими характеристиками (механической устойчивостью, однородностью, прозрачностью) образовывались при нанесении 50—250 мкл раствора хитозана на поверхность площадью около 5 см2 (что соответствует плотности нанесения хитозана 0.1 - 0.5 мг/см2 или содержанию хитозана 0.5 - 2.5 мг в реакционной системе в дальнейшем). При больших объемах и, соответственно, большей плотности нанесения биополимера (мг/см3), пленка часто скалывалась или отслаивалась от поверхности стекла. В случае желатина удалось получить пленки на поверхности стекла с плотностью нанесения до 3.2 мг/см2, хотя меньшие значения были предпочтительнее с точки зрения прочности закрепления пленки на стекле. Разработали методику нанесения чувствительного слоя на основе полимеров (хитозана или желатина) на поверхность предварительно очищенных механически и этанолом стеклянных пластинок: сухие пластинки раскладывали на ровной строго горизонтальной поверхности, после чего по всей поверхности каждой пластинки распределяли отобранные с помощью микродозатора 50-250 мкл смеси, состоящей из 1% раствора хитозана (или 2% раствора желатина) и растворов других компонентов (например, ПХ или лакказы, или тирозиназы). Пластинки оставляли до полного высыхания (5—6 ч), после чего хранили в холодильнике (4'С).

В качестве возможных индикаторных систем, позволяющих регистрировать аналитический сигнал от определяемого соединения непосредственно в матрице биочувствительного слоя, были апрбированы две классические реакции для определения фенольных соединений после их окисления — с участием 4-аминоантипирина (4-ААП) и З-метил-2-бензотиазолингидразона (МБТГ). Кроме того, нами впервые была использована в качестве индикаторной система на основе ковапентного взаимодействия хитозана с хинонами, которую ранее не применяли в аналитических целях. В табл. 1 приведены формулы реагентов и найденные в литературе схемы перечисленных реакций, на основании которых было сделано предположение о потенциальной возможности их использования в составе разрабатываемого оптического сенсора.

Для иммобилизации МБТГ и 4-ААП в качестве матрицы выбрали желатин, так как в случае использования хитозана возможно протекание побочной реакции -связывание хинона свободными аминогруппами хитозана, указанной в таблице;

9

кроме того, низкая эффективность иммобилизации МБТГ в пленке хитозана описана в литературе. Эксперименты по иммобилизации проводили на примере МБТГ (который по литературным данным является более эффективным и менее требовательным к условиям реагентом по сравнению с 4-ААП), используя методику нанесения чувствительного слоя на основе желатина, приведенную выше. Так как МБТГ находился в катионной форме (в виде 3-метилбензотиазолин-гидразон гидрохлорида), с целью повышения удерживания реагента иммобилизацию проводили в пленки желатина, полученные из растворов с различной щелочностью (полученные растворением его сухого порошка в воде, 0.05 М пирофосфате калия (рН ~ 10.4) или щелочи различной концентрации); кроме того, в пленки желатина также вводили макроциклические лиганды - циклодекстрины (ЦП) (а-, р-циклодекстрин, сульфо-р-циклодекстрин и 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин). Эффективность иммобилизации оценивали по проценту удерживания МБТГ в чувствительном слое после 15 мин контакта с водным раствором (эту величину оценивали, используя поглощение этого реагента при 300 нм,£зоо = 4.1 * 103 М"'см"').

Таблица I. Выбранные индикаторные системы для определения фенольных соединений с помощью оптического биосенсора

Название реагента (сокращение) Реакция взаимодействия реагента с продуктами окисления фенольных соединений; примечания

Хитозан (Chit) о» о ¿^¿Г^-зйз^г Т ¡р У г ОДОте* Ммсаэм фенол о-хюген о Аддукт Михаэля поглощает в ближней УФ-области.

4-Ам иноантипир ин (4-ААП) Реакция преимущественно идет в щелочной среде с фенолышми соединениями, у которых п-положеиие свободно или занято заместителем, представляющим собой легкоуходящую группу, типичный диапазон поглощения аддукта 450-550 нм, в случае пирокатехина в водном растворе - 510 нм.

З-Метил-2-бензотиазолин гидразон (МБТГ) ии ац 1и, ° Реакция преимущественно идет с о-замещенными фенольными соединениями в щелочной среде, типичный диапазон поглощения аддукта 400-500 нм, в случае пирокатехина в водном растворе - 450 нм.

Выявили, что введение циклодекстринов не влияло существенно на удержание реагента (хотя следует отметить, что пленки с включенным ЦД (но не анионным сульфоциклодекстрином) были однородны и прозрачны; повышение щелочности раствора желатина до 20 мМ по ЫаОН повышало эффективность иммобилизации, хотя при этом прозрачность пленок ухудшалась. Однако, даже в лучшем случае в перечисленных пленках удерживалось не более 50% реагента. Таким образом, в случае выбора реакции с участием МБТГ в качестве индикаторной системы необходимы дополнительные меры по его закреплению в чувствительном слое (например, введение дополнительных слоев полимеров в чувствительную пленку).

Таблица 2. Выбор индикаторной системы (в случае 4-ААП и МБТГ серой стрелкой показана область, где, согласно данным, полученным нами в растворе, должны поглощать свет образующиеся аддукты)

Реагент/ состав чувствитель ного слоя Условия проведения реакции Спектр поглощения чувствительного слоя Примечания

Хигозан (хитозан -0.4 мг/см2, пероксидаза - 50 пмоль) 0.05 М фосфатный буферный раствор, рН 7.0, конц.: гидрохинон -500 мкМ,Н202-5 мМ, время выдерживания 24 ч 2.4 1.8 1.2 < 0.6 0.0 2С до реакции . после реакции Ю 400 600 Чувствительный слой однородно окрашивался в коричневый цвет, сохранявшийся после высыхания длительное время

МБТГ (0.8 мг/см2 желатина, 250 мкМ МБТГ) 0.05 М пирофосфат-ный буферный раствор, рН 9.0; конц.: пирокатехин — 25 мкМ, Н202 - 1 мМ, ПХ-30 нМ, время выдержива-ния - 3 мин 0.4 < 0.2 0.0 35 \ после реакции \ ..............до реакции _ : ' Г ............jjjüüjjjjjj^^^ ! 1 0 450 550 А, НМ Чувствительный слой окрашивался в слабо-розовый цвет, при высыхании становился слабо-коричневым или оставался бледно-розовым при избытке реагента

ААП (0.8 мг/см2 желатина, 50 мкМ 4-ААП) 0.05 М пирофосфат-ный буферный раствор, рН 9.0; конц.: пирокатехин - 50 мкМ, Н202 - 1 мМ, ПХ - 30 нМ, время выдерживания - 3 мин 0.4 < 0.2 0.0 после реакции до реакции ¡>-0- 00 500 700 НМ

На следующем этапе для выбора наиболее перспективной индикаторной системы провели ряд предварительных экспериментов с целью смоделировать работу сенсора выбранного дизайна на основе каждой из реакций: взаимодействия продуктов окисления фенолов с хитозаном, МБТГ, 4-ААП в присутствии ПХ. Индикаторные реакции проводили следующим образом (состав чувствительных

слоев, условия проведения реакции и наблюдаемые эффекты указаны в табл. 2): в стеклянную кювету добавляли буферный раствор, растворы пероксида водорода и фенольного соединения, смесь тщательно перемешивали, после чего в нее вводили пластинку биосенсора, которую прислоняли к стенке кюветы чувствительным слоем в сторону анализируемого раствора; после протекания реакции и высушивания пластинки (если не оговорено особо) пластинку закрепляли на фронтальной поверхности кюветного отделения спектрофотометра и регистрировали спектр поглощения чувствительного слоя.

Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что наиболее перспективной среди трех рассмотренных индикаторных систем (включающих хитозан, МБТГ или ААП в качестве хромогенного вещества) является система на основе хитозана. Недостатками использования МБТГ и 4-ААП являются существенное (до 50%) вымывание реагента из пленки и недостаточно высокие значения молярных коэффициентов поглощения образующихся аддуктов в желатиновой пленке. В случае хитозана недостатком является низкая скорость реакции, протекающей в течение нескольких часов. Однако, наличие ковалентной связи между матрицей - хитозаном и продуктом окисления фенольного соединения обеспечивает полное закрепление и связывание индикаторного аддукта в толще пленки. При этом продукты ферментативного окисления фенольных соединений фактически концентрируются из анализируемого раствора. Поэтому чувствительный слой на основе именно хитозана, который играл роль и матрицы, и дериватизирующего агента, был выбран для дальнейшей работы по созданию оптического сенсора

Оптимизация условий получения чувствительного слоя на основе хитозана и изучение его поведения в присутствии органических растворителей

Для определения оптимального содержания хитозана в чувствительном слое варьировали плотность его нанесения на стеклянную подложку и выяснили, что при увеличении содержания хитозана на поверхности пластинки с 0.75 до 3 мг (что соответствует плотности нанесения пленки хитозана с 0.15 мг/см до 0.6 мг/см ) ее поглощение после выдерживания в реакционном растворе ожидаемо возрастает. Это можно связать с увеличением толщины поглощающего слоя, т.е. удлинением оптического пути и появлением большего количества аминогрупп, способных связать большее количество хинона и, соответственно, образовать большее количество поглощающего аддукта. Для дальнейшей работы в качестве оптимального выбрали содержание хитозана 2 мг (соответственно, плотность нанесения 0.4 мг/см), поскольку оно обеспечивало сочетание высокого поглощения чувствительного слоя после реакции и хорошей воспроизводимости получаемых результатов измерений.

Далее исследовали поведение чувствительного слоя на основе хитозана при выдерживании его в водном и водно-органическом растворах. В качестве основного органического растворителя выбрали ДМСО, как неограниченно смешивающийся с водой, мало летучий и часто используемый для подготовки проб самых разных образцов (фармацевтической продукции, образцов растений и т.д.).

Для этого эксперимента выбрали водно-органическую среду состава 30% ДМСО - 70% буферного раствора, поскольку было показано, что в этих условиях ПХ в реакции окисления о-дианизидина в присутствии хитозана сохраняла ту же активность, что и в отсутствие органического растворителя. После выдерживания пленок состава {хитозан-ПХ} в течение 1 ч в водной (0.05 М фосфатный буферный

раствор, pH 6.5) и водно-органической (в присутствии 30% ДМСО и того же буферного раствора) средах выявили, что пленки, выдержанные в присутствии органического растворителя, не только не мутнели, но и оказались более прозрачными, чем пленки, выдержанные в водном растворе (пропускание (96±2)% против (81±4)%, п=5). Аналогичные результаты были получены и в присутствии ацетонитрила и этанола.

Методом атомно-силовой микроскопии изучили морфологию и топографию пленок, выдержанных в водном и водно-органическом растворах. Представленные на рис. 2 результаты свидетельствуют о том, что пленки после их выдерживания в 30% растворе ДМСО более однородные и гладкие на микроуровне, чем пленки, полученные из водного раствора (флуктуации по высоте на 1 кв. микрон поверхности составили 30-35 и 140-150 нм, соответственно).

Рис. 2. Профили и изображения поверхности чувствительного слоя (ПХ

- 50 пмоль, хитозан 0.4 мг/см2) после выдерживания в 0.05 М фосфатном буферном растворе, pH 6.5 (рисунки справа) и среде вода (0.05 М фосфатный буферный раствор, pH 6.5)

- ДМСО (30%) (рисунки слева). Цветовая шкала справа соответствует глубине изображения (в нм).

Атомно-силовые изображения получены на сканирующем зондовом микроскопе NT-MTD

УШЩ1

Кроме того, оказалось, что поглощение чувствительного слоя на основе хитозана понижалось при увеличении содержания полярного органического растворителя (не только ДМСО, но и этанола, и ацетонитрила) в интервале 0 - 40%. Результаты изучения пленок методом оптической микроскопии показали, что толщина пленок, содержащих 2 мг хитозана на 5 см2 (соответственно, плотность нанесения 0.4 мг/см2), составляла примерно 5 микрон.

Таким образом, чувствительный слой на основе хитозана отвечал требованиям, сформулированным при постановке задачи: он сохранял прозрачность и механическую стабильность при выдерживании и в водной, и в водно-органической средах (в присутствии ДМСО, этанола и ацетонитрила) и, как следствие, мог быть использован для разработки оптического сенсора предложенного дизайна.

Определение водорастворимых фенольных соединений

Следующим этапом работы стало изучение взаимодействия чувствительного слоя на основе хитозана с водорастворимыми ди- и три-замещенными фенольными соединениями, а именно гидрохинона, пирокатехина, резорцина, пирогаллола и

флороглюцина. Выбор именно этих веществ объясняется тем, что, помимо того, что их определение в некоторых объектах представляет практический интерес (например, гидрохинона в косметических препаратах, в которых его содержание регулируется во многих странах), они являются структурными единицами ряда более сложных соединений (в частности, катехинов, флавоноидов, катехоламинов) и могут моделировать их поведение в исследуемой системе. •■> •

Проведя индикаторную реакцию с участием чувствительных слоев на основе различных ферментов (ГЕХ, лакказы из Trámeles Versicolor и грибной тирозиназы) с участием выбранных простейших фенольных соединений, установили, что все три фермента могут быть использованы в качестве катализаторов в выбранной системе. Наличием отклика считали появление в спектре поглощения чувствительной пленки новых максимумов поглощения (что происходило в области 345 нм). Далее, если не оговорено особо, под «поглощением» подразумевается максимальная оптическая плотность чувствительной пленки в диапазоне длин волн 300 - 400 нм. Выявили, что специфичность фермента влияет на селективность сенсора: тирозиназный сенсор дает отклик только в присутствии пирокатехина и пирогаллола, т.е. о-замещенных фенолов, поскольку только они по литературным данным являются субстратами этого фермента. В то же время, чувствительные пленки, содержащие лакказу и пероксидазу, которые катализируют окисление всех изученных фенолов, реагировали на присутствие и гидрохинона, и пирокатехина. Таким образом, как мы и предполагали, с помощью предложенной индикаторной системы - присоединения продукта ферментативного окисления фенольного соединения к хитозану - могут быть определены только те из изученных водорастворимых фенольных соединений, которые в результате окисления образуют хиноны, а именно, гидрохинон и пирокатехин. Знание механизмов ферментативного окисления и целенаправленный выбор катализатора позволяет управлять селективностью биосенсора на основе такой индикаторной системы: так, включение в чувствительную пленку тирозиназы может обеспечить селективное определение о-фенолов в присутствии «-фенолов, а, например, фенольные соединения, не образующие хинонов при окислении, вообще не оказывают влияния на аналитический сигнал сенсора.

Изучение зависимости поглощения чувствительного слоя от времени выдерживания пленки в реакционном растворе показало: при комнатной температуре наиболее высокое поглощение наблюдалось и, в перспективе, наиболее высокая чувствительность определения фенольных субстратов ожидалась при выдерживании сенсора в реакционном растворе в течение как минимум суток (24 ч). На примере пероксидазного сенсора оценили возможность уменьшения времени отклика при повышении температуры. Для этого построили ряд градуировочных зависимостей для определения гидрохинона в диапазоне температур 20 - 40°С (при времени выдерживания 3 ч, так как поддержание повышенной температуры в течение более длительного времени неудобно и лишено практического смысла). Повышение температуры до 30 - 40°С позволило повысить скорость реакции и наклон градуировочного графика для определения гидрохинона в 1.6 раза, однако наклон градуировочного графика при комнатной температуре и 24 ч выдерживания пластинки был практически в 3 раза выше, чем при 30'С и 3 ч выдерживания. При этом для проведения эксперимента более длительный вариант был проще и, в перспективе, более предпочтителен для внелабораторного анализа: после погружения пластинки с чувствительным слоем в раствор не требовалось никаких манипуляций

до их извлечения на.. следующий день. По этой причине использование предложенного сенсора при повышенной температуре сочли нецелесообразным, и далее во всех экспериментах время выдерживания составляло около 24 ч при комнатной температуре. . ....

