Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор/октан тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КОЛЛОИДНО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СМЕСЕЙ ЛИЗОЦИМ - ПАВ В СИСТЕМЕ ВОДНЫЙ РАСТВОР/ОКТАН

специальность 02.00.11 - коллоидная химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2015

005558073

005558073

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Соболева Оксана Анатольевна,

кандидат химических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». Официальные оппоненты: Калинина Мария Александровна,

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, ФГБУН «Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина». Деркач Светлана Ростиславовна, доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Мурманский государственный технический университет». Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский химико-

технологический университет имени Д.И. Менделеева».

Защита состоится 19 марта 2015 года в 15 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.49 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: Москва, ГСП-1, 119991, Ленинские горы, дом 1, строение 3, ауд. 446.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова и на сайте химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова http://www.chem.msu.ru/.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: Москва, ГПС-1, 119991, Ленинские горы, дом 1, строение 3, Ученому секретарю диссертационного сопета Д 501.001.49 Богдановой Ю.Г.

Автореферат разослан 15 января 2015.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.49 /Богданова Ю.Г./

кандидат химических наук, доцент ^^

Общая характеристика работы Актуальность темы. Изучение адсорбции глобулярных белкой на границах раздела фаз водный раствор/органическая жидкость в присутствии поверхностно-активных веществ ПАВ актуально с точки зрения понимания ряда биологических процессов, происходящих в клеточных мембранах, и развития новых биохимических технологий в различных областях. Интерес к изучению смесей белок - ПАВ связан с широким использованием таких композиций при создании лекарственных препаратов, моющих средств, эмульсий в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Большинство результатов, полученных в последнее время, относится к изучению водных растворов смесей белок — ПАВ или их адсорбции на границе водный раствор/воздух. Система усложняется, если водная фаза граничит с органической, так как оба компонента смесей и их комплексы могут не только адсорбироваться на межфазной поверхности, но и переходить в органическую фазу. Такие двухфазные системы ближе к условиям протекания как биологических, так и ряда технологических процессов. Слабая изученность поведения смесей белок — ПАВ в системе водный раствор/органическая жидкость объясняется ограниченным набором экспериментальных методик, позволяющих получать достоверные данные об адсорбции на межфазной границе. Использование в данной работе метода сцинтиллирующей фазы с меченными тритием веществами открывает широкую перспективу получения надежных данных об адсорбции, распределении веществ в системе и, главное, о взаимном влиянии белка и ПАВ на эти свойства. Развитый в диссертации подход к изучению бинарных смесей, в котором тритиевую метку содержит поочередно один из компонентов смеси, дает информацию о взаимном влиянии веществ на их адсорбцию, распределение, состав адсорбционного слоя в широкой области концентраций, включая область низких концентраций, в которой другие методы не применимы. В последнее время разработаны методики получения, выделения и идентификации меченных тритием органических веществ различного строения, что позволило исследовать смеси глобулярного белка лизоцима (Ьг) не только с традиционными ПАВ -бромидом додецилтриметиламмония (БТАВ) и додецилсульфатом натрия (БОБ), но и с цвиттерионным ПАВ кокоамидопропил бетаином (САРВ), который в последнее время широко используется в качестве соПАВ при создании различных композиций в косметической промышленности и

моющих средствах. Сочетание методов сцинтиллирующей фазы и межфазной тензиометрии позволило впервые показать, как взаимодействия между белком и ПАВ разной природы влияют на коллоидно-химические свойства двухфазных систем водный раствор/органическая жидкость.

Цель работы: установить механизмы адсорбции и распределения смесей лизоцима и ПАВ различной природы в системе двух несмеши-вающихся жидкостей. Установить влияние взаимодействия белка и ПАВ на коллоидно-химические свойства систем водный раствор смеси Ъг -ПАВ/октан.

Для достижения поставленной цели в диссертации решались следующие задачи:

- методом сцинтиллирующей фазы определить коэффициенты распределения и величины адсорбции лизоцима и ПАВ на границе вода/октан, установить состав адсорбционных слоев;

- разработать методику получения меченного тритием цвиттерионного ПАВ кокоамидопропил бетаина;

- изучить взаимное влияние белка и ПАВ на межфазное натяжение;

- определить размер и структуру агрегатов белок - ПАВ;

- исследовать ферментативную активность лизоцима в присутствии ПАВ;

- оценить устойчивость смачивающих пленок, стабилизированных смесями лизоцим - ПАВ.

Научная новизна. Разработанный в диссертации подход, основанный на сочетании методов сцинтиллирующей фазы и межфазной тензиометрии, позволил получить уникальные данные о взаимном влиянии лизоцима и ПАВ на адсорбцию на границе водный раствор/октан, на распределение в двухфазной системе, определить состав смешанных адсорбционных слоев с ПАВ различного типа (анионного, катионного и, впервые, цвиттерионного) в широкой области концентраций. На основании сопоставления данных методов сцинтиллирующей фазы, тензиометрии, статического и динамического светорассеяния, флюоресценции, определения ферментативной активности установлены основные стадии перераспределения компонентов между контактирующими фазами и межфазным адсорбционным слоем. Выявлены области концентраций, при которых формируются гидрофобный и гидрофильный комплексы белок -ПАВ, установлена их локализация и влияние на межфазное натяжение, ферментативную активность, устойчивость смачивающих пленок.

Практическая значимость. Выявленные закономерности адсорбции глобулярных белков в присутствии других веществ на границе жидкость/жидкость могут способствовать пониманию функционирования белков в живых организмах, а также быть использованы для развития новых биохимических технологий. Данные о влиянии ПАВ на ферментативную активность Lz позволяют оптимизировать состав композиций, использующихся для создания дисперсных систем, стабилизированных смесями белок — ПАВ.

Полученные закономерности поведения смесей белок - ПАВ в системе водный раствор/органическая жидкость могут быть использованы в спецкурсах для студентов и аспирантов, специализирующихся в области коллоидной химии, биохимии, биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных мероприятиях: XVIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III конференция молодых ученых «Реология и физико-химическая механика гетерофазных систем» (Суздаль, 2011), XIX Всероссийской конференция «Структура и динамика молекулярных систем. Яль-чик 2012» (Йошкар-Ола, 2012), XX международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), IV International Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Moscow, 2013), The First Russian-Nordic Symposium on Radiochemistry (Moscow, 2013), XXI международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014» (Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в международных журналах и рекомендованных ВАК российских периодических изданиях, одна статья в рецензируемом сборнике и 7 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа объемом 135 страниц машинописного текста (127 страниц основного текста и 8 страниц приложений) состоит из введения, трех глав, содержащих 54 рисунка и 6 таблиц, выводов, списка литературы, включающего 217 наименований, и 8 приложений.

