Предшественники бактериальных секторных протеиназ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список использованных сокращений Введение

1. Литературный обзор.

Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ

1.1. Предшественники субтилизиноподобных сериновых протеиназ бацилл: субтилизин Е В. sub tills, субтилизин BPN' В. amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg

В. liheniformis

1.1.1. Структура генов предшественников бациллярных просубтилизинов. Сравнительная характеристика

1.1.2. Получение предшественников и пропептидов субтилизинов

1.1.3. Процессинг предшественников субтилизинов и возможные механизмы активации

1.1.4. Взаимодействия пропептидов со зрелыми ферментами

1.1.5. Пропептид, как "внутримолекулярный шаперон" для белкового фолдинга. Функциональный анализ

1.1.6. Некоторые аспекты фолдинга субтилизина

1.2. Предшественники сериновых протеиназ химотрипсинового семейства - а-литическая протеиназа Lysobacter enzymogenes и химотрипсиноподобные протеиназы А, В, С, D, Е Streptomyces griseus (SGPA, SGPB, SGPC,SGPD, SGPE)

1.2.1. Структурная организация генов, кодирующих предшественники химотрипсиноподобных протеиназ

1.2.2. Изучение процессинга проферментов in vivo

1.2.3. Изучение функциональной роли пропептида 37 а-литической протеиназы

1.2.4. Взаимодействия между пропептидами и зрелыми 40 ферментами химотрипсиноподобных протеиназ S. griseus

1.2.5. Сравнительная характеристика предшественников 42 химотрипсиноподобных протеиназ бактериального и животного происхождения

1.3. Предшественники термолизиноподобных металлопротеиназ микроорганизмов

1.3.1. Структура генов, кодирующих металлопротеиназы, и 44 краткая характеристика ферментов

1.3.2. Изучение активации предшественников 47 металлопротеиназ in vivo и in vitro

1.3.3. Изучение функциональной роли пропептида 52 термолизина

1.3.4. Изучение функциональной роли пропептида эласгазы 54 P. aeruginosa

1.3.5. Изучение роли пропептида в секреции

2. Обсуждение результатов

2.1. Получение предшественника металлопротеиназы Brevibacillus brevis и изучение структурно-функциональных отношений в его молекуле

2.1.1. Экспрессия полноразмерного гена металлопротеиназы 62 В. brevis (прг) в Е. coli и анализ полученных продуктов

2.1.2. Идентификация компонентов Npr

2.1.3. Очистка и разделение полученных компонентов

2.1.4. Определение молекулярной массы профермента Npr

2.1.5. Пропептид Npr - сильный ингибитор собственного 70 зрелого фермента

2.1.6. Специфичность ингибирования

2.2. Получение предшественника глутамилэндопептидазы ^ В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro

2.2.1. Стратегия создания рекомбинантной экспрессионной 74 системы

2.2.2. Конструирование модифицированного гена gseBL и 76 анализ продуктов его экспрессии

2.2.3. Активация in vitro профермента GseBL

2.2.4. Очистка активированного GseBL

2.2.5. Экспрессия GseBL в отсутствии пропептида.

2.3. Изучение функций пропептида карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris методом делеционного анализа

2.3.1. Общая характеристика карбоксипептидазы Т Т. vulgaris

2.3.2. Конструирование и экспрессия модифицированного гена cpt

2.3.3. Очистка и характеристика растворимого продукта экспрессии модифицированного гена cpt

3. Материалы и методы исследования

3.1. Материалы

3.1.1. Ферментные препараты

3.1.2. Стандартные растворы

3.1.3. Среды для выращивания бактерий

3.1.4. Антитела

3.2. SDS-электрофорез в ПААГ

3.3. Иммуноферментный анализ методом Вестерн - блоттинга

3.4. Анализ аминокислотных последовательностей

3.5. Определение протеолитической активности ферментов

3.5.1. Определение активности металлопротеиназы

3.5.2. Определение активности глутамилэндопептидазы

3.5.3. Определение активности карбоксипептидазы Т

3.6. Штаммы бактерий и плазмиды

3.6.1. Металлопротеиназа В. brevis (Npr)

3.6.2. Глутамилэндопептидаза В. licheniformis (GseBL)

3.6.3. Карбоксипептидаза Т Т. vulgaris (СрТ)