Для выбора оптимальных условий проведения индикаторной реакции присоединения продукта окисления фенольного соединения к хитозану изучили зависимость поглощения чувствительной пленки от содержания в ней фермента (оптимальное количество хитозана было выявлено ранее), состава реакционной среды (природы, концентрации и рН буферного раствора), а при использовании пероксидазы в качестве биокатализатора - и концентрации субстрата-окислителя -пероксида водорода. В качестве модельного субстрата применяли гидрохинон (в присутствии ПХ и лакказы) или пирокатехин (в случае тирозиназы).

Увеличение концентрации фермента во всех трех случаях сначала приводит к накоплению продукта второй стадии индикаторного процесса и, соответственно, росту поглощения пленки хитозана; при более высоких концентрациях, соответствующих большей активности фермента, дальнейший прирост продукта не наблюдается. Очевидно, это связано с тем, что первая - ферментативная - стадия перестает быть скорость-лимитирующей в работе сенсора. На зависимостях в присутствии ПХ и лакказы выше их определенных концентраций/активностей (5 нМ пероксидазы и 0.5 у.е. лакказы) наблюдается практически плато, что является положительным моментом: в диапазонах содержаний 0.5-2.5 у.е. лакказы и 5-50 нМ ПХ поглощение чувствительной пленки оказывается достаточно устойчивым к снижению активности фермента, например, при хранении.

Независимо от природы биокатализатора, в случае окисления простейших фенольных соединений поглощение прореагировавшей хитозановой пленки имеет колоколообразную зависимость от рН с максимумом при рН 6.5, который практически совпадает с рКа хитозана. При повышении рН, с одной стороны, возрастает число свободных непротонированных аминогрупп, а с другой - из-за электростатических взаимодействий молекула хитозана сворачивается в глобулу, и аминогруппы становятся менее доступны. Для исследования влияния на значение аналитического сигнала природы буферного раствора с рН 6.5 выбрали: 0.05 М фосфатный, 0.05 М цитратно-фосфатный, 0.2 М глициновый, 0.05 М МЕЭ (2-(М-морфолино)этансульфоновая кислота), 0.01 М имидазолевый буферные растворы. Проводя индикаторную реакцию в каждом из них, регистрировали два параметра: оптическую плотность чувствительного слоя при 345 нм («сигнал») и его поглощение при 700 нм («фон», который использовали для оценки прозрачности пленки, поскольку при этой длине волны аналитический сигнал отсутствовал). В фосфатном буферном растворе достигались наилучшие значения обоих параметров (рис. 3), в то время как после пребывания в органических буферных растворах пленка мутнела или даже деформировалась, возможно, вследствие высаживания компонентов буфера на ее поверхности, а в глициновом буферном растворе реакция шла незначительно. Изменение концентрации фосфатного буферного раствора в диапазоне 0.025 - 0.1 М не влияло существенно на величину аналитического сигнала пероксидазного сенсора. При дальнейшем увеличении ионной силы величина отклика сенсора уменьшалась, что, по-видимому, связано с инактивацией фермента.

Для того, чтобы выявить, связан ли наиболее высокий отклик сенсора при рН 6.5 с особенностями взаимодействия хитозана с ферментом, провели следующий эксперимент с чувствительным слоем состава хитозан-ПХ. Пластинки биосенсора выдерживали в фосфатном буферном растворе при рН 6.0, 6.5 или 7.0 в течение 2 ч и далее, используя свежую порцию буферного раствора, проводили реакцию. При выдерживании в буферном растворе с рН 6.5 (в отличие от рН 7.0 и 6.0) отклик биосенсора не изменялся при варьировании времени его выдерживания вплоть до 2 ч.

Рис. 3. Зависимость поглощения чувствительного слоя сенсора при аналитической длине волны и при 700 нм (фон) от природы буферного раствора (концентрации в растворе: Н202 - 5 мМ, ГХ - 0.1 мМ, состав чувствительной пленки: ПХ - 50 пмоль, хитозан - 0.4 мг/см2, рН 6.5, буферные растворы - 0.05 M фосфатный, 0.05 M цитратно-фосфатный, 0.2 M глициновый, 0.05 M MES, 0.01 M имидазолевый; объем реакционного раствора - 5 мл, время выдерживания -24 ч).

Возможно, при рН 6.5 взаимодействие между биомолекулами достаточно сильно, чтобы они могли удерживаться вблизи друг друга, что, таким образом, предотвращает вымывание фермента из чувствительного слоя в буферный раствор, по крайней мере, в той степени, чтобы оно влияло на отклик биосенсора. Таким образом, наиболее высокий отклик биосенсора при рН 6.5 может быть связан с более сильным нековалентным взаимодействием между молекулами ПХ и хитозана в этих условиях: в таком случае первая - ферментативная стадия проходит вблизи поверхности биосенсора, и пространственная доступность образующегося хинона выше, что обусловливает большую эффективность его взаимодействия с хитозаном. Предположение о том, что диффузия хинона к поверхности хитозана -скорость-лимитирующая стадия, подтверждается также тем, что при перемешивании реакционной смеси сигнал возрастал в два раза (при времени выдерживания пластинки 3 ч).

Увеличение объема пробы ожидаемо приводит к усилению аналитического сигнала, что позволяет повысить чувствительность определения фенольного соединения. Хитозан способен концентрировать компоненты реакции за счет хемосорбции. Однако, учитывая диффузионные препятствия, для дальнейшей работы мы выбрали объем 5 мл, поскольку высокий аналитический сигнал при больших объемах (20 мл и более) пробы проявлялся недопустимо медленно (в течение несколько суток).

Таким образом, нами была разработана методика измерения и выбраны условия определения водорастворимых фенольных соединений с помощью биосенсоров на основе различных ферментов (табл. 3).

Аналитические характеристики разработанных методик определения гидрохинона и пирокатехина с помощью биосенсоров на основе пероксидазы, тирозиназы и лакказы представлены в табл. 4.

Как видно из данных табл. 4, чувствительность определения с помощью предложенных сенсоров зависит как от использованного биокатализатора, так и от определяемого фенола. Как и практически все сенсоры для определения фенольных соединений, разработанные нами биосенсоры неселективны по отношению к какому-либо одному определенному фенолу. Тем не менее, мы изучили возможность индивидуального и совместного определения гидрохинона и пирокатехина и исследовали влияние отклика всех сенсоров на совместное присутствие фенолов. При концентрациях, попадающих в диапазон линейности градуировочной зависимости, величина отклика сенсоров на выбранные фенолы аддитивна (различия оптических плотностей статистически незначимы) и не искажают друг друга. Однако, коэффициенты чувствительности определения фенолов различаются по величине, поэтому информация, полученная при анализе объекта, содержащего одновременно гидрохинон и пирокатехин, не позволит точно определить их содержание в анализируемом образце. В то же время, учитывая, что тирозиназный сенсор дает селективный отклик на пирокатехин, следует ожидать, что совместное использование пероксидазного (или лакказного) и тирозиназного сенсоров позволит определить содержание пирокатехина, а, соответственно, и гидрохинона в таком объекте. Разработанные биосенсоры можно применять либо для анализа объектов, содержащих только одно фенольное соединение, либо для общей оценки или скрининга содержания фенольных соединений, что является типичным для ферментативных биосенсоров для определения фенольных соединений.

Таблица 3. Оптимальные условия проведения индикаторной реакции с помощью предложенных биосенсоров

Параметр (изученный диапазон) /Фермент Перо-ксидаза Лак-каза Тиро-зиназа

Содержание фермента в чувствительном слое (0.5-260 пмоль ПХ , 0.1-2.7 у.е. лакказы, 0.4-12.5 у.е. тирозиназы) 50 пмоль 1.25 у.е. 8 у.е.