Основное содержание диссертационной работы.

Во введении кратко излагается актуальность темы, цели и задачи работы, научная новизна и практическая значимость исследования.

Первая глава представляет обзор литературы, посвященный изучению объемных и поверхностных свойств смесей белков с ПАВ различного типа. Рассмотрены современные представления о взаимодействии белков с ПАВ, структуре образующихся агрегатов и о влиянии взаимодействия на поверхностное натяжение и адсорбцию смесей белок - ПАВ на различных межфазных поверхностях. В отдельном параграфе проанализирована литература, касающаяся использования радиоактивных меток для изучения адсорбции белков и ПАВ на границе водный раствор/органическая жидкость. В заключительной части обзора рассмотрено стабилизирующее действие смесей белок - ПАВ на пены и эмульсии. Отмечается, что в научной литературе практически отсутствуют количественные данные об адсорбции смесей белок - ПАВ на границе жидкость/жидкость.

Во второй главе описаны использованные реактивы и экспериментальные методы. В эксперименте использовали лизоцим (Lz) белка куриных яиц, додецилтриметиламмоний бромид (DTAB), додецилсульфат натрия (SDS), кокоамидопропил бетаин (САРВ). В растворах поддерживали постоянную концентрацию белка-0,01, 0,1 и 1 г/л (7-Ю"7, 7-10"6, 710"5М, соответственно), концентрацию ПАВ С [М] варьировали от 10"7 до 10"2М. Все водные растворы были приготовлены в солевом фосфатном буфере, рН 7,2, ионная сила 0,15 М. В качестве органической фазы использовали октан.

Адсорбция и распределение смесей Lz - ПАВ в системе вода/октан были определены методом сцинтиллирующей фазы с использованием меченных тритием веществ. Метод основан на измерении радиоактивности двухфазной системы А и аликвоты органической фазы /„,, из которых можно рассчитать концентрацию меченного вещества в органической фазе (С„) и его адсорбцию (Г) по уравнениям:

С = ,у Г = 2/у

° 60 eVAmoC 60eSAmo¡'

где ¡v = ■ V - радиоактивность в объеме органической фазы, имп/мин,

* al

(К-объем органической фазы, мл, Va! - объем аликвоты, мл), Amot-

молярная радиоактивность меченого вещества, Бк/моль, Is = Iz-Iv-

радиоактнвность поверхностного слоя, имп/мин, 5-площадь межфазной

б

поверхности, м2, е - эффективность регистрации трития. Измерения проводили на жидкостном сцинтилляционном спектрометре Rack Beta 1215 (Финляндия). Поочередное введение тритиевой метки в белок и ПАВ позволило определить адсорбцию и коэффициент распределения D =

cw

(С,„— концентрация в водной фазе) для каждого компонента смеси, рассчитать состав адсорбционных слоев. В работе были использованы меченные тритием Lz, DTAB и SDS с молярной радиоактивностью 5,4, 3,2 и 30,0 ТБк/мОль, соответственно. Меченный тритием САРВ был получен методом термической активации трития; выделение, очистка и идентификация САРВ проведены с использованием методов тонкослойной хроматографии и экстракции. Молярная радиоактивность САРВ 23,3 ТБк/моль.

Изотермы поверхностного натяжения а(С) Lz, DTAB, SDS, САРВ и их смесей на границах водный раствор/воздух и водный раствор/октан были получены методом висящей капли.

Размер частиц и электрокинетический потенциал определяли методом динамического светорассеяния на дзета-сайзере Zeta Trac (Microtrac, США), спектры поглощения водных растворов получали на спектрофотометре Agilent 8453 (Agilent Technologies, США), спектры флюоресценции - на спектрофлуориметре FluoroMax-3 (Horiba Jobin Yvon, Франция). Влияние ПАВ на ферментативную активность лизоцима было изучено турбидиметрическим методом с использованием грам-положительных бактерий Micrococcus luteiis. Измерения проводились на двулучевом спектрофотометре UV-1601PC (Shimadzu, Япония). Активность фермента A¡_ оценивали по изменению оптической плотности (OD) суспензии клеток во

d OD

времени на начальном линейном участке, ЛЕ = ——.

Методом высокоскоростной видеосъемки (до 1000 кадр/с) была изучена кинетика растекания капли октана по пластине гидрофобизованного стекла, погруженной в водный раствор смесей Lz - ПАВ.

В третьей главе изложены результаты исследований смесей Lz-ПАВ в системе водный раствор/октан и проведено их обсуждение.

Для индивидуального лизоцима коэффициент распределения D = (З^ОДТО-4 во всем диапазоне изученных концентраций белка. D DTAB и SDS составляют (б±0,5)Т0"4 и (4,3±1,3)-10~3, соответственно.

Коэффициенты распределения лизоцима в бинарных растворах с DTAB и SDS, содержащих 0,01 г/л белка и 10"7 - 10"6М ПАВ возрастают

на 40% и 60% по сравнению с £> индивидуального лизоцима, соответственно (рнс.1). О Ьг уменьшается при концентрации ПАВ свыше 10"6М (мольное соотношение Ьг:ПАВ в системе ~1:1). Коэффициент распределения белка из смеси с концентрацией 0,1 г/л больше .О индивидуального белка на 40% (ОТАВ) и 80% (БОБ) в области концентраций ПАВ 10"7 -10"4 М. При мольном соотношении Ьг:ПАВ в системе свыше 1:10 происходит снижение I) до значений близких коэффициенту распределения индивидуального лизоцима.

Рис. 1. коэффициенты распределения лизоцима в смесях с Г)ТА В (а, б) и (в, г). Концентрация Ьг 0,01 г/л (а, в) и 0,1 г/л (б, г). Пунктирные линии — коэффициенты распределения индивидуального Ьг.

