Получение и использование магнитных частиц для стабилизации белков в водно-органических смесях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи

КИСЕЛЕВ Максим Всеволодович

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ (НА ПРИМЕРЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ И ос-ХИМОТРИПСИНА)

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных соединений

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук,

профессор Левашов A.B.

кандидат химических наук Гладилин А.К.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 1.1 Белки в водно-органических смесях б

1.1.1 Неспецифические взаимодействие фермента и 6 органического растворителя

1.1.2 Специфические взаимодействия белков с 12 органическими растворителями

1.2. Методы стабилизации белков к инактивации в водно- 15 органических системах

1.2.1 Иммобилизация белков 18

1.3 Магнитные носители для иммобилизации белков 22

1.3.1 Магнитные материалы 23

1.3.2 Способы синтеза мелкодисперсных магнитных частиц 24

1.4 Физико-химические характеристики взаимодействия 26 белок-лиганд

1.4.1 Способы расчета параметров связывания 29

1.4.2 Анализ графиков в координатах Скетчарда 30

1.4.3 Анализ нелинейных графиков в координатах Скетчарда 31

1.5 Характеристика циклоспоринов 32 1.5.1. Общие сведения о цикпоспоринах 33

1.5.2 Фармакодинамика циклоспорина А 33

1.5.3 Фармакокинетика циклоспорина А 35

1.5.4 Метаболизм и элиминирование циклоспорина А 36

1.5.5 Методы анализа циклоспоринов 38

2. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ И ПОСТАНОВКА 44 ЗАДАЧИ

3. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ 46

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47 4.1. Материалы 47

4.1.1 Реактивы 47

4.1.2 Приборы и материалы 48

4.2 Методы 49

4.2.1 Получение суспензии мелкодисперсного магнетита 49

4.2.2 Получение покрытий магнитных частиц 49

4.2.3 Рентгенофазовый анализ 51

4.2.4 Интерференционная микроскопия 51

4.2.5 Квазиупругое рассеяние лазерного света 52

4.2.6 Активация полимерных покрытий магнитных частиц 52

4.2.7 Иммобилизация антител на частицах 52

4.2.8 Определение активности иммобилизованного а- 53 химотрипсина

4.2.9 Активация циклоспорина С 54

4.2.10 Получение конъюгата активированного циклоспорина 54 С с флуоресцеин- гексаметиледиамином

4.2.11 Получение конъюгата активированного циклоспорина 55 СсБСА

4.2.12 Методика проведения твердофазного 55 иммуноферментного анализа

4.2.13 Методика проведения иммунофлуоресцентного 56 анализа с использованием магнитных частиц

4.2.14 Экстракция циклоспорина А из крови пациентов 56

4.2.15 Определение концентрации циклоспорина А в 57 экстракте из крови пациентов

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58

5.1 Получение мелкодисперсного магнетита 58

5.2 Получение покрытий магнитных частиц 59

5.2.1 Гидроксиапатитное покрытие 62

5.2.2 Покрытие из окиси титана (IV) 65

5.2.3 Получение ПЭИ покрытия 68

5.2.4 Покрытие из поперечно-сшитого ПАА 68

5.3 Активация полимерных покрытий магнитных частиц 71 5.4. Иммобилизация белков на поверхности частиц 71

5.4.1 Иммобилизация на неорганических покрытиях 71

5.4.2 Иммобилизация на полимерных покрытиях 73

5.5. Свойства а-химотрипсина, иммобилизованного на 74 магнитных частицах

5.6. Стабильность иммобилизованного а-химотрипсина в 76 водно-этанольных смесях

5.7 Свойства антител, иммобилизованных на магнитных 84 частицах

5.8. Разработка метода иммуноанализа циклоспорина А в 87 этанольных экстрактах крови пациентов

