Подходы к конструированию вакцин на модели PSEUDOMONAS AERUGINOSA тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

УДК 615.371:616.98:579.8

615.371:579.841.11] .012.07

КУЛЬШИН Владимир Андреевич

ПОДХОДЫ к КОНСТРУИРОВАНИЮ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель —

доктор химических наук, профессор Б. А. ДМИТРИЕВ

Официальные оппоненты — доктор химических наук Ю. А. КНИРЕЛЬ, доктор биологических наук А. В. ПРОНИН

Ведущая организация — Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится « ^ » С^иЭЦ-Л 1992 г. в /о часов на заседании специализированного совета К 002.62.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н. Д. Зе-л'и'нского АН РФ (117913, Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН.

Автореферат разослан « ъв » 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Н. Я. ГРИГОРЬЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. К настоящему времени стало очевидным. что традиционные вакцинные препараты пастеровского типа будут, несмотря на их заслуги, вытеснены вакцинными препаратами третьего поколения - химическими и биотэхнологическими вакцинами. Основным препятствием на пути такой замены является трудности технологического характера, а также необходимость накопления дополнительных знаний о взаимосвязи эффективности действия и химического строения таких препаратов. Любая дополнительная информация по данным вопросам представляет большую ценность для оптимизации процесса разработки химических вакцинных препаратов . и приближения начала их практического применения.

Цель работы. Одной из наиболее острых проблем клинической эпидемиологии является борьба с септическими осложнениями, вызываемыми грам-отрицателышм микроорганизмом Pseudomonas aeruginosa. Высокая жизнестойкость микроорганизма и его устойчивость к средствам хемотерапии делает обоснованным выбор иммунологических методов борьбы с этим возбудителем. Поэтому в данной работе была поставлена задача отработки методов синтеза искусственных антигенов, которые могут быть использованы в качестве химических вакцин для борьбы с синегнойными инфекциями.

В качестве источника антигенной информации были выбраны О-специфические полисахариды липополисахаридов (ЛПС) P.aerugJno-, sa, на основе которых п было решено синтезировать ряд углевод-белковых и углевод-лшшдных искусственных антигенов.

: Научная новизна и практическая'значимость работы. Оптимизирована методика выделения J1UÜ гран-отрицательных • бактерий «етодои водно-фенолыгоП экстракции.

Синтезированы протективныз полисахарид- и олигосахарид-беЛковыэ коньюгаты па основе бютьего сывороточного альбумина, а такхе экзотоксина А сипегнойной палочки п О-специфических поли' сахаридоз микроорганизма. Экспериментально подтверядена пёобхо-дкость присутствия в вакцинном препарате антигенных детерминант, нескольких наиболее вэеных факторов naforeimoeni возбудителя.

Обнаружено син&ргнческое стимулирувсэе действие гомологичного по углеводной цепи- ЛПС при иммунизации полисахарид-белковыми коньюгатаки. * . • . ' . •

Оптимизирована общая схема изучения химического строения . липида А. Установлена полная химическая.структура липида А сине-гнойной палочки. •Впервые показано существование липида А с двумя неацилировашпм! гидроксплы1ым1Г 'груЙпамн J остатке врсстанавли-

вающего ClcN. Охарактеризованы иинунобиологичекие свойства липи-да А синегнойной палочки. Предложено объяснение низкой токсичности липида А синегнойной палочхи исходя из его структурных особенностей.

Осуществлен синтез искусственного углевод-липидного коньо-гата из липида А и олигосахарида с.антигенной специфичностью ЛПС иммунотипа Фишер 2 синегнойной палочки, моделирующий нативный липополисахарид. Показана его серологическая активность и имну-ногенность.

Предложен метод рассчета констант связывания антигенов с антителами на основании данных ингибиторного иииуноферментного анализа. Метод использован для анализа энергетики связывания олигосахаридных гаптенов с антителами, специфическими к нативно-иу ЛПС.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на Международном симпозиуме "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (г. Пущино, 1987 г.), 111 Советско-Шведском симпозиуме по химии углеводов (г.Киев, 1988 г. ), Международном симпозиуме по химии и биохимии углеводов (г.Иокагама, 1990 г.). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 153 страницах, содержит. 33 рисунка, 10 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 145 ссыяок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИП0П0ЛИСАХАРИД0В, ПОЛИСАХАРИДОВ И 0ЛИГ0САХАРИД0В.

Нике приведены структуры повторяющихся звеньев 0-специфических полисахаридов P.aeruginosa семи иммунотипов Фишере-

4 > -D-Gal МАс AN- U1 -4) -D-GalNFaA-1acl-3 J -D-Qui HAc-(al-2) -l-Rha- (al -

I3

Ac Иммунотип 1 -3)-1-FucNAc-(al-3)-D-FucNAc-(0 >1-2)-D-Glc-(01 -, Иммунотип 2.

-4)-D-HanNAc3NA-t01-4)-L-GulNAc3HAcA-(al-3)-D-FucNAc-(01-

I

сн3с*мн Иммунотип 3.

-4):D-G1cNAc3NAcA-<01-3)-D-FucNAc-(al-3)-D-QulHAc-(al-4)-DGalNAc-( Иммунотип 4.

-4)-L-GalNAcA-(al-3)-D-QulNAc-(al-3)-L-Rha-H-

I2

Имиунотип 5,

-4)-Pse5NAc7NFn-(o2-4)-D-Xy1-< Э1-3>-D-FucNAc-(0-

Иммунотип 6.

-4)-L-GulNAc3NA-(al-4)-D-HanNAc3MAcA-(fll-3)-D-FucNAc-<al-

I

CHjONH Имиунотип 7.

Для работы были выбрани штаммы синегноййой палочки Р. а. 185, (имиунотип 1). Р. а. 07, и Р. а. 186 (имиунотип 2) и штамм Р. а. 286, (имиунотип 7). Эти патогенные штаммы наиболее часто выделялись в- качестве изолятов в клинической практике и обладали высокой вирулентностью.

1. Выделение липополисахаридов.

Липополисахариды P.aeruginosa выделяли модифицированным нами методом горячей водно-феиольной экстрахции. Суммарный вод-по-фенолышй экстракт подвергают исчерпывающему проточному диализу, нерастворимый остаток отбрасывают, суперна.ант подкисляют . уксусной кислотой до рЯ 3,2-3,5, выпавший осадок отделяют фильтрованием и, после концентрирования фильтрата упариванием на роторной испарителе, ЛПС высаживают 6-3 объемами этанола. Выход ЛПС после растворечия осадка, диализа и лиофилизации составил для птаииов иммунотипа 1 и 7 5-7'/., а для иммунотипа 2 - 2-4% от веса сухи» клеток, что соответствовало повышению выхода ЛПС из тех го птаммов по сравнению с традиционной методикой в 1,5-2 раза. Содержание белка в препаратах не превышало О, .5%.