1еС, [М]

В присутствии лизоцима концентрация ОТАВ и БОБ в органической фазе заметно выше, чем в системах без белка в разбавленных растворах ПАВ. Рост концентрации ОТАВ выше 5-10"6М и БОБ выше 10"6 М приводит к снижению коэффициентов распределения до значений, соответствующих величинам В для индивидуальных ПАВ.

Рост О лизоцима в бинарных растворах может быть связан с формированием гидрофобных комплексов белок - ПАВ, обладающих большей растворимостью в органической фазе, чем нативный белок.

Добавки САРВ практически не влияют на распределение лизоцима. Коэффициент распределения САРВ в области малых концентраций ПАВ (до 10"5М) постоянен и составляет (1,1±0,3)Т0°, при дальнейшем увеличении концентрации САРВ происходит рост значений Б (рис.2). В присутствии 1.7, величины О САРВ увеличиваются примерно в два раза.

Рис.2. Зависимость коэффициента распределения САРВ от концентрации в индивидуальном растворе (♦) и в смеси с Ьг 0,01 г/л (») и 0,1 г/л (Д).

-7 6 -5 -4 -3

1вС, [М]

Рост О САРВ может быть связан с образованием обратных предмицел-лярных агрегатов в объеме органической фазы. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по изучению распределения воды в системе, содержащей САРВ. Было получено, что растворимость воды в органической фазе составляет (4,3±1,2)10 5 объемных долей, и эта величина практически не меняется при добавлении САРВ, Ьг и смеси 1л.— САРВ. Таким образом, заметной полярной области (ядра обратных мицелл) в данных условиях не образуется, однако полученный результат не противоречит предположению о формировании в октане агрегатов с меньшим числом агрегации (например, димеров САРВ).

При добавлении ОТАВ к раствору белка с концентрацией 0,01 г/л в области малых концентраций ПАВ 10"7 - 10~6 М адсорбция лизоцима в 2,5 раза выше, чем у индивидуального белка (рис.3). Для смеси \л - ОТАВ с концентрацией белка 0,1 г/л адсорбция лизоцима в диапазоне концентраций ПАВ Ш^-Ю"4 М в 4 раза выше, чем у индивидуального белка. Рост адсорбции коррелирует с увеличением растворимости Ьг в октане. При больших концентрациях ПАВ адсорбция снижается.

а) 25 ",20

б) 100

-5 -4 ^с, [МЗ

-6 -5 -4 1&С, [М1

Рис.3. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси Ьг - ОТАВ с концентрацией белка 0,01 г/л (а) и 0,1 г/л (б) от концентрации ОТАВ. Пунктирные линии - адсорбция индивидуального

Адсорбция лизоцима из смеси с SDS в области концентраций ПАВ превышает адсорбцию индивидуального белка в 1,5 раза при концентрации Lz 0,01 г/л и в 8 раз при концентрации Lz 0,1 г/л (рис.4). В последнем случае значение Г превышает величину максимальной адсорбции, получаемой . при формировании насыщенного монослоя (1,3-10~7 моль/м ). По-видимому, в данной системе образуются полимолекулярные слои. Дальнейшее увеличение концентрации ПАВ приводит к снижению адсорбции белка, однако, лизоцим остается в адсорбционном слое даже при большом избытке ПАВ в растворе.

б) 200 "i 160

а) 20 5 15

' 10 -

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -7 -6 -5 -4 -3 -2

1ВС, [М] |ВС [М]

Рис.4. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси Ьг - вБЯ с концентрацией белка 0,01 г/л (а) и 0,1 г/л (б) от концентрации БОЗ. Пунктирные линии — адсорбция индивидуального 1.2.

Во второй серии экспериментов по изучению адсорбции методом сцннтиллирующей фазы тритиевую метку содержали молекулы ПАВ. В системе Ьг - ЭТА В при концентрации лизоцима 0,01 г/л присутствие белка практически не влияет на адсорбцию ПАВ, при концентрации белка в смеси 0,1 г/л адсорбция ОТАВ возрастает (рис.5а). Рост адсорбции ОТАВ наблюдается при той же концентрации, при которой снижается адсорбция лизоцима. Вытеснение Ьг из адсорбционного слоя происходит как за счет конкурентной адсорбции с ЭТА В, так и за счет гидрофилизации комплекса - ЭТА В, происходящей при взаимодействии ПАВ с белком по механизму гидрофобного связывания. Снижение адсорбции до величин, превышающих адсорбцию индивидуального белка, указывает на незначительную гидрофилизацию лизоцима.

Добавки Ьг к раствору БОБ слабо влияют на адсорбцию ПАВ при концентрации БОБ ниже 3 ■ I О"5 М (рис.5б). При более высоких концентрациях ПАВ адсорбция БОБ из бинарного раствора превышает адсорбцию индивидуального ПАВ. В диапазоне концентраций 3-Ю"5 - 10^ М наблюдается синергетический эффект при адсорбции: адсорбция и Ьг, и БОБ превышает соответствующую величину для индивидуальных веществ.

ю

О ОД 0,2 0,3 0,4 0,5 О 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

С, ММ С, ММ

Рис.5. Изотермы адсорбции DTAB(a) и SDS (б) из индивидуального раствора (♦) и из смеси с лизоцимом с концентрацией Lz 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (А).

При добавлении как катионного, так и анионного ПАВ к раствору Lz в области низких концентраций ПАВ (до 10~6М) происходит увеличение величин Г и D белка. Полученные результаты указывают на формирование гидрофобного комплекса, растворимость которого в органической фазе и адсорбция на межфазной поверхности выше, чем у индивидуального Lz.

Формирование гидрофобного комплекса Lz - DTAB может происходить следующим образом. Молекула белка содержит в своей структуре группы -СООН и -NH2, которые в водных растворах при pH близких к нейтральным могут иметь отрицательный и положительный заряд соответственно (рис.6). В результате как катионное, так и анионное ПАВ имеют возможность взаимодействовать с лизоцимом за счет электростатического притяжения полярных групп.