3.7. Условия культивирования

3.7.1. Рекомбинантный продуцент Npr на основе Е. coli

3.7.2. Рекомбинантные продуценты на основе L-форм 102 P. mirabilis

3.7.2.1. Трансформация L-форм

3.7.2.2. Адаптация культур L-форм к росту в жидкой 102 среде

3.7.2.3. Ферментация рекомбинантных штаммов 103 L-форм - продуцентов СрТ и GseBL

3.7.2.4. Анализ экспрессии рекомбинантных генов 103 gseBL и cpt в клетках L-форм P. mirabilis

3.8. Очистка и разделение компонентов Npr В. brevis

3.9. Определение молекулярной массы профермента Npr

3.10. Определение кинетических параметров ингибирования зрелого 105 Npr собственным пропептидом

3.11. Активация предшественника GseBL экзогенными протеиназами

3.12. Выделение зрелого фермента GseBL

3.13. Синтез иммуносорбента для карбоксипептидазы Т

3.14. Выделение карбоксипептидазы Т из культуральной жидкости L- 109 форм P. mirabilis

3.15. Процессинг in vitro секреторной формы СрТ

4. Выводы

Большинство охарактеризованных к настоящему времени протеиназ из различных источников первоначально синтезируются в виде лишенных активности предшественников - проферментов, в молекулах которых после секреторного лидера (препептида) содержится активационный пептид (пропептид). Известно, что активация предшественников, приводящая к появлению протеолитической активности, сопровождается отщеплением и деградацией соответствующих пропептидов.

В отличие от препептидов, обеспечивающих транспорт белка через плазматическую мембрану, функциональная роль пропептидов до конца не установлена. Предполагается, что пропептиды могут быть необходимы не только для поддержания фермента в неактивном состоянии, но и для формирования функциональной третичной структуры белка, направляя свертывание белковой глобулы.

Изучение предшественников, их функциональной роли и роли их пропептидов требует, в первую очередь, наличия надежных способов получения проферментов, что в случае предшественников бактериальных протеиназ представляет сложную методическую задачу, которая до сих пор не решена. Основная проблема состоит в том, что предшественники бактериальных секреторных протеиназ, в отличие от предшественников пищеварительных ферментов млекопитающих, по своей природе не рассчитаны на длительное существование и в процессе секреции легко процессируются с образованием зрелого активного фермента. Поэтому получить предшественник бактериальной протеиназы в природном штамме не представляется возможным. Использование для этих целей стандартных экспрессионных систем в Е. coli или других грам-отрицательных бактериях, как правило, приводит либо к накоплению предшественника в виде нерастворимых агрегатов, либо к процессингу с образованием зрелой формы протеиназы.

В связи со сложностью получения предшественники бактериальных секреторных протеиназ изучены плохо, а существующие данные получены либо опосредованными методами, либо имеют отношение к реассоциированным комплексам зрелый фермент-пропептид. Поэтому создание клеточных систем, позволяющих зафиксировать секреторную протеиназу в виде ее неактивного предшественника, является актуальной

1. Литературный обзор

Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ

1. Впервые разработан метод получения нативного профермента металлопротеиназы термофильной бактерии В. brevis.2. Выделены в индивидуальном состоянии предшественник, пропептид и зрелый фермент металлопротеиназы В. brevis. Установлено, что пропептид является сильным ингибитором собственного зрелого фермента с константой ингибирования К1 = 0,17нМ.

3. Впервые разработана основанная на использовании L-форм Proteus mirabilis система для получения нативного предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis. Доказана неспособность профермента глутамилэндопептидазы В. licheniformis к самоактивации.4. На примере карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces vulgaris впервые экспериментально доказана возможность получения in vivo активного зрелого фермента в отсутствии прочасти, что ставит под сомнение правильность гипотезы об универсальности фолдируюшей функции пропептидов.

1. Siezen R.J., de Yos W.M., Leunissen J.A., Dijkstra B.W. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases. Protein Eng. (1991) 4(7): 719-737.

2. Stahl M.L., Ferrari E. Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an In vitro-derived deletion mutation. J Bacteriol. (1984) 158(2): 411-418.

3. Chu N.M., Chao Y., Bi R.C. The 2 A crystal structure of subtilisin E with PMSF inhibitor. Protein Eng. (1995) 8(3): 211-215.

4. Wells J.A., Ferrari E., Henner D.J., Estell D.A., Chen E.Y. Cloning, sequencing, and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res. (1983) 11(22): 7911-7925.

