Твердофазные флуоресцентные биосенсоры для определения фенольных соединений и органических пероксидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Родионов Павел Валерьевич

ТВЕРДОФАЗНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 2013

Москва-2013

005538481

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Шеховцова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штыков Сергей Николаевич Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского, кандидат химических наук, вед. науч. сотр. Рубцова Майя Юрьевна, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, кафедра химической энзимологии.

Ведущая организация: Казанский (Приволжский) Федеральный

университет

Защита состоится 11 декабря 2013 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации размещен на сайге химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (www.chem.msu.ru) и на сайте ВАК (http://vak.ed.gov.ru). Автореферат разослан 8 ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочеш никова И.И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность . работы. Совершенствование сенсорных технологий представляет собой активно развивающееся направление современной аналитической химии. Перспективность применения сенсорных устройств в практике химического анализа обусловлена рядом их преимуществ по сравнению с традиционными аналитическими методиками (спекгрофотометрическими, хроматографическими, электрохимическими и т.д.): экспрессностью и экономичностью анализа, технологической и »методической простотой, отсутствием необходимости привлечения высококвалифицированного персонала. Кроме того, сенсоры могут работать автономно без вмешательства оператора, а также в ряде случаев могут быть использованы во внелабораторном анализе при отсутствии сложного оборудования. Важное требование, предъявляемое к химическим сенсорам, заключается в том, что отклик их чувствительного слоя должен быть пропорционален только концентрации определяемого соединения (или нескольких соединений при их групповом определении). При этом компоненты матрицы анализируемого образца не должны оказывать влияния на результаты измерения аналитического сигнала. Однако, как правило, реальные объекты, представляющие наибольший аналитический интерес, имеют матрицы сложного состава (например, биологические жидкости), в том числе нерастворимые в воде (в частности, многие косметические и лекарственные препараты). Компоненты этих матриц могут не только вносить гонрешности в результаты измерения, но и в ряде случаев делают процедуру анализа неосуществимой. По этой причине часто при анализе реальных объектов возникает необходимость дополнительной пробоподшговки анализируемого образца с использованием токсичных или агрессивных органических растворителей, фильтрования, разделения, что существенно увеличивает погрешность результатов измерений, время анализа, а также усложняет его выполнение. Перспективный подход для решения перечисленных проблем заключается в создании твердофазных сенсоров, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала не в анализируемом растворе, а непосредственно на поверхности сенсора - в его чувствительном слое.

Актуальной аналитической задачей остается определение фенолыплх соединений и пероксидов различного строения в объектах на основе матриц сложного состава (биологических жидкостях и лекарственных препаратах). В настоящее время большинство существующих твердофазных сенсоров для определения указанных соединений основано па электрохимической регистрации аналитического сигнала. Созданию твердофазных оптических сенсоров посвящены единичные публикации, причем существующие сенсоры являются исключительно спекгрофотометрическими, а их чувствительность, селективность и особенно экспрессность недостаточны для решения многих аналитических задач. В то же время использование новых индикаторных систем и способов измерения аналитического сигнала (в частности флуоресцентное детектирование) должны значительно улучшить аналитические характеристики и расширить возможности использования твердофазных оптических сенсоров в химическом анализе.

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии МГУ им. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.

Цель работы - создание твердофазных флуоресцентных ферментативных сенсоров, действие которых основано на формировании и измерении аналитического сигнала непосредственно в чувствительном слое, закрепленном на поверхности подложки, для определения фенолышх соединений и пероксидов различного строения в матрицах различного состава.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• предложить конструкцию флуоресцентного сенсора, позволяющую регистрировать аналитический сигнал вне раствора;

• выбрать индикаторные системы для твердофазного определения фенольных соединений и пероксидов; разработать методики определения перечисленных аналитов.

• продемонстрировать возможность использования разработанных биосенсоров в анализе реальных объектов различной природы, в том числе водонерастаоримых (фармацевтических и лекарственных препаратов, биологических жидкостей человека).

Научная новизна. Предложена простая конструкция твердофазного флуоресцентного биосенсора: полимерная пленка, закрепленная на поверхности подложки (стекла), содержащая иммобилизованные компоненты индикаторной системы. Для измерения интенсивности флуоресценции чувствительного слоя биосенсор устанавливается в гаоветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркалом); аналитический сигнал регистрируется в режиме отражения. Предложены новые индикаторные системы для определения фенольных соединений и пероксидов различного строения, основанные на:

• взаимодействии продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (ферменты - пероксидаза, лакказа или тирозиназа) с хитозаном, меченным флуоресцентной меткой (родамина Б изотиоцианатом), и уменьшении интенсивности флуоресценции (обратное определение);

• взаимодействии продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (фермент - пероксидаза) с дериватизирующими агентами (о-фенилендиамином, этилендиамином) с образованием флуоресцирующих аддуктов (прямое определение).

Разработаны методики определения фенольных соединений и органических пероксидов в объектах на основе матриц сложного состава с использованием твердофазных флуоресцентных сенсоров на основе ферментов-оксидоредуктаз (пероксидазы, лакказы, тирозиназы), иммобилизованных в хитозановые пленки, не требующие предварительной пробоподготовки анализируемого образца. По чувствительности и экспрессности определения предложенные биосенсоры превосходят описанные в литературе твердофазные спектрофотометрические аналоги, также основанные на формировании и измерении аналитического сигнала вне раствора. Установлен механизм сорбции фенольных соединений и продуктов их ферментативного окисления хитозановой пленкой при условиях, оптимальных для функционирования биосенсоров. Изучено влияние ПАВ различной природы на интенсивность сигнала биосенсоров. В результате проведенных исследований показана возможность целенаправленного варьирования аналитических

характеристик методик определения перечисленных аналитов с использованием разработанных биосенсоров.

Практическая значимость. Предложено техническое решение для измерения аналитического сигнала (интенсивности флуоресценции) на твердой поверхности. Разработаны методики определения простейших изомерных дигидроксифенолов (пирокатехина, резорцина, гидрохинона) и катехоламинов (допамина, адреналина) в водной среде в диапазоне их концентраций 0.5 - 25 мкМ и: 5 "— 150 мкМ, соответственно, с помощью твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе пероксидазы, лакказы или тирозиназы, иммобилизованных в пленке хитозана, меченного флуоресцентной меткой (обратное определение). Достигнутые чувствительность и селективность позволяют определять перечисленные соединения в объектах, содержащих только одно фенольное соединение, либо оценивать их суммарное содержание в анализируемом образце. Разработаны методики чувствительного и селективного определения замещенных о-дигидроксифенольных соединений - катехоламинов (допамин, адреналин) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) в водной среде в диапазоне их концентраций 0.1-5 мкМ и 5 - 250 нМ, соответственно, с помощью твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе пероксидазы и о-фенилендиамина, иммобилизованных в пленке хитозана (прямое определение). Разработаны методики определения пероксида водорода и ряда органических пероксидов (пероксида мочевины, 2-бутанонпероксида, бензоилпероксида и трет-бутилгидропероксида) на уровне их концентраций 10 мкМ — 2500 мМ с использованием обратного и прямого твердофазных флуоресцентных биосенсоров на основе пероксидазы. Предложенные методики определения простейших изомерных дигидроксифенольных соединений, катехоламинов и пероксидов апробированы в анализе фармацевтических и косметических препаратов, в том числе водонерастворимых (шампуни, кремы, мази) при их минимальной пробоподготовке, ограничивающейся гомогенизацией образца в водной среде, что позволяет расширить круг анализируемых объектов. Методики определения гомованилиновой и ванилилминдальной кислот апробированы в анализе биологической жидкости (мочи).

Автор выносит на защиту:

• конструкцию твердофазного флуоресцентного биосенсора и схему регистрации аналитического сигнала;

• индикаторную систему, включающую взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (фермент — пероксидаза, лакказа, тирозиназа) с хитозаном, меченным флуоресцентной меткой, положенную в основу обратного твердофазного флуоресцентного биосенсора для определения фенолов и пероксидов различного строения, позволяющего регистрировать аналитический сигнал вне раствора;

• данные о влиянии состава чувствительного слоя (молекулярной массы и плотности нанесения хитозана, природы и содержания фермента), а также параметров среды (концентрации и рН фосфатного буферного раствора, температуры и объема реакционной системы, природы и концентрации ПАВ) на эффективность взаимодействия продуктов ферментативного окисления фенольных соединений с меченым и немеченым хитозаном;

• сравнительные результаты изучения сорбции пирокатехина, гидрохинона и продуктов их ферментативного окисления хитозановой пленкой при условиях, оптимальных для функционирования твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе меченого хитозана, а также описанного ранее твердофазного спектрофотометрического биосенсора на основе хитозана;

• сравнительные данные о кинетике окисления пирокатехина пероксидом водорода и органическими пероксидами, катализируемого пероксидазой, в немицеллярной среде и среде прямых мицелл ПАВ;

• индикаторную систему, включающую взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (фермент - пероксидаза) с дериватизирующими агентами (о-фенилендиамином и этилендиамином), положенную в основу прямого твердофазного флуоресцентного биосенсора для определения фенолов и пероксидов различного строения, позволяющего регистрировать аналитический сигнал вне раствора;

• данные о влиянии параметров среды и состава чувствительного слоя на эффективность взаимодействия продуктов ферментативного окисления фенольных соединений с о-фенилендиамином и этилендиамином в растворе и на поверхности сенсора;