2. Изучение протективности ЛПС. Р,aeruginosa.

Протективныз свойства пр -ратов ДЙС были проверены на модели виутрибрюаинного синегнойного сепсиса, с использованием беспородные белья шлей. Яивотякя иммунизировали различными дозами ЛПС, а затеи па пятый день посла иммунизации Ы вводили 3-5 ЛДзд

* клеток P.aeruginosa тестируемого штамма. Оптимальный протектив- ■ пый зффоят наблюдался в диапазоне доз ЛПС 1-10 шсг. ЛПС бшш протективны только против гомологичных* огаииов. Наиболее про-тективея был ЛПС имунотипа 1, защищавший па 100% в дозо 1 шсг.

ЛПС иммунотипа 7 также был активен, ко d дозе 10 шсг, и. 100% протективности иногда кс удабалось достичь даже яосле 2-3 иммунизаций. Штамм РА 286 имЦунотипа 7, использованный в исследованиях. продуцирует большое количество .чрезвычайно активных

протеолитических ферментов, что обусловливает его высокую вирулентность.

Протективность ЛПС иммунотипа 2 проверяли при заражении клетками сииегнойной палочки двух различных штаммов. Штамм РА 07 является штаммом-суперпродуцентом экзотоксина А, а штамм РА 186 продуцирует нормальное количество этого белка. Выяснилось, что ЛПС иммунотипа 2 является лишь умеренно протективным против штамма РА07 (100% протективности не было получено при дозах 10 ' мкг ), но оказывается сравним по эффективности с ЛПС иммунотипа 1, если заражение проводилось клетками штамма РА 186.

Изучение токсичности ЛПС P.aeruginosa »ало результаты, суммированные в таблице 1.

Таблица 1. Токсичность ЛПС P.aeruginosa,

Иммунотип Fl . F2 F7

ЛДвд (иг) 3.2 3,2 1.8

Для исследования причин низкой токсичности ЛИС P.aeruginosa было решено охарактеризовать химическое строение его липида А, как компонента ЛПС, определяющего его иммунобиологические свой-• ства.

Последующая работа развивалась по двум направлениям, ■ а именно: а) конструирование углевод-белковых коньюгатов на основе О-специфических.ПС, присоединенных к белковым носителям (БСА или экзотоксин А) и б) установление химического строения липида А и синтез на его основе искусственных липоолигосахаридов, как антигенов нового типа.

3.Получение и характеристика О-специфических полисахаридов P. aeruginosa.

Полисахариды получали гидролизом соответствующих ЛПС 1%-ной АсОН (100°С, 3 ч) и выделяли последовательными хроматографиями на колонках с Акрилексом П-В и Сефарозой 45. Молекулярный вес полученных полисахаридов по данным ВЭОХ на колонке Zorbax GF-250 составил для nCFl (полисахарид иммунотипа Фишер 1) 45 кД. nCF2 -10 кД, a nCF7 - 55 кД. Спектры 13С -ЯМР, полученных полисахаридов были идентичными опубликованным в литературе.

Полисахариды не давали реакции преципитации с антисыворотками к убитым клеткам сикегнойной палочки гомологичных штаммов, но активно ингибировали взаимодействие этих антисывороток с исходными ЛПС в твердофазном иммуноферментном анализе. При иммунизации мышей в дозах 1-50 мкг, полисахариды не вызывали образования антител и ие проявляли протективного эффекта.

4.'Гидролиз полисахаридов иммунотипов 1 и 7.

Поскольку иммуногенность полисахарид-белковых-коныэгатов

зависит от длины полисахаридной цепи, нами была осуществлена частичная деполимеризация полисахаридов иммунотипов 1 и 7 до молекулярного веса приблизительно соответствующего полисахариду иммунотипа 2.

Оба полисахарида ПСП и nCF7 при растворении о воде в кон* центрации 50 нг/мл дали растворы с рН 2,69 и 2.36 соответственно. Растворы, подкисленные добавлением трифторуксусной кислоты до рН 1,80 в 0,80 соответственно, инкубировали при 105°С в термостате. Анализ за ходом фрагментации полисахаридов выполнялся методом ВЭХХ. Кодифицированные полисахариды, обозначенные как nCFl„ и ПСП^, имели мол. вес. около 10 кД и активно ингибировали взаимодействие анти-ЛПС сыворотки с ЛПС в ИФА-тесте.

5. Частичное расщепление по Смиту полисахарида иммунотипа 2.

Из структуры полисахарида шт следует, что он может быть

подвергнут расщеплении по Сайту. Эксперименты по окислению ПСГ2 NaJO^ показали, что полное разрушение остатков Glc приводит к полной потеря серологической активности полисахарида. Были по- • добрайы соотношения концентраций полисахарида и RaJO^, при которых по даннш! ИФА сохранялось до 70% серологической активности • CCF2. Па рис. 1 приведена разработанная схема частичного pacnjen-лепия по Скпту.

I e-L-FucHAc {1-3)-D-FucHAc (1-2) -D-Glc (1-3 П n

1.йаЛ04< 20 nil; 1% NAOAc, рН 4,0,

2. ilaBHjj ' . "

3.Гель-фильтрация на TSK-40F (О.ЗХ АсОН)

4.2%-АсОН, 100°С, 2 час. *

5.Голь-фильтрация па TSK-40F (0,3% АсОЯ)

t a-L-Fuc?iAc (1 -3) -D-FucHAc (1-2) -D-Glc (1-3)1 д-L-FucNAc (1 -3) -D-FucHAc-^7 OS-l - n*0, 0S-2 - n*l, OS-3 - n=3, 0S-5 - n=t Рис. 1. C&eua частичного расс5пле!шя по'Сшггу О-специфичёског^ йолисахаряда нмунопша. 2,

Поело выделения в индивидуальном состоянии первый и последний члены этого ряда олигоыёр-гомологов (соответственно. ОС-1 и ОС-5) были исследованы' методами С13~ЯМР-спектросхотга и Ш. В таблице 2 приведено отнесение сигналов спектра 1 С-ЯМР

олигосахарида ОС-1 и исходного полисахарида ПСГ2.