Концентрация субстрата - окислителя, мМ (0.1-50 мМ) 5 -

Буферный раствор (рН 5-8, фосфатный, цитратно-фосфатный, глициновый, MES, имидазолевый, 0.025-0.1 М) 0.05 M фосфатный с рН 6.5

Объем реакционной системы (2.5-20 мл) 5 мл

Время выдерживания (1-24 ч) 1 сутки (около 24 ч)

Аналитическая длина волны (200-700 нм) ~ 345 нм

Таблица 4. Метрологические характеристики методик определения гидрохинона и пирокатехина (и = 4, Р = 0.95)

Сенсор, субстрат Уравнение градуировочной зависимости, диапазон определяемых концентраций Коэфф. корреляции, г Сттигъ мкМ ¿г

Пероксидазный: а) гидрохинон б) пирокатехин Л=(0.22±0.06) + (6.8±0.5)103 с, 20 - 200 мкМ А =(0.22±0.04) + (3.2±0.3)103 с, 25 - 250 мкМ 0.998 0.997 3 7 0.02 0.02

Лакказный: а) гидрохинон б) пирокатехин А =(0.18±0.09) + (8±2)103 с, 10 - 100 мкМ А =(0.18±0.05) + (5.7±0.8)103 с, 10 - 100 мкМ 0.987 0.994 3 4 0.06 0.05

Тирозиназный, пирокатехин А =(0.15±0.08) + (8±1)103 с, 10- 100 мкМ 0.991 3 0.04

А - аналитический сигнал, с - концентрация определяемого соединения, М

Следует отметить, что от концентрации фенольного соединения зависит визуально наблюдаемая интенсивность коричневой окраски прореагировавшей хитозановой пленки. Следовательно, разработанный биосенсор может быть применен и для визуальной регистрации аналитического сигнала. Индикаторное соединение очень стабильно: поглощение использованного сенсора остается постоянным при его хранении на воздухе в течение, по меньшей мере, 8 недель (на практике до полугода). На рис. 4 приведен вид оптических стекол, модифицированных пленкой {ПХ-хитозан}, выдержанных в растворах с разным содержанием гидрохинона.

10 20 50 75 100 200 300 500 Рис. 4. Окраска чувствительного слоя

1 . ШММ! ЯШМ пероксидазного сенсора после выдерживания " - Ье?Кт1 в растворах, содержащих 10, 20, 50, 75, 100, I 200, 300 и 500 мкМ гидрохинона

£ «« (концентрация в растворе Н202 - 5 мМ,

• состав чувствительной пленки: ПХ — 50 ' пмоль, хитозан - 0.4 мг/см2, 0.05 М

фосфатный буферный раствор, рН 6.5, время выдерживания - 24 ч).

Биосенсор стабилен при хранении. Отклик его после 5 дней хранения при комнатной температуре (25°С) составил (69±7)% (п=4, Р=0.95), а после 30 дней хранения при 4°С - (98±8)% (л=4, /М).95). Следовательно, перед использованием биосенсор можно хранить в течение, по меньшей мере, месяца в холодильнике.

Таким образом, созданный дизайн оптических биосенсоров и выбранная индикаторная система удовлетворяют требованиям, которые были сформулированы в начале работы, а именно, позволяют определять фенольные соединения по измерению аналитического сигнала вне анализируемого раствора, что дает возможность анализировать мутные и негомогенные растворы образцов.

Определение малорастворимых в воде фенольных соединений

Следующим этапом работы стало изучение возможности применения созданного оптического пероксидазного сенсора для определения малорастворимых в воде фенольных соединений в присутствии органических растворителей. В качестве модельных фенольных соединений выбрали кверцетин, рутин, эскулетин (табл. 5).

Эти соединения относятся к природным полифенолам, которые содержатся в растительном сырье, продуктах питания и фармацевтических препаратах и обладают антиоксидантным и антимикробным действием. Круг природных соединений, содержащих фрагменты ди- и три-фенолов, очень широк, и эти три соединения были выбраны нами как модели соединений с разным размером молекулы и структурой: так, кверцетин и рутин относятся к флавоноидам, причем рутин является гликозидом кверцетина, а эскулетин является кумарином с существенно меньшим размером молекулы. Все три соединения малорастворимы в воде, однако, хорошо растворимы в полярных растворителях: в частности, одним из методов их введения в водный раствор является их предварительное растворение в ДМСО, который используют для подготовки проб образцов или введения этих веществ при исследовании их влияния на живые организмы или их терапевтическом применении.

Таблица 5. Изученные нерастворимые в воде фенольные соединения

Кверцетин Рутин Эскулетин

но. ,0- гт "ХХХ

он о УУ\ н он о \ н ом а;т~ънп

В литературе имеются сведения, что выбранные соединения являются субстратами ПХ, однако их пероксидазное окисление изучено мало. Взаимодействие с хитозаном этих полифенольных соединений после их окисления также не было изучено ранее, однако были все основания предполагать, что они будут вступать в эту реакцию аналогично простым фенольным соединениям, изученным выше (в частности, пирокатехина), и, следовательно, тоже могли быть определены с помощью предложенного биосенсора. Вместе с тем, несомненный интерес представляло изучение влияния присутствия органического растворителя (ДМСО) на протекание индикаторной реакции.

Проведя индикаторную реакцию с кверцетином, рутином и эскулетином аналогично экспериментам, описанным выше для простейших фенолов, убедились, что эти соединения после окисления также вступают во взаимодействие с хитозаном с образованием продукта, поглощающего в УФ-области. На рис. 5 в качестве примера представлены спектры, демонстрирующие наличие максимумов поглощения аддукта с хитозаном с продуктом окисления кверцетина в области 280-300 нм, увеличение максимума поглощения хитозана при 265 нм в случае окисления рутина и эскулетина, а также появление максимума поглощения при 350 нм в реакции окисления эскулетина. Поглощение прореагировавшей чувствительной пленки при указанных длинах волн и было использовано в качестве отклика сенсора.

Далее изучили влияние на аналитический сигнал рН, концентраций ДМСО и пероксида водорода (на примере реакции окисления кверцетина). Зависимость поглощения прореагировавшей чувствительной пленки от содержания ДМСО имела колоколообразный вид с максимумом в присутствии 10% ДМСО. Введение 20% ДМСО практически не влияет на отклик сенсора по сравнению с откликом в водной среде (с содержанием ДМСО 0.01%), в то время как при более высоком содержании ДМСО ингибирует фермент. Тем не менее, при необходимости анализ можно проводить и при 60% содержании ДМСО в системе. Четкой зависимости отклика сенсора от рН в диапазоне 5—8 не выявили, в отличие от систем с изученными простейшими фенольными соединениями, что, видимо, связано с более сложной структурой рассматриваемых водонерастворимых соединений и наличием в них нескольких диссонирующих групп.

Рис. 5. Спектры поглощения чувствительной пленки после взаимодействия с кверцетином (конц. в растворе: кверцетин -100 мМ, Н202 - 1 мМ), рутином (конц. в растворе: рутин - 100 мМ, Н202 - 1 мМ) и эскулетином (конц. в растворе: эскулетин - 100 мкМ, Н202 - 2 мМ). Условия: состав чувствительной пленки -50 пмоль ПХ, 0.4 мг/см2хитозана, 0.05 М фосфатный буферный раствор, 10% ДМСО, время выдерживания 24 ч.