Глобула лизоцима в водных растворах при pH ниже изоэлекгриче-ской точки (pl = 11) заряжена положительно. Однако, измеренные нами величины ^-потенциала показали отрицательные значения (—4,31 ±0,03 мВ). Все эксперименты в данной работе проводили в солевом фосфатном буфере с ионной силой 0,15 М, которая соответствует физиологическому раствору и создается за счет добавления NaCl. Хлорид ионы, находящиеся в большом избытке, способны адсорбироваться на поверхности белка, вызывая её перезарядку. Соответственно, возможно электростатическое при-

нейтральные й NH:: группы 9 COÜH - группы

а

щ

Рис.6. Пространственное расположение NH.,- и СООН-групп в глобуле лизоцима.

тяжение между поверхностно-активным катионом и белком. Получено, что добавки БТАВ не влияют на значение ¡¡-потенциала лизоцима во всем изученном диапазоне концентраций: ^-потенциал составляет -4,37±0,04 мВ. Это возможно, если совместно с БТА+ внутрь границы скольжения входят противоионы. В изученной системе концентрация №С1 существенно превышает концентрацию ОТАВ, поэтому в качестве противоионов могут выступать не только ВГ, но и СГ. При взаимодействии полярной группы ОТАВ с Ьъ углеводородные цепи ПАВ обращаются в сторону водного раствора, в результате чего образуется комплекс белок - ПАВ более гидрофобный, чем нативный белок.

В системах Ьг - БОБ ¡¡-потенциал частиц составляет -4,71±0,03 мВ при всех концентрациях ПАВ. Рост гидрофобности лизоцима при сохранении ¡¡-потенциала может происходить в результате замещения хлорид-анионов в двойном электрическом слое белка на анионы додецилсульфа-та.

Увеличение концентрации ПАВ в водном растворе приводит к снижению адсорбции и коэффициента распределения лизоцима. Полученные результаты могут быть связаны с гидрофилизцией комплекса Ьг-ПАВ при взаимодействии белка и ПАВ по механизму гидрофобного связывания.

В системе Ьг - ОТАВ гидрофилизация начинается при мольном соотношении ОТАВ:Ьг в водной фазе 1:1 в разбавленном растворе белка (С^ = 0,01 г/л) и при соотношении ОТАВ:Ьг = 10:1 в более концентрированном растворе (С^ = 0,1 г/л). При этом соотношение ОТАВ:Ьг в адсорбционном слое в обоих случаях близко к 10:1, поэтому можно предположить, что состав гидрофобного комплекса соответствует стехиометрии ОТАВ:Ьг= 10:1.

В системе Ьг — БОБ уменьшение адсорбции лизоцима происходит при концентрации БОБ 10"4 М, что соответствует мольному соотношению БОБ^ в водном растворе 140:1 (Си = 0,01 г/л) и 14:1 (Си = 0,1 г/л). При этом адсорбционные слои обогащены молекулами ПАВ: мольное соотношение БОБ:Ьг в слое = 300:1 (Си =0,01 г/л) и 30:1 (СЬ2 =0,1 г/л).

Рассчитанные из адсорбционных данных зависимости мольных долей ПАВ в смеси в адсорбционном слое Х$ от мольных долей ПАВ в смеси в водном растворе Ху показали, что межфазные слои обогащены молекулами ПАВ (рис.7).

Рис.7. Зависимость состава адсорбционного слоя смссн - ОТАВ (а) и — ЭОЗ (б) с концентрацией 1.2 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (Д) от состава раствора.

В системе Ьг - САРВ при добавлении ПАВ к раствору лизоцима адсорбция белка практически не меняется (рис.8). На адсорбцию САРВ присутствие белка также не влияет (рис.9)

1.Е-07

ч-

•{......1

-5 4

1бС, [М1

0,3

с, мм

Рис.9. Изотерма адсорбции САРВ из индивидуального раствора (♦) и из смеси с лизоцимом с концентрацией 0,01 г/л («) и 0,1 г/л (Д).

Рис.8. Зависимость адсорбции лизоцима из смеси \л. - САРВ с концентрацией белка 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (Д) от концентрации ПАВ. Пунктирные линии - адсорбция индивидуального Ьг.

Лизоцим при добавлении САРВ остается на поверхности и не вытесняется из межфазного адсорбционного слоя, несмотря на многократный избыток ПАВ в системе: в адсорбционном слое при концентрации, соответствующей области плато на изотерме адсорбции САРВ, мольное соотношение САРВ:Ьг ~ 100:1. Такое возможно только при сильном взаимодействии полярных групп ПАВ с белковой глобулой, в результате которого формируется гидрофобный комплекс. Этим можно объяснить и рост коэффициента распределения САРВ в присутствии Ьг.

Методом висящей капли были получены изотермы поверхностного натяжения индивидуальных белка, ПАВ, а также их смесей. Начальный участок изотерм бинарных растворов во всех системах соответствует натяжению раствора индивидуального белка. С увеличением концентрации ПАВ в системе Ьг - ОТАВ натяжение снижается при той же концентрации, что и в растворе индивидуального ОТАВ (рис.10).

Рис. 10. Изотермы поверхностного натяжения смесей Ьг - ОТАВ (а, б) и Ьг - БОБ (в, г) с концентрацией белка 0,01 г/л (♦), 0,1 г/л (Д) и 1 г/л (и) па границе водный раствор/воздух (а, в) и раствор/октан (б, г).

В системе Ьг - БОБ натяжение смешанного раствора начинает снижаться при концентрации на порядок меньшей, чем у индивидуального БОБ. Начало снижения межфазного натяжения соответствует мольному соотношению в водной фазе БББ:Ьг ~ 10:1 и 1:1 при концентрации белка 0,01 и 0,1 г/л, соответственно. При этом соотношение БОБ:Ьг в адсорбционном слое составляет 8-^9:1 в обеих системах. По-видимому, указанные соотношения БОБ:Ьг соответствуют стехиометрии гидрофобного комплекса. При концентрации ПАВ 10~5 М лизоцим сохраняет свое присутствие в адсорбционном слое, и величина его адсорбции превышает соответствующее значение для индивидуального белка. Адсорбция БОБ из бинарного раствора, начиная с концентрации ПАВ 3 • 10"5 М, увеличивается и превышает адсорбцию индивидуального БОБ. Это значит, что в области концентрации БОБ Ю^-Ю^М происходит совместная адсорбция гидрофобного комплекса Ьг — БОБ и молекул БББ. При дальнейшем увеличении концентрации БББ на изотермах поверхностного натяжения наблюдается слабо выраженное плато, что может свидетельствовать об образовании гидрофильного комплекса в водном растворе. При формировании гидрофильного комплекса адсорбция Ьг из бинарного раствора начинает снижаться.