Таблица 2. Химические сдвиги в 13С-5ШР спектрах

полисахарида ПСГ2 и олигосахарида ОС-1/

Соедине- Остаток (Л С2 СЗ Ш СБ СЕГ ние

nCF2 -*2>D-Glc(ßl 99,99 81,88 76,56 71.01 76,69 61.93

->3) D-FucNAc (ßl 103.26 52,46 78,01 71.44 71,67 16,15

->3)L-FucNAcfal 99,86 48,69 77,15 69.06 67,20 16,15

ОС-1 -*2)Gro 89.19 79,51 62,20

->3> D-FucNAc <ß 103,22 52,21 77,33 71,01 71.21 15,91

->)L-FucNAc(al 99,63 50,05 68,07 71,49 67,65 15,91

В спектрах также присутствовали сигналы СН3СО в области 22.7 - 23,1 м. д. и СН3СО в области 174.6"- 175,2 м.д.

Из полученных данных следует, что олигосахарид ОС-1 представляет собой одно повторяющееся звено полисахарида, содержащее окисленный до глицеринового альдегида остаток Glc. т.е. L-• FucNАс( al -3)-D-FucNAc(ßl-2)-Gro.

На основании спектров ^С-ЯМР исходного полисахарида, олигосахарида ОС-5, их моносахаридного анализа методом ГХХ в виде альдитолацетатов, а также поведения олигосахаридов при гель-фильтрации методом ВЭЖХ был сделан вывод, что выделенные олиго-сахариды ОС-1. ОС-2, ОС-3 и ОС-5 действительно построены полимеризацией повторяющихся звеньев IICF2 и содержат возрастающее количество иммунодомннанткых остатков Glc.

6. Иммунологическая характеристика олигосахаридов.

На рис. ci представлены данные эксперимента по ингибированию полученными олигосахаридамн взаимодействия антител, специфичных

[1 ) (<Ч'«<>

D&srj iOS-e OOS-2 XOS-г 40S-1 Гхе.г KKTMiposaiu:» <u2Toaua;uua Bsuuoseictsu ЯК-всесМгташ акткт в ЛЮГ2.

Для оценки серологической активности выделенных олигосаха-ридов и сравнения ее с активностью ПСГ2 для ОС-1 —ОС-5 и ПСГ2 были определены константы диссоциации представленые в таблице 3. Таблица 3. Константы связывания ПСГ2 и ОС с антитетлами к ЛПСР2.

Препарат

ПСГ2 ОС-1 ОС-2 ОС-3 ОС-5 Ка 3.8*104 4*10* 3,6»103 3.2М04 1.1М04

Из данных, приведенных, в таблице 3 следует, что участком полисахаридной цепи, оптимальным для взаимодействия с активным центром антитела, является область размером в три повторяющихся эвена, хотя определяющий вклад в специфичность детерминанты вносит один остаток С1с, взаимодействующий с активным центром антитела. С учетом необходимости снижения роли терминального остатка ГисЯАс, для синтеза олигосахарид-белкового конъюгата был выбран олигосахарид ОС-5.

Для исследования возможности взаимодействия антител с антигенной детерминантой, находящейся внутри короткого олигосахари-да, привязанного к белковой молекуле, было решено приготовить коньюгат 0С-2 с белком, хотя использование его в качестве про-тективного иинунизируюаего препарата смысла ие имело, так как такой коньюгат должен индуцировать антитела, специфичные преимущественно к терминальному остатку ГисНАс, не являющемуся иммуно-доминантньм в нативном полисахариде.

ГЛАВА 2. СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫХ КОНЪЮГАТОВ.

1. Синтез коньюгатов и-слецнфичеркнх полисахаридов с бычьим сывороточным альбумином : ьиА-иОм, ьиА-никй- и ьил-пи1-у .

Икыунотип 7, Р. а. ¡¿иь. ~

' Полисахариды ПСП и ПСП активировали водорастворимым кар-бодиимидои, а ПСЕ2 активировали брокциаион. В качестве спейсера, "был выбран гептацетнлепдиашш, который присоединяли, к молекуле • БСА по карбоксильным группам активированным водорастворимы» кар-бодиимидоя. Количество вводимых аминогрупп оценивала, ; Колориметрически с тринйтробензолсуяьфокислотой.. Синтезированные коньюгата выделяли гель-хроматографией на колонке с Сефарйзой 6В-СЬ. Для преодоления неспецифическойсо£бцин в элюнрующий буфер Добавлялся МаС1 до концентрации 0.5М.

Из-за высокого содержания в исследуемых полисахаридах ами-

иоеахаров использование колориметрических методов их обнаружения оказывалось недостаточно надежным. Поэтому для обнаружения конь-вгатов в хроматографических фракциях использовался твердофазный нммуиоферментный анализ (ИФА), при помощи которого во фрахциях определяли серологически активный материал, сорбировавшийся на планшетах для ИФА. Полисахариды исследованных иммуыотипов сами или в смеси с белком на планшетах не адсорбировались и положительной реакции не давали, но их коньюгированная форма сорбировалась очень активно. Белковый профиль злюции строили пользуясь микромодификацией метода Брэдфорд. Белковые серологически активные фракции объединяли и диофилизовали после исчерпывающего диализа против Н2О. Содержание углеводов в коньюгатах с ПСП и ПСГ2 определяли колориметрически, пользуясь калибровочной кривой, построенной по соответствующему полисахариду. Содержание углеводов в БСА-ПСР1 составляло примерно 17%. в коныэгате БСА-ПСГ2 -10%,а в коньюгате БСА-ПСГ7 - около 20%, если исходить из содержания белка в препарате БСА-ПСГ7 по аналогии с двумя другими коньюгатами. Уровни серологической активности коньюгатов подтверждают такие оценки.

2. Изучение протективности подученных коньюгатов.

При проверке коньюгатов на протективиость, беспородных белых мышей иммунизировали в дозах 50 икг препарата в двух вариантах. 1)свободным коныогатом и 2)в присутствии максимальной дозы ЛПС, на вызывающей самостоятельного прот«ктивного эффекта, а именно 10 нг на мышь, и она входила в состав самостоятельного контроля при экспериментах по протективности. В таблице 4 представлены данные данные, полученные при иммунизации по варианту 2.

