Синтез фосфоресцентных маркеров на основе металлокомплексов порфиринов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од 2 5 МНИ 1395

На прииах рук

ГОНАМОРЕбЛ ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ «ЮЮРЕСЦЕНТНЫХ маркеров НЛ ОСНО[5[: 1ЖТЛЛЛОКСШЕКСОВ порфириноз

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ• диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 1995

Работа шполнена на кафедре химии и технологии тонких органических соединений Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В.Ломоносова и в Государственном научно-исследовательском институте, биологического приборостроения (г.'Москва).

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор . Миронов А.Ф.

кандидат химических наук, с.н.с. Чудинов А.В.

OJ-ициальные оппоненты: ;

доктор химичесгах наук, профессор Юркевич A.M.

доктор биологических наук, профессор Харитоненков И.Г.

Ведущая организаши: Всероссийский центр по безопасности биологически активных,веществ, .г.Купавна, Моск.обл. • «/

Защита диссертации состоится ШОНЖ Б /часов на

заседании диссертационного совета Д, 063.41.01 в Московской

Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им.

М.В.Ломоносова по адресу: 117571, пр.Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться' в библиотеке Академии (119831,Москва, М.Пироговская,1).

Автореферат разослан •/9

Ученый секретарь совета,

кандидат химических наук л г Лютик А.И.

Актуальность проблемы. Метадлокомплексы порфиринов, как сопряженные системы с высокой симметрией, обладают уникальными фотофизическими свойствами. Это объясняет интерес к ним, как к моделям для различных физико-химических исследований, а таюне как к возможным объектам использования в медицине, науке и технике. ■

Известно, что комплексы порфиринов с металлами [РсЦШ; РЬ(П)3 обладают интенсивной фосфоресценцией. Это позволяет использовать данные соединения в аналитической биохимии с регистрацией сигнала при комнатной температуре с отсечением коротко-кивущей люминесценции фона, в частности, в качестве фосфорес-центных меток для люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением. Время свечения, положение полос возбуждения и фосфоресценции для металлопорфиринов оптимально, что позволяет сравнивать чувствительность этого метода с другим широко используемым в настоящее время методом, основанным на флуоресценции ионов редкоземельных элементов. В то же время фосфоресцент-ные метки на основе порфиринов имеют ряд существенных преимуществ. В отличие от кинетически нестабильных лантаноидных меток, состоящих иэ нескольких соединений, порфирины - индивидуальные химические соединения. Проведение анализа с использованием порфиринов является методологически более простым, в связи с чем они представляют реальную альтернативу использованию лантаноидов в иммуноанализе с временным разрешением.

Требования, предъявляемые к маркерам в иммуноанализе, делают необходимым поиск порфиринов, сочетающих в себе ряд свойств: высокий квантовый выход фосфоресценции,; гидрофильность для уменьшения агрегации и неспецифической сорбции метки, надежность конъюгации с белками.

Данная работа выполнена в рамках темы кафедры ХТТОС 1Г-19-865 "Синтез и изучение свойств порфиринов и субмолекулярных структур на их основе, содержащих аминокислоты, пептиды, полйены, хиноны с целью моделирования важнейших биологических процессов и использования для нужд медицины, науки, техники."

Цель работы. Целью настоящей работы явился синтез водорастворимых фосфоресцентных маркеров на основе порфиринов, обладающих высоким квантовым выходом люминесценции и способных ковалентно связываться с белками.

Научная новизна работы. Впервые синтезированы производные палладиевых комплексов порфиринов с изотиоцианатными- группами, удаленными от порфиринового ядра. Получены коньюгаты синтезированных порфиринов с антителами. Изучены фотофизические свойства палладиевых и платиновых комплексов водорастворимых порфиринов. Исследована реакция хлорирования лезо-незамещенных комплексов порфиринов тионилхлоридом. Впервые показана возможность хлорирования метальных групп порфиринов.

Практическая значимость работы. Получены и охарактеризованы коньюгаты синтезированных металлокомплексов порфиринов с антителами. Написаны регламенты по получению палладиевых и платиновых комплексов уропорфирина. Подана заявка на изобретение«,*™ применению платинового комплекса уропорфирина в качестве люминесцентного маркера для иммуноанализа с временным разрешением.

Основные положения выносимые на защиту.

1.Синтезирован ряд палладиевых и платиновых комплексов водорастворимых порфиринов. Изучены люминесцентные свойства этих соединений и предложено их использование в качестве фосфоресцентных маркеров в иммуноанализе.

2. Впервые синтезированы порфирины. содержащие изотиоциа-натную группу, удаленную от. порфиринового ядра.

3. Получены и охарактеризованы коньюгаты синтезированных порфиринов с антителами.

4. Показана возможность хлорирования металлокомплексов порфиринов тионилхлоридом. В зависимости от природы центрального атома металла и структуры порфиринового кольца найдена возможность селективного замещения по мезо-углеродным мостикам и боковым метальным группам атомов водорода на атомы хлора.