В водном растворе смеси Ьг (1 г/л)-БОБ при концентрации ПАВ 2-10^ - 10"3 М выпадает осадок, что приводит к снижению концентрации веществ в объеме фаз и на межфазной поверхности и, как следствие, росту межфазного натяжения (рис. 11).

60

50

I 40 г

30 20 10 -0

Рис.11. Изотермы поверхностного натяжения смесей Ьг — БЭЗ с концентрацией белка 1 г/л на границе водный раствор/воздух (1) и раствор/октан (2).

-5 -4 [М]

Для индивидуальных ОТАВ и БОБ было проведено сопоставление величин адсорбции, полученных методом сцинтиллирующей фазы с адсорбцией, рассчитанной из изотерм поверхностного натяжения по уравнению Гиббса Г — — Для расчета использовали уравнение Гиббса для неионогенных ПАВ, поскольку исследуемые растворы были приготовлены в избытке электролита (ионная сила 0,15 М). Согласие расчета и эксперимента (коэффициент корреляции 0,87 (ОТАВ) и 0,95 (БОБ)) указывает на корректность полученных методом сцинтиллирующей фазы величин адсорбции (рис.12).

1-*

.-Г

л

Рис.12. Адсорбция ЭТАВ (а) и ЭИБ (б) на границе вода/октан. Пунктирные линии — расчет по уравнению Гиббса.

0,5 1,0 С, [тМ]

1.5

0,05 0,10 С, [тМ]

0,15

Натяжение смеси Ьг-САРВ (рис. 13) снижается с ростом концентрации ПАВ и выходит на плато, после чего происходит дальнейшее уменьшение натяжения до значений, характерных для индивидуального ПАВ. Вид изотерм поверхностного натяжения позволяют судить о формировании гидрофильного комплекса при концентрации выше 2-Ю"5 М (начало области плато на изотермах поверхностного натяжения).

Рис.13. Изотермы поверхностного натяжения смесей Lz — САРВ с концентрацией белка 0,01 г/л (♦) и 0,1 г/л (А)на границе водный раствор/воздух (а) и раствор/октан (б).

Для совместного описания изотерм поверхностного натяжения и адсорбции смесей белок - ПАВ была использована модель Файнермана [Pradines V., Fainernian V.B. et al. Langmuir. 2011], учитывающая, что молекулы на поверхности занимают определенную площадь и взаимодействуют друг с другом. Согласно модели, изотермы двумерного давления П = Go - и, адсорбции ПАВ и белка из смешанных растворов описываются уравнениями:

-—■ = ln(l - Qps - es) + 9ps + apse^s + as0j + 2aspseps9s,

bscs = !_gpS5_es exp{-2ases - 2aspseps},

bpscp = ~ aqexp (-2aps-^Qps - 2asps0ps], (i-eps-e,)^ }

где a„ aps, asps— параметры взаимодействия между молекулами ПАВ, комплексами белок - ПАВ и между молекулами ПАВ и комплексами белок -ПАВ, соответственно, 6S- степень заполнения поверхности молекулами ПАВ, Qps — комплексами белок —ПАВ, со и средняя площадь, приходящаяся на моль белка и растворителя в насыщенном адсорбционном слое, соответственно, м2/моль, bs и bps-константы адсорбционного равновесия, л/моль.

Для смесей Lz - DTAB и Lz - SDS получены следующие параметры (таблица 1), описывающие экспериментальные данные с коэффициентами корреляции 0,95 - 0,99. Малые отрицательные значения констант а, указывают на слабое отталкивание одноименно заряженных молекул ПАВ. Положительные значения aps и a,:ps обусловлены притяжением между комплексами белок - ПАВ и между комплексами и молекулами ПАВ. По-

16

видимому, при концентрации соли, соответствующей физиологическому раствору, дисперсионные силы притяжения между компонентами адсорбционного слоя превышают силы электростатического отталкивания.

Таблица 1. Параметры модели Файнермана.

Параметр ОТАВ-Ьг - \л.

Ьрх, л/моль (4,8±0,7)-10 (4,0±0,9)10

Ь„ л/моль (3,0±1,4)-10 (1,5±0,5)-10

Ярт 7,7±0,7 10,5±0,7

а5 -0,9±0,1 -0,4±0,2

2,7±0,4 1,8±0,5

Методом динамического светорассеяния получено, что на кривых распределения частиц по размерам в растворах Ьг наблюдается максимум при 3,5 нм, соответствующий гидродинамическому диаметру белковой глобулы. Установлено, что размер частиц практически не изменялся при добавлении ЭТА В, а также при добавлении БОБ к раствору белка с концентрацией 0,1 г/л. При добавлении БББ к раствору белка концентрацией 1 г/л начиная с концентрации БОБ 5Т0"4 М в растворе образуется осадок, препятствующий проведению измерений.

В водном растворе смесей - САРВ при концентрации ПАВ свыше 10"4 М формируются крупные агрегаты размером в десятки и сотни нанометров, которые могут быть образованы частично денатурированными молекулами белка, связанным с молекулами или мицеллами САРВ. Частичное разрушение нативной структуры лизоцима может быть вызвано как взаимодействием с цвиттерионной группой САРВ, способной нарушить систему водородных связей в белке, так и с наличием амидной группы САРВ, способной к взаимодействию с активным центром лизоцима. Кроме того, САРВ с лизоцимом может взаимодействовать и по механизму гидрофобного связывания (особенно длинноцепочечные компоненты САРВ). Крупные агрегаты начинают формироваться при той же концентрации САРВ, при которой адсорбция ПАВ достигает постоянного значения, межфазное натяжение выходит на плато, и начинается рост коэффициента распределения САРВ. По-видимому, в системе одновременно происходит несколько процессов: формирование гидрофобного комплекса - САРВ, адсорбирующегося на межфазной поверхности, и образование гидрофильного комплекса в водном растворе.