Наибольший протективный эффект конъюгаты имели при введении «х с гомологичным ЛПС. ГетерояогичныЙ ЛПС стимулирующего эффекта не оказывал, и поэтому в дальнейшей конъюгаты испытывали на протективиость, вводя при первой иммунизации 50 мкг конььгата в присутствия 10 нг гоиологичного ЛПС. При последующих кммуиизацн-Ях вводили чистый коньюгат.

При иммунизации конъюгатом БСА-ПСГ2лучший протективный эффект был.подучен При заражении мышей клетками штамма РА 186. При заражении сильно токсигенным штаммом РА 07, коньюгат протектив-шш не был, что объясняется необходимостью наличия токсин-нейтралнзуиаих антител.

В случае коньюгатов БСА-ПСП и БСА-ПСГ7, 100%-ной защиты достичь не удалось даже после многократных (до четырех) иммуни-

эаций. Очевидна также необходимость замены БСА на экзотоксин А с целью повышения протективности полисахарнд-бвлковьи коньсгатоа в случае активно токсигенных штаммов.

Таблица 4. Протективность синтезированных конъюгатов при заражении культурой клеток Pseudomonas aeruginosa в дозе 5 ЛЛс^.

Иммунизация 1

Коныэгат I И III IY

(инфицир. штамм)

Fi (Ра185) töAVl^Fl ExtA/PSFl_ в 40 • 60 40 100 60 80

F2 BSA/PSF2 60 100 . - -

(Pal86> ExtA/PSF2 100 - - -

F2 BSA/PSF2 .0 0 _ ■ _

f Pa071 ExtA/PSF2 60 100 - -

F7 • (Pa286) BSA/PSF7 BSA/PSF7Q ExtA/PSF7_ H ООО n to to 40 too 100 . 60 -80

3. Получение п проверка протективности коньюгатов с укороченными полисахаридами и Экзотоксином А. Г На основе ашшированного SUA н укороченного ПС F7a был сип-тозирозап коиьвгат БСА-ПСПв н его протектквкосгь была сравнепа с коаьсгато'! БСА-ПСГ7. йэ таблицы 3 mi видим, что коньюгат с укороченной углеводной цепьэ имея значительно более высокую про-тектнвпость. Иа оскбаатш зтая дакиык было ревэяо синтезировать ' копъюгата о зкзотояспкои ti на основе fcCFÍB, FTCF2 и Í1CF7K.

ГоютешшП по дашш ВЭШ» ва коговко Zprbax GF-25Q зкзо-токснп А бот проашшироваа гагга&тидекднашгаоа согласно методике, отработакой для БСА. Полученный аштнрюаавЕыЯ экзотоксин А , *коньсгироваяи о еэди§гщ!5розашьт пояисайаридаш. Выведение, конъюгатов экзотоксина А с ПСПа я HCF7q проводилось нетодси апробированным ва soireoraTaR е БСА.

Из преяставяешАа в таблице 4 даниых следует, что замена БСА на экзотоксин А принципиально улучшла протективность всея коньюгатов. Наиболее заметный эффект наблюдается в случае инфицирования клетками иммунотипа 2 как токсигенного штамма РА 07; так и штамма РА 186 с умеренной продукцией экзотоксина А.

В случав иммунотипа ФКшер 7 протективиость конызгата на основе экзотоксина А осталась практически такой же,как и у конь-югата БСА-ПСПВ, что объясняется тем, что главными факторами патогенностн здесь являются высокоактивные зластазы, продуцируемые микроорганизмом.

Протективность конъюгата экзотоксин А-ПСПВ такае улучшилась по сравнению с протективностью коньвгата БСА-ПСП.•

Следует подчеркнуть, что одновременное введение полисахарид-белкового коньсгата и гомологичного ему по полисахаридной цепи ЛПС приводило к наибольшему протектнвному эффекту. Это мож-Н9 объяснить тем, что активации ЛПС подвергаются те же клоны лимфоцитов, которые получают слгнав от антигена. В этом случае мы имеем дело с антигеном, обладающим иммуностимулирующей активностью и вводимым одновременно с другим антигеном той же специфичности, но лишенным иммуностимулирующей активности. То есть используется пара антиген-антигенспецифический иммуномодулятор (в данном случае это иммуностимулятор).

4. Оптимизация свойств белка-носителя и синтез балок-олиго-сахарндных коньюгатов. •

Введение гептаметилендиаминового спейсера приводит к ухудшению свойств белка с точки зрения его растворимости м поэтому было решено сравнить возможности синтеза коньюгатов BCA-0CF2 с участием немодифицированного белка (БСА), белка, амииированного гептаметилендиамином (БСА-С7), и БСА. превращенного 6 его аши-гидразидное производное по карбоксильным группам Glu и Авр (БСА-N2).

Сравнение результатов введения в бедок остатков цемобиозы. взятой в концентрации 50 иг/ил, показало, что в БСА. БСА-Н2 к гептаметнлендиамии-БСА (БСА-С7-11) в одинаковых условиях вводится следующее количество углеводов:

БСА- 18 остатков цеалобиозы,

БСА-Ы2- 22 остатка цеялобиозы.

БСА-С7-11 9 остатков целлобиозы.

Различия между БСА в БСА-Н2 не били принципиальными и поэтому оба' белка были взяты для синтеза коньсгата с 0CF2.

Синтез и выделение коньюгатов BCA-0CF2 и BCA-N2-0CF2 проводили методом восстановительного аминирования в присутствии NaCNBHg как восстанавливающего реагента. Коньюгат BCA-0CF2 выделяли ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (собирали адсорбированный материал), а коньюгат BCA-H2-0CF2 - ионообменной

хроматографией на КМ-целлюлозе (собирали адсорбированный материал). Ионообменная хроматография позволяла полностью отделиться от непрсреагировавшего незаряженного олигосахарида, присутствие которого было нежелательно в опытах по изучению протективности.

На основании аминокислотного анализа синтезированных конью-гатов (содержание FucNAc), а также колориметрического определения содержания в них углеводов реакцией с фенол/серной кислотой, были получены согласующиеся между собой оценки. Конъюгат 5CA-OCF2 содержал около 2 олигосахарндных цепей на молекулу БСА, а конъюгат BCA-N2-0CF2 содержал 1,5-2 цепи на молекулу. Молекулярный вес коньюгатов. оцененный методом ВЭХХ на колонке Zorbax CF-250 был примерно одинаков у обоих коньюгатов и составлял около 70 кД.