5.8.1 Получение конъюгатов для иммуноанализа 87

5.8.2.Выбор концентрации органической компоненты 89

5.8.3 Подбор условий экстракции циклоспорина А из 91 образцов крови

5.8.4 Построение градуировочной зависимости 91

5.8.5 Сравнение с существующими методами 93

6. ВЫВОДЫ 95

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96

ВВЕДЕНИЕ

В последние несколько десятилетий внимание многих исследователей в области белковой химии и энзимологии сконцентрировано на проблеме стабилизации белков, главным образом ферментов и антител, в системах, содержащих полярные органические растворители. Интерес к стабильности белков в системах вода -полярный органический растворитель вызван перспективностью широкого применения таких систем для решения прикладных задач, таких как: проведение ферментативных реакций с участием гидрофобных субстратов и эффекторов, иммуноанализ и аффинная очистка соединений, нерастворимых и плохо растворимых в воде Также, проблема функционирования белков в водно-органических смесях актуальна с фундаментальной точки зрения. За годы исследований в этой области разработан ряд подходов, направленных на повышение устойчивости белков к инактивирующему и денатурирующему действиям органических растворителей. За годы исследований в области неводной белковой химии разработан целый ряд подходов, направленных на повышение стабильности белков в системах «вода - смешивающийся с водой органический растворитель». Разработанный подходы можно условно разделить на две группы: Первая - эта группа методов стабилизации, позволяющих сохранить гомогенность системы. К этой группе методов относятся введение в систему различных аддитивов, таких как полиэлектролиты и хаотропные агенты и химическая модификация белковой глобулы [1]. «Гомогенные» методы крайне удобны в фундаментальных исследованиях, например для прояснения роли воды в биокатализе, выявления данных о взаимосвязи структуры и функциональных свойств ферментов путем перехода к различным формам надмолекулярной организации биокатализаторов, не реализующимся в водных растворах. Основным недостатком таких систем является сложность разделения белка и реакционной среды.

Вторая группа методов - эта «гетерогенные» методы. Отличительной чертой этих методов является пространственное разделение белка и реакционной среды. Одним из наиболее часто

применяемых таких приемов является иммобилизация на разного рода носителях. При всех очевидных преимуществах этого подхода он имеет ряд существенных недостатков. Зачастую проведению реакций в гетерогенных системах мешают диффузионные ограничения. Уменьшение размеров носителей для увеличения скоростей протекания реакций приводит к усложнению отделения белков от реакционной среды. Таким образом, весьма актуальной представляется разработка методов стабилизации белков, позволяющих объединить преимущества как гомогенных, так и гетерогенных методов.

Одним из возможных путей решения этой проблемы является иммобилизация белков на мелкодисперсных магнитных носителях. Иммобилизация белков приводит к фиксации их активной конформации и повышению устойчивости к инактивации под действием органического растворителя; высокая дисперсность частиц позволяет избежать диффузионных ограничений при взаимодействии антитела с антигеном; магнитная восприимчивость дает возможность быстро перевести систему из микрогетерогенного (псевдогомогенного) состояния в истинно гетерогенное (твердая фаза и оптически прозрачный супернатант).

В данной работе мы предлагаем методы синтеза мелкодисперсных магнитных носителей для иммобилизации белков с целью стабилизации в водно-органических смесях и демонстрируем возможность использования таких систем в практических приложениях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Белки в водно-органических смесях

Литературные данные по поведению антител в системах «вода-смешивающийся с водой органический растворитель» крайне разрознены. Поэтому свойства природных полипептидов в водно-органических средах будут в основном рассмотрены на примере другого класса белков - ферментов, для которых накоплен существенно больший экспериментальный материал. Ферменты во многом аналогичны антителам, поскольку также являются макромолекулами связывающими лиганды, в данном случае называющиеся субстратами. Как и антитела, ферменты имеют специализированный участок - активный центр, в котором происходит связывание субстрата, предшествующее его химическому превращению.

Каталитические свойства ферментов характеризуются двумя основными параметрами: константой скорости ферментативной реакции (ккат) и эффективной константой связывания субстрата (Кт). Последняя по своему физическому смыслу аналогична константе связывания антигена с антителом.