17

Анализ спектров поглощения водных растворов смесей Lz — ПАВ в области светорассеяния (при длине волны 320 нм) показывает, что для смеси Lz - SDS зависимость оптической плотности от концентрации ПАВ проходит через максимум в интервале 10"4 - 5Т0"3 М. Для смеси Lz -САРВ характерен рост оптической плотности при увеличении концентрации ПАВ, что согласуется с увеличением размера частиц в водном растворе. В системе Lz - DTAB оптическая плотность не меняется.

Спектры флюоресценции растворов смесей Lz - ПАВ, полученные при возбуждении УФ-светом с длиной волны 280 нм, имеют максимум при длине волны 342 нм. Для смеси Lz - SDS наблюдается рост интенсивности флуоресценции по сравнению с индивидуальным Lz, начиная с концентрации ПАВ 5- Ю-4 М; для смеси Lz - DTAB рост интенсивности происходит при 10"2М. Рост флюоресценции указывает на увеличение полярности микроокружения триптофановых фрагментов лизоцима, возможно, за счет взаимодействии с полярными группами ПАВ. Для смеси Lz -САРВ наблюдается тушение флуоресценции при той концентрации добавленного ПАВ, при которой в растворе появляются крупные агрегаты. Тушение флуоресценции может быть вызвано уменьшением полярности микроокружения триптофана при взаимодействии с углеводородными цепями молекул ПАВ.

При исследовании влияния ПАВ на ферментативную активность ЛЕ лизоцима по отношению к клеткам Micrococcus luteiis было установлено, что величины ЛЕ увеличиваются в области малых концентраций ПАВ, при которых формируется гидрофобный комплекс (рис.14). Можно предположить, что в результате взаимодействия с ПАВ меняется микроокружение активного центра лизоцима, что приводит к уменьшению электростатического отталкивания между ферментом и клеткой. С ростом концентрации DTAB и SDS активность лизоцима снижается до величин, характерных для индивидуального белка.

При добавлении САРВ происходит существенное снижение активности фермента в той же области концентраций САРВ, в которой в водном растворе формируются крупные агрегаты. Процесс агрегирования заметно снижает доступность активных центров молекул лизоцима для субстрата. Снижение ферментативной активности лизоцима в присутствии малых концентраций цвиттерионного ПАВ (10~5 М) установлено впервые.

a) 2

3 1

6) 2

IS'

h }1 { ♦

* 1

7 -б -5 -4 tec, [Ml -3

Рис.14. Изменение активности лизоцима с ростом концентрации ПТАВ (а), вОЭ (б) и САРВ (в). Концентрация лизоцима 0,01 г/л (0) и 0,1 г/л (♦). Пунктирные линии — активность индивидуального Ьг. Сплошные линии - расчет по уравнению (1).

Предложена простая модель, описывающая зависимость активности фермента от концентрации ПАВ. Предполагается, что на поверхности белковой глобулы присутствует два типа участков связывания с ПАВ, характеризующиеся константами десорбции Кл\ и Кя2, при заполнении которых молекулами ПАВ происходит формирование гидрофобного и гидрофильного комплексов, соответственно. Принимается допущение, что активность белка линейно меняется в зависимости от степени заполнения участков типа 1 (20 " 2 (Оу) молекулами ПАВ (предполагается независимое заполнение участков 1 и 2). Тогда зависимость активности от (21 и имеет вид:

А = А0 + (А1 - А0) • (}г + (А2 - А^ ■ (}2, где Ао - активность белка в отсутствии ПАВ, А\ и А2— активность при практически полном заполнении участков связывания 1 и 2. Полагая, что получаем

А = А0 + (Aj - А0) ■

[с]

I+CAz-AJ--

[с]

(1).

(Л-Д1+1С1) ' (АГд2+[с])

Методом наименьших квадратов были подобраны величины А\, An, Klt и КЯ2, позволяющие описать зависимости активности лизоцима от концентрации DTAB и SDS (сплошные линии на рис.14).

При растекании капли октана по гидрофобизованному стеклу, погруженному в водный раствор смеси \л. - ПАВ, сначала происходит прорыв смачивающей пленки между каплей и твердой поверхностью, вслед за которым начинается собственно растекание капли. Сопоставление времен, необходимых для прорыва смачивающей пленки, позволяет сделать вывод, что с ростом концентрации ПАВ увеличивается их стабилизирующее действие по отношению к смачивающим пленкам (таблица 2). Наиболее устойчивые пленки получены в системах с САРВ. Добавки лизоцима слабо влияют на устойчивость пленок.

Таблица 2. Времена прорыва смачивающих пленок (с).

с,м БОБ БОБН- 1л. ОТАВ ОТАВ+ Ьг САРВ САРВ+ Ьг

кг4 0 0 — — 0 35±10

104 0 0 0 70±15 190±40 60±10

кг1 130±50 80±20 0 130±50 1100±250 1250±250

КГ* 150±40 110±20 1500±300 860±30 1100±200 1200±300

Анализ зависимостей радиуса смоченной площади от времени показал, что экспериментальная скорость растекания ниже, чем рассчитанная по модели вязкого растекания. По-видимому, растекание происходит в режиме граничной кинетики, и основное сопротивление связано с необходимостью «деадгезии» жидкости-предшественника с твердой поверхности, а также с десорбцией и перестройкой адсорбционных слоев на границах жидкость/твердое тело и жидкость/жидкость.

На основании сопоставления данных методов тензиометрии, сцин-тиллирующей фазы, динамического и статического светорассеяния, флюоресценции, избирательного смачивания и определения ферментативной активности были выявлены основные стадии процесса распределения компонентов между фазами и адсорбционным слоем в соответствии с протекающими процессами самоорганизации, со структурой и локализацией образующихся агрегатов белок - ПАВ.

Смесь 1г - РТАВ (рис. 15).

I. С < 10~6М. Рост адсорбции Ьг и коэффициентов распределения и ВТ А В указывает на формирование гидрофобного комплекса Ьг — ОТАВ, растворимость которого в октане и адсорбция на межфазной поверхности выше, чем у индивидуального белка. Повышается ферментативная активность лизоцима.

II. 10"6 < С < 10"* М. Происходит постепенная гидрофилизация комплекса Ьг-ОТАВ, способствующая уменьшению концентрации Ьг в октане и его адсорбции на поверхности. Взаимодействие ОТАВ с белком не влияет на размер белковой глобулы. Ферментативная активность Ьг снижается до значений ЛЕ индивидуального белка.