Апробация работы. Результаты ;работы , докладывались на I Международной конференции по координационной химии (Ивано-

во,1994). на XIII Всесоюзном семинаре по химии порфиринов и их аналогов (Самарканд.1991),

По материалам работы опубликована 1 статья, 4 тезисов конференций, подана заявка на изобретение, 1 статья находится в печати.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ,4д.О страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, который включает ис-

точников. Работа иллюстрирована . ./5" рисунками.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез палладиевых комплексов ряда природных и синтетических порФиринов и изучение их спектральных свойств

Заместители в различных положениях макрокольца- оказывают значительное влияние на фотофизические свойства порфиринов. Известно, что в ряду палладиевых комплексов этиопорфирина. порфи-на и тетрафенилпорфирина квантовый выход фосфоресценции педает. При переходе от порфириновой структуры к хлориновой также наблюдается снижение фосфоресцел^цОднако, сведения о влиянии структуры порфиринов на фосфоресцентные свойства их палладиевых комплексов отрывочны и несистематичны. к

С целью поиска эффективных люминофоров для возможного использования в качестве меток в иммуноанализе с временным разрешением нами были синтезированы палладиевые комплексы производных дейтеропорфирина с различными заместителями в макрокольце и проведена оценка их фосфоресцентных свойств в водно-мицеля^ых растворах. В качестве заместителей по р - положениям.были выбраны алкильные. винильныэ и ацетильные, группы. Для установления влияния несимметричного мезо-замещения использовали палладиевый комплекс мезо-ацетилдейтеропорфирина. Одновременное воздействие карбоксильного заместителя по мезо-положению и гидрирования одного пиррольного кольца рассмотрено на примере хлорина р6' -производного пурпурина 18.

Палладиевые комплексы (1) - (6) получали кипячением порфиринов с хлоридом палладия в диметилформамиде. Соединения (1) -(3) были выделены с выходами близкими к количественным. Наличие ацетильной группы [соединения (4) - (6)] приводило к снижению выхода до 60%. Электронные спектры полученных соединений приведены в таблице 1.

Для изучения люминесцентных свойств палладиевых комплексов в водно-мицелярных растворах провели щелочное омыление метиловых эфиров карбоновых кислот в соединениях (1) - (6).

Шг

COOCrtb COOCHj,

1 Rj =R3 = CH3

r2 =r4 =r5 =h

2 r, =r3 = ch3

r2=r4 = c2h5 r5=h

3 Rj -R3 ~ CH3

r2=r4 = ch=ch2 r5=h

4 rt =r3= ch3 r2= c2h5 r4=ac

r5=h

5 rj =r4 = ch3 r2=r3=ac

r5 =h

CH,

r2=r3=h r5=ac

Табл.1. Спектральные характеристики полученных соединений.

Соединение Спектр поглощения. X макс •

нм, хлороформ

Соре а - Р - отн a/ß

Pd-дейтеропорфирии IX дмэ (1) 392 544 510 2.7

Pd-мезопорпорфирин IX дмэ (2) 392 545 511 2. 7

Pd-протопорфирин IX дмэ (3) 400 554 517 2.8

Р0-2-этил-4-ацетилдейтеропорфи- 405 568 528 2. 7

рин IX дмэ (4)

Pd-2,3-диацетилдейтеропорфи- 415 572 551. 1.2

рин III дмэ (5)

Pd-a-лезо-ацетилдейтеропорфирин 397 550 513 2.3

III дмэ (6)

Pd-пурпурин 18 (7) 411 647 602 4.1

Pd-хлорин р6 (8) . 400 623 587 4.3

Спектры фосфоресценции записывали в растворе вода - диме-тилформамид (5:1) при добавлении тритона Х-100 до 0.1%. Растворенный кислород удаляли сульфитом натрия (3 мг/мл). Качественная оценка люминесценции полученных соединений позволила сделать вывод, что комплексы порфиринов с заместителями, подобными алкильным, интенсивно фосфоресцируют. В области до 750 нм не наблюдали существенной фосфоресценции у несимметричных порфиринов, имеющих ацетильные заместители в ß - положениях пиррольно-го кольца и в. мезо - положениях порфирина. Менее интенсивным свечением обладал палладиевый комплекс протопорфирина. Возможно, уменьшение интенсивности свечения производных дейтеропорфи^' рина обусловлено неоптимальными условиями измерения в водных

растворах с детергентом, в которых не удалось перевести порфи-рины в мономерные формы за счет снижения их общей растворимости. 0 степени агрегации порфиринов в водно-мицеллярных растворах судили по уширению полосы Соре в спектре поглощения и о ее смещении в коротковолновую область.

Особый интерес в качестве маркера представлял палладиевый комплекс пурпурина 18, ангидридный цикл которого мог бы быть использован для прямого связывания метки с белками. Комплекс пурпурина 18 (7) синтезировали при кипячении безметального пурпурина в ацетоне с хлоридом палладия. Выход после перекристаллизации из хлороформа с гексаном составил 94%.