• методики определения субстратов-восстановителей (фенольных соединений) и субстратов-окислителей (пероксида водорода и органических пероксидов) в водной среде и среде прямых мицелл ПАВ, апробированные в анализе фармацевтических препаратов и биологических жидкостей.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 17 международных и всероссийских конференциях, включающих Международную научно-методическую конференцию «Химия и экология. Развитие науки и образования» (Москва, Россия, 2010), III Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, Россия, 2010), Международные научные конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2012», «Ломоносов-2013» (Москва, Россия, 2009, 2010, 2012, 2013), V Всероссийскую конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, Россия, 2011), Всероссийскую конференцию по аналитической спектроскопии с международным участием (Краснодар, Россия, 2012), 2nd Russian — Hellenic symposium with international participation and young scientist's school (Ираклион, Крит, Греция, 2011), 10th International conference of the European Chitin Society (Санкт-Петербург, Россия, 2011), Euroanalysis XVI (Белград, Сербия, 2011), Euroanalysis XVII (Варшава, Польша, 2013), BIT'S 3rd Symposium on Enzymes and Biocatalysis (Сиань, Китай, 2012), 9th International Symposium on Polyelectrolytes - ISP (Лозанна, Швейцария, 2012), 3rd International Conference on Bio-Sensing Technology (Сиджсс, Испания, 2013), International conference «Biocatalysis 2013» (Москва, Россия, 2013), II Съезд аналитиков России (Москва, Россия, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей, 23 тезиса докладов на международных и всероссийских конференциях, получены положительные заключения о выдаче 2 патентов РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав обзора литературы, 1 главы экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов,

выводов, приложения, списка литературы, включающего 148 источников. Работа изложена на 217 страницах машинописного текста, содержит 93 рисунка и 3.9 таблиц.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 4 главы. В первой главе изложены общие сведения о сенсорах: их существующие классификации, возможные конструкции и принципы работы. Вторая и третья главы посвящены оптическим сенсорам для определения фенольных соединений и пероксидов, соответственно. Подробно рассмотрена их конструкция (подходы к формированию чувствительного слоя, варианты проведения индикаторной реакции, способы детектирования), различные типы индикаторных систем, а также аналитические характеристики и примеры применения существующих сенсоров в анализе реальных объектов. В четвертой главе систематизированы подходы к флуориметрическому определению катехоламинов и их метаболитов. Отдельное внимание уделено определению перечисленных соединений по флуоресценции их производных.

Экспериментальная часть работы содержит одну главу (5). В пятой главе перечислены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование, а также приведены методики приготовления растворов, проведения реакций и обработки результатов измерений.

Обсуждение результатов представлено четырьмя главами (6 — 9). Шестая глава посвящена обоснованию выбора конструкции твердофазного флуоресцентного сенсора и индикаторных систем для определения фенольных соединений и пероксидов различного строения. Рассмотрены основные проблемы и предложено техническое решение для формирования и измерения флуоресцентного сигнала на твердой поверхности. В седьмой главе описаны исследования по выбору оптимальных условий функционирования твердофазных флуоресцентных биосенсоров на основе пероксидазы, лакказы или тирозиназы, иммобилизованных в пленке хитозана, меченного флуоресцентной меткой - родамина Б изотиоцианатом (РБИТЦ); результаты изучения сорбции фенольных соединений и продуктов их окисления хитозановой пленкой при условиях, оптимальных для работы твердофазных флуоресцентного и описанного ранее спектрофотометрического биосенсоров на основе хитозана. Приведены данные исследования кинетики пероксидазного окисления модельного соединения пирокатехина в водной среде и среде прямых мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ). Описаны разработанные методики определения простейших изомерных дигидроксифенольных соединений (пирокатехина (ПК), резорцина (РЗ), гидрохинона (ГХ)), катехоламинов (допамина (ДА), адреналина (АД)), пероксида водорода и органических пероксидов (пероксида мочевины, 2-бутанонпероксида, /яре/м-бутилгидропероксида, бензоилпероксида) с использованием твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе меченного хитозана в водной и мицеллярной средах. Приведены аналитические характеристики, обсуждены особешюсти и преимущества биосенсора. Предложены подходы к увеличению чувствительности определения фенольных соединений и пероксидов с использованием созданного ранее твердофазного спектрофотометрического биосенсора на основе хитозана. В восьмой главе описаны методики определения катехоламинов и их метаболитов по реакциям ферментативной дериватизации с о-фенилендиамином (о-ФДА) и этилецциамином (ЭДА), положенные в основу твердофазного флуоресцигпюго биосенсора. Описаны методики определения катехоламинов

(допамина (ДА), адреналина (АД)), их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминальной кислот (ГВК, ВМК)), пероксида водорода и органических пероксидов (пероксида мочевины, 2-бутанонпероксида, /ярем-бутилгидропероксида, бензоилпероксида) в водной и мицеллярной средах с использованием указанного сенсора. Представлены аналитические характеристики, обсуждены особенности и преимущества биосенсора. В девятой главе приведены примеры практического применения разработанных твердофазных сенсоров в анализе реальных объектов на основе матриц сложного состава (в т.ч. водонерастворимых) без их предварительной пробоподготовки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Использование твердофазных оптических сенсоров, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала вне раствора, позволяет расширить аналитические возможности сенсоров за счет определения малорастворимых аналитов в объектах на основе сложных матриц при их минимальной пробоподготовке. Однако следует отметить, что чувствительность, селективность и особенно экспрессность описанных в литературе твердофазных сенсоров недостаточны для решения многих аналитических "задач. Подход, основанный на формировании и измерении аналитического сигнала на твердой поверхности, не был ранее использован при создании флуоресцентных сенсоров для определения фенольных соединений и органических пероксидов. В то же время метод флуоресценции характеризуется высокой чувствительностью и селективностью анализа. Реализация предложенного подхода предполагала выполнение следующих этапов эксперимента:

1) разработка конструкции твердофазного флуоресцентного сенсора и схемы измерения аналитического сигнала;

2) выбор индикаторных систем, позволяющих регистрировать аналитический сигнал непосредственно в чувствительном слое сенсора;

3) оптимизация условий формирования аналитического сигнала;

4) апробация разработанных сенсоров в анализе реальных объектов.

Разработка конструкции твердофазного оптического сенсора.

Из большого разнообразия конструкций оптических сенсоров мы выбрали наиболее простую: стеклянную пластинку, на поверхности которой закреплены необходимые вещества. В качестве матрицы для иммобилизации компонентов индикаторной реакции, являющейся основой чувствительного слоя любого химического сенсора, нами были использованы природные полимеры: хитозан и желатин, известные своей способностью образовывать прочные, однородные и оптически прозрачные пленки.

Чувствительный слой сенсора формировали капельным нанесением смеси, состоящей из матрицы для иммобилизации и компонентов индикаторной системы. Смесь равномерно распределяли по поверхности подложки, расположенной на строго горизонтальной поверхности, и высушивали на воздухе при комнатной температуре (рис. 1). Для проведения индикаторной реакции сенсор погружали в раствор, содержащий определяемое соединение, выдерживали в нем необходимое время (непроточный вариант проведения индикаторной реакции), извлекали и высушивали на воздухе при комнатной температуре.

Аналитический сигнал регистрировали в режиме поглощения (спектрофотометрическое детектирование) или отражения (флуориметрическое детектирование) непосредственно в чувствительном слое на поверхности подложки, устанавливая сенсор, соответственно, на фронтальной поверхности юоветного отделения спектрофотометра или в кюветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью - зеркалом (рис. 2). Таким образом, описанная конструкция позволяла при необходимости сочетать два способа измерения аналитического сигнала. Использование отражающей поверхности в случае флуориметрического детектирования позволяло существенно повысить чувствительность определения, поскольку при этом в детектор попадало больше возбужденного излучения.

Рис. 1. Формирование чувствительного

Чувствительный __1 1 *

°10' ' «ямф* 1— ■ I сдоя оптического биосенсора.

I-1 Нвигсемпе Твердофазный

|_I чувствительного бносмсор

Подложка спо" (аореаыии)

I I Детатор

о

о

Рис. 2. Схема измерения поглощения (1) и флуоресценции (2) чувствительного слоя твердофазного оптического биосенсора.

ЮйВ«1Ийе отаеяевие флуориыетра

Серьезной проблемой при регистрации флуоресцентного сигнала с использованием твердофазных сенсоров предложенной конструкции явилось высокое значение фонового сигнала в области 300 - 500 нм (>.ех = 300 - 400 нм и = 400 - 500 нм). На рис. 3 представлены спектры, полученные при отражении возбуждающего излучения от зеркала, расположенного под углом 45' (угол максимального отражения) относительно источника возбуждения (Хе лампа). Даже при минимально возможной ширине щели (1.5 нм) интенсивность фонового сигнала в рассматриваемой области спектра составляла от 100 до 800 у.е. (полная шкала измерения прибора составляет 1000 у.е).

Рис. 3. Спектры флуоресценции, полученные при отражении возбуждающего излучения от зеркала, расположенного под углом 45° относительно источника возбуждения, при разных длинах волн возбуждающего излучения: (1) Хсх = 300; (2) Х^ = 350; (3) = 400; (4) = 450 нм; ширина входной и выходной щелей 1.5 нм.

Наличие высокого фонового сигнала делало фактически невозможным измерение полезного аналитического сигнала. С целью выявления природы фонового сигнала, уменьшения его величины, а также установления рабочей области спектра (а, следовательно, и выбора подходящих индикаторных систем) было использовано два подхода: изменения угла отражения возбуждающего излучения и применение оптических светофильтров.

Для реализации первого подхода в иоветное отделение флуориметра в качестве отражающей поверхности устанавливали зеркальные пластинки разного размера, каждая из которых могла быть зафиксирована в кюветном отделении только в нескольких положениях под определенными углами относительно источника возбуждения (рис. 4). Как свидетельствуют спектры, приведенные на рис. 5, изменение угла позволило существенно уменьшить величину фонового сигнала (до 1 - 4 у.е.), однако не позволило полностью от него избавиться.

Т ! Т

! 1

<1- — X Ч •4—

*— \ — \ \

____ - - N \

410 500 550

Рис. 4 Схема расположения зеркала в кюветном отделении флуориметра, а - угол отражения возбуждающего излучения.

Рис. 5. Спектры флуоресценции, полученные при отражении возбуждающего излучения от зеркала, расположенного под разными углами относительно источника возбуждения: (1) 15°; (2) 30°; (3) 60°; (4) 75°; Х^ = 350 нм, ширина входной и выходной щелей 1.5 нм.