5. Hirono S., Akagawa H., Mitsui Y., Iitaka Y. Crystal structure at 2.6 A resolution of the complex of subtilisin BPN' with streptomyces subtilisin inhibitor. J Mol Biol. (1984) 178(2): 389-414.

6. Jacobs M., Eliasson M., Uhlen M., Flock J.I. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic Acids Res. (1985) 13(24): 89138926.

7. Siezen R.J., Leunissen J.A. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. Protein Science (1997) 6: 501-523.

8. Wong S.L., Doi R.H. Determination of the signal peptidase cleavage site in the preprosubtilisin of Bacillus subtilis. J Biol Chem. (1986) 261(22): 10176-10181.

9. Kobayashi Т., Inouye M. Functional analysis of the intramolecular chaperone. Mutational hot spots in the subtilisin pro-peptide and a second-site suppressor mutation within the subtilisin molecule. J Mol Biol. (1992) 226(4): 931-933.

10. Ikemura H., Takagi H., Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. J Biol Chem. (1987) 262(16): 7859-7864.

11. Hu Z., Zhu X., Jordan F., Inouye M. A covalently trapped folding intermediate of subtilisin E: spontaneous dimerization of a prosubtilisin E Ser49Cys mutant in vivo and its autoprocessing in vitro. Biochemistry (1994) 33(2): 562-569.

12. Ohta Y, Inouye M. Pro-subtilisin E: purification and characterization of its autoprocessing to active subtilisin E in vitro. Mol Microbiol. (1990) 4(2): 295-304.

13. Ikemura H., Inouye M. In vitro processing of pro-subtilisin produced in Escherichia coli. J Biol Chem. (1988) 263(26): 12959-12963.

14. Hu Z., Haghjoo K., Jordan F. Further evidence for the structure of the subtilisin propeptide and for its interactions with mature subtilisin. J Biol Chem. (1996) 271(7): 3375-3384.

15. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitory abilities of propeptide mutants. J Biol Chem. (1995) 270(42): 25127-25132.

16. Power S.D., Adams R.M., Wells J.A. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin. Proc Natl Acad Sci USA. (1986) 83(10): 3096-3100.

17. Philipp M., Bender M.L. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin. Mol Cell Biochem. 1983 51(1): 5-32.

18. Li Y., Inouye M. The mechanism of autoprocessing of the propeptide of prosubtilisin E: intramolecular or intermolecular event? J Mol Biol. (1996) 262(5): 591-594.

19. Strausberg S., Alexander P., Wang L., Schwarz F., Bryan P. Catalysis of a protein folding reaction: thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' interactions with its propeptide fragment. Biochemistry (1993) 32(32): 8112-8119.

20. Shinde U., Inouye M. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: characterization of the structural changes in pro-subtilisin E coincident with autoprocessing. J Mol Biol. (1995) 252(1): 25-30.

21. Takeuchi Y., Satow Y., Nakamura K.T., Mitsui Y. Refined crystal structure of the complex of subtilisin BPN' and Streptomyces subtilisin inhibitor at 1.8 A resolution. J Mol Biol. (1991) 221(1): 309-325.

22. Carter P., Wells J.A. Engineering enzyme specificity by "substrate-assisted catalysis". Science (1987) 237(4813): 394-399.

23. Jain S.C., Shinde U., Li Y., Inouye M., Berman H.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. J Mol Biol. (1998) 284(1): 137-44.

24. Kojima S., Minagawa Т., Miura K. Tertiary structure formation in the propeptide of subtilisin BPN' by successive amino acid replacements and its close relation to function. J Mol Biol. (1998) 277(5) : 1007-1013.

25. Williams J.W., Morrison J.F. The kinetics of reversible tight-binding inhibition. Methods Enzymol. (1979) 63: 437-467.

26. Ohta Y., Hojo H., Aimoto S., Kobayashi Т., Zhu X., Jordan F., Inouye M. Pro-peptide as an intramolecular chaperone: renaturation of denatured subtilisin E with a synthetic propeptide. Mol Microbiol. (1991) 5(6): 1507-1510.

27. Chou P.J. Prediction of protein structure and the principles of protein conformation. (1989) in (Fasman G.D., ed.) pp. 549-586, Plenum Press, NY.