В литературе имеются сведения о том, что на способность кверцетина к окислению можно влиять, связывая его с циклодекстринами (известно, кверцетин, как и другие флавоноиды, способен включаться в полость Р-ЦЦ), что могло бы быть использовано для управления чувствительностью и селективностью сенсора при анализе содержащих кверцетин образцов или смесей. Нами выявлено, что при введении 10-167-кратных избытков Р-ЦЦ по отношению к кверцетину скорость пероксидазного окисления последнего возрастает на 20%. Для выяснения причины активирующего действия р-ЦЦ сравнили кинетические параметры окисления кверцетина в отсутствие и в присутствии ЦД, и обнаружили, что при введении ЦЦ возрастала максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса, рассчитанная относительно кверцетина, в то время как кинетические параметры относительно пероксида водорода и специфичность связывания (выраженная как отношением кы/Кт) менялись незначительно. Поэтому предположили, что ускорение реакции в данном случае не связано с влиянием ЦД на фермент или субстраты, а может быть обусловлено неспецифическим взаимодействием ЦД с продуктом окисления кверцетина. Несмотря на полученный интересный результат, от применения циклодекстрина в индикаторной реакции отказались.

Таблица 6. Условия определения водонерастворимых фенольных соединений

Соединение/ параметр (изученный диапазон) Условия проведения реакции Аналит. длина волны (200-700 нм) Об.% ДМСО (0-60%) рН (58) Конц. пероксида водорода (0.1-10 мМ)

Кверцетин Объем 5 мл, длительность выдерживания 24 ч, 0.05 М фосфатный буферный раствор, состав чувствительного слоя:ПХ - 50 пмоль, хитозан -0.4 мг/см2 -280 нм 10% 6.5 1 мМ

Рутин -265 нм

Эскулетин -350 нм

В выбранных условиях (табл. 6) построили градуировочные зависимости для определения эскулетина, рутина и кверцетина и рассчитали аналитические характеристики разработанных методик (табл. 7).

20

/., нм

•кверцетин —рутин ——эскулетин

Таблица 7. Метрологические характеристики методик определения эскулетина, кверцетина и рутина с помощью пероксидазного сенсора (и = 4, Р = 0.95)

Субстрат Уравнение градуировочной зависимости, диапазон определяемых концентраций Коэфф. Корреляц ИИ г CtTlin; мкМ S, при С„

Эскулетин А=( 0.12±0.07) + (3.6±0.3)10J с, 10-200 мкМ 0.9981 10 0.05

Кверцетин Л=(0.22±0.08) + (13±1)10J с, 10-150 мкМ 0.9971 3 0.06

Рутин /Н0.47±0.05) + (3.9±0.5)10J с, 10- 150 мкМ 0.9945 10 0.08

Следует отметить, что (табл. 7) при определении рутина наблюдается высокое значение свободного члена уравнения градуировочной зависимости, а также худшая по сравнению с другими определениями воспроизводимость результатов измерений. Мы связываем это с тем, что рутин является гликозидом кверцетина и, соответственно, при ковалентном закреплении рутина на хитозановой пленке остаток сахара (дисахарида рутинозы)в его молекуле снижает ее прозрачность и приводит к повышению фона.

***

Таким образом, созданные нами биосенсоры позволяют определять растворимые и малорастворимые в воде фенольные соединения на микромолярном уровне концентраций (что сравнимо с чувствительностью оптических биосенсоров, известных из литературы). При этом предложенный нами дизайн оптического биосенсора принципиально позволяет регистрировать аналитический сигнал вне анализируемого раствора. Как и большинство ферментативных сенсоров для определения фенолов, они не обеспечивают селективное определение какого-либо конкретного фенола, однако за счет сочетания ферментативной реакции окисления и реакции присоединения образующегося хинона к матрице-хитозану отклик сенсора на какие-либо соединения нефенольной природы (за исключением хинонов) маловероятен. Вследствие этого разработанные сенсоры можно применять для анализа объектов, содержащих единственное фенольное соединение (например, фармацевтических препаратов), или же они могут быть использованы для оценки общего содержания фенолов или полифенолов в пересчете на выбранный фенол-эквивалент (в сточных водах, травяном сырье или напитках). Недостатком предложенных биосенсоров является длительность получения аналитического сигнала (24 ч), однако это компенсируется простотой выполнения определения, небольшими непосредственными затратами времени аналитика на определение и длительной стабильностью сигнала биосенсора при хранении. Следует отметить, что в случае необходимости сокращения времени проведения анализа до трех часов путем перемешивания реакционной смеси при повышенной температуре (35°С). Существенными преимуществами являются возможность регистрации аналитического сигнала вне анализируемого раствора и высокая стабильность продукта индикаторной реакции.

Определение органических пероксидов с помощью оптического биосенсора

Наличие пропорциональной зависимости поглощения чувствительной пленки оптического сенсора на основе ПХ от концентрации пероксида водорода в диапазоне 1 - 5 мМ в реакции окисления фенольных соединений, а также возможность

функционирования биосенсора в присутствии органических растворителей открывает перспективу его использования для определения не только фенольных соединений, но также и пероксидов, в том числе органических. Выбранные для изучения органические пероксиды представлены в табл. 8. В качестве субстрата-восстановителя (индикаторного вещества) в этих экспериментах использовали пирокатехин.

Таблица 8. Изученные органические пероксиды и их свойства

Название (растворимость в воде) 7рет-бутилгидро-пероксид (70%) 2-Бутанонпероксид (10-50 мг/л) Бензоилпероксид (0.1 мг/л)

Структурная формула Хг» Н3С О-ОН НзС-Х0^0"3 н3с о-он

В присутствии 20% ДМСО изучили зависимости поглощения чувствительной пленки от концентрации органических пероксидов в реакции окисления пирокатехина. Для этого использовали методику и условия, выбранные и описанные выше для работы сенсора в водно-органических средах. Отклик на присутствие т-бутилгидропероксида был низок (порядка 0.2 ед. опт. плотности при его концентрации 5 мМ), а зависимости отклика от концентраций 2-бутанонпероксида и бензоилпероксида имели линейный участок, который можно использовать для определения этих веществ. Метрологические характеристики разработанных методик сенсорного определения органических пероксидов представлены в табл. 9.

Таблица 9. Метрологические характеристики определения органических пероксидов с помощью пероксидазного сенсора (п = 4, Р = 0.95)

Субстрат Уравнение градуировочной зависимости, диапазон определяемых концентраций Коэфф. корр-и, г Спип, мМ 5Г При Си

2-Бутанон-пероксид А=(0Л1±0.04) + (1.2±0.1)103 с, 0.05 - 1 мМ 0.9989 0.03 0.06

Бензоил-пероксид /Н0.15±0.02) + (0.9±0.1)10' с, 0.05 - 0.25 мМ 0.9985 0.04 0.08

Предложенная нами методика определения органических пероксидов обладает метрологическими характеристиками, сопоставимыми с характеристиками электрохимических сенсоров, описанных в литературе. Сведения в литературе об оптических сенсорах для определения органических пероксидов отсутствуют. Возможность определения органических пероксидов в непрозрачных средах представляется особенно важной, поскольку объекты, содержащие этот класс соединений, часто имеют жировую основу (продукты питания, фармацевтические препараты) и, следовательно, их солюбилизация требует специальных манипуляций.

Анализ реальных объектов

Разработанный оптический сенсор на основе ПХ апробировали для определения фенольных соединений и органических пероксидов в ряде реальных объектов. С учетом того, что основными его достоинствами является возможность анализа мутных и водно-органических растворов, выбрали следующие объекты: крем

на жировой основе «Ахромин» (Болгария, Ален Мак), витамины «Аскорутин» (Фармстандарт, Уфа), порошок для инъекций «Корвитин» (Борщаговский химический завод, Украина), гель «Базирон» (ОаИегта). Результаты анализа реальных объектов представлены в табл. 10.