«СЮ 4» 500

Величина фонового сигнала была максимальной при = 330 нм, причем интенсивность, форма и положение полосы флуоресценции фона зависели от длины волны возбуждения (рис. 6а). На основании полученных результатов сделано предположение, что возникновение фонового сигнала обусловлено собственным излучением источника возбуждения (Хе лампы).

Для выбора оптимального угла отражения на поверхность зеркальных пластинок (т.е. непосредственно на отражающую поверхность) равномерно наносили смесь, состоящую из матрицы для иммобилизации (хитозана или желатина) и органического соединения, интенсивно флуоресцирующего в области 300 - 600 нм, и регистрировали спектры флуоресценции полученных пленок. В качестве такого флуорофора использовали пиронин Б (ПБ), спектры поглощения которого характеризуются несколькими максимумами в области 340 - 360 и 540 - 560 нм. Таким образом, при = 350 нм спектр флуоресценции пленок {полимер-ПБ} охватывал широкую область длин волн, включая область фоновой флуоресценции (400 - 500 нм) и область флуоресценции ПБ (т.е. полезного аналитического сигнала,

Хеш ~ 580 нм). В отличие от фонового сигнала форма и положение максимума флуоресценции ПБ (но не интенсивность) не зависели от длины волны возбуждения (рис. 66). Таким образом, явления, наблюдаемые при измерении полезного аналитического сигнала на твердой поверхности, подчинялись основным законам флуоресценции.

б)

Л нм

А, нм

Рис. 6. Спектры флуоресценции хитозановых пленок и пленок {хитозан-ПБ}, нанесенных на поверхность зеркала: (1) ХеХ = 330; (2) Хех = 340; (3) = 350, (4) Хвд = 360; (5) Хех = 370 нм; угол отражения возбуждающего излучения 75°, ширина щелей 5.0 нм.

Диаграмма, представленная на рис. 7, иллюстрирует изменение отношения интенсивности флуоресценции фона к интенсивности флуоресценции ПБ при разной ширине входной и выходной щелей флуориметра. Как свидетельствуют приведенная диаграмма, это отношение минимально при угле 75°. Следует отметить, что при использовании зеркал, расположенных под углами 5° и 85° отношение интенсивностей фонового и полезного аналитического сигналов не превышало 1-2 ед. Однако при этом и сама интенсивность обоих сигналов не превышала нескольких у.е. даже при ширинах входной и выходной щелей 5.0 нм. По-видимому, это связано с тем, что при 5° и 85° на детектор отражалось мало возбужденного излучения. Поэтому для дальнейшей работы в качестве отражающей поверхности использовали зеркало, расположенное в иоветном отделении флуориметра под углом 75°.

Е31 D2 ИЗ

Рис. 7. Соотношения интенсивностей флуоресценции фона и молекулы-флуорофора в пленке {хитозан-ПБ} при разных углах отражения возбуждающего излучения; У(хитозан-ПБ) = 200 мкл, с(ПБ) = 5 мкМ, У(хитозан)/У(ПБ) = 1/1, = 350 нм, ширина входной и выходной щелей: (1) 1.5; (2) 3.0; (3) 5.0 нм.

угол отражения возбуждающею излучения

Фоновое излучение в области 300 - 500 нм зависело от длины волны возбуждения, поэтому для его уменьшения также были применены оптические светофильтры, установленные в юоветном отделении в специальном держателе перед входной щелью флуориметра. Из большого числа коммерчески доступных оптических светофильтров был выбран ряд фиолетовых (ФС) и ультрафиолетовых (УФС) стекол, выделяющих область 300 - 400 нм. На примере пленок {хитозан-ПБ}, нанесенных на поверхность зеркала, установили, что светофильтры не позволяли

полностью избавиться от фонового сигнала или существенно улучшить отношение сигнал/фон, поскольку при их использовании уменьшались как фоновый, так и полезный аналитического сигнала ~ 580 нм). Это отношение во всех случаях (как при использовании светофильтров, так и в их отсутствии) не превышало 0.5 - 0.6 ед.

При условиях, позволяющих зарегистрировать максимальную интенсивность флуоресценции ПБ в пленках {полимер-ПБ} (табл. 1), были построены зависимости аналитического сигнала = 350 нм, ~ 580 нм) от концентрации ПБ и рассчитаны аналитические характеристики пленок при разных ширинах входной и выходной щелей. Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 2, предложенная конструкция сенсора позволяет воспроизводимо регистрировать флуоресцентный сигнал на твердой поверхности, причем варьирование ширины щелей флуориметра позволяло направленно регулировать чувствительность определения.

Таблица 1. Состав чувствительного слоя и оптимальные условия регистрации спектров флуоресценции пленок {полимер-ПБ}.

Параметр Пленка

{хитозан-ПБ} {желатин-ПБ}

с(полимер), % по массе 1 0.5

с(полимер) в пленке, % по объему 95

У(полимер-ПБ), мкл 200

Угол отражения возбуждающего излучения 75°

нм 350

^еш» НМ 580

Таблица 2. Аналитические характеристики пленок {полимер-ПБ} при разной ширине входной и выходной щелей флуориметра (п = 4, Р = 0.95).

Ширина щелей, нм Пленка {хитозан-ПБ} Пленка {желатин-ПБ}

Диапазон линейности, мкМ Стіс» нМ г Диапазон линейности, мкМ Cmln» нМ г

3 5-25 500 0.993 5-25 600 0.996

5 1-25 60 0.994 1-25 70 0.993

10 1-10 55 0.991 1-10 65 0.987

Таким образом, твердофазный флуоресцентный сенсор предложенной конструкции может быть использован для измерения аналитического сигнала в длинноволновой области спектра (^ > 500 нм) и угле отражения возбуждающего излучения 75 Рекомендуемая ширина входной и выходной щелей составляет 5.0 нм. Эти параметры использованы нами для дальнейшей работы.

Выбор индикаторных систем

В качестве аналитов в работе использовали простейшие изомерные дигидроксифенолы (Г1К, РЗ, ГХ), катехоламины (ДА, АД) и их метаболиты (ГВК. ВМК), а также пероксиды различного строения (пероксид водорода, пероксид мочевины, 2-бутанонпероксид, бензоилпероксид, треот-бутилгидропероксид). Выбор перечисленных соединений в качестве аналитов обусловлен потребностью в разработке чувствительных, селективных, простых и экспрессных методик их определения в объектах на основе матриц сложного состава.

Как правило, отклик чувствительного слоя обратных сенсоров аддитивен по отношению к определяемым соединениям. Кроме того, обратные сенсоры

характеризуются меньшей чувствительность определения и более широкой групповой селективностью по сравнению с прямыми аналогами. По этой причине обратные сенсоры идеально подходят для анализа объектов, содержащих только одно фенольное соединение или пероксид, либо для оценки их суммарного содержания в анализируемом образце (фармацевтических и косметических препаратах). Прямые сенсоры больше подходят для селективного определения одного аналита в присутствии других (в биологических жидкостях). Исходя из задач, стоящих при определении фенольных соединений и органических пероксидов в реальных объектах, в качестве возможных индикаторных систем для разработки твердофазного флуоресцентного биосенсора выбрали две реакции:

• взаимодействие хитозана, меченного флуоресцентной меткой, с продуктами ферментативного окисления фенолов с образованием нефлуоресцирующих соединений (обратное определение по тушению флуоресценции);

• реакцию ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов с ароматическим и алифатическим аминами (прямое определение по усилению флуоресценции).

Предложенные индикаторные системы ранее не использовались в сенсорных технологиях. Действие биосенсоров основано на последовательном протекании двух реакций: ферментативного окисления фенольного соединения и взаимодействия продукта окисления с индикаторным веществом (хитозаном, меченным флуоресцентной меткой, или дериватизирующим агентом). Сочетание двух последовательно протекающих реакций позволяет управлять селективностью и чувствительностью определения подбором иммобилизованных реагентов, в частности ферментов. В качестве основного фермента выбрали пероксидазу из корней хрена, также использовали лакказу и грибную тирозиназу. Эти ферменты относятся к классу оксидоредукгаз, катализирующих двухсубстратные окислительно-восстановительные реакции.

Наиболее часто в качестве флуоресцентных меток используют флуоресцеина изотиоцианат (Х^ ~ 500 iim, ~ 525 нм) и родамина Б изотиоцианат (РБИТЦ, ХеХ ~ 550 нм, ~ 575 нм). Последний был выбран нами для дальнейшей работы, поскольку он характеризовался максимумами возбуждения и испускания в более длинноволновой области спектра. В качестве дериватизирующих агентов использовали ароматические и алифатические амины: бензил амин (БА), 1,2-дифенилэтилендиамин (ДЭД), о-фенилендиамин (о-ФДА) и этилендиамин (ЭДА).

Твердофазный флуоресцентный биосенсор на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой.

Распространешшй подход при создании флуоресцентных сенсоров заключается во введении в их чувствительный слой соединений, обладающих сильной собственной флуоресценцией и последующем обратном определении компонентов индикаторной системы. Чувствительный слой разработанного нами твердофазного биосенсора представлял собой смесь хитозана, меченного флуоресцентной меткой, и фермента. При ферментативном окислении фенольных соединений интенсивность флуоресценции чувствительного слоя биосенсора уменьшалась пропорционально содержанию аналита (рис. 8). При этом при выдерживании биосенсора на основе пероксидазы в растворе, содержащем только фенольное соединение (т.е. в отсутствие пероксида) или только пероксид водорода (в отсутствие фенольного соединения), флуоресценция не уменьшалась. Аналогичные

закономерности были получены при окислении ПК пероксидом водорода в растворе в присутствии пероксидазы и родамина Б, а также при использовании вместо хитозана водорастворимого полимера полиаллиламина, меченного флуоресцентной меткой.