В спектре ПМР палладиевого комплекса пурпурина 18 отчетливо наблюдаются 3 сигнала мезо-протояов макроцикла, сигналы протонов винильной группы и хлоринового кольца при С-7 и С-8.' Электронный спектр имеет четыре полосы поглощения и смещен, по-сравнению со спектром безметального пурпурина, на „ 45 нм в коротковолновую область.

Раскрытие в щелочной среде ангидридного цикла приводи^к образованию тринатриевой соли палладиевого комплекса хлорина р6 (8). В электронном спектре полученного хлорина длинноволновая полоса поглощения имеет гипсохромный сдвиг на 24 нм (табл.1).

л . .

н <\ соон соон соон

фосфоресценцию палладиевого комплекса хлорина р6 наблюдали в ближней ИК-области (820 нм) в 0.1% растворе тритона Х-100 в фосфатном буфере (рН 7.4) при химическом удалении кислорода сульфитом натрия. Интенсивнось свечения этого соединения," одна-, ко. оказалась недостаточной для использования в качестве фосфо-ресцентной метки.

Проведенные исследования показали,, что . фосфоресцентные

свойства выражены значительно слабее у хлоринов и порфиринов с электоноакцепторными заместителями. Кроме того, большое влияние на увеличение интенсивности фосфоресценции оказывает растворимость соединений в воде, так как агрегация порфиринов приводит к тушению фосфоресценции.

2. Синтез металлокомплексов водорастворимых порфиринов

Дальнейшую работу в области фосфоресцентных маркеров продолжили в направлении увеличения их гидрофильности без снижения люминесцентных характеристик.

2.1. Выделение и очистка октаметилового эйира уропорфирина

Культуральная жидкость Arthrobacter globiformis (ВКМ-658), содержащая уропорфирин микробиологического происхождения, была получена из Института биохимии им.А.И.Баха РАН.

Согласно спектральным данным содержание уропорфирина в культуральной жидкости составляло 200 мг/л. Нами была разработана методика выделения и очистки октаметилового эфира уропорфирина. Осаждение порфирина достигалось нейтрализацией кислого (pH 1) раствора культуральной жидкости. Полноту высаживания проверяли спектрофотометрически по полосе Соре. После этерифи-кации октаметиловый эфир уропорфирина (9а.б) очищали на окиси ягшминия ИТ степени активности и перекристаллизовали из смеси хлороформ - метанол. Выход октаметилового эфира уропорфирина составил 80 мг на один литр культуральной жидкости.

В масс-спектре соединения (9) наблюдали интенсивный пик молекулярного иона с m/z 942.2. Данные элементного анализа также подтверждали структуру октаметилового эфира.

С помощью тонкослойной хроматографии было показано, что выделенное вещество состоит из двух изомеров. Идентификацию изомерного состава уропорфирина проводили после гидролиза метиловых эфиров с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Было найдено, что образец состоит из уропорфирина I (9а) и уропорфирина III (96) в соотношении.4:1.

Таким образом, отработана методика выделения природного водорастворимого уропорфирина и опеределен его изомерный сос-

тав.

2.2. Синтез палладиевых и платиновых комплекс уропорФирина

С целью получения соединений с высоким квантовым выходом фосфоресценции были синтезированы палладиевые и платиновые комплексы октаметиловых эфиров уропорфирина I и III (10а, б) и (11а.б). Их получали кипячением порфирина с соответствующий солями в диметилформамиде и бензонитриле с выходами 85% и 45%. соответственно. Состав полученных соединений был подтвержден с помощью элементного анализа и масс-спектрометрии (m/z 1049.0, m/z 1136.7).

Щелочной гидролиз метиловых эфиров приводил к образованию водорастворимых натриевых солей металлокомплексов порфиринов (12а. б) и (13а, б).

СООЯ

C00R.

C0DR.

C00R.

im

№

HOOG'

COOÜ

CDOR

•V

coon

cooe

COOR.

COOß.

6

9 M=2H, R= CH3

10 M=Pd, R= CH3

11 M=Pt. R= CH3

12 M=Pd, R=Na

13 M=Pt, R=Na

Электронные спектры поглощения соединений (12) и (13) показаны на рис. 1.

Рис. 1. Спектры поглощения палладиевого (12) (—) и платинового (13) (—) комплексов уропорфирина в фосфатном буфере при рН 7.4.

Палладиевый и платиновый комплексы имеют квантовые выходы фосфоресценции 0.24 и 0,69. соответственно, хорошую растворимость в водных средах при рН > 5 и могут быть использованы в качестве фосфоресцентных меток для биологических объектов.