Серологическую активность коньюгатов оценивали методом ИФА, после адсорбирования их на планшетах. Из рис. 3 следует, что конъюгат BCA-N2-OCF2 значительно более активен серологически, чей конъюгат BCA-0CF2. Так как плато, свидетельствующее о насы-. сэини центров сорбции на твердой фазе, простирается в случае обоих коньюгатоз до одной и той во концентрация, вряд ли следует говорить, что способность к адсорбции у коньюгатов сильно разли-чзотел. Объяснение« различия о доступностп олнгосаяаридов мояет сяуаить то. что огш присоединены по разным остаткам а молекула БСА. Ацялгидразидк Asp it Glu располоаеиы блияо к поверхности глобули, 48« остатки Lyo, что моает сказаться п на доступности гаптепа дал антител. *

obsa/os-б absa-n2/0s-5 obsa-n2/os-2 Ряс.3 Взаимодействие оянтосагарнд-беляовшг коньюгатов с аятп-ЯПС сывороткой. ■ . ' • . С целью выяснения возможность получения, серодогичесхи активного коньюгата из 00-2, с уверенной ппгибирующеД активностью, был поставлен эксперимент по коньюгировашго БСА-Н2

и ОС-2. Коньюгат бия отделай от ««прореагировавшего олигосахари-да диафильтрацией на мембране UH-10. Согласно данным аминокислотного анализа коньюгат содержал 4 олигосахаридных цепи на мо-лекуяу белка. Полученный коньюгат сорбировался на планшетах для ИФА и реагировал с антителаии к JII1CF2 (си. рис.4), что свидетельствовало о доступности имеющихся иммунодоминантных остатков С1с. Проверкапротективности синтезированного коньюгата BCA-N2-0CF2 показала,что при введении 50 мкг конъюгата на мыоь в присутствии 10 иг Jli]CF2, он индуцирует протективцый иммунный ответ, не уступающий ответу, вызываемому коньюгатом BCA-nCF2. УСТАНОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ ЛИПИДА А И СИНТЕЗ УГЛЕВОД-ЛИПИДНЫХ КОНЬЮГАТОВ 1. Химическое строение яипнда А Р.aeruginosa. Для исследования химического строения липнда А сннегнойной палочки были выбраны ЛПС трех штаммов S-типа (РА 185, иммунотип 1; РА 07, иммунотип 2; РА 286, иммунотип 7) и одного штамма R-типа (РАС 605). Сравнительное изучение липида А из четырех ЛПС, обладающих различными углеводными цепями, должно было дать ответ на вопрос о консервативности структуры липида А.

На первом этапе работы был проведен количественный анализ препаратов липида А различных штаммов. В таблице 5 приведены дан-вые количественного анализа препаратов яипида. А подученных я результате гидролиза 0,1 Н HCl.

Таблица 5. Количественный состав препаратов липида А Р.aeruginosa

параметр Препарат ClcNA (ИЗ) (jlB0l/Bg) ClcH-AA ((IBOl/Bg) P04-opr. (fiaol/ftg) вирные кислоты «Hg/Bg)

LpA-Fl/HCl 0,428 1,065 0,350 715,3

LpA-F2/HCl 0.466 1,152 0,395 656^8

LpA-F7/HCi 0,520 1.202 0,393 675,0

LpA-PAC/HCl 0,508 0,973 • 0,564 599,5

Из данных табл. 5 следует, что препараты липида А из различных вггаммов, полученные в одинаковых условиях практически не различаются мекду собой. Очевидно, что углеводно- фосфатный скелет липида А, подученного гидролизом НС1 представляет собой дисаха-рид из двух остатков С1сК и одного монофосфата.

На основании предварительных экспериментов был разработан подход к установлению строения липида А, представленный на Рис.4. '

- ro-

ll-саязанаью жирные кисяоты/пояокениа К DO

1 )о-дезацшшрование о,гН NaOH ^ "а)Лнализ гзгрных кислот

О-свяэашшэ гярные кислоты

1 )НР-дафосфорил.

2)НС1/ИаОАо-гидр."

3)Ш£5-ан&лиэ

ЬР5

1 )О-Д038ЦИЛИроВ81Ш9 0.2Н НаОН 100°С, 1 час.

2)дефосфорнлироваиив «ах Iff

3)аналиэ иотодои иетилированкт

Гидролиз 0,1 U NaOAc,

-—-» LpA/HaQíW

рН 4,0, too и, з чао.

Гидролиз o,i Ы №21,100^,1,5 чао

ыопофосфорил липид ¿(LpA/НСП

Iteróseнио 4--Р0 4- .

грушш

пиетанолиз

г) СН £ 2-мв тнлиров.

3)перивтилировише

4) ribC/UC- анализ

с

i »Восстановление НвШЦ.б-Ю чес., 2)Диализ илй 0-28 хроматогрефия

LpApei (восстановленный липнд А)

1) Гидраэинолиз, «в час.,too <?

3) Н-ацвтилированив, До20/Ыа0н

3) 0-гз хроматография

4) TSK-406-хромвтогравия

Э-конфпгурацнл гдихсзад-ной связи

1)ПеривП1ДИрОВ8НИ9

С1сНЛс/Л.6С1сНАс-о1 'Н-ЯНР-вналиэ

21ацетолиз 3)Г20С/ЫС-анализ

1,0-заиещенив в дисахариде'ййййД«

Рис.4. Схема структурного анализа яипида А Р.aeг^lglnosa.

(ШР-спехтр дисахарида, выделенного после хроматографии на ТБК-40Б, оказался токдественныа спектру заведомого синтетического образца Н-ацетия-глюкозаминил-Э-1, В- Н-ацетил- глюкозаминн-тола. Дублет при 4,8 рри с £»10 йг свидетельствовал о Э-кои-фигурации гликозидной связи иёвосстанавливасогго С1с!1. Перкети-лироаакие дисахарида с последующи, ацетолнзои и ГЗХ/ЦС-аналязои подтвердило, что остатки С1сН в яипиде А соединены 1,Б-связью.