28. Gamier J., Osguthorpe D.J., Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. J Mol Biol. (1978) 120: 97-120.

29. Shinde U, Inouye M. Intramolecular chaperones and protein folding. Trends Biochem Sci. 1993 18(11): 442-446.

30. Kojima S., Minagawa Т., Miura K. Tertiary structure formation in the propeptide of subtilisin BPN' by successive amino acid replacements and its close relation to function. J Mol Biol. (1998) 277(5): 1007-1013.

31. Fox Т., de Miguel E., Mort J.S., Storer A.C. Potent slow-binding inhibition of cathepsin В by its propeptide. Biochemistry (1992) 31(50): 12571-12576.

32. Baker D., Silen J.L., Agard D.A. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme. Proteins: structure, function and genetics (1992) 12(4): 339-344.

33. Anfinsen C.B. Principles that govern the folding of protein chains. Science (1973) 181(96): 223-230.

34. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature (1989) 339(6224): 483-484.

35. Eder J., Fersht A.R. Pro-sequence-assisted protein folding. Mol Microbiol. (1995) 16(4): 609-614.

36. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. Nature (1997) 389(6650): 520-522.

37. Eder J., Rheinnecker M., Fersht A.R. Folding of subtilisin BPN': characterization of a folding intermediate. Biochemistry (1993) 32(1): 18-26.

38. Eder J., Rheinnecker M., Fersht AR. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence. J Mol Biol. (1993) 233(2): 293-304.

39. Gallagher Т., Gilliland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN' complex: crystal structure of a specific 'foldase'. Structure (1995) 3(9): 907-914.

40. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. Biochemistry (1992) 31(21): 4937-4945.

41. Laskowski M.Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Annu Rev Biochem. (1980) 49: 593-626.

42. Matsubara M., Kurimoto E., Kojima S., Miura K., Sakai T. Achievement of renaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. FEBS Lett. (1994) 342(2): 193-196.

43. Sidhu S.S., Borgford T.J. Selection of Streptomyces griseus protease В mutants with desired alterations in primary specificity using a library screening strategy. J Mol Biol. (1996) 257(2): 233-245.

44. Fujinaga M., Delbaere L.T., Brayer G.D., James M.N. Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. J Mol Biol. (1985) 184(3): 479-502.

45. Read R.J., Fujinaga M., Sielecki A.R., James M.N. Structure of the complex of Streptomyces griseus protease В and the third domain of the turkey ovomucoid inhibitor at 1.8-A resolution. Biochemistry (1983) 22(19): 4420-4433.

46. Lesk A.M., Fordham W.D. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. J Mol Biol. (1996) 258(3): 501-537.

47. Silen J.L., McGrath C.N., Smith K.R., Agard D.A. Molecular analysis of the gene encoding alpha-lytic protease: evidence for a preproenzyme. Gene (1988) 69(2): 237-244.

48. Henderson G., Krygsman P., Liu C.J., Davey C.C., Malek L.T. Characterization and structure of genes for proteases A and В from Streptomyces griseus. J Bacteriol. (1987) 169(8): 3778-3784.

49. Yang M.Y., Ferrari E., Henner D.J. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-dzrived deletion mutation. J Bacteriol. (1984) 160(1): 15-21.

50. Takagi M., Imanaka Т., Aiba S. Nucleotide sequence and promoter region for the neutral protease gene from Bacillus stearothermophilus. J Bacteriol. (1985) 163(3): 824-831.

51. Holland B. Autotransporters: protein contortionists whose carboxyl termini translocate their own amino-terminal domains. Trends Microbiol. 1998 6(10): 388-389.

52. Sidhu S.S., Kalmar G.B., Borgford T.J. Characterization of the gene encoding the glutamic-acid-specific protease of Streptomyces griseus. Biochem Cell Biol. (1993) 71 (9-10): 454-461.

53. Stennicke H.R., Birktoft J.J., Breddam K. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus. Protein Sci. (1996) 5(11): 2266-2275.

54. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. Nature (1989) 341(6241): 462-464.

55. Baker D., Sohl J.L., Agard D.A. A protein-folding reaction under kinetic control. Nature (1992) 356(6366): 263-265.

56. Anderson D.E., Peters R.J., Wilk В., Agard D.A. Alpha-lytic protease precursor: characterization of a structured folding intermediate. Biochemistry (1999) 38(15): 47284735.

57. Peters R.J., Shiau A.K., Sohl J.L., Anderson D.E., Tang G., Silen J.L., Agard D.A. Pro region C-terminus:protease active site interactions are critical in catalyzing the folding of alpha-lytic protease. Biochemistry (1998) 37(35): 12058-12067.