По результатам работы написаны лабораторные регламенты на получение палладиевого и платинового комплексов смеси изомеров уропорфирина I и III. На основании проведенных исследований по-

,<-1, Gil ¿¿Л v-J CW t lj l ilCl jIoC U^JO i ^IlíIC ÜU llOiiG JllJOO UeilíliíU i IJJli i llilUUU i IVUl'iil

лекса уропорфирина в качестве маркера для иммуноанализа. По сравнению с .ранее используемыми комплексами копропорфирина, применение уропорфирина позволяет повысить уровень сигнала люминесценции за счет лучшей растворимости последнего в водных растворах и большей степени его мономеризации. Кроме того, более высокая степень растворимости уропорфирина в нейтральных и слабокислых средах, в которых проводится реакция синтеза конь-агатов позволяет увеличить соотношение "порфирин - белок" при синтезе карбодиимидным методом.

3. Синтез металлокомплексов порфиринов с изотионианатной группой

Одной из актуальных проблем в иммуноанализе является создание фосфоресцентных меток с активными группировками для связи с белками. Такой активной группировкой может быть изотиоцианат-ная. Но положение этой группы в составе порфириновой метки должно быть таким, чтобы не снижались фосфоресцентные свойства исходного металлопорфирина и не увеличивалась общая гидрофоб-ность маркера.

С этой целью нами был выбран спейсор для изотиоцианатной группы в виде молекулы лизина. Удаление этой группировки от порфиринового ядра не скажется на люминесцентных свойствах маркера, а наличие пептидной связи и карбоксильной группы в конечном соединении уменьшит гидрофобность метки.

Аминокислотные производные металлокомплексов порфиринов были нами получены по двум схемам. В первом случае метиловые эфиры дейтеропорфирина IX и мезопорфирина IX нагревали в дпг-^-тилФормамиде с хлоридом палладия, в результате чего были получены соответствующие палладиевые комплексы (1) и (2). Их омыление проводили щелочью в тетрагидрофуране. Последующая конденсация соединений (146) и (156) с метиловым эфиром М£-карбобензок-си-Ь-лизина осуществлялась в присутствии водорастворимого И-циклогексил-М'-(2-морфолиноэтил)карбодиимид-метил-п-толуол- ., сульфоната. Общий г:аход по этой схеме составил для производного дейтеропорфпршг, ;х (18) - 37%, а для производного мезопорфирина IX (19) - 45,; (схема 1).

Согласно второй схеме введение, металла осуществлялось на заключительной стадии синтеза. Дейтеропорфирин IX (14а) и мезо-порф;ирин IX (15а) обработкой тионилхлоридом переводили в хло-рангидриды, которые затем конденсировали с защищенным лизином. Аминокислотные производные порфиринов (16) и (17) нагревали при температуре 150°С с хлоридом палладия и после очистки были получены комплексы (18) и (19). Общие выходы по этой схеме составили для производных дейтеропорфирина IX (18) и мезопорфирина IX (19) 51% и 58%, соответственно.

TOS©

14a R=H, M=2H 146 R=H, M=Pd 15a R=-C2H5, M=2H 156 R=-C2H5> M=Pd

16 R=H. M=2H

17 R=-C2H5. M=2!I

18 R=H. M=Pd

19 R=-C2H5, M=Pd

Схема 1. Синтез аминокислотных производных металлокомплек-сов порфиринов.

При получении лизиновых производных металлопорфиринов не ставилась задача сохранить оптическую активность аминокислоты в конечном соединениии. Для синтезированных соединений не определяли степень изомеризации.

Структура конечных соединений (18) и (19) подтверждена данными элементного анализа и масс-спектрометрии. В ИК-спектре имеются полосы в районе 1640 см"1, соответствующие амидной связи. В пользу этой связи также свидетельствует .сигнал протона Ш-группы при 7.15 - 7.18 м.д. В спектре ПМР наблюдаются и другие сигналы, подтверждающие строение синтезированных продуктов.

Таким образом, из возможных путей синтеза лизиновых производных палладиевых комплексов порфиринов наиболее оптимальной является схема с использованием тионилхлорида.

Омыление сложноэфирных групп в соединениях (18) и (19) проводили действием щелочи в тетрагидрофуране, а И^-бензилок-сикрбонильные группы отщепляли раствором бромистого водорода в уксусной кислоте. После упаривания получали хорошо растворимые в воде гидробромиды бис-лизино-металлопорфиринов (20) и (21).

Соединения (20) и (21) показали хорошую фосфоресценцию,; в водных обескислороженных с помощью сульфита натрия растворах. Аминокислотные производные хорошо растворимы при рН < 7. что делает их удобными при получении коньюгатов с белками щадящим

перийодатным методом. Кроме того, из литературы известно, что аминокислотные производные порфиринов могут избирательно накапливаться в злокачественных образованиях, при этом значительно снижается токсичность порфиринов. Следовательно, люминесценцию металлокомплексов лизинового производного порфиринов удастся, по-видимому, использовать для диагностики раковых заболеваний.