Пояоаение фосфатной группы в ионофосфория липиде А было выяснено следующий образом. Липид А бил подвергнут последовательно восстановлению НаВИ^, иетанолизу в сиеси 1Н НС1/МеОН, метилированию диазометаном, периетилированию смесью СН3/НаОН/0И5О. При этом перыетилированньШ остаток С1сН сохраняет, остаток Н-

*

связанной жирной кислоты я метилированную фосфатную группу. Анализ методом ГIX/НС показал присутствие фосфатной группы только b остатке невосстанавливающего GlcN. Производное глюхозаминитола, полученного из остатка восстанавливающего ClcN липида А фосфорн-лировано не было. На хроматограмие присутствовали два пика соответствовавших фосфорилированному ClcN, несущему остаток Н-связанной 3-гидроксндекановой кислоты и имевшие одинаковые массы H/Z&555 с соотношением площадей на хроматограмме 3:1. В масс-спектре электронного удара мажорного компонента присутствовал сигнал с М/2»406, характерный для остатка GlcH. фосфорилиро-ванного в положение 4'. Uacc-спектр электронного удара минорного компонента содержал сигнал с U/z=2*2, характерный для GlcN. фос-форнлированного в положение 6*. Наличие минорного сигнала мокко объяснить миграцией фосфатной группы в положение 6* в ходе мета-иолиза или кислотного гидролиза при получении липида А из ЛПС. Дополнительные эксперименты показали, что действительно, нагревание липида А в присутствии кислоты приводит к увеличению содержания 6'фосфорилированного производного. Окончательно этот вопрос был решен при помощи ^Р-ЯЫР-спехТроскопии.

На рис. 5а и 5tí представлены спектры Р-5ШР липида А из ЛПС РАС 605, полученного гидролизом в 0,11! НС1 (рис. 5a). и липида А, полученного в результате гидролиза в НаОАс-буфере (рис.5^). На рис. 5В представлен спектр Р-ЯМР липида А из JII1CF2, полученный в результате уксуснокислого гидролиза. В спектре липида А, полученного солянокислым гидролизом присутствует мажорный сигнал с 5=3,47 м.д,, соответствующий 4*-фосфату. Сигнал меньсоП интенсивности с 5=4,37 можно отнести х фосфату в положении 6*. Шпог-ралы этих сигналов относятся как примерно 3:1. В спектре лппида А, полученного гидролизом в НаОАс-буфере с рН 4,0 присутствует сигнал с д=3,39 и. д. (фосфат в положении 4') в сигнал с 5=1,63 (фосфат а положении 1). Сигнал с ¿«4,29 носит минорный характер, что согласуется с малой возможность» миграции фосфата в чрезвычайно мягких условиях гидролиза ЛПС в данной случав. Следоаа-твльнв фосфатная группа в ыонофосфорял липида А находится а положении 4'. Из спектра на рис. 5® следует, что при длительной гидролизе' 1% АсОН также образуется иовофосфория лстшд А.

Pnc.5a 3IP -ЯМР-спектр ладвда L рЛ/ilCl

Pao^0 31Р-ШР-сп0ктр дипида L pA/VaOAo

t.» -i •• ■ '*м * •«» » 'M.»

Рис. 5B 31Р-ШР -спектр липвда L рА/АоОН

Распределение лирных кислот в яипиде А Р,»егим1повв. Ь таблице Ь приведены данные анализа вирных кислот л (1С а препаратов липида А исследованных штаммов Р.aeruglnos». Таблица 6. Вирнокислотный состав препаратов липида А Р.«еги;1по5«.

Препарат

Кислота ЬрАП/НСГ ЬрАГ2/НС1 ЬрАП/НС! • 1рАРАС/НС1

30НСЮ:0

<ао1/2во1С1сН) 1,24 0,95 1,03 1.24

(во1/2 во1

-30НС121_______ „1Л5______ _____1*55.—. ___1Л4______ _ЛЛ1______

С12:0

(во1/2шо1С1сН) 0,62 0,54 0,65 0,20

(во1/2то1

__30НС121______ ..О^з______ ____ч^еа_____ ____олс______ ___0^31______

20НС12:0

<во1/2юо1С1сН> 1,50 1.28 0,96 1,71

(то1/2то1

__30НС121______ ..1,32______ ____1.04._____ ___1Л5___—.

30НС12:О ___

(15О1/2ПО1С1СН) 2,12 1.81 1,85 1,95

(во/2ио1

30НС12) 2,00 2,00 2,00 2,00

Эирнокислотный анализ ЛПС РАС Б05 после его О-дезацилп-рования 0,1 К НаОН. показал, что единственной Н-связаниоЙ ЕиряоЙ-кислотой в липиде А является 3-гидрокси-додехановая квслота. .

Для выяснения вопроса о распределении О-саязакпш; хиркиа кислот в яипиде А был применен катод масс-спектрометрпк с лазар-ной десорбцией (ЛДИС). При анализе липида А методой ЯД1!С образец но долвеи содержать заряженных фосфаттгх групп, поэтому ЛПС всей четырех штаммов дефосфорияировааи обработкой 48%-ноЙ ВТ, поело чего подвергли гидролизу в ОД В НС1 ш а 0,1 И КаОАс, рН 4.0.

Мы проанализируем спектры, принадяехащие препаратам лияада А из ДПСГ2, которые являются репрезентативными для всей совокупности полученных спектров. На рис.6а представлен спектр ЛДНС липида А, полученного гидролизом в 0,1М НаОАс> и снятом с ионами Св. На рис. представлен спектр липида А, полученного гидролизом в 0,1 М НС 1 и также снятый в присутствии ионов Се.

Pao.6a ЛДХ-спектр дшщда A L pA/F 2-WaOAo (Ci )

P.-.0.60 JUr.iC-cnsKTp липвда A L pA/F 2-HCl (Cr)

692 " ГсТсН7*

од

8вЗ

п

©ЕЗ

ГЙ

965

708 'СПсЙ

879

ГК

¥-ок Р '

I?2

981

Еб Ё) ©а!

1421

• П , ,

51 ЁЗа) ®0 © ©а

1575 "С1сК "ХсПсН

1607

-он

пгп

яги ЙГС

. - И'"" ГТ0Н

© ©а© еа © ©а® ¿¿,

1501

1591

-он

■о ►-он I—о

гГ П

1Рио,7 Строение фрагаантов п молекулярных ионов липида А при ЛДМС-опектроокопии.

аз I

...... П~

а) ао © ©а

На рис.7 показаны структурные формулы всех псевдомолекулярных ионов, получающихся из липида А и его фрагментов (все компоненты содержат один ион Cs+. вес которого включен в вес иона). Анализ ЛДМС-спектров, выполненный с привлечением этих данных ставит вопрос о реальности существования изомеров липида А, содержащих пять хирнокисдотных остатков. Для ответа на этот вопрос были использованы данные сравнительного количественного жирно-кислотного анализа ЛПС и липидов А всех четырех штаммов, а также результаты химической модификации липида А.