Таблица 10. Результаты определения фенольных соединений и органических пероксидов в реальных объектах

Объект/ использованная пробоподготовка Определяемое вещество/сопутствующие компоненты по данным на упаковке Найдено с исп. биосенсора Заявл. произво дителем

Крем «Ахромин»/ суспендирование образца в воде, спирте или ацетонитриле Гидрохинон/парафин, протегин X, глицерин, ланолин, хлорид натрия, ютанол Э, гидрохинон, витконол АРМ, парсол МСХ, отдушка розы, метабисульфит натрия, трилон ВД, трилон В, молочная кислота (1.9±0.1)% * 1.9%

Витамины «Аскорутин»/ суспендирование таблетки в ДМСО Рутин/аскорбиновая кислота, сахар; крахмал картофельный; кальция стеарат; тальк (0.051 ± 0.003) г/табл** 0.05 г/табл

Порошок для инъекций «Корвитин»/ растворение образца в ДМСО Кверцетин/поливинилпирролидон, натрия гидроксид (0.052 ± 0.004) г/0.5 г 0.05 г/0.5г

Гель «Базирон»/ суспендирование образца в воде Бензонл пероксид/акрилат сополимер, полоксамер 182, карбомер 940 (карбополь 980), глицерин, динатрия эдетат, натрия диоктил сульфосукцинат, пропиленгликоль, кремний коллоидный безводный, натрия гидроксид (5.0±0.4)% 5%

Результаты определения альтернативным методом: "1.9% (ВЭЖХ) ** 0.050 г (спектрофотометрия)

Таким образом, предложенный нами оптический пероксидазный сенсор был успешно использован для анализа различных объектов, в том числе с матрицей сложного состава, с минимальной пробоподготовкой: без экстракции, центрифугирования или фильтрации образца.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения прозрачных, механически Прочных и каталитически активных пленок состава {пероксидаза-хитозан}, {тирозиназа-хитозан}, {лакказа-хитозан}, сохраняющих свои свойства после выдерживания в водных и водно-органических средах (в присутствии до 40% ДМСО, ацетонитрила, этанола).

2. Предложена новая индикаторная система: взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенолов с хитозаном с образованием ковалентно связанного с ним светопоглощающего аддукта, позволяющая регистрировать аналитический сигнал непосредственно в матрице биочувствительного слоя вне анализируемого раствора.

3. На основе полученных пленок и предложенной индикаторной системы созданы оптические биосенсоры простой конструкции для определения фенольных соединений и органических пероксидов в объектах со сложной матрицей без предварительной пробоподготовки.

4. В результате изучения влияния на чувствительность и селективность биосенсоров состава их чувствительного слоя, рН, концентрации, природы буферного раствора и фермента, температуры, содержания полярного органического растворителя (ДМСО) разработаны методики определения в водных или водно-органических средах растворимых и нерастворимых в воде фенольных соединений и органических пероксидов в диапазонах концентраций, соответственно: гидрохинона и пирокатехина - 20-200 и 25-250 мкМ; кверцетина, рутина, эскулетина - 10-200, 10150, 10-150 мкМ; 2-бутанонпероксида и бензоилпероксида - 0.05-1 и 0.05-25 мМ.

5. Продемонстрирована возможность применения сенсора, созданного на основе пленки {пероксидаза-хитозан}, для анализа реальных объектов (крема, геля, витамина в таблетках и порошка для приготовления инъекций) без отделения матрицы и полной гомогенизации анализируемого раствора, а также в присутствии органического растворителя ДМСО.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях и тезисах докладов:

1. Veselova I.A., Malinina L.I.. Rodionov P.V., Shekhovtsova T.N.. Properties and analytical application of self-assembled complex {peroxidase-chitosan}. // Talanta. 2012. V. 102. P. 101-109.

2. Олейник (Малинина) Jl. Я. Весепова И. А., Родионов П. В., Будашов И. А., Шеховцова Т. Н. Оптический биосенсор на основе комплекса {пероксидаза-хитозан} для определения гидрохинона. // Зав. Лаб. Диагностика материалов. 2011. Т. 77. №4. 2011. С. 23-28.

3. Олейник (Малинина) Л.И.. Буслова Т.С., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Кинетика пероксидазного окисления кверцетина в присутствии p-циклодекстрина. // Вести. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2010. Т. 52. № 3. С. 199 - 203.

4. Malinina L.I.. Rodionov P.V., Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Novel application of chitosan. // Advances in Chitin Sciences. 2011. V. XIII. P. 309 - 312.

5. Veselova LA., Malinina L.I.. Rodionov P.V., Shekhovtsova T.N. Self-assembling chitosan/peroxidase films in the optical biosensor for the determination of low water-soluble analytes in water-insoluble samples. / 10th International Conference of the European Chitin Society. St.-Petersburg, Russia. 2011, May 20 - 24. P.64.

6. Олейник (Малинина) Л.И.. Родионов П.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Оптический биосенсор для определения фенольных соединений на основе полиэлектролитного комплекса {пероксидаза-хитозан}. / Международная научно-методическая конференция "Химия и экология. Развитие науки и образования". Москва. 17-18 февраля 2010. С.172.

7. Veselova /., Kireiko A., Oleinik (Malinina) L.. Shekhovtsova Т. Analytical application of nanostructured colloid particles formed by the self-assembled polyelectrolyte complex {horseradish peroxidase-chitosan}. / Euroanalysis XIV. Antwerp, Belgium. 2007, September 9-14. P.315.

8. Яблоцкий КВ., Олейник (Малинина) Л.И.. Родионов П.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Дизайн среды, как средство управления ферментативными процессами для

повышения чувствительности определения субстратов пероксидазы. / Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности». Москва. 26 - 30 апреля 2010. С.345.

9. Олейник (Малинина) Л.И. Полиэлектролитный комплекс «пероксидаза-хитозан» как основа оптических и электрохимических биосенсоров для определения ряда физиологически активных соединений. / Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ учащихся и студенческой молодежи «Научный потенциал XXI». Обнинск-Москва. 17-20 апреля 2008. С. 39.

10. Родионов П.В., Олейник Шалинина) Л.И. Оптический сенсор на основе полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан для определения фенольных соединений. / XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2009". Москва. 13 — 18 апреля 2009.

11. Olevnik (Malinina) LI. Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. A new optical biosensor based on the polyelectrolyte complex {horseradish peroxidase-chitosan} for determining phenolic compounds. / International Conference Chimia 2009. Constanta, Romania. 2009, May 13 -18.P.114.

12. Veselova I., Olevnik (Malinina) L. Kireyko A., Shekhovtsova T. Self-Assembling Peroxidase-Chitosan Complex in the Analysis of Water Insoluble Sample. / Euroanalysis XV. Innsbruck, Austria. 2009, September 6 - 10.

13. Veselova I.A., Malinina L.I.. Rodionov P.V., Shekhovtsova T.N. Self-assembling peroxidase chitosan structure as the basis of optical sensor films for determination of physiologically active compounds. 9th International Symposium on Polyelectrolytes - ISP 2012. Lausanne, Switzerland. 2012, July 9 - 12.

14. Veselova I. A., Malinina LI.. Buslova T.S., Shekhovtsova T.N. Peroxidase encapsulated in chitosan matrix as the basis of optical sensor films. XIX International Conference on Bioencapsulation. Amboise, France. 2011, October 5-8.

15.Shekhovtsova Т., Veselova /., Malinina L.. Yablotskiy K., Rodionov P. Analytical application of self-assembled {peroxidase-chitosan} films as the basis for optical biosensor in aqueous - organic and micellar media. / BIT'S 3rd Symposium on Enzymes and Biocatalysis. Xian, China. 2012, April 25-28.

16. Veselova /., Olevnik (Malinina) L. Kireyko A., Lobashov I., Shekhovtsova Т.. Self-assembling peroxidase-chitosan films as the basis of optical biosensors in analysis of water insoluble samples. / E-MRS 2010 Spring Meeting. Strasbourg, France. 2010, June 8-10.

17. Veselova I.A., Malinina LI.. Rodionov P.V., Shekhovtsova T.N. Analytical application of self-assembling peroxidase-chitosan and peroxidase-gelatin films as the basis for optical biosensors. / 2nd Russian - Hellenic symposium with international participation and young scientist's school Bionanotox. Heraklion, Greece. 2011, May 5 - 12. P.23.