Для достижения конечной цели - получения изотиоцианатных производных - водные растворы порфиринов (20) и (21) подщелачивали до рН 8 и обрабатывали при интенсивном перемешивании тио-фосгеном в хлороформе (схема 2). °

Л

0=9

Н^чл/у^

Ъон

20 к=н

21 С2Н5

22 И=Н

23 й - С2 Н5

Схема 2. Синтез изотиоцианатных производных металлокомплексов порфиринов.

После подкисления продукты реакции экстрагировали хлороформом и хроматографировали на силикагеле. В результате были получены изотиоцианаты металлокомплексов дейтеропорфирина IX (22) и мезопорфирина IX (23).

ИК-спектры подтверждают наличие изотиоцианатной группы. Высокочастотная полоса поглощения валентных колебаний органических изотиоцианатов находится в области 2020-2100 см"1 и обычно представляет собой дублет или имеет плечо. Именно такую интенсивную полосу поглощения с плечом в области 2100 см"1 мы обнаружили в ИК-спектре выделенных веществ, причем в спектре исходного вещества эта полоса отсутствовала. Структура конечного продукта (22) также была подтверждена данными масс-спектро-метрии (т/2 1011.8).

Таким образом, были получены фосфоресцирующие порфирины с активной группировкой для связи с белками.

4. Взаимодействие металлокомплексов порфиринов с тионилхлоридом

При получении лизиновых производных мегаллопорфиринов мы отрабатывали различные пути синтеза этих соединений. В частности, нами была проверена схема, в которой попытались отказаться от использования карбодиимида и введения палладия на сравнительно лабильном аминокислотном производном порфирина. Эта схема должна была включать получение палладиевого комплекса порфирина (156), его обработку тионилхлоридом и конденсацию полученного хлорангидрида с защищенным лизином. Однако, при получении хлорангидрида палладиевого комплекса мезопорфирина IX мы встретились с определенными трудностями. Было найдено, что под действием тионилхлорида уже на холоду происходит замещение всех четырех лезо-протонов на хлор. Последующая конденсация промежуточного хлорангидрида с защищенным лизином приводила к соединению (24). ^ м

2-HN\AA{^ . . COOCHj

Строение последнего подтверждено отсутствием в спектре ПМР сигналов мезо-протонов. пиком молекулярного иона с m/z 1362 и характерным для лезо-галоидзамещенных порфиринов электронным спектром - батохромным смещением полос примерно на 50 нм и су-щественнымпонижением интенсивности а - полосы.

Подобное взаимодействие тионилхлорида с порфиринами ранее не наблюдалось. Традиционные методы хлорирования порфиринов и металлопорфиринов по мезо-положениям, описанные в литературе,' предполагают, использование в качестве'хлорирующих агентов хлор-

сульфоновую кислоту, сульфурилхлорид и системы, содержащие соляную кислоту и перекись водорода. В реакциях образуется смесь продуктов, и выходы тетрахлорзамещенных порфиринов не превышают

В связи с этим нами было изучено взаимодействие тионилхло-рида с палладиевым и никелевым комплексами этопорфирина II. Действие на эти комплексы тионилхлорида приводит к быстрому изменению окраски реакционной массы от красной до ярко-зеленой. В электронных спектрах поглощения всех соединений наблюдается ба-тохромный сдвиг' на 55-60 нм по сравнению с исходными металло-комплексами и изменение соотношения интенсивностей а - и Р -полос (рис.2), что характерно для металлокомплексов. свободные основания которых имеют фйлло-тип спектра.

Рис.2. Электронные спектры ' поглощения хлорпроизводных никелевого (—) и палладиевого (- -) комплексов этиопорфирина.

Неожиданный результат был получен при анализе продукта, выделенного после 2-х часового взаимодействия никелевого комплекса этиопорфирина с тионилхларидом.

Как и у ранее полученного соединения (24) в спектрах ПМР отсутствовали сигналы всех мезо-протонов. Однако, сигналы метальных и этильных групп претерпевали существенные изменения. Вместо синглетов 4-х метальных групп в спектре появляются два синглета при 5,68 и 5,72 м.д. интенсивностью по 4 Н каждый, которые можно отнести к четырем метиленовым группам хлорметюТь-ных производных (рис.3).

Л.нм

350 500 550 600 650

а

<0 987654 Ъ 2

L_

б .

i0 9 8 7 t

2i

А

' Рис.3. Спектры ПМР соединений:

А - никелевый комплекс мезо-тетрахлор-1,4,5.8-тетрахлорме-тил-2,3,6.7-тетраэтилпорфирина (25);

Б - палладиевый комплекс /иезо-тетрахлор-1.4. 5-трихлормг— тил-2,3.6.7-тетраэтилпорфирина (26).

Сигналы всех этильных групп в отличие от исходного соединения расщепляются, что может свидетельствовать о их неэквивалентности. возможно, за счет изгиба плоскости хлорированного соединения (25).