III. 10"4<С < 5- 1СГМ. Адсорбции 1^7. уменьшается, адсорбция ОТАВ растет, межфазное натяжение снижается. Происходит вытеснение Ьг из адсорбционного слоя как за счет конкурентной адсорбции с ОТАВ, так и за счет формирования гидрофильного комплекса Ьх - ОТАВ.

IV. С > 5 ■ 10"3М. В органической фазе и на межфазной поверхности доминируют молекулы ПАВ, небольшое количество белка на поверхности присутствует в виде гидрофобного комплекса. В водном растворе находится гидрофильный комплекс белок - ПАВ компактной структуры, мицеллы и отдельные молекулы ОТАВ. В этой области концентраций повышается устойчивость смачивающих пленок, стабилизированных смесями Ъг - ОТАВ.

Рис. 15. Схема адсорбции смеси \л. - ОТАВ на границе вода/октан. 21

Смесь Ьг-БРБ (рис.16). I. С < 1(Г6М. Формируется гидрофобный комплекс Ьг- БРБ, переходящий в органическую фазу и адсорбционный слой. Ферментативная активность Ьг повышена.

- * * «¡¡г Чг % Щ \ |р ЩР V» )й& «Г \

1,1 ^ ¥ у* Ж у IV Ш

II ^шнииишш й --у \ Щ® X

Рис.16. Схема адсорбции смеси Ьг - ЭБЭ на границе вода/октан.

II. 10"6 < С < Ю^М. Адсорбция Ьг не меняется, адсорбция БРБ возрастает, межфазное натяжение снижается. Происходит совместная адсорбция гидрофобного комплекса Ьг - БРБ и БРБ, что приводит к синер-гетическому эффекту при снижении межфазного натяжения. Ьг сохраняет ферментативную активность, аналогичную активности индивидуального белка.

III. 10~4 < С < 10"3М. Начало формирования компактного гидрофильного комплекса в водном растворе, приводящее к появлению плато на изотерме межфазного натяжения и уменьшению адсорбции лизоцима. При концентрации белка 7Т0"5 М (1 г/л) при мольном соотношении Ьг^РЭ = 1:1 в водном растворе образуется осадок.

IV. С > 10"3М. Вытеснение белка из адсорбционного слоя вследствие формирования гидрофильного комплекса. В органической фазе и на меж-

фазной поверхности доминируют молекулы ПАВ, небольшое количество белка присутствует в виде гидрофобного комплекса. В водном растворе находится гидрофильный комплекс белок - ПАВ компактной структуры, мицеллы и отдельные молекулы БОБ. В этой области концентраций повышается устойчивость смачивающих пленок, стабилизированных смесями Ьг - БОБ.

Обращает на себя внимание достаточно сходное поведение смесей БОБ и 1^-БТАВ при концентрации белка 0,01 и 0,1 г/л: формирование гидрофобного комплекса и рост ферментативной активности лизоци-ма в области малых концентраций ПАВ, последующее образование гидрофильного комплекса и вытеснение лизоцима из адсорбционного слоя, близкие значения электрокинетического потенциала, размера частиц в системах, а также параметров взаимодействия комплексов белок - ПАВ, рассчитанных по модели Файнермана. Основные отличия заключаются в том, что в смеси Ьг - БОБ образуется более гидрофобный комплекс, чем в смеси с БТАВ. Это приводит к снижению натяжения при меньших концентрациях и к вытеснению белка из адсорбционного слоя в водный раствор при больших концентрациях добавленного ПАВ. Более сильные взаимодействия БББ с Ьг способствуют формированию осадка в системах с концентрацией белка 1 г/л, что не наблюдается для смеси с ОТАВ.

Смесь Ьг-САРВ (рис.17).

I. С < 5Т0"6 М. В области малых концентраций поверхностное натяжение постоянно и соответствует значениям для чистого лизоцима. В этой области концентраций САРВ наблюдается линейный рост его адсорбции. Можно сделать вывод, что в слое происходит независимая адсорбция лизоцима и САРВ. В водной фазе присутствуют только малые частицы, соответствующие нативному лизоциму. Рост коэффициента распределения САРВ в присутствии Ьг позволяет предположить образование гидрофобного комплекса, переходящего в органическую фазу.

II. 10"5 < С < 2-10"5. Начинается снижение поверхностного натяжения смешанного раствора до значений, меньших натяжения растворов индивидуальных веществ; адсорбция САРВ продолжает расти, а адсорбция лизоцима не меняется. Такое уменьшение натяжения может быть вызвано формированием гидрофобного комплекса белок - ПАВ, адсорбирующегося на поверхности и переходящего в органическую фазу.

Рис.17. Схема адсорбции смеси Lz - САРВ на границе вода/октан.

III. 2-10° < С < 10"4 М. В этой области концентраций ПАВ адсорбция САРВ и межфазное натяжение выходят на плато, увеличивается коэффициент распределения ПАВ и в водном растворе начинают формироваться большие агрегаты, снижается ферментативная активность белка. В этой области концентраций адсорбционный слой, состоящий из молекул ПАВ, гидрофобных комплексов белок - ПАВ и индивидуального белка, близок к насыщению. В водном растворе начинается взаимодействие САРВ с ли-зоцимом по механизму гидрофобного связывания, в результате которого в растворе появляются большие агрегаты частично денатурированного белка. Рост D САРВ, который наблюдается как в индивидуальном растворе, так и в присутствии белка, может быть вызван началом процесса формирования обратных предмицеллярных агрегатов ПАВ в органической фазе.

IV. С > 10"4 М. Завершается процесс связывания белка с ПАВ в водной фазе, в водном растворе появляются «свободные» молекулы ПАВ и поверхностное натяжение снова начинает уменьшаться и совпадает с натяжением для индивидуального ПАВ. При С > 5Т0"4 М межфазное натяжение достигает постоянной величины. В водном растворе начинается об-

разование мицелл САРВ. Таким образом, в области высоких концентраций органическая фаза содержит белок, ПАВ (отдельные молекулы и обратные предмицеллярные агрегаты) и гидрофобные комплексы белок — ПАВ. Поверхностный слой состоит из молекул ПАВ и гидрофобного комплекса белок - ПАВ. В водном растворе находятся большие агрегаты из частично денатурированного белка и ПАВ, молекулы и мицеллы ПАВ.