ЛПС РАС 605 был окислен 0,1 К NaJO^. Анализ соотношения фос-форилированного и нефосфорилированного ClcH, несущих остатки Н-свяэанной 3-гидроксидодекановой кислоты, в виде их перметили-рованных производных, методом TSX/UC показал, что при окислении ЛПС РАС 605 HaJOjj в липиде А была разрушено примерно 70% восстанавливающего ClcH. Следовательно в нативном ЛПС примерно 70% молекул липида А не содержат в положении С-3 остатка 3- гидрок-сидекановоЯ кислоты.

Второй подход использовал метилирование гидроксильных групп липида А в условиях исключающих отщепление О-связанных жирных кислот. Ыетилирование монофосфорил липида А триметилоксоний бор-тетрафторидом с последующим ацетолизом, восстановлением НаВН^, перацетилированиеи и анализом методой хроиатоиасс-спектрокетрни показало, что из остатков восстанавливающего GlcN липида А было получено около 70% 3.4-дн-0-метильного производного и 30% 4-0-моноыетильного производного перацетчлированного Н-ацетил-глю-козаминитола. Это также подтверждает наличие в примерно 70% молекул липида А P.aeruginosa свободной гидроксильной группы в положении С-3 и хорово согласуется с результатами эксперимента по окислению ЛПС РАС 605.

Сравнение данных количественного анализа содержания жирных кислот в ЛПС н препаратах липида А показало, что при получении яипидов А гидролизом в 0,1Н НС1 или 1% АсОН не происходит отщепления жирных кислот. ЛДМС-анализ метилированного диазометаном монофосфорилированого липида А также подтвердил, что пентаацили-рованные изомеры липида А присутствуют в нативном ЛПС и не являются артефактом, обусловленным методами получения и анализа липида А.

Из всей совокупности экспериментальных данных был сделан вывод, что в липиде А P.aeruginosa положения 3 и З'ацилированы 3-гидроксидодекановой кислотоП, причем в примерно 70% молекул

липида А остаток кислоты в положении С-3 отсутствует.

Таким образом мы вынуждены сделать вывод, что липид А ЛПС Р.aeruginosa, иммунотипа 2 по Фишеру, который мы рассматриваем в данный момент, представляет собой реально существующую сложную смесь из пяти-восьми изомеров, различавшихся между собой числом, типом и положением 0-связанных вирных кислот. Совершенно тождественный вывод следует из анализа дипидов А трех других исследованных штаммов P.aeruginosa. Число изомеров и количественное соотношение между ними варьирует от штамма х штамму и составляет обычно 5-8 изомеров.

Иммунобиологические свойства липида А.

Йыли исследованы пирогенносп. лпс рао 605 и липида А, полученного солянокислым гидролизом из штаммов РА 07 и РАС 605, а также способность липида А индуцировать биосинтез TNF и 116.

Сравнение с ЛПС Е.соП и липкдом A S. abortus показало, что ЛПС и липид А P.aeruginosa в дозе до 10 мкг/кг ие обладает пиро-ренностыз. Препараты знтёробактериалышх ЛПС были пирогенны в дозе до 0,1 мкг/кг.

Способность к индукции THF и IL6 также была снижена у препаратов липида А из синегнойной палочки примерно в 500 раз, однако все еще была заметна при индукции 116 в концентрациях до 0,2 мкг/мл.

Пониженная биологическая активность липида А P.aeruginosa по сравнение с энтеробактериальиыми липидамм А становится понятной в свете обнаруженных нами особенностей его химического строения. Отсутствие шестого яирнокислотиого остатка и наличие только жирных кислот с короткими цепями, видимо, ие дает возиолпости реализовать стабильную коифоркацио молекулы липида А, необходимую для эффективного взаимодействия с внешней иеибраяой ля«|оад-ной клетки.

Отсутствие токсичности в гшрогенностн у препаратов пшвда А P. aeruginosa позволяет надеятся на успешное использование его в качестве носителя и инмуномодулирующаго компонента при конструа- ' роваиии искусственных шшуногенов.

. 2. Синтез искусственного липоолигосахарида.

1 Для "коньюгирования с олигосахаридным гаптеном было выбрало монофосфорильное производное липида А, получающееся в результате кислотного гидролиза в ОД Н HCl (75 мин., 100°С) или 1% АсОН (3-4 ч. 100°С). Уксуснокислый гидролиз применялся для препаративного получения nCF2 и было решено использовать липид А, полу-

чаемый этик методой. Липнд А бил очищен переосаждекиеи кислотой (НС1) из его раствора в 0,02% Е^Н. Он был свободен от примесей 1ПС по данным аминокислотного анализа и не обладал серологической ахтивностыэ при адсорбировании на планшетах для ИФА.

По восстанавливающему концу олигосахарида методом востано-вительного аминирования был введен остаток тетраметилендиамина. Аминированный олигосахарид был очищен двукратной хроматографией на Сефадексе С-25. Для коньюгирования использовали активацию фосфатной группы дициклогексилкарбодиимидом. Общая схема синтеза липоолигосахарида (ЛОС) приведена на Рис.8.

• н2ы-{сн2)4-ын2

ОБ-О-Сго-ЮБ-ОН

НаСНВН

3

дициклогексил-

карбодиимид/^ЫФА

НН-1СН2>4-НН2

О

он

♦ . Н0-1-0-

липид А

ОЭ-О—

ОН

«Н-(СН2)

О

-НН-^-О-Л0СГ2

липид А

Рис.8. Схема синтеза искусственного липоолигосахарида (ЛОС*?.

Искусственный Л0СР2 был выделен хроматографией на Сефарозе 4Б. Собирали материал, элюировавшийся в свободном объеме. 0СР2 при этом злшровался с полным объемом колонки.

Аминокислотный анализ показал, что препарат Л0СР2 содержит С1сН н ГисМ в соотношении 2:3.

Серологическая активность синтезированного ЛОС была оценена после его адсорбции на планшетах для твердофазного ИФА. Полученные данные представлены на рис. 9.

Как и в случае полисахаридов, исходный 0СГ2 не сорбировался на пластике, а липид А не обладал серологической активностью, что видно из рис.91 Таким образом мы видим, что синтезированный материал по своим физико-химическим и серологическим свойствам аналогичен природному ЛПС, и можно говорить о синтезе искусственного липоолигосахарида - ЛОС, моделирующего ЛПС сине-гнойной палочки.