■Анализ соединения (25) с помощью времяпролетной плазмен-но-десорбционной масс-спектрометрии подтвердил замещение 8 протонов на атомы хлора (m/z 813, ИГ]). Состав нового соединения бып nnnTDppwnou .naiiiii.iv:: злс"с:1т::огс анализа.

Реакция палладиевого комплекса этиопорфирина II с тионилх-лоридом проходит медленнее. Через 20 часов из реакционной массы выделили продукт (26). • •

ПМР этого соединения О.олее сложный. В нем также отсутствуют сигналы мезо-протонов. сигналы этильных групп расщепляются, появляется синглет при 5.78 м.д., но в тоже время остается-сигнал от одной метальной группы при 3.3 м.д. Масс-спектр соединения (26) показывает наличие пика молекулярного - иона 823.7. что соответствует введению 7 .атомов хлора.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что никелевый комплекс этиопорфирина показал большую реакционную способность, чем палладиевый при взаимодействии с тионилхлоридом. Структура порфириновой молекулы также играет существенную роль. Так, при взаимодействии палладиевого комплекса этиопорфирина происходит частичное хлорирование метальных групп, хотя в случае палладиевого комплекса мезопорфирина.этого не наблюдалось.

я фото(Т)изические исследования

Спектры фосфоресценции палладиевых и платиновых комплексов водорастворимых порфиринов показаны на рис.4. Спектры фосфоресценции записаны после добавления сульфита натрия (3 мг/мл) при оптической плотности 0=0.1 в-полосе поглощения Соре, время задержки 50 мкс, время строба 3 мс.

I

I

" л>

/ 1

/1

/1

/ 1

< \ / и А

/ // ч N

^-\

600 650 700 '

Рис.4. Спектры фосфоресценции металлокомплексов порфиринов:

(A) - РсЬуропорфирин (12) в бикарбонатном буфере рН 8;

(B) - Р1;-уропорфирин (13) в бикарбонатном буфере рН 8; . :

(C) - Бис-лизино-№'-РсЗ-дейтеропорфирин (20) в водном растворе(рН5); (0) - Бис-лизино-И^-РсЬмезопорфирин (21) в водном растворе(рН5).

Люминесцентные свойства полученных соединений представлены в таблице 2.

Табл.2. Люминесцентные свойства полученных водорастворимых соединений.

Квановый Коэффици-

Соединение выход Т ^ фОСф ^ погл ент моляр Ф*Е

фосфор. экстинции

N Ф мкс НМ НМ Е, М~1СМ~1

1 Платиновый комплекс 0.69 ■ 75 646 381 191000 132000

2 уропорфирина Палладиевый комплекс 0.24 1200 665 392 163500 39240

3 уропорфирина Палладиевый комплекс j -6, 7-бис(М -лизино)мезопорфирина IX 0.16 1200 663 393 121000 19360

4 Палладиевый комплекс j 6. 7-6nc(N -лизино)дейтеропорфирина IX 0.10 1200 659. 393 115000 11500

Квантовые выходы фосфоресценции измерены в сравнении с известной величиной 0.2 для палладиевого комплекса копропорфирина с учетом кривой чувствительности прибора и времени задержки т = 50 мкс. •■ •

Наибольший квантовый выход - у платинового комплекса уро-порфирина (смесь изомеров I и III). Палладиевые комплексы пор-.фиринов по своим люминесцентным характеристикам значительно уступают платановым. , - .

Добавление поверхностноактивных веществ к растворам метал-локомплексов уропорфиринов не приводило к увеличению фосфоресценции этих соединений в отличие от копропорфирина. что может быть объяснено тем. что уропорфирины в водных растворах находятся. главным образом, в виде мономеров.

Палладиевый комплекс лизинового производного мезопорфирина IX по своим люминесцентным характеристикам близок к палладиево-му комплексу копропорфирина III. Наблюдаемое снижение фосфорес-центных. свойств производного дейтеропорфирина по сравнению с

производным мезопорфирина подтверждает известные факты об увеличении квантового выхода фосфоресценции при введении алкильных заместителей в порфириновое кольцо. Уменьшение растворимости соединения (20) также может отрицательно сказаться на его фосфоресценции.

Изучение люминесцентных свойств синтезированных соединений показало, что палладиевые и платиновые комплексы полученных водорастворимых соединений являются перспективными маркерами для фосфоресцентного иммуноанализа, причем наибольший интерес представляют платиновые комплексы порфиринов, так как имеют более высокий квантовый выход фосфоресценции,.

6. Биологические испытания

Для оценки возможности применения полученных соединений в качестве фосфоресцентных меток для белков были получены и охарактеризованы их коньюгаты с антителами IgG-к осповакцине и со стрептавидином. Коньюгаты. меченные платиновым комплексом уро-порфирина, были использованы, для проведения иммуноанализа на определение вируса осповакцины с применением стрептавидиновой системы и без нее,' в качестве модельных систем.