18. Veselova I., Yablotskiy K„ Malinina L. Rodionov P., Shekhovtsova T. Sensitive fluorescent determination of peroxidase substrates in aqueous-organic and micellar media. / Euroanalisys 2011, 16th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». Belgrade, Serbia. 2011, September 11 - 15. P. 27.

19.Веселова И.А., Малинина Л.И.. Родионов П.В., Борзенкова Н.В., Буслова Т.С., Шеховцова Т.Н. Оптические биосенсоры для определения биологически активных соединений в матрицах сложного состава. / Всероссийская конференция по аналитической спектроскопии с международным участием. Краснодар, Россия. 23 -29 сентября 2012. С.318.

20.Веселова И.А., Кирейко' А.В., Яблоцкий КВ., Олейник (Малинина) Л.И.. Шеховцова Т.Н. Самоорганизованные молекулярные системы на основе полиэлектролитов и

поверхностно-активных веществ для регулирования свойств пероксидазы: применение в химическом анализе. / Всероссийская конференция по аналитической химии «Аналитика России-2009». Краснодар, Россия. 27 сентября - 2 октября 2009. С. 126.

21 .Олейник (Малинина) Л.И.. Веселова H.A., Шеховцова Т.Н.. Самоорганизованный катализатор - надмолекулярный комплекс {пероксидаза-хитозан} как основа оптического биосенсора для определения фенольных соединений. / Rusnanotech-09. Международный форум по нанотехнологиям. Москва. 6 — 8 октября 2009. Р. 700.

22.Родионов П.В., Олейник (Малшхта) Л.И.. Веселова И.А, Шеховцова Т.Н, Наноструктурированные прозрачные пленки {фермент-природный полимер} как основа оптических сенсоров для определения фенольных соединений в объектах с матрицей сложного состава. / III Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. Москва. 1—3 ноября 2010. С.63 - 64.

23.Мугинова C.B., Веселова И.А., Поляков А.Е., Олейник СМалинина) Л.И., Шеховцова Т.Н. Ферментативные методы определения катехоламинов и фенольных соединений в готовых жидких и мягких лекарственных формах. / I Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции». Москва. 1-4 декабря 2009. С. 199 - 200.

24.Веселова И.А., Кирейко A.B., Мапинина Л.И.. Родионов П.В., Шеховцова Т.Н. Пероксидаза в надмолекулярных ансамблях с полиэлектролитами и поверхностно-активными веществами: свойства и применение в анализе объектов со сложной матрицей. / 5 Биотехнологическая выставка-ярмарка РосБиоТех-2011. Международная научно-практическая конференция: «Нанобиоматериалы: Современные достижения и токсилогические вопросы безопасности». Москва. 31 октября 2011.С.21 -22.

Подписано в печать:

18.04.2013

Заказ № 8382 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

04201357340

Малинина Любовь Игоревна

ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ

02.00.02 -Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: профессор, д.х.н. Шеховцова Т.Н.

Москва-2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................9

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ............................................................................................................9

Индикаторные системы, ферменты, методы детектирования.........................................................10

Иммобилизация ферментов при создании биосенсоров для определения фенольных соединений................................................................................................................................................................19

Особенности сенсорного определения фенольных соединений в органических и водно-органических средах......................................................................................................25

Аналитические характеристики и практическое применение ферментативных сенсоров для определения фенольных соединений...................................................................................................................28

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ....................................................................................................43

Биосенсоры на основе безмедиаторных индикаторных систем.......................................................46

Биосенсоры на основе индикаторных систем, включающих медиаторы......................................47

Биосенсоры, основанные на регистрации изменения концентрации кислорода..........................51

Биосенсор, основанный на образовании окрашенного соединения.................................................54

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......................................................................................56

ГЛАВА 3. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, ПОСУДА, АППАРАТУРА, ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ, МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.............................................56

Исходные вещества...................................................................................................................................56

Посуда и аппаратура.................................................................................................................................59

Методики экспериментов........................................................................................................................59

Обработка результатов измерений........................................................................................................64

2

ГЛАВА 4. ДИЗАЙН БИОСЕНСОРА И ИНДИКАТОРНАЯ СИСТЕМА.......................65

Выбор конструкции биосенсора.........................................................................................................66

Выбор индикаторной системы и иммобилизация реагентов в пленках.........................................70

Оптимизация условий получения биочувствительного слоя на основе хитозана и изучение его поведения в присутствии органических растворителей..................................................................................84

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ........................................................................................................................................................87

Оптимизация условий определения водорастворимых фенольных соединений..........................87

Определение водорастворимых фенольных соединений с помощью оптических биосенсоров.......................................................................................................................................100

ГЛАВА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОНЕРАСТОРИМЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ...................................................................................................................................104

Выбор условий для определения с помощью оптического биосенсора фенольных соединений нерастворимых в воде..........................................................................................................................................104

Определение нерастворимых в воде фенольных соединений с помощью оптического биосенсора...............................................................................................................................................................115

ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ С ПОМОЩЬЮ ОПТИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА....................................................................................................116

ГЛАВА 8. АНАЛИЗ РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ..............................................................119

ВЫВОДЫ................................................................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной аналитической химии является создание простых средств контроля качества разнообразной продукции и мониторинга состояния окружающей среды. Включение в такие аналитические средства биологических компонентов -ферментов, антител, ДНК - позволяет повысить чувствительность и селективность анализа и расширяет его возможности за счет высокой избирательности биохимических взаимодействий. В последние 20 лет во всем мире активно проводятся исследования, направленные на создание ферментативных сенсоров для определения биологически активных неорганических и, особенно, органических веществ в объектах окружающей среды, продуктах питания, фармацевтических препаратах, физиологических жидкостях. Тем не менее, остается актуальной проблема совершенствования предложенных и создания новых биосенсоров в результате внедрения новых типов конструкций, индикаторных систем, оригинальных способов иммобилизации ферментов, обеспечивающих их активность и стабильность при хранении и проведении каталитических процессов в неблагоприятных для белков условиях и средах. Кроме того, важными аспектами таких разработок является расширение области возможного применения сенсоров для анализа различных реальных объектов (в том числе нерастворимых или ограниченно растворимых в воде) и определение в них соединений, которым ранее было уделено недостаточное внимание.

Подавляющее большинство существующих ферментативных сенсоров основано на электрохимической регистрации аналитического сигнала, и с их помощью успешно определяют органические соединения многих классов. Значительно меньшее внимание уделяется созданию и развитию биосенсоров с оптическим детектированием. При этом новые индикаторные системы и приемы регистрации оптического сигнала способны расширить возможности ферментативных методов за счет увеличения числа определяемых веществ и анализируемых объектов и в дальнейшем позволят упрочить место оптических биосенсоров среди современных средств анализа.

Для создания новых биосенсоров целесообразно использовать такие ферменты, которые катализируют превращение либо только одного какого-либо соединения (примеры таких узко специфических ферментов крайне малочисленны), либо группы близких по свойствам веществ; особый интерес представляют ферменты, одновременно катализирующие превращение разных по свойствам и строению соединений, например, субстратов-восстановителей и субстратов-окислителей. В этой связи чрезвычайно перспективно применение пероксидазы из корней хрена (ПХ). Этот хорошо изученный высокоактивный коммерческий фермент катализирует превращение разных групп органических веществ, определение которых представляет значительный интерес; в частности, субстратами-восстановителями пероксидазы являются фенольные соединения различного строения, а в роли субстратов-окислителей могут выступать органические пероксиды. К первым относятся многие важнейшие экотоксиканты, гормоны, антиоксиданты природного и промышленного назначения, вторые могут исполнять роль маркеров качества пищевых продуктов, а также являются важным техническим и фармацевтическим сырьем. Следовательно, определение перечисленных классов органических соединений является актуальной задачей химического анализа, решение которой особенно важно при анализе реальных объектов со сложной для спектрофотометрического и ферментативного анализа матрицей (например, мазей, кремов, продуктов питания) без предварительной пробоподготовки. Следует отметить, что этим проблемам функционирования оптических ферментативных сенсоров посвящены лишь единичные публикации.