Рис. 8. Спеюры флуоресценции чувствительного слоя флуоресцентного биосенсора на основе хитозана после выдерживания в реакционной системе при разных концентрациях ПК: (1) 0, (2) 1, (3) 3, (4) 5 мкМ; Условия реакции: и(пероксидаза) = 0.1 у.е., с(Н202) = 100 мкМ, 0.05 М фосфатный буферный раствор рН 6.5, время реакции 10 мин, 550 нм

Определение фенольных соединений Первым этапом работы был выбор условий регистрации максимального отклика чувствительного слоя биосенсора в присутствии аналитов. Для этого изучили зависимость аналитического сигнала от соотношения компонентов в реакционной системе: концентрации хитозана, флуоресцентной метки, фермента, пероксида водорода, толщины пленки, концентрации и рН буферного раствора, длин волн возбуждения и испускания. Оптимальные условия функционирования биосенсоров на основе разных ферментов приведены в табл. 3.

Таблица 3. Оптимальные условия определения пирокатехина с использованием биосенсоров на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой.

Параметр Пероксидаза Лакказа Тирозиназа

и(Е), у.е. 0.10 0.25 2.5

с(Н202), мкМ 100 - -

Концентрация и рН буферного раствора 0.05 M Фосфатный буферный раствор pH 7.5

с(хитозан), % по Массе 1

с(СНзСООН), % по объему 0.5

ш(хитозан), мг-см" 0.4

ш(РБИТЦ), иг-см'2 25

У(хитозан-псроксидаза), мкл 200

Объем реакционной смеси, мл 5

Время реакции, мин 10 15 15

Хех, НМ 550

Хет> НМ 575

Ранее для определения фенольных соединений и флавоноидов различного строения в лаборатории кинетических методов кафедры аналитического химии МГУ им. М.В. Ломоносова был разработан твердофазный спектрофотометрический бйосенсор на основе пленок {хитозан-пероксидаза}, закрепленных на поверхности стекла. Его действие основано на последовательном протекании двух сопряженных реакций: ферментативного окисления фенольного соединения и химического взаимодействия продуктов окисления с хитозаном с образованием окрашенного

соединения. В результате изучения сорбции компонентов чувствительных слоев спекірофотометрического и флуоресцентного сенсоров при различных температурах установлено, что их отклики формируются в результате протекания преимущественно химических и физических взаимодействий, соответственно.

Один из подходов к повышению эффективности сорбции заключается в изменении объема реакционной системы (при постоянной концентрации сорбируемого соединения). Для обоих сенсоров нами рекомендован объем индикаторной системы 5 мл.

С использованием пероксидазного сенсора разработаны методики определения ПК, РЗ, ГХ, ДА и АД, а с использованием лакказного и тирозиназного - только ПК, РЗ и ГХ, т.е. только простейших изомерных фенольных соединений (табл. 4).

Таблица 4. Метрологические характеристики методик определения дигидроксифенолов и катехоламинов с использованием биосенсоров на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой.

Определяемое соединение Диапазон линейности, мкМ Сщїп» мкМ вДприСн, „ - 4, р = 0.95)

Пероксидазный

ПК 0.5-5.0 0.10 0.04

РЗ 0.5-7.5 0.15 0.03

ГХ 0.20 0.03

ДА 5.0-50.0 2.0 0.05

АД 1.5 0.06

Лакказный

ПК 0.5-5.0 олоЛ 0.03

РЗ 0.5-7.5 0.15 0.04

ГХ 0.20 0.04

Тирозиназный

ПК 0.5 - 5.0 0.10 0.05

Как и ожидалось, тирозиназный сенсор не давал отклика в присутствии РЗ и ГХ, что, очевидно, связано с тем, что тирозиназа катализирует окисление только п-замещенных фенольных соединений. Тем не менее, следует отметить, что вследствие эффекта субстрат-субстратной активации использование тирозиназы вместо пероксидазы не позволяло селективно определять ПК в присутствии ГХ и РЗ.

Отклик чувствительного слоя сенсора аддитивен при концентрациях аналитов, входящих в диапазоны линейности градуировочных графиков. Поскольку коэффициенты чувствительности определения различаются по величине, информация, полученная при анализе объекта, одновременно содержащего смесь фенолов, позволяет сделать вывод лишь об их суммарном содержании в образце.

Таким образом, разработанные биосенсоры на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой, могут быть использованы при анализе объектов, содержащих только одно фенольное соединение (например, фармацевтических и косметических препаратов), либо для оценки их суммарного содержания в анализируемом образце (в промышленных и сточных водах), а также при проведении анализа с использованием совокупности сенсоров, основанных на разных индикаторных реакциях. Анализ более сложных смесей (биологических жидкостей)

требует создания более чувствительных, селективных и стабильных индикаторных систем.

Определение пероксидов Отклик чувствительного слоя флуоресцентного сенсора на основе пероксидазы пропорционален концентрации не только восстановителя - фенольного соединения, но и окислителя - пероксида водорода. Вследствие этого перспективно его применение для определения пероксидов различного строения, в том числе органических. В качестве субстрата-восстановителя использовали ПК (фенольное соединение с наибольшим коэффициентом чувствительности определения) при концентрации 2.5 мкМ, соответствующей середине диапазона линейности.

Установили, что оптимальные условия определения всех пероксидов были одинаковыми. Метрологические характеристики методик определения ряда пероксидов с использованием спектрофотометрического и флуоресцентного биосенсоров приведены в табл. 5.

Таблица 5. Метрологические характеристики определения пероксидов в водной среде с использованием оптических биосенсоров на основе хитозана._

Определяемое соединение Диапазон линейности, мкМ Сгшп* мкМ Бг(прИ С„, п = 4, Р = 0.95)

Флуоресцентный биосенсор

Пероксид водорода 10-100 7 0.08

Пероксид мочевины 10-100 5 0.06

2-Бутанонпероксид 10-250 7 0.05

Бензоилпероксид 25 -100 10 0.06

тре/я-Бутилгидропероксид 250-1000 100 0.10

Спектрофотометр ический биосенсор

Пероксид водорода 100-1000 45 0.08

Пероксид мочевины 25-250 10 0.08

2-Бутанонпероксид 100 - 1000 40 0.08

Бензоилпероксид 50-750 45 0.07

/ярею-Бутилгидропероксид 250-25000 230 0.07

По чувствительности и воспроизводимости результатов определения органических пероксидов флуоресцентный биосенсор сопоставим с описанными в литературе аналогами, в том числе твердофазным спектрофотометрическим биосенсором на основе хитозана (несколько превосходя последний). При этом существенное преимущество твердофазного флуоресцентного биосенсора по сравнению со спектрофотометрическим аналогом заключается в меньшем времени анализа (15 мин вместо 24 ч).

С целью повышения чувствительности определения пероксидов решили проводить индикаторную реакцию в среде прямых и обращенных мицелл ПАВ, что позволило бы увеличить активность фермента за счет изменения его конформации и доступности активного центра, а также увеличить выход продукта окисления ПК. Кроме того, использование мицеллярных сред позволило бы увеличить аналитический сигнал вследствие повышения растворимости малорастворимых аналитов. Введение молекул ПАВ в' раствор флуорофора может сопровождаться увеличенйек шггенсивностй флуоресценции в результате его включения в мицеллу и

уменьшения числа его вращательных степеней свободы, что понижает долю безызлучательных переходов. Поскольку действие биосенсора на основе меченого хитозана основано на тушении собственной флуоресценции чувствительного слоя, введение молекул ПАВ могло как повысить, так и понизить чувствительность определения (вследствие наличия в системе двух конкурентных процессов). Следовательно, требовалось разделить вклад каждого процесса в формирование аналитического сигнала. По этой причине изучили возможность использования мицеллярных сред параллельно для флуоресцентного и спектрофотометрического сенсоров.

Как и ожидалось, использование флуоресцентного биосенсора в мицеллярных средах сопровождалось существенным по сравнению с немицеллярной системой (до 2 раз в случае мицелл на основе ДДС) увеличением интенсивности собственной флуоресценции хитозановой пленки (в том числе при проведении контрольного опыта). При этом значительно ухудшалась воспроизводимость результатов измерений (бг ~ 0.2 - 0.3 при п = 4, Р = 0.95). Рассчитанные нами метрологические характеристики методик определения пероксидов в среде прямых мицелл ПАВ с использованием спектрофотометрического биосенсора (табл. 6) позволили выявить следующие закономерности: в случаях всех пероксидов, кроме трет-бутилгидропероксида чувствительность определения возрастала в ряду сред ЦТАБ < немицеллярная среда < ТВИН 80 < ДДС, причем повышение чувствительности закономерно сопровождалось сужением диапазона линейности.

Таблица 6. Метрологические характеристики определения пероксидов в среде прямых мицелл ПАВ с помощью спектрофотометрического биосенсора на основе хитозана.

ПАВ Диапазон линейности, мкМ С|ТНПТ мкМ «г (при с„, п = 4, Р = 0.95)

Пероксид водорода

ЦТАБ 50-500 60 0.09

ТВИН 80 25-100 10 0.12

ДДС 10-500 7 0.09

2-Бутанопероксид

ЦТАБ 250-1000 150 0.10

ТВИН 80 25 - 500 25 0.13

ДДС 10-1000 . 10 0.09

Пероксид мочевины

ЦТАБ 50-500 50 0.09

ТВИН 80 25-500 10 0.13

дцс 10-250 5 0.10

Бензоилпероксид

ЦТАБ 100-5000 100 0.08

ТВИН 80 100-2500 45 0.07

ДЦС 25 - 500 20 0.06

/ярети-Бутилгидропероксид

ЦТАБ 2500-25000 2500 0.10

ТВИН 80 5000-25000 3500 0.07

ДДС 2500-25000 2500 0.08

Данные, полученные при изучении кинетики ферментативного окислении ПК в водной и мицеллярной средах;(в отсутствие хитозана) свидетельствуют о том, что наблюдаемые закономерности находятся в соответствии с изменением субстратной специфичности фермента (характеризующейся величиной кк^/Кщ) к определяемым пероксидам- Следует отметить, что даже при проведении индикаторной реакции в среде, прямых мицелл, ПАВ чувствительность спекгрофотометрического биосенсора уступает;, чувствительности флуоресцентного биосенсора в немицеллярной среде. Использование последнего в среде прямых мицелл ПАВ представляется на наш взгляд нецелесообразным из-за низкой чувствительности определения и высокой погрешности результатов измерений.