Основные выводы.

1. Впервые методом сцинтиллирующей фазы получены количественные данные об адсорбции и распределении компонентов смесей Lz - ПАВ в системе вода/октан. Для систем Lz - SDS и Lz - DTAB установлено, что в области малых концентраций ПАВ (10"7- 10~6М) образуется гидрофобный комплекс стехиометрией HAB:Lz = 8+10:1, обладающий более высокой растворимостью в октане и адсорбцией на границе вода/октан по сравнению с нативным белком.

2. Установлены условия, при которых происходит частичное вытеснение лизоцима из адсорбционного слоя. Показано, что при мольных соотношениях DTAB(SDS):Lz в системе свыше 10+100:1 адсорбция лизоцима уменьшается как за счет конкурентной адсорбции с ПАВ, так и за счет формирования в водной фазе гидрофильного комплекса компактной структуры.

3. Установлено, что гидрофобные комплексы Lz - SDS и Lz —DTAB обладают повышенной ферментативной активностью по отношению к грам-положительным бактериальным клеткам Micrococcus luleus по сравнению с индивидуальным Lz. Предложена модель, описывающая зависимость ферментативной активности лизоцима от концентрации ПАВ.

4. Впервые получен меченный тритием САРВ, что позволило применить метод сцинтиллирующей фазы для изучения смеси Lz - САРВ в системе вода/октан. Взаимного влияния Lz и САРВ на адсорбцию компонентов смеси не обнаружено. Впервые установлено снижение ферментативной активности лизоцима при добавлении цвиттерионного ПАВ с концентрацией свыше 10~5 М.

5. Показано, что смешанные адсорбционные слои Lz — ПАВ на границе вода/октан обогащены ПАВ; мольная доля ПАВ в слое возрастает в ряду DTAB < SDS < САРВ.

6. Найдено, что устойчивость смачивающих пленок в системе гидро-фобизованное стекло/октан/водный раствор смеси Lz — ПАВ увеличивается с ростом концентрации ПАВ; добавки Lz практически не влияют на устойчивость смачивающих пленок. Растекание капель в условиях избирательного смачивания происходит в режиме граничной кинетики.

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Соболева O.A. Поверхностное натяжение смесей лизоцима с бромидом додецилтриметиламмония и додецилсульфатом натрия на границах вода/воздух и вода/октан / Соболева O.A., Иванов P.A. // Вестн. Моск. Унта. Сер.2. Химия. - 2011. - Т.52, №5. - С.390-393.

2. Chernysheva M.G. Do low surfactants concentrations change lysozyme colloid properties? / Chernysheva M.G., Ivanov R.A., Soboleva O.A., Badun G.A. // Colloids and Surfaces. A. - 2013. - V.436. - P. 1121-1129.

3. Иванов P.A. Адсорбция и распределение компонентов смесей ко-коамидопропил бетаина и лизоцима в системе вода/октан / Иванов P.A., Соболева O.A., Чернышева М.Г., Бадун Г.А. // Коллоидн. журн. - 2014. -1.16, №3. - С.347-355.

4. Иванов P.A. Влияние поверхностно-активных веществ различной природы на бактериолитическую активность лизоцима / Иванов P.A., Соболева O.A., Смирнов С.А., Левашов П.А. // Биоорг. Химия. - 2015. - Т.41, №3. (принята к печати).

Статья в сборнике научных трудов. 1. Иванов P.A. Влияние лизоцима на межфазное натяжение, реологию адсорбционных слоев ионогенных ПАВ и на краевые углы избирательного смачивания / Иванов P.A., Соболева O.A. // Структура и динамика молекулярных систем: сб. статей XIX Всеросс. Конф. - М., 2012 - Т.1. -С.186-188.

Тезисы докладов конференций.

1. Иванов P.A. Адсорбция смесей лизоцима с ионогенными поверхностно-активными веществами на границе вода/октан / Иванов P.A. // XVIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011»: сб. тезисов. - Москва, 2011. - С.40-41.

2. Иванов P.A. Избирательное смачивание гидрофобизованного стекла растворами смесей лизоцим-ионогенное ПАВ / Иванов P.A., Соболе-

ва О.А. // III конференция молодых ученых «Реология и физико-химическая механика гетерофазных систем»: сб. тезисов. — Суздаль, 2011. - С.68-69.

3. Иванов Р.А. Влияние лизоцима на межфазное натяжение, реологию адсорбционных слоев ионогенных ПАВ и на краевые углы избирательного смачивания / Иванов Р.А., Соболева О.А.// XIX Всероссийской конф. «Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик 2012»: сб. тезисов. — Йошкар-Ола, 2012. - С.77.

4. Иванов Р.А. Изучение методом сцинтиллирующей фазы адсорбции и распределения лизоцима и кокамидопропил бетаина в системе вода/октан / Иванов Р.А. // XX международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013»: сб. тезисов. — Москва, 2013.-С.65.

5. Ivanov R.A. The adsorption and distribution of lysozyme and cocoamidopropyl betaine mixtures in the water/octane system studied by the scintillating phase method / Ivanov R.A., Soboleva O.A., Chernysheva M.G., Badun G.A. // IV International Conference on Colloid Chemistry and Physico-chemical Mechanics IC-CCPCM 2013: book of abstracts. - Moscow, 2013. — P.351-352.

6. Ivanov R.A. Lysozyme-zwitterionic surfactant adsorption at the aqueous/octane interface as studied by scintillation phase method / Ivanov R.A., Soboleva O.A., Chernysheva M.G., Badun G.A. // The first Russian-Nordic Symposium on radiochemistry: book of abstracts. - Moscow, 2013. — P. 13.

7. Иванов Р.А. Адсорбция смесей лизоцим - ПАВ на границе водный раствор/октан. / Иванов Р.А. // XXI международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014»: [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2014. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM).

Подписано в печать 12.01.2015г. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Заказ № 193. Тираж 120 экз. Типография «КОПИЦЕНТР» 119234, г. Москва, Ломоносовский пр-т, д.20 Тел. 8(495)213-88-17