с ( дут\ ) □ЦР5Г2 Ы(,А/0$-В ОирА

Рис. 9. Взаимодействие ЛПСГ2 и Л0СГ2 с антителами к ЛПСР2. Эксперименты по изучение иммуногенности синтезированного липид-олигосахаридного коньюгата (Л0СР2) показали, что он индуцирует при иммунизации мышей линии С57/В1 образование антител, специфичных х олигосахаридной части. В таблице 6 представлены данные по кинетике синтеза ^М и антител при иммунизации йытей ЛПСР2 и Л0СР2.

Таблица 7. Титры антител, к О-специфическому полисахариду, образующихся- при иммунизации Л0СР2 и ЛПСР2.

Титры антител

Антиген 5 день 7 день ' 14 день

(доза) 1бС 1еМ 1ВС 1ЕН

ЛПСР2 (50мкг) 800 6400 3200 6400 1000 800

Л0СР2 (80мкг) <100 800 1300 2000 100 300

Л0СГ2(30мхг) ЛПСГ2(10мкг) 800 6400 1600 6400 3200 12800 •

Сравнение иммуногенности синтезированного Л0СГ2 и нативкого ШСГ2 показало, что хотя Л0СГ2 и уступает по иммуногенности ЛПСР2 примерно в 5-10 раз, тем не менее он является высокошшу-ногенным соединением. При этом совместное введение Я0СГ2 я ЛПСР2 приводит к ярко выраженному синэргичесхому эффекту п индуцирует напряженный специфический иммунитет.

ВЫВОДЫ . .

1. Синтезированы протективные полисахарид- и олигосахарид-белковые коньегаты на основе бычьего сывороточного альбумина и

экзотоксина А синегнойной палочки и полисахаридов микроорганизма. Экспериментально подтверждена необходимость наличия антигенных детерминант нескольких наиболее важных факторов патогенности возбудителя.

Предложена использование гидразидных производных бычьего сывороточного альбумина в качестве носителя в синтезе искусственных антигенов.

2.Обнаружено скнэргическое действие гомологичного по углеводной цепи ЛПС при иммунизации полисахарид-белковыми коныэгата-ин. Предложено объяснение этого эффекта на основании антиген-специфической стимуляции гомологичным липополисахаридом клонов лимфоцитов, прошедших селекцию иммунизирующим искусственным углевод-белковым антигеном.

3.Проведено сравнительное исследование химического строения липида А ЛПС синегнойной палочки из четырех штаммов микроорганизма. Оптимизирована общая схема изучения химического строения липида А. Установлена полная химическая структура липида А сине-гнойной палочки. Впервые показано существование липида А с двумя неацилированныци гидроксильными группами в остатке восстанавливающего GlcN.

4.Охарактеризованы иммунобиологичекие свойства липида А синегнойной палочки. Предложено объяснение низкой токсичности, липида А синегнойной палочки исходя из его структурных особенностей.

5. Осуществлен синтез искусственного углевод-липидного коиью-гата с участием липида А и олигосахарида с антигенной специфичностью ЛПС иммунотипа Фишер 2 синегнойной палочки, моделирующий дативный липополисахарид. Показана его серологическая активность и иымуиогенность.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Кульшин В. А., Яковлев А. П., Аваева С. Н.. Дмитриев Б. А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрица-тельных бактерий// Код. Генетика Никробиол. Вирусол., 1987, Ш, с. 44-46.

2. Дмитриев Б. А., Кульшин В. А.. Цороз А. Ф., Анциферова Н. Г., Лапина Е. Б., Круковец И. Л. // Регуляция протективного ответа против Pseudaaonas aeruginosa при иммунизации искусственными антигенами//-Тез. Междунар. Симпозиума "Структура, биосинтез н функции молекулярных элементов иммунной системы". Пушшо. 1987. с. 84

3. Дмитриев Б. А., Кульшин В. А., Анциферова Н. Г., Вовк В. А., Мороз А. Ф. Протективные полисахарид-белковые искусственные антигены из О-специфических полисахаридов синегнойной палочки и ее экзотоксина А.// ДАН СССР. -1988. -т. 298. -*5- с. 1277-80.

4. Кульшин В. А., Анциферова Н. Г.. Ыороэ А. Ф., Дмитриев Б. А. Протективные искусственные полисахарид-белковые антигены из О-специфических полисахаридов бактерий Pseudomonas aeruginosa иммунотипов 1,2 и 7. //Журн. Ыихробиол. -1988. -Ж11. -с. 89-71.

5.Kulshln V., Lindner В.. Rietschel E.Th., Daltriev В.. Jager К., Zahringer U. Characterization of chemical structures of the lipid A component of P.aeruginosa LPS's// Тез. YI Int.Synp. Carbohydr.Chea., Yokagana,1990, B005.

B.Rietschel E.Th..Brade L.,Schade U..Seydel U., Zahringer U.. Lindner B.,Moran A.-P..Kulschln V.A..Haishloa Y., Hoist 0., Rohrscheidt-Andrzeveskl E.,Ulaer А.-J..Flad H.-D.,Brade H. //Chenlcal structure and biological activity of llpopoly-« saccharides//in:Endotoxin fro» pathophlsiology to therapeutic approaches.-1990.-Hedecine-Science Flamnarion, Paris p. 5-18. . ^

7.Rletschel E.Th..Brade L.,Hoist 0.,Kulschln V.A.,Lindner В., Moran A.P., Schade U.F., Zahringer 0., Brade H.// Molecular structure of bacterial endotoxins in relation to bioacti-vity// in:Cellular and aolecular aspects of endotoxin reactions.-ieds. Nowotny A., Spitzer 4.J., Ziegler E.J.)-1990.-Elsevier Science Publishers B.V.-Aiisterdai.-p. 15-32.

B.Kulshin V.A., Zahringer U., Lindner В., Jager K.-E., Dnitriev B.A.. Rietschel E.-Th.//Structural characterization of the lipid A conponent of Pseudomonas aeruginosa uild- • type ahd rough nutant lipopolysaccharldes// Eur. J.Biochen., 1991, v. 198, p. 697-704.

9.Rietschel E.Th.,Brade L.»Sçhade U.,Seydel U.,Zahringer U., Hoist 0., Kuhn H.-H., Kulschln V.A., Horan A.P., Brade H.//. Bacterial endotoxins:Relationship between cheBlcal structure and biological activity of the inner core-lipid A dooain// in:Microbial Surface components and Toxins in Relation to Pathogenesis.-(eds. Ron E.Z., Rotten S.)-1991.- Plenua Press.-New York.-p.209-217.