***

• • Таким образом, аналитические характеристики разработанного нами биосенсора на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой, сопоставимы с характеристиками сенсоров, описанных в литературе. При этом значительное преимущество предложенного сенсора заключается в том, что использованная при его создании методика формирования и измерения аналитического сигнала позволяет проводить анализ негомогенных и непрозрачных сред. Достигаемая чувствительность и селективность определения остаются недостаточными для решения некоторых важных аналитических задач, например определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях. Как показал анализ литературных данных, прямые индикаторные системы, основанные на образовании флуоресцирующих (или окрашенных) производных характеризуются большей чувствительностью и селективностью анализа, чем обратные. Перспективным для определения КА представляется подход, основанный на измерении флуоресценции их дериватнзатов. На следующем этапе работы этот подход был использован для создания прямого флуоресцентного биосенсора.

Твердофазный флуоресцентный биосснсор на основе ароматических н алифатических аминов, иммобилизованных в пленках природных полимеров

Перспективными дериватизирующими агентами, обеспечивающими чувствительное и селективное определение фенольных соединений по флуоресценции их производных, являются ароматические и алифатические амины, в особенности БА и ДЭД (соответствующие методики позволяют селективно определять катехоламины и их метаболиты на пМ - нМ уровне концентраций). Продукты дериватизации катехоламинов и их метаболитов с БА и ДЭД характеризуются1 максимумами флуоресценции в области 450 - 500 нм (при ~ 350 нм). Использование твердофазпого сенсора предложенной нами конструкции по инструментальным причинам невозможно при Т^т < 500 нм. Однако при измерении аналитического сигнала на поверхности максимум флуоресценции может смещаться^ как в более коротковолновую, так и в более длинноволновую области относительно положения того же максимума в растворе. По этой причине для выбора подходящего дерйватизирующего агента при проведении реакции в твердофазном (сенсорном), варианте предварительно изучили в том числе и возможность применения Б А и ДЭД.

Определение фенольных соединений

Показали, ¡.¿Что максимум флуоресценции продуктов ферментативной дериватизации АД с Б А на поверхности сенсора смещается в коротковолновую область спектра относительно максимума, зарегистрированного в растворе. Форма и

положение максимумов флуоресценции зависят от дайны волны возбуждающего излучения при измерении сигнала на поверхности и не зависят при измерении сигнала в растворе. Следовательно, максимумы флуоресценции, зарегистрированные на поверхности, могут быть обусловлены как полезным аналитическим, так и фоновым сигналом. При регистрации спектров флуоресценции на поверхности фоновый сигнал имел значительную величину даже в отсутствие АД. В связи с этим применение БА и ДЭД в качестве дериватизирующих агентов сочли технологически нецелесообразным. Для дальнейшей работы в качестве дериватизирующих агентов использовали о-ФДА и ЭДА, дериватизаты которых флуоресцируют в области 500 -600 нм; и интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации фенольных соединений. Спектры возбуждения и флуоресценции симметричны, а положение максимумов флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего излучения.

Для получения наибольшего количества флуоресцирующего аддукта в чувствительном слое биосенсоров оптимизировали условия формирования аналитического сигнала (концентрацию фермента, пероксида водорода, дериватизирующего агента, время реакции, pH и концентрацию буферного раствора). В случае биосенсора, содержащего иммобилизованный о-ФДА, в качестве модельных фенольных соединений использовали простейший изомерный дигидроксифенол (ПК), катехоламины (ДА, АД) и их метаболиты (ГВК, ВМК). В случае биосенсора, на основе ЭДА, ограничились определением ПК, ДА и АД (табл. 7).

Таблица 7. Метрологические характеристики определения фенольных соединений с использованием биосенсоров на основе о-ФДА и ЭДА.

Определяемое соединение Диапазон линейности, Cmln» нМ Sr(npH с„, п = 4, Р = 0.95)

А приватизирующий агент - о~ФДА

ПК 50.0-500.0 200 0.03

ДА 25.0-500.0 70 0.03

АД 10.0-250.0 50 0.04

ГВК 1.0-25.0 5 0.03

ВМК 0.5 -10.0 3 0.03

Дериватизирующий агент — ЭДА

ПК 5.0-100.0 3.0 0.04

ДА 5.0-50.0 2.5 0.06

АД 2.5 -100.0 1.5 0.08

Чувствительность и воспроизводимость результатов измерений, а также экспрессность анализа существенно увеличивались при переходе от измерения сигнала в растворе к измерению сигнала на поверхности, а также при замене ЭДА на о-ФДА. Так, биосенсор на основе о-ФДА позволяет определять катехоламины и их метаболиты на нМ уровне концентраций, что достаточно для определения этих соединений в биологических жидкостях человека. При этом время реакции, необходимое для достижения 90% величины аналитического сигнала, , не превышает 30 с. Биосенсор на основе ЭДА позволяет определять фенольные соединения на мкМ уровне концентраций, а время реакции составляет от 2 до 15 мин. Отклик чувствительного слоя биосенсоров на основе о-ФДА и ЭДА сохраняется на уровне 90 - 95% от первоначального в течение двух дней при 25°С и не менее 4 недель при -20 °С. При переходе от измерения аналитического сигнала в растворе к использованию биосенсоров сужается диапазон линейности, что свидетельствует о

концентрировании продуктов окисления фенольных соединений в полимерной пленке. Как и в случае описанного ранее твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе меченого хитозана, увеличение объема реакционной системы сопровождается понижением чувствительности определения и расширением диапазона линейности.

На примере анализа смесей, одновременно содержащих ДА и АД, ГВК и АД, а также ВМК и АД, установили, что как в растворе, так и при использовании биосенсора, АД значительно превосходит остальные модельных феиольные соединения по реакционной способности, вследствие чего величина аналитического сигнала в перечисленных системах не была аддитивна. Так, определение ДА, ГВК и ВМК в присутствии АД возможно только при их многократном (в 100 - 1000 раз) избытке. При одновременном введении в реакционную систему ДА и ГВК, ДА и ВМК, а также ГВК и ВМК сенсор давал аддитивный отклик. Следует отметить, что при рН 10 (оптимальном для определения ГВК) скорость реакции ферментативной дериватизации ВМК с о-ФДА настолько мала, что даже при двухкратном избытке ВМК не мешает определению ГВК. В норме содержание ГВК в биологических жидкостях превышает содержание ВМК. Следовательно, с учетом возможного разбавления анализируемого образца, а также требуемой и достигаемой чувствительности определения катехоламинов и их метаболитов биосенсор на основе о-ФДА может быть использован для индивидуального определения ГВК в крови и моче (при проведении реакции при рН 10), а также для совместного определения ГВК и ВМК в моче (при проведении реакции при рН 9.5).

Таким образом, разработанный нами биосенсор на основе о-ФДА превосходит описанные в литературе аналоги по чувствительности определения и сопоставим с ними по селективности и воспроизводимости результатов измерения, а также стабильности аналитического сигнала. Достигаемые чувствительность и селективность определения позволяют использовать предложенный биосенсор для индивидуального определения катехоламинов и их метаболитов в фармацевтических препаратах, а также для определения ГВК и ВМК в биологических жидкостях.

Определение пероксидов

Описанные в этом разделе биосенсоры были также использованы для разработки методик определения пероксидов различного строения. В качестве дериватизирующего агента использовали о-ФДА, поскольку биосенсор на его основе имел лучшие метрологические характеристики, чем биосенсор на основе ЭДА. Пероксиды определяли в водной среде и среде прямых мицелл ПАВ (табл. 8).

Таблица 8. Метрологические характеристики определения пероксидов в водной и мицеллярной средах с помощью флуоресцентного биосенсора на основе о-ФДА.

Определяемое соединение Диапазон линейности, мкМ Сщш» , мкМ ®г(нрИ Сн, п = 4, Р = 0.95)

Дероксид водорода 25-500 10 0.03

Пероксид водорода (ЦТАБ) 100-2500 90 0.15

Пероксид водорода (ТВИН) 50-500 30 0.15

Пероксид мочевины 25 - 500 15 0.05

2-Бутанонпероксид 100-1000 90 0.06

Бензоилпероксид 50-500 30 0.07

тярет-Бутилгидропероксид 50-2500 40 0.13

Установили, что проведение индикаторной реакции в мицеллярных средах не дает выигрыша в чувствительности определения пероксидов и сопровождается значительным ухудшением воспроизводимости результатов измерений.

Применение разработанных твердофазных флуоресцентных биосенсоров в анализе реальных объектов.

Флуоресцентные биосенсоры на основе меченого хитозана и о-ФДА, а также спектрофотометрический биосенсор на основе хитозана были апробированы для определения фенолышх соединений (ГХ, ДА, АД) и органических пероксидов (бензоилпероксида, пероксида мочевины) в составе косметических и лекарственных препаратов различной природы (растворимых и нерастворимых в воде). Следует подчеркнуть, что пробоподготовка ограничивалась гомогенизацией (в случае водонерастворимых препаратов) или разбавлением (в случае инъекционных растворов) анализируемого образца в воде. Результаты определения фенольных соединений в фармацевтических препаратах хорошо согласовывались с содержаниями, указанными производителем (табл. 9).

Флуоресцентный биосенсор на основе о-ФДА применили для определения конечных продуктов метаболизма катехоламинов (ГВК, ВМК) в моче (табл. 10). Анализ проводили способом стандартных добавок при условиях оптимальных для определения ГВК (селективное определение ГВК) и оптимальных для определения ВМК (определение суммарного содержания ГВК и ВМК). Результаты определения ГВК хорошо согласуются с данными, полученными при определении ГВК по реакции ее ферментативной дериватизации с БА в растворе способами стандартных добавок и

градуировочного графика (альтернативный метод).