Цель работы- создание оптических ферментативных сенсоров для определения фенольных соединений и органических пероксидов в объектах различной природы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- предложить такие индикаторные системы и дизайн* биосенсора для

* термин заимствован из англоязычной литературы, поскольку он наиболее полно соответствует всему комплексу характеристик сенсора: конструкции, составу и закреплению чувствительного слоя, способам проведения индикаторной реакции и регистрации сигнала.

фенольных соединений и органических пероксидов, которые бы позволили регистрировать оптический сигнал вне анализируемого раствора для того, чтобы исключить отделение матрицы образца и, кроме того, упростить анализ сред, содержащих органические растворители;

- изучить влияние различных органических растворителей на отклик биосенсора и его зависимость в водных и водно-органических средах от содержания веществ с разными свойствами и структурой: растворимых и нерастворимых в воде фенольных соединений и органических пероксидов;

продемонстрировать возможности использования разработанного биосенсора для определения фенольных соединений и органических пероксидов: апробировать его в анализе разных типов реальных объектов (водорастворимых, нерастворимых в воде и несмешивающихся с ней) без предварительной подготовки.

Научная новизна. Разработан способ получения прозрачных, каталитически активных, стабильных в водной и водно-органической средах биочувствительных пленок на основе пероксидазы хрена (ПХ), тирозиназы и лакказы, иммобилизованных в матрицу природного полимера хитозана. Предложена новая индикаторная система, основанная на реакции взаимодействия хитозана с продуктами ферментативного окисления фенольных соединений, с использованием которой на основе полученных биочувствительных пленок, закрепленных на стеклянной пластинке, созданы простые оптические сенсоры для определения фенольных соединений и органических пероксидов, позволяющие регистрировать оптический сигнал вне анализируемого раствора, что исключает необходимость отделения матрицы образца и его предварительной пробоподготовки.

Установлены отличия в селективности чувствительных слоев на основе оксидоредуктаз ПХ, тирозиназы и лакказы по отношению к простейшим ди- и три-фенолам в предложенной индикаторной системе. Впервые выявлено взаимодействие хитозана с флавоноидами после их ферментативного окисления.

Показано, что изменение параметров среды (рН и природы буферного раствора, биокатализатора, содержания ДМСО, температуры) позволяет

регулировать эффективность присоединения к хитозану продуктов ферментативного окисления фенолов различной структуры.

Обнаружено, что введение уЗ-циклодекстрина в реакцию пероксидазного окисления кверцетина приводит к 20% увеличению скорости этой реакции.

Практическая значимость работы. На основе полученных пленок {пероксидаза/хитозан}, {лакказа/хитозан}, {тирозиназа/хитозан} разработаны простые оптические ферментативные сенсоры для определения фенольных соединений и пероксидов в мутных и непрозрачных растворах. Показано, что индикаторное соединение в пленке настолько стабильно, что аналитический сигнал может быть измерен месяцы спустя после проведения анализа. Разработаны методики определения веществ различной структуры (гидрохинона, пирокатехина, кверцетина, рутина, эскулетина, 2-бутанонпероксида, бензоилпероксида) с помощью оптического биосенсора в водной и водно-органической среде (в присутствии ДМСО). Методики апробированы для анализа реальных объектов (в том числе, водонерастворимых) в водных и водно-органических растворах с минимальной пробоподготовкой, заключавшейся в суспендировании образца в водной среде или полярном органическом растворителе.

Автор выносит на защиту:

- способ получения биочувствительных прозрачных пленок состава {фермент (пероксидаза хрена, грибная тирозиназа или лакказа) - природный полиэлектролит хитозан} на стеклянных (кварцевых) пластинках, которые сохраняют прозрачность и механическую прочность после выдерживания в водной и водно-органической средах, и проявляют каталитическую активность в реакциях превращения фенольных субстратов указанных ферментов, а в случае пероксидазы - и пероксидов;

- индикаторную систему (реакцию взаимодействия хитозана с продуктами ферментативного окисления фенольных соединений), положенную в основу простого оптического сенсора для определения фенольных соединений и органических пероксидов, позволяющего регистрировать аналитический сигнал вне анализируемого раствора, без отделения матрицы сложного образца и его предварительной пробоподготовки;

- результаты изучения кинетики окисления кверцетина пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой, в присутствии и в отсутствие макроциклического комплексообразователя (3-циклодекстрина;

- данные о влиянии на эффективность взаимодействия между хитозаном и продуктами ферментативного окисления фенольных соединений различной структуры параметров среды (рН, природы буферного раствора, биокатализатора, температуры, содержания полярного органического растворителя ДМСО);

- методики определения субстратов-восстановителей (простейших фенольных соединений, флавоноидов и кумаринов) и субстратов-окислителей (органических пероксидов), апробированные в анализе фармацевтических препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Ферментативные биосенсоры для определения фенольных

соединений

Определение фенольных соединений -актуальная задача аналитической химии, поскольку многочисленные соединения, относящиеся к этому классу, широко распространены в природе и используются в промышленности. Фенолы являются продуктами распада ряда пестицидов и отходами некоторых производств (например, производства бумаги). Легко проникая в организм человека и животных через кожу и слизистые, они отравляют органы и ткани и могут служить причиной различных заболеваний, в первую очередь, легких, печени, почек и мочеполовой системы [1, 2]. Степень токсичности фенольных соединений зависит от их строения; очень опасными загрязнителями считают сам фенол, его хлорированные и алкилированные производные [3]. В то же время некоторые фенольные соединения (полифенолы, такие как флавоноиды и катехины) обусловливают качество и полезность многих овощей, фруктов и напитков, в частности вин и пива [4]. Кроме того, такой класс веществ, как катехоламины, также имеющие в основе своей структуры фенол, являются важнейшими нейротрансмиттерами в организме человека, и их используют в качестве лекарственных средств (Табл. 1). Это свидетельствует о том, что в дополнение к многочисленным существующим инструментальным методикам определения этих веществ (преимущественно методами спектрофотометрии или амперометрии, в большинстве случаев с предварительным разделением методами хроматографии и капиллярного электрофореза [4]), необходимы быстрые и простые устройства и методики, в том числе для использования в целях внелабораторного скрининга. Эта задача может быть решена в результате разработки сенсоров на основе ферментов для определения указанных соединений. Настоящий обзор посвящен анализу работ по созданию сенсоров на основе ферментов (далее биосенсоров) для определения наиболее распространенных фенольных соединений — фенола, крезолов, нитрофенолов, хлорофенолов, катехоламинов и полифенольных соединений (флавоноидов, катехинов), опубликованных в 2001-2011 годах.

Таблица 1. Фенольные соединения/объекты, на определение которых направлено создание ферментативных сенсоров

Соединения Объекты

Фенол, крезолы, хлорфенолы Сточные воды (в т.ч. сточные воды бумажных производств и производств оливкового масла)

Катехоламины Биологические жидкости (кровь, моча)

Катехоламины, флавоноиды, крезолы, хлорфенолы, фенол Фармацевтические препараты

Полифенольные соединения (флавоноиды и катехины) Вина, пиво

Флавоноиды Растительное сырье и фармацевтические препараты на его основе

Индикаторные системы, ферменты, методы детектирования

Все применяемые в биосенсорах для определения фенольных соединений индикаторные системы основаны на ферментативном или электрохимическом окислении фенольного соединения и либо его последующем восстановлении (электрохимическом или ферментативном), либо взаимодействии со специально введенным реагентом. Соответственно, в сенсорных системах для определения фенольных соединений используют ферменты двух классов - оксидоредуктазы и дегидрогеназы, а способ регистрации аналитического сигнала определяется типом индикаторной системы.

Индикаторные системы, основанные на ферментативном окислении

фенольных соединений. В индикаторных системах, в которы