58. Kettner C.A., Bone R., Agard D.A., Bachovchin W.W. Kinetic properties of the binding of alpha-lytic protease to peptide boronic acids. Biochemistry (1988) 27(20): 7682-7688.

59. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. Eur J Biochem. (1992) 204(2): 433-451.

60. Sohl J.L., Shiau A.K., Rader S.D., Wilk B.J., Agard D.A. Inhibition of alpha-lytic protease by pro region C-terminal steric occlusion of the active site. Biochemistry (1997) 36(13): 3894-3902.

61. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the propeptide. J Bacteriol. (1998) 180(12): 3241-3244.

62. Delbaere L.T., Brayer G.D., James M.N. The 2.8 A resolution structure of Streptomyces griseus protease В and its homology with alpha-chymotrypsin and Streptomyces griseus protease A. Can J Biochem. (1979) 57(2): 135-144.

63. Higaki J.N., Evnin L.B., Craik C.S. Introduction of a cysteine protease active site into trypsin. Biochemistry (1989) 28(24): 9256-9263.

64. Stroud R.M., Kossiakoff A.A., Chambers J.L. Mechanisms of zymogen activation. Annu Rev Biophys Bioeng. (1977) 6: 177-193.

65. Hooper N.M. Families of zinc metalloproteases. FEBS Lett. (1994) 354(1): 1-6.

66. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. Mol Microbiol. (1992) 6(12): 1593-1604.

67. Tran L., Wu X.C., Wong S.L. Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis. J Bacteriol. (1991) 173(20): 63646372.

68. Аваков A.C, Болотин А.П. Сорокин A.B. Структура гена металлопротеиназы Bacillus brevis. Молекулярная биология (1990) 24(5): 1363-1372.

69. Chang Р.С., Kuo T.C., Tsugita A., Lee Y.H. Extracellular metalloprotease gene of Streptomyces cacaor. structure, nucleotide sequence and characterization of the cloned gene product. Gene (1990) 88(1): 87-95.

70. Bever R.A., Iglewski B.H. Molecular characterization and nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa elastase structural gene. J Bacteriol. (1988) 170(9): 4309-4314.

71. Fukushima J., Yamamoto S., MoriharaK., Atsumi Y., Takeuchi H., Kawamoto S., Okuda K. Structural gene and complete amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa IFO 3455 elastase. J Bacteriol. (1989) 171(3): 1698-1704.

72. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5-A resolution. J Biol Chem. (1991) 266(5): 2864-2871.

73. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. Biochemistry (1984) 23(24): 5730-5741.

74. Vriend G., Eijsink V. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding of thermolysin-like proteases. J Comput Aided Mol Des. (1993) 7(4): 367-396.

75. Tsuru D., Imajo S., Morikawa S., Yoshimoto Т., Ishiguro M. Zinc protease of Bacillus subtilis var. amylosacchariticus: construction of a three-dimensional model and comparison with thermolysin J Biochem. (Tokyo). (1993) 113(1): 101-105.

76. Beaumont A., O'Donohue M.J., Paredes N., Rousselet N., Assicot M., Bohuon C., Fournie-Zaluski M.C., Roques B.P. The role of histidine 231 in thermolysin-like enzymes. A site-directed mutagenesis study. J Biol Chem. (1995) 270(28): 16803-16808.

77. Corbett R.J., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. Biochem Cell Biol. (1986) 64(10): 953-961.

78. O'Donohue M.J., Roques B.P., Beaumont A.Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. Biochem J. (1994) 300 (Pt 2): 599-603.

79. Chang P.C., Lee Y.H. Extracellular autoprocessing of a metalloprotease from Streptomyces cacaoi. J Biol Chem. (1992) 267(6): 3952-3958.

80. Werb Z., Banda M.J., McKerrow J.H., Sandhaus R.A. Elastases and elastin degradation. J Invest Dermatol. (1982) 79: 154-159.

81. Heck L.W., Morihara K., McRae W.B., Miller E.J. Specific cleavage of human type III and IV collagens by Pseudomonas aeruginosa elastase. Infect Immun. (1986) 51(1): 115118.

82. Heck L.W., Alarcon P.G., Rulhavy R.M., Morihara K., Russell M.W., Mestecky J.F. Degradation of IgA proteins by Pseudomonas aeruginosa elastase. J Immunol. (1990) 144(6): 2253-2257.