***

Таким образом, в результате проведенных нами исследований предложено техническое решение для измерения интенсивности флуоресценции на твердой поверхности. Предложены новые индикаторные системы для прямого и обратного определения фенольных соединений и пероксидов различного строения; разработаны твердофазные флуоресцентные биосенсоры на их основе. Достоинствами биосенсоров являются простота их изготовления и эксплуатации. Чувствительность, селективность и экспрессность предложенных устройств достаточны для определения указанных аналитов в фармацевтической продукции и биологических жидкостях человека. Формирование и измерение аналитического сигнала вне раствора (непосредственно в чувствительном слое сенсора) позволяет анализировать непрозрачные и мутные среды и, следовательно, объекты на основе матриц сложного состава без их дополнительной пробоподготовки. Последнее достоинство выгодно отличает предложенные биосенсоры от описанных в литературе аналогов, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала в растворе.

ВЫВОДЫ

1. Предложена конструкция твердофазного флуоресцентного сенсора, основанного на формировании и измерении аналитического сигнала непосредственно- в чувствительном слое, закрепленном на поверхности подложки.

2. Предложены и описаны новые индикаторные системы для определения фенольных соединений и пероксидов различного строения: взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенолов (фермент - пероксидаза, лакказа,

Таблица 9. Результаты определения ГХ, ДА, АД, бензоилпероксида и пероксида мочевины в фармацевтических и лекарственных препаратах в водной среде (I) и в среде прямых мицелл ПАВ (II).

Тип биосенсора ? Фармацевтический препарат Определяемое соединение Найдено, % Паспортное содержание, %

I II

Спектрофотометрический биосенсор v «Ахромин» ГХ 2.1 ±0.2 - 1.9

«Базирон» Бензоилпероксид 4.8 ±0.7 4.8 ± 0.7 5.0 :

«Пероксидерм» 2.8 ± 0.4 2.5 ±0.3 2.5:

«Splat Exreem White» Пероксид мочевины 0.09 ±0.01 0.09 ±0.01 0.1

Флуоресцентный биосенсор на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой «Ахромин» ГХ 2.1 ±0.2 - 1.9-

«Допамин - Ферейн» ДА 0.53 ± 0.04 0.5

«Адреналина гидрохлорид» АД 0.1 ±0.01 0.1

«Ксилокаин - Адреналин» (5.4 ± 0.6)-10"4 5-Ю"4 -

«Базирон» Бензоилпероксид 4.7 ±0.6 5.0 v.

«Пероксидерм» 2.5 ±0.4 ■ 2.5

«Splat Exreem White» Пероксид мочевины 0.11 ±0.02 0.1

Флуоресцентный биосенсор на основе о-ФДА «Допамин - Ферейн» ДА 0.54 ± 0.07 0.5

«Адреналина гидрохлорид» АД 0.11 ±0.02 0.1

«Ксилокаин - Адреналин» (4.9 ± 0.6)-10"4 5-Ю"4

«Базирон» Бензоилпероксид 4.7 ±0.4 5.0

«Пероксидерм» 2.4 ±0.4 2.5

«Splat Exreem White» Пероксид мочевины 0.11 ±0.01 0.1

Таблица 10. Результаты определения ГВК и ВМК в моче методами стандартных добавок (I) и градуировочного графика (II) с использованием флуоресцентного биосенсора на основе о-ФДА и по реакции ферментативной дериватизации с БА.

Методика определения Определяемое соединение Найдено, мкМ

I II

Использование биосенсора на основе о-ФДА ГВК 42 ±2

ГВК и ВМК 52 ±4

Ферментативная дериватизация с БА (альтернативный способ) ГВК 41 ±2 45 ±3

тирозиназа) с хитозаном, меченным флуоресцентной меткой, сопровождающееся уменьшением интенсивности флуоресценции; реакция ферментативной дериватизации (фермент - пероксидаза) катехоламинов и их метаболитов' с о-фенилендиамином или этилендиамином с образованием флуоресцирующих производных.

3. Разработан твердофазный флуоресцентный биосенсор на основе пленок хитозана, меченного флуоресцентной меткой, содержащих иммобилизованный фермент (пероксидазу, лакказу или тирозиназу), для обратного определения фенольных соединений и органических пероксидов в диапазонах их концентраций: 0.5 — 5 мкМ (пирокатехин), 0.5 - 7.5 мкМ (резорцин и гидрохинон), 5-50 мкМ (допамин и адреналин), 10 - 50 мкМ (пероксид водорода), 10 - 75 мкМ (пероксид мочевины), 10 -100 мкМ (2-бутанонпероксид), 25 - 100 мкМ (бензоилпероксид), 250 - 1000 мкМ (/преот-бугилгидропероксид). Перечислешше соединения возможно определять индивидуально в объектах, содержащих только один аналит, либо суммарно при их совместном присутствии анализируемом образце.

4. На основе предложенной реакции ферментативной дериватизации создан твердофазный флуоресцентный биосенсор для прямого определения фенольных соединений и пероксидов в диапазонах их концентраций: 0.5 - 25 мкМ (пирокатехин),

0.25.- 20 мкМ (допамин), 0.1 - 10 мкМ (адреналин), 10 - 100 иМ (гомованилиновая кислота), 5-75 нМ (ванилилминдальная кислота), 25 - 100 мкМ (пероксид водорода и пероксид мочевины), 50 - 500 мкМ (бензоилпероксид и юрети-бутилгидропероксид), 100 - 2500 мкМ (2-бутанот1ероксид). Достигаемые чувствительность и селективность позволяют определять перечисленные соединения в фармацевтической продукции и биологических жидкостях человека.

5. Продемонстрирована возможность применения разработанных биосенсоров в анализе реальных объектов на основе матриц сложного состава, в том числе водонерастворимых (шампунях, кремах, гелях, биологических жидкостях), без предварительной пробоподготовки.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях и патентах:

1. Олейник Л.И., Веселова И.А., Родионов П.В., Будашев И.А., Шеховцова Т.Н. Оптический биосенсор на основе комплекса {пероксидаза-хитозан} для определения гидрохинона. // Зав. лаб. Диагностика материалов. 2011. Т. 77. № 4. С. 23-28.

2. Malinina LI., Rodionov P. V.. Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Novel application of chitosan. // Advances in Chitin Sciences. 2011. V. XI. P. 309 - 312.

3. Veselova I.A., Malinina L.I., Rodionov P.V.. Shekhovtsova T.N. Properties and analytical application of self-assembled complex {peroxidase-chitosan}. // Talanta.

2012. V. 102. P. 101-109.

4. Родионов П.В.. Веселова И.А., Павлова M.E., Алиева Е.А., Шеховцова Т.Н. Подходы к повышению чувствительности определения фенольных Соединений с использованием твердофазных оптических биосенсоров на основе хитозана. // Веста. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2013. Т. 54. № 3. С. 154 - 163.

5. Родионов П.В.. Веселова U.A., Шеховцова Т.Н. Оптические сенсоры для определения фенольных соединений различного строения. // Ж. аналит. химии.

2013. Т. 68. № 11. С. 1044-1055.

6. Веселова Й.А., Шеховцова Т.Н., Родионов П.В. Заявка на патент РФ № 2012155430. Способ получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов методом дериватизации. Дата подачи: 20.12.2012.

7. Веселова И.А., Шеховцова Т.Н., Родионов П.В. Заявка на патент РФ № 2013123641. Способ определения катехоламинов и их метаболитов с ' использованием твердофазного флуоресцентного • биосенсора. Дата подачи: 23.05.2013.

тезисах докладов:

8. Родионов П.В.. Олейник Л.И. Оптический сенсор на основе полиэлекгролитного комплекса {пероксидаза-хитозан} для определения фенольных соединений. // XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». г. Москва, Россия. 13-18 апреля 2009. С, 51.

9. Олейник Л.И., Родионов П.В.. Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Оптический биосенсор для определения фенольных соединений на основе полиэлектролитного комплекса {пероксидаза-хитозан}. // Тезисы международной научно-методической конференции «Химия и экология. Развитие науки и образования», г. Москва, Россия. 17—18 февраля 2010. С. 17.

10. Родионов П.В., Олейник Л.И. Подходы к повышению селективности определения фенольных соединений с использованием оптического биосенсора. // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». г. Москва, Россия. 12 -15 апреля 2010. С. 10.

11. Яблоцкий КВ., Олейник Л.И., Родионов П.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Дизайн среды, как средство управления ферментативными процессами для повышения чувствительности определения субстратов пероксидазы. II Тезисы докладов съезда аналитиков России 2010 г. «Аналитическая химия - новые методы и возможности», г. Москва, Россия. 26 - 30 апреля 2010. С. 345.

12. Родионов П.В.. Олейник Л.И., Веселова И.А, Шеховцова Т.Н. Наноструктурированные прозрачные пленки {фермент-природный полимер} как основа оптических сенсоров для определения фенольных соединений в объектах с матрицей сложного состава. // III Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. г. Москва, Россия. 1-3 ноября 2010. С. 63-64.

13. Родионов П.В.. Шеховцова Т.Н. Разработка твердофазных флуоресцентных сенсоров для определения фенольных соединений. // V Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире», г. Санкт-Петербург, Россия. 18 - 22 апреля 2011. С.36 - 37.

14. Veselova I.A,, Malinina L.I., Rodionov P.V.. Shekhovtsova T.N. Analytical application of self-assembling peroxidase-chitosan and peroxidase-gelatin films as the basis for optical biosensors. // 2nd Russian - Hellenic symposium with international participation and young scientist's scKool. Heraklion, Crete, Greece. 2011, May 5 - 12. P. 23.

15. Veselova I.A., Malinina L.L, Rodionov P.V.. Shekhovtsova T.N. Self-assembling chitosan/peroxidase films in the optical biosensor for the détermination of low water-soluble analytes in water-insoluble samples. // lOth International conférence of the European Chitin Society. St.-Petersburg, Russia. 2011, May 20 - 24. P. 64.