Взаимодействия белков с органическими растворителями можно разделить на специфические и неспецифические. Ниже будут рассмотрены оба типа взаимодействия белков с органическими растворителями

1.1.1 Неспецифические взаимодействие фермента и органического растворителя .

К неспецифическому воздействию растворителей на белки можно отнести те случаи, когда изменение физико-химических свойств среды, таких как полярность и гидрофобность влияет на каталитическую активность фермента. Можно выделить ряд основных механизмов неспецифического влияния органического растворителя на каталитическую активность ферментов.

Даже небольшие изменение полярности среды могут влиять на конформацию белка [2-6]. В связи с этим, в ряде случаев изменения в

каталитических свойствах ферментов (Кт и Умакс.) [7-9] сопровождаются конформационными изменениями, за которыми можно следить физико-химическими методами.

Нарушение гидрофобных контактов и разрушение водородных связей в белках являются наиболее важными причинами денатурации [10, 11]. Изменение экспонированости гидрофобных групп белка при денатурации было зарегистрировано прямыми методами: по увеличению интенсивности полос в спектрах кругового дихроизма в области 280-300 нм, соответствующей изменению микроокружения ароматических хромофоров [12], по уширению линий в спектрах ПМР [13,14], при определении тонкой структуры комплексов методом нейтронной дифракции [15]. По уширению линий в сигналах ПМР, соответствующих различным протонам, было показано, что гидрофобное связывание спиртов и гликолей с молекулой белка дополнительно стабилизируется водородными связями, в которых принимают участие гидроксильные группы растворителей и различные функциональные группы белка [14, 16, 17]. Денатурация р-лактоглобулина в системе вода-этанол изучена методом инфракрасной спектроскопии. Нарушение гидрофобных контактов с последующей агрегацией белка предполагается как основная причина наблюдаемых изменений во вторичной структуре [18]. Методами кругового дихроизма и Фурье-спектроскпии показано, что даже невысокие концентрации органических растворителей этанола и диметилформамида (3.2-6.2 моля растворителя на 100 молей воды) вызывали изменения в третичной структуре миоглобина [19]. Предполагаемый механизм денатурации фермента связан с влиянием на гидрофобные взаимодействия в области (3-структуры и на водородные связи в области а-спиралей. Денатурация бактериородопсина изучена методами кругового дихроизма, флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии. Показано, что денатурация спиртами связана, главным образом, с разрушением внутримолекулярных водородных связей в структуре белка [20-21]. В работе [22] методом Фурье-спектроскопии изучен механизм денатурации

различных ферментов в системе вода - диметилсульфоксид (ДМСО). Предполагается, что разрушение водородных связей происходит вследствие того, что Б=0 группа в ДМСО конкурирует с пептидной группой С=0 при образовании связи с Н-1Ч. В результате этого, свободные С=0 и N-14 группы белка способны участвовать в интермолекулярных взаимодействиях, приводящим к образованию межмолекулярных р-структур и, в конечном итоге, к агрегации фермента. Отметим, что влияние органических растворителей на конформацию белка, связанное с участием молекул органического растворителя в образовании водородных связей с различными функциональными группами молекулы белка, следует отнести к условно неспецифическому, так как оно свойственно только растворителям определенного (хотя и очень широкого) круга (например, спирты, диолы, ДМСО и многие другие растворители, способные участвовать в образовании водородных связей).