6.1. Получение коньюгатов металлокомплексов порфиринов с белками

Для связывания порфиринов с белками использовался карбоди-имидный метод, а также метод прямого взаимодействия изотиоциа-натной группы порфирина с аминогруппами белка.

6.1.1. Получение коньюгатов антител с платиновым комплексом уропорйтоина

Для получения коньюгатов платинового комплекса уропорфири-на с антителами IgG к осповакцине и стрептавидином был использован хлоргидрат 1-этил-З-диметиламинопропилкарбодиимида в .качестве активирующего агента ("Serva", Германия). Очистку конь-югата проводили на сефадексе G-50 в фосфатном буфере рН:- 1Л? Спектрофотометрическая характеристика коньюгатов представлена в

таблице 3. Степень метки (соотношение количества молей порФири-на и белка) у обоих коньюгатов имеет довольно низкий уровень: 2,5 для меченных антител и 2,8 для меченного стрептавидина.

6.1.2. Получение коньюгатов изотноцианатнпго производного палладиевого комплекса дейтеропорфирина с белками

. Для ковалентного связывания с антителами к осповакцине (1еСОВ) и со стрептавидином ^г) порфириновой метки, содержащей изотиоцианатную группу использовали прямое присоединение в фосфатном буфере при рН 9,5. После гель-фильтрации на сефаяекое С-50 соотношение порфирина к белкам в коньюгатах составляло 6.6 (для антител) и 15.2 (для стрептавидинз) (табл.З).

Табл.3. Характеристика коньюгатов с порфириновши метками

Мп/п Коньюгат £>2 8 0 ^3 8 0 елка ^П 0 РФ '"'п о р (5 /'''б елка

мкмоль/мл

1 1йС0В-Р Ьуро .44 0.99 ,2.08 5.20' 2,5

2 э^-ргуро 0, 27 0.69 1.28 3.61 2.8

3 1ЯС0В-РбДПпро'(22) 0.20 1.01 0.95 6. 27 6.6

4 Б(,г-Рс1ДППр0 (22) 0,07 0.83 0.34 5. 15 15,2

6.2. Люминесцентные свойства коньюгатов

. Исследование полученных коньюгатов с помощью люминесцентной спектроскопии показало, что спектры фосфоресценции коньюгатов аналогичны спектрам маркера без белка.

На флуоресцентном импульсном спектрофотометре были проведены сравнения люминесцентных свойств полученных коньюгатов с коньюгатамн антител меченных платиновым и палладиевым

комплексами кбпропорфирина (табл 4).

Табл. 4. Сравнительная оценка люминесцентных свойств антител коньюгатов с металлокомплексами порфиринов.

Концентрация метки в пробе.И Интенсивность люминесценции,имп/сек Соотношение уровня сигнал.

Р^уро (1зУ РС-колро РсЬкопро

Рс1г*

10-ю 13980 10860 2771 2715 1.28 1, 1

ю-11 1659 1230 482 495 1.34 1,0

10"12 346 254 152 156 1,36 1.1

10"13 175 156 144 .144 1, 12

Фон раст-

вора 144 144 144 144

Условия регистрации: X возб.=381 нм,' X регистр.=645 нм. длительность строба 100 мкс (для платиновых комплексов); X возб. =392 нм. X регистр.=663 нм. длительность строба 2000 мкс (для палладиевых комплексов); нужная длина волны выделялась с помощью интерференционных фильтров; время задержки строба 50 мкс. время регистрации 1 сек. Регистрация проводилась в' полистироловых стрипах (ТУ-64-2-375-86). Анализ осуществлялся на' приборе ИФЙ-01 (производства ГосНИИБП).

Из данных таблицы видно, что наиболее перспективными фос-форесцентными метками являются платиновые комплексы порфиринов, причем предлагаемый реагент - платиновый комплекс уропорфирина (13) - определяется с пороговым уровнем детекции выше, чем платиновый комплекс копропорфирина в среднем в 1,3 раза. Кроме того, более высокая степень растворимости уропорфирина в нейтральных и слабокислых средах, в которых проводится реакция синтеза коньюгатов, позволяет увеличить соотношение "порфи-рин-белок" при синтезе карбодиимидным методом. Пределы детекции меток - изотиоцианатного производного палладиевого комплекса дейтеропорфирина (22) и палладиевого комплекса копропорфирина - . сравнимы. " -

6.3. Иммуноанализ с временным разрешением

Коньюгаты платинового комплекса уропорфирина с антителами и стрептавидином были оценены при проведении твердофазного иммуноанализа на моделе вируса осповакцинн с использованием стрептавидин-биогиновой системы и без нее методом фосфоресцент--ного иммуноанализа (рис.5).

Рис.5, Схема для определения поликлональных антител к осповак-' цине твердофазным методом:

а - с использованием коньюгатов ОВ - метки б - с использованием стрептавидин-биотиновой системы.