. 16. Veselova I., Yablotskiy K., Malinina L., Rodionov P.. Shekhovtsova Г. Sensitive fluorescent determination of peroxidase substrates in aqueous-organic and micellar media. // Euroanalysis 2011, 16th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». Belgrade, Serbia. 2011, September 11 -15. P. 27.

17. Rodionov P.. Veselova I., Shekhovtsova T. A solid-phase Optical biosensor for the determination of phenolic compounds. // Euroanalysis 2011,16th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». Belgrade, Serbia. 2011, September 11-15. P. 155.

18. Веселова И.А., Кирейко A.B., Малинина JI.K, Родионов П.В.. Шеховцова Т.Н. Пероксидаза в надмолекулярных ансамблях с полиэлектролитами и поверхностно-активными веществами: свойства и применение в анализе объектов со сложной матрицей. // 5-ая Биотехнологическая выставка-ярмарка РосБиоТех-2011. Международная научно-практическая конференция: «Нанобиоматериалы: Современные достижения и токсилогические вопросы безопасности», г. Москва, Россия. 31 октября 2011. С. 21 - 22.

19. Ахметзянова Л.Р., Родионов П.В. Твердофазный флуоресцентный оптический биосенсор для прямого определения фенольных соединений и катехоламинов . // XIX Молодежная научная конференция «Ломоносов-2012». г. Москва, Россия. 9

- 13 апреля 2012. С. 7.

20. Shekhovtsova Т., Veselova I., Malinina L., Yablotskiy К., Rodionov P. Analytical application of self-assembled {peroxidase-chitosan} films as the basis for optical biosensor in aqueous - organic and micellar media. // BIT'S 3rd Symposium on Enzymes and Biocatalysis. Xian, China. 2012, April 25 - 28. P. 148.

21. Veselova I.A., Malinina L.I., Rodionov P.V.. Shekhovtsova T.N. Self-assembling peroxidase chitosan structure as the basis of optical sensor films for determination of physiologically active compounds. // 9th International Symposium on Polyelectrolytes

- ISP. Lausanne, Switzerland. 2012, July 9 - 12. P. 51.

• 22. Веселова И.А., Малинина Л.И., Родионов П.В., Борзенкова Н.В., Буслова Т.С., Шеховцова Т.Н. Оптические биосенсоры для определения биологически активных соединений в матрицах сложного состава. // Всероссийская конференция по аналитической спектроскопии с международным участием, г. Краснодар, Россия. 23 - 29 сентября 2012. С. 318.

23. Родионов П.В.. Ахметзянова Л.Р., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Твердофазный флуоресцентный биосенсор на основе комплекса {фермент-хитозан} для определения биологически активных фенольных соединений. // Всероссийская конференция по аналитической спектроскопии с международным участием, г. Краснодар, Россия. 23 - 29 сентября 2012. С. 335.

24. Алиева Е.А., Родионов П.В. Сорбция фенольных соединений в чувствительном слое твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе хитозана. // XX Молодежная научная конференция «Ломоносов-2013». г. Москва, Россия. 8-13 апреля 2013. С. 2.

" 25. Павлова М.Е., Родионов П.В. Подходы к повышению чувствительности определения фенольных соединений с использованием твердофазного спекгрофотометрического биосенсора на основе полиэлектролитного комплекса

.. {хитозан-пероксидаза}. // XX Молодежная научная конференция «Ломоносов-2013». г. Москва, Россия. 8-13 апреля 2013. С. 78.

26. Veselova I.A., Rodionov P.V., Malinina L.I., Borzenkova N.V., Shekhovtsova T.N. Optical biosensors for the determination of biologically active compounds in samples with complex matrices. // 3rd International Conference on Bio-Sensing Technology. Spain, Sitges. 2013, May 12 - 15. P. 82.

27. Rodionov P. V. Veselova I.A., Shekhovtsova T. N. The solid-phase fluorescent optical biosensors for direct and indirect determination of biologically active phenolic compounds. // International conference «Biocatalysis 2013». Moscow, Russia. 2013, July 2-5. P. 51.

28. Rodionov P.. Veselova I., Alieva E., Shekhovtsova T. The solid-phase optical biosensors for the determination of organic peroxides in aqueous and micellar media. // Euroanalysis 2013, 17th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». Warsaw, Poland. 2013, August 25 - 29. P. 244.

29. Rodionov P.. Veselova I., Buslova Т., Sokolova L., Pirogov A., Shekhovtsova T. Application of enzymatic derivatization of catecholamines // Euroanalysis 2013, 17th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». Warsaw, Poland. 2013, August 25 - 29. P. 245.

30. Веселова И.А., Родионов П.В.. Борзенкова Н.В., Буслова Т.С., Малинина Л.И., Шеховцова Т.Н. Новые индикаторные системы и устройства для ферментативного определения биологически активных соединений. II съезд аналитиков России, г. Москва, Россия. 23 - 27 сентября 2013. С. 467.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракт ЖП991 от 27.05.2010 и соглашение 8448 от 31.08.2012) и РФФИ (проекты Ж9-03-00823-а и 12-03-00249-а). Автор выражает искреннюю благодарность д.х.н., проф. М.А. Проскурнину и к.х.н., доценту А.Г. Борзенко за ценные советы при разработке конструкции твердофазного флуоресцентного сенсора; кх.н. А.С. Малинину за помощь в синтезе хитозана, меченного флуоресцентной меткой; к.х.н. В.В. Апяри за ценные замечания при изучении сорбции фенольных соединений и продуктов их окисления хитозановыми пленками.

Отпечатано в копицентре «СТПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495) 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 08.11.2013 г.

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет Кафедра аналитической химии

На правах рукописи

04201365268

Родионов Павел Валерьевич

ТВЕРДОФАЗНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОРГАНИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДОВ

02.00.02 -Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: проф., д.х.н. Шеховцова Т.Н.

Москва - 2013

Оглавление

Список сокращений, используемых в работе..............................................................................4

Введение..................................................................................................................................................................................5

Обзор литературы......................................................................................................................................................10

Глава 1. Общие сведения о сенсорах....................................................................................................11

Глава 2. Оптические сенсоры для определения фенольных соединений...................................................................................

2.1. Конструкция сенсоров и формирование аналитического сигнала..................15

2.2. Метрологические характеристики оптических сенсоров, время

отклика чувствительного слоя, стабильность аналитического сигнала..............23

2.3 Применение оптических сенсоров в анализе реальных объектов........................23

Глава 3. Оптические сенсоры для определения пероксида водорода и

органических пероксидов..............................................................................................................................35

Глава 4. Подходы к флуориметрическому определению катехоламинов

и их метаболитов......................................................................................................................................................................40

4.1. Определение катехоламинов и их метаболитов по флуоресценции их производных..............................................................................................................................................................41

4.2. Дериватизация катехоламинов и их метаболитов с использованием ароматических и алифатических аминов........................................................................................51

Экспериментальная часть..................................................................................................................................56

Глава 5. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методики

эксперимента, обработка результатов измерений................................................................56

5.1. Исходные вещества....................................................................................................................................56

5.2. Посуда и аппаратура................................................................................................................................58

5.3. Методики эксперимента........................................................................................................................59

5.4. Обработка результатов измерений................................................................................................66

Обсуждение результатов......................................................................................................................................69

Глава 6. Обоснование выбора конструкции сенсора и индикаторных систем.........................................................................................

6.1. Выбор конструкции твердофазного оптического сенсора..........................................69

6.2. Выбор индикаторных систем................................................................................................................81

Глава 7. Твердофазный флуоресцентный биосенсор на основе хитозана, меченного флуоресцентной меткой.......................................................... 86

7.1. Определение фенольных соединений............................................ 87

7.1.1. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции и формирования аналитического сигнала............................................ 87

7.1.2. Изучение сорбции фенольных соединений и продуктов их окисления хитозановой пленкой..................................................... 95

7.1.3. Аналитические характеристики биосенсора................................. 104

7.2. Определение пероксида водорода и органических пероксидов............ 107

7.2.1. Оптимизация условий формирования аналитического сигнала в водной среде и метрологические характеристики биосенсора.................. 107

7.2.2. Определение органических пероксидов в среде прямых и обращенных мицелл ПАВ.............................................................. 109

Глава 8. Твердофазный флуоресцентный биосенсор на основе

ароматических и алифатических аминов, иммобилизованных в

пленках природных полимеров....................................................... 121

8.1. Получение флуоресцирующих производных замещенных о-дигидроксифенольных соединений с о-ФДА и ЭДА в растворе............. 123

8.2. Получение флуоресцирующих производных о-дигидрокси-фенольных соединений с о-ФДА и ЭДА в чувствительном слое сенсора и оптимизация условий формирования аналитического сигнала................. 134

8.3. Аналитические характеристики методик определения фенольных соединений по реакции их ферментативной дериватизации с о-ФДА и ЭДА в растворе и на поверхности..................................................... 147

8.4. Определение пероксида водорода и органических пероксидов с использование твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе о-ФДА.......................................................................................... 155

Глава 9. Применение разработанных твердофазных флуоресцентных

быосенсоров в анализе реальных объектов........................................ 157

Выводы......................................................................................... 162

Приложения.................................................................................... 164

Список литературы............................................................................. 204

Список сокращений, используемых в работе

CAPS - 3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновая кислота; СиТАФЦ - тетрааминофталоцианин меди;

АБТС - 2,2'-азидо-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота); АД - адреналин;-БА - бензиламин;

ВМК - ваниллилминдальная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГВК - гомованиллиновая кислота;

ГФПК - 3-(п-гидроксифенил)пропионовая кислота;

ГХ - гидрохинон;

ГЭКМЦ - гидроксиэтилкарбоксиметилцеллюлоза; ДА - допамин;

ДБТМБ - МДЧ-дибензил-3,3',5,5'-тетраметилбензидин; ДДС - додецилсульфат натрия; ДМСО - диметилсульфоксид;