83. Morihara K., Tsuzuki H., Oda K. Protease and elastase of Pseudomonas aeruginosa: inactivation of human plasma alpha 1-proteinase inhibitor. Infect Immun. (1979) 24(1): 188-193.

84. Schultz D.R., Miller K.D. Elastase of Pseudomonas aeruginosa: inactivation of complement components and complement-derived chemotactic and phagocytic factors. Infect Immun. (1974) 10(1): 128-135.

85. Kessler E., Safrin M. Synthesis, processing, and transport of Pseudomonas aeruginosa elastase. J Bacteriol. (1988) 170(11): 5241-5247.

86. Toma S., Campagnoli S., De Gregoriis E., Gianna R., Margarit I., Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. Protein Eng. (1989) 2(5): 359-364.

87. Marie-Claire С., Roques B.P., Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. J Biol Chem. (1998) 273(10): 5697-5701.

88. O'Donohue M.J., Beaumont A. The roles of the prosequence of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. J Biol Chem. (1996) 271(43): 26477-26481.

89. Marie-Claire C., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence of thermolysin acts as an intramolecular chaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli. J Mol Biol. (1999) 285(5): 1911-1915.

90. Eijsink V.G., Veltman O.R., Aukema W., Vriend G., Venema G. Structural determinants of the stability of thermolysin-like proteinases. Nat Struct Biol. (1995) 2(5): 374-379.

91. Kessler E., Safrin M. The propeptide of Pseudomonas aeruginosa elastase acts an elastase inhibitor. J Biol Chem. (1994) 269(36): 22726-22731.

92. Mclver K.S., Kessler E., Olson J.C., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. (1995) 18(5): 877-889.

93. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. (1996) 19(2): 297-306.

94. Chang S.C., Chang P.C., Lee Y.H. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. J Biol Chem. (1994) 269(5): 3548-3554.

95. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K., Ohman D.E. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. J Biol Chem. (1998) 273(46): 30225-30231.

96. Kessler E., Safrin M. Partial purification and characterization of an inactive precursor of Pseudomonas aeruginosa elastase. J Bacteriol. (1988) 170(3): 1215-1219.

97. Mclver K.S., Olson J.C., Ohman D.E. Pseudomonas aeruginosa lasBl mutants produce an elastase, substituted at active-site His-223, that is defective in activity, processing, and secretion. J Bacteriol. (1993) 175(13): 4008-4015.

98. Kessler E. Beta-lytic endopeptidases. Methods Enzymol. (1995) 248: 740-756.

99. Schad P.A., Iglewski B.H. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the Pseudomonas aeruginosa lasA gene. J Bacteriol. (1988) 170(6): 2784-2789.

100. Gustin J.K., Kessler E., Ohman D.E. A substitution at His-120 in the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa blocks enzymatic activity without affecting propeptide processing or extracellular secretion. J Bacteriol. (1996) 178(22): 6608-6617.

101. Epstein D.M., Wensink P.C. The alpha-lytic protease gene of Lysobacter enzymogenes. The nucleotide sequence predicts a large prepro-peptide with homology to pro-peptides of other chymotrypsin-like enzymes. J Biol Chem. (1988) 263(32): 1658616590.

102. Fujishige A., Smith K.R., Silen J.L., Agard D.A. Correct folding of alpha-lytic protease is required for its extracellular secretion from Escherichia coli. J Cell Biol. (1992) 118(1): 33-42.

103. Pugsley A.P., Francetic O., Possot O.M., Sauvonnet N., Hardie K.R. Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Gene (1997) 192(1): 13-19.

104. Taylor M.A., Pratt K.A., Revell D.F., Baker K.C., Sumner I.G., Goodenough P.W. Active papain renatured and processed from insoluble recombinant propapain expressed in Escherichia coli. Protein Eng. (1992) 5(5): 455-459.

105. Smith S.M., Gottesman M.M. Activity and deletion analysis of recombinant human cathepsin L expressed in Escherichia coli. J Biol Chem. (1989) 264(34): 20487-20495.

106. Fusek M., Mares M., Yagner J., Voburka Z., Baudys M. Inhibition of aspartic proteinases by propart peptides of human procathepsin D and chicken pepsinogen. FEBS Lett. (1991)287(1-2): 160-162.

107. Conner G.E. The role of the cathepsin D propeptide in sorting to the lysosome. J Biol Chem. (1992) 267(30): 21738-21745.

108. Markaryan A., Lee J.D., Sirakova T.