Чувствительность анализа с использованием порфириновых коньюгатов сравнили с чувствительностью метода европийного флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением ОЕЬГ1А. 'Чувствительностью определения. . антигена (вируса осповакцины) считали наибольшее разведение диагностикума, при котором определялся. антиген. . Пробу • считали положительной, если значение специфического сигнала в'_2 или более раз превышало значение фона. Результаты исследований суммированы в таблице 5.

'Габл.5. Чувствительность выявления вируса осповакцины методами-иммуноанализа с временным разрешением. *

Метод иммуноанализа Коньюгат, содержащий . индикаторную метку Чувствительность определения анти гена (вируса осповакцины)

разведение диагностикума бляшкообразующие единицы/мл

БЕЬПА З^СОВ-Еи3*. 1:50000 5*103

БЕЬПА Б^-Еи3* 1:50000 5* 103

Фосфоресцент-ный имм. анал. фосфоресцент-ный имм.анал. ^ОВ-ГШ Б1,г-Р1УП 1:6400 1:25000 4* 104 1*104

Чувствительность определения вируса осповакцины методом фосфоресцентного иммуноанализа с применением коньюгата стрепта-видин - платиновый комплекс уропорфирина в 4 раза выше.,, чем с применением ^ ОВ - платиновый комплекс уропорфирина. но в 2 раза уступает чувствительности метода ОЕЬПА. Однако, анализ с Ей3*-метками трудоемок и неудобен при проведении: необходима дополнительная стадия десорбции; на чувствительность метода влияют малейшие загрязнения; при хранении меченных белков (антител) возможно частичное перекомплексование ионов европия. В то же время маркеры на основе порфиринов имеют ряд преимуществ, а именно: они являются индивидуальными химическими соединениями. термодинамически высокостабильны, анализ с их использованием менее трудоемок.

• Твердофазный иммуноанализ был проведен научным сотрудником 1 ГосНИИ биологического приборостроения Москвиной Т.М. на базе Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Полученные результаты показывают перспективность применения фосфоресцентных металлокомплексов порфиринов в качестве маркеров в иммуноанализе с временным разрешением. Дальнейшая разработка методов фосфоресцентного иммуноанализа, несомненно, перспективна.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы палладиевый и платиновый комплексы уро-порфирина, изучены их фотофизические свойства.

2. Получены и охарактеризованы коньюгаты платинового комплекса уропорфирина с антителами. Проведена сравнительная оценка чувствительности фосфоресцентного иммуноанализа с использованием. этих коньюгатов с европийным флуоресцентным иммуноализом.

%3. Сделана сравнительная оценка двух' путей синтеза водорастворимых палладиевых комплексов аминокислотных производных порфиринов, изучены их люминесцентные свойства. Показано влияние электронодонорных заместителей на интенсивность фосфоресценции.

4. Синтезированы палладиевые комплексы порфиринов. содержащие изотиоцианатные группы, удаленные от порфиринового макрокольца. Получены и охарактеризованы их коньюгаты с антителами.

5. Обнаружено,■ .что под действием тионилхлорида на никелевые и палладиевые комплексы порфиринов происходит замещение ме-зо-протонов на атомы хлора. Показана возможность селективного хлорирования боковых заместителей порфиринов в зависимости от природы металла и структуры порфирина.

Основные результаты диссертации'опубликованы в следующих работах:

1. Понаморева О.Н.. Румянцева В. Д.. Миронов А.Ф.. Чудпнов A.B. Синтез фосфоресцентных металлопорфиринов с изотиоцианатной группой//Биоорганическая химия. -1995. -21,-4. -с. 300г304.

2. Понаморева О.Н.-,' Брандис A.C., Козырев А.Н., Миронов А.Ф.,

' Чудин.ов А. В. . Люминофоры из сине-зеленых водорослей//Гезисы XIII сессии Всесоюзного 'семинара по химии порфиринов и их анало-

зов, -Сшларканд,-1991, -с. 42.

3. Понаморева 0. Fi., Румянцева В. Д., Миронов А.Ф., Чудинов A.B., Люминесцентные метки на основе порфиринов//Гезисы XIII цессии Всесоюзного семинара по химии порфиринов и ilx аналогов. -Самарканд.-1991.-с. 11. . '

4. Понаморева О.Н.. Румянцева В. Д.. Миронов AI Ф.. Чудинов A.B.. Синтез фосфоресцентных металлопорфиринов с изотиоцианатной группой//Гезисы докладов I Международной конференции по биокоординационной химии, -Иваново, -1994, -с. 168.

5. Румянцева В.Д. .Понаморева О.Н., Миронов А.Ф. ,0 взаимодействии металлокомплексов порфиринов с тионилхлоридом// Тезисы докладов I Международной конференции по биокоординационной химии, -Иваново.-1994.-с.141.

6. Осин Н.С., Понаморева О.Н.. Румянцева В.Д., Миронов А.Ф.. Маркер для люминесцентного иммуноанализа//Заявка на изоб-peT..nocT.N 94/006940 от 10.03.94 (в печати).