ДТПП - 5-и-[[4-(10'15'20'-трифенил-5-порфинато)фенилоксил]-1-бутилоксил] фенил-10,15,20-трифенил-порфирин; ДЭД- 1,2-дифенилэтилендиамин;

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования;

КЭ - капиллярный электрофорез;

МАЭК - 3-(1Ч-метакрилоил)амино-9-этилкарбазол;

МБТГ - З-метил-2-бензотиазолингидразон;

ОФОДЭ - октадецилат флуоресцеиноктадецилового эфира;

ПАВ - поверхностно активное вещество;

ПАЭАН - 1Ч-пропил-4-(Ъ1-акрилоксиэтил)амино-1,8-нафталимид;

ПБ - пиронин Б;

ПВС - поливиниловый спирт;

ПВХ - поливинилхлорид;

ПГЭА - поли(2-гидроксиэтилакрилат);

ПГЭМА - поли-2-гидроксиэтилметакрилат;

ПДДА - полидиметилдиаллиламмония хлорид;

ПДМС - полидиметилсилоксан;

ПК - пирокатехин;

РБИТЦ - родамина Б изотиоцианат;

РЗ - резорцин;

ТГКАЛ4 - 25,26,27,28-тетрагидроксикаликс[4]арен; ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин; ТМОС - тетраметилортосиликат; ТТА - теноилтрифторацетон;

ФБГХ - 2,2'-(1,4-фенилендивинилен)бис-8-гидрохинолин;

0-ФДА - о-фенилендиамин;

ФИТЦ - флуоресцеина изотиоцианат;

ФОДЭ - флуоресцеиноктадециловый эфир;

ЦД - циклодекстрин;

ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид;

ЭДА - этилендиамин;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Введение

Актуальность работы. Совершенствование сенсорных технологий представляет собой активно развивающееся направление современной аналитической химии. Перспективность применения сенсорных устройств в практике химического анализа обусловлена рядом их преимуществ по сравнению с традиционными аналитическими методиками (спектрофотометрическими, хроматографическими, электрохимическими и т.д.): экспрессностью и экономичностью анализа, технологической и методической простотой, отсутствием необходимости привлечения высококвалифицированного персонала. Кроме того, сенсоры могут работать автономно без вмешательства оператора, а также в ряде случаев могут быть использованы во внелабораторном анализе при отсутствии сложного оборудования. Важное требование, предъявляемое к химическим сенсорам, заключается в том, что отклик их чувствительного слоя должен быть пропорционален только концентрации определяемого соединения (или нескольких соединений при их групповом определении). При этом компоненты матрицы анализируемого образца не должны оказывать влияния на результаты измерения аналитического сигнала. Однако, как правило, реальные объекты, представляющие наибольший аналитический интерес, имеют матрицы сложного состава (например, биологические жидкости), в том числе нерастворимые в воде (в частности, многие косметические и лекарственные препараты). Компоненты этих матриц могут не только вносить погрешности в результаты измерения, но и в ряде случаев делают процедуру анализа неосуществимой. По этой причине часто при анализе реальных объектов возникает необходимость дополнительной пробоподготовки анализируемого образца с использованием токсичных или агрессивных органических растворителей, фильтрования, разделения, что существенно увеличивает погрешность результатов измерений, время анализа, а также усложняет его выполнение. Перспективный подход для решения перечисленных проблем заключается в создании твердофазных сенсоров, основанных на формировании и измерении аналитического сигнала не в анализируемом растворе, а непосредственно на поверхности сенсора — в его чувствительном слое.

Актуальной аналитической задачей остается определение фенольных

соединений и пероксидов различного строения в объектах на основе матриц сложного состава (биологических жидкостях и лекарственных препаратах). В настоящее время большинство существующих твердофазных сенсоров для определения указанных соединений основано на электрохимической регистрации аналитического сигнала. Созданию твердофазных оптических сенсоров посвящены единичные публикации, причем существующие сенсоры являются исключительно спектрофотометрическими, а их чувствительность, селективность и особенно экспрессность недостаточны для решения многих аналитических задач. В то же время использование новых индикаторных систем и способов измерения аналитического сигнала (в частности флуоресцентное детектирование) должны значительно улучшить аналитические характеристики и расширить возможности использования твердофазных оптических сенсоров в химическом анализе.

Цель работы - создание твердофазных флуоресцентных ферментативных сенсоров, действие которых основано на формировании и измерении и измерении аналитического сигнала непосредственно в чувствительном слое, закрепленном на поверхности подложки, для определения фенольных соединений и пероксидов различного строения в матрицах различного состава.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• предложить конструкцию флуоресцентного сенсора, позволяющую регистрировать аналитический сигнал вне раствора;

• выбрать индикаторные системы для твердофазного определения фенольных соединений и пероксидов; разработать методики определения перечисленных аналитов.

• продемонстрировать возможность использования разработанных биосенсоров в анализе реальных объектов различной природы, в том числе водонерастворимых (фармацевтических и лекарственных препаратов, биологических жидкостей человека).

Научная новизна. Предложена простая конструкция твердофазного флуоресцентного биосенсора: полимерная пленка, закрепленная на поверхности подложки (стекла), содержащая иммобилизованные компоненты индикаторной системы. Для измерения интенсивности флуоресценции чувствительного слоя

биосенсор устанавливается в юоветном отделении флуориметра перед отражающей поверхностью (зеркалом); аналитический сигнал регистрируется в режиме отражения. Предложены новые индикаторные системы для определения фенольных соединений и пероксидов различного строения, основанные на:

• взаимодействии продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (ферменты - пероксидаза, лакказа или тирозиназа) с хитозаном, меченным флуоресцентной меткой (родамина Б изотиоцианатом), и уменьшении интенсивности флуоресценции (обратное определение); в взаимодействии продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (фермент - пероксидаза) с дериватизирующими агентами (о-фенилендиамином, этилендиамином) с образованием флуоресцирующих аддуктов (прямое определение).

Разработаны методики определения фенольных соединений и органических пероксидов в объектах на основе матриц сложного состава с использованием твердофазных флуоресцентных сенсоров на основе ферментов-оксидоредуктаз (пероксидазы, лакказы, тирозиназы), иммобилизованных в хитозановые пленки, не требующие предварительной пробоподготовки анализируемого образца. По чувствительности и экспрессности определения предложенные биосенсоры превосходят описанные в литературе твердофазные спектрофотометрические аналоги, также основанные на формировании и измерении аналитического сигнала вне раствора. Установлен механизм сорбции фенольных соединений и продуктов их ферментативного окисления хитозановой пленкой при условиях, оптимальных для функционирования биосенсоров. Изучено влияние ПАВ различной природы на интенсивность сигнала биосенсоров. В результате проведенных исследований показана возможность целенаправленного варьирования аналитических характеристик методик определения перечисленных аналитов с использованием разработанных биосенсоров.

Практическая значимость. Предложено техническое решение для измерения аналитического сигнала (интенсивности флуоресценции) на твердой поверхности. Разработаны методики определения простейших изомерных дигидроксифенолов (пирокатехина, резорцина, гидрохинона) и катехоламинов (допамина, адреналина) в водной среде в диапазоне их концентраций 0.5 - 25 мкМ

и 5 - 150 мкМ, соответственно, с помощью твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе пероксидазы, лакказы или тирозиназы, иммобилизованных в пленке хитозана, меченного флуоресцентной меткой (обратное определение). Достигнутые чувствительность и селективность позволяют определять перечисленные соединения в объектах, содержащих только одно фенольное соединение, либо оценивать их суммарное содержание в анализируемом образце. Разработаны методики чувствительного и селективного определения замещенных о-дигидроксифенольных соединений - катехоламинов (допамин, адреналин) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) в водной среде в диапазоне их концентраций 0.1-5 мкМ и 5 - 250 нМ, соответственно, с помощью твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе пероксидазы и о-фенилендиамина, иммобилизованных в пленке хитозана (прямое определение). Разработаны методики определения пероксида водорода и ряда органических пероксидов (пероксида мочевины, 2-бутанонпероксида, бензоилпероксида и трет-бутилгидропероксида) на уровне их концентраций 10 мкМ - 2500 мМ с использованием обратного и прямого твердофазных флуоресцентных биосенсоров на основе пероксидазы. Предложенные методики определения простейших изомерных дигидроксифенольных соединений, катехоламинов и пероксидов апробированы в анализе фармацевтических и косметических препаратов, в том числе водонерастворимых (шампуни, кремы, мази) при их минимальной пробоподготовке, ограничивающейся гомогенизацией образца в водной среде, что позволяет расширить круг анализируемых объектов. Методики определения гомованилиновой и ванилилминдальной кислот апробированы в анализе биологической жидкости (мочи). Автор выносит на защиту:

• конструкцию твердофазного флуоресцентного биосенсора и схему регистрации аналитического сигнала.

• индикаторную систему, включающую взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенольных соединений (фермент - пероксидаза, лакказа, тирозиназа) с хитозаном, меченным флуоресцентной меткой, положенную в основу обратного твердофазного флуоресцентного

биосенсора для определения фенолов и пероксидов различного строения, позволяющего регистрировать аналитический сигнал вне раствора; данные о влиянии состава чувствительного слоя (молекулярной массы и плотности нанесения хитозана, природы и содержания фермента), а также параметров среды (концентрации и рН фосфатного буферного раствора, температуры и объема реакционной системы, природы и концентрации ПАВ) на эффективность взаимодействия продуктов ферментативного окисления фенольных соединений с меченым и немеченым хитозаном; сравнительные результаты изучения сорбции пирокатехина, гидрохинона и продуктов их ферментативного окисления хитозановой пленкой при условиях, оптимальных для функционирования твердофазного флуоресцентного биосенсора на основе меченого хитозана, а также описанного ранее твердофазного спектрофотометрического биосенсора на основе хитозана;

сравнительные данные о кинетике окисления пирокатехина пероксидом водорода и органическими пероксидами, катализируемого пероксидазой, в немицеллярной среде и среде прямых мицелл ПАВ;

индикаторную систему, включающую взаимодействие продуктов ферментативного окисления фенольных с