Изменение каталитической активности ферментов может быть связано с влиянием среды на стадии ферментативных реакций [23]. Примером может служить изменение энергии активации реакции, в которой при образовании переходного состояния происходит перераспределение зарядов [24]. Для объяснения влияния органических растворителей на каталитический механизм ферментативных реакций были рассчитаны энергетические диаграммы на примере реакций гидролиза анилидных и эфирных субстратов, катализируемых а-химотрипсином и субтилизином. При введении в систему органического растворителя (с диэлектрической константой более низкой, чем для воды), способность среды гидратировать заряды снижается. В результате этого органический растворитель дестабилизирует соединения с низкой делокализацией заряда и мало влияет на свободную энергию соединений с высокой делокализации зарядов. Таким образом, при повышении концентрации органического растворителя в системе абсолютная величина активационного барьера

изменяется и наблюдается изменение константы скорости ферментативной реакции [25].

Изменение свойств среды может влиять на электростатические и гидрофобные взаимодействия фермента и субстратов [26, 27, 28, 30]. Связывание молекул субстрата в активном центре фермента может осуществляться за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий [29]. Сила этих взаимодействий зависит от свойств среды. Влияние растворителя на взаимодействие фермента с субстратом обусловлено, в первую очередь, электростатическими эффектами [27] вследствие изменения диэлектрической проницаемости. Изменение свойств среды может существенно влиять на связывание субстрата при образовании фермент-субстратного комплекса, что приводит к изменению величины Км [30, 31]. Характер изменения Км в водно-органических системах, в основном, определяется природой взаимодействия при образовании фермент-субстратного комплекса. В случае гидрофобной природы взаимодействия, чаще всего, наблюдается увеличение величины Км в присутствие органических растворителей [30, 32, 33]. В этом случае одним из основных механизмов изменения Км при увеличении концентрации органических растворителей является влияние органического растворителя на распределение субстрата между поверхностью фермента и объемом раствора [26]. Напротив, в случае электростатической природы взаимодействия фермент-субстрат, величина Кт может уменьшаться при переходе к водно-органическим системам [8, 34, 35, 40], так как электростатические взаимодействия усиливаются при уменьшении полярности среды.

Изменение свойств среды может влиять на константы диссоциации ионогенных групп белка, что может приводить к сдвигу рН~ оптимума каталитической активности [35], а также может вызывать изменение конформации белковой глобулы [20, 37, 38] и реакционной способности субстратов [28].

С целью обобщить и количественно охарактеризовать влияние органических растворителей на свойства ферментов были предприняты

попытки найти корелляции каталитических параметров ферментов и физико-химическими параметрами среды, такими как гидрофобность и диэлектрическая константа и другими [35, 39-42, 44, 45]. Изучению взаимосвязи полярности (параметр Рейхарда), диэлектрических констант, гидрофобности смешивающихся с водой органических растворителей и каталитических параметров ферментов посвящен ряд работ [31, 46, 47]. Для выяснения роли свойств среды в ферментативном катализе физико-химические параметры системы изменяли путем варьирования концентрации и природы органических растворителей и проводили корреляции с каталитическими свойствами ферментов. В работе [30] было изучено влияние диэлектрических констант и гидрофобности среды на каталитические константы для трех ферментативных реакции, различающихся по природе образования фермент-субстратного комплекса: а-химотрипсин-этиловый эфир 14-ацетил-1_-триптофана (главным образом, гидрофобные взаимодействия); рибонуклеаза-РНК (главным образом, электростатические взаимодействия); трипсин-этиловый эфир Ы-бензоил-Ь-аргинина (гидрофобные и электростатические взаимодействия). Была обнаружена корреляция величины 1од(Кт/кса0 с гидрофобностью среды в случае химотрипсина и трипсина (в обоих случаях при образовании фермент-субстратного комплекса важны гидрофобные взаимодействия). Однако, для этих трех систем не было обнаружено корреляции диэлектрической проницаемости среды и каталитических параметров (^ и Кт). Особенно неожиданным с теоретической точки зрения оказался результат, что изменение полярности среды не приводило к изменению Кт для системы рибонуклеаза-РНК, так как известно, что образование фермент-субстратного комплекса определяется, главным образом, электростатическими взаимодействиями. В работах [49-51] основное внимание уделялось установлению количественной взаимосвязи между физическими свойствами органических растворителей и их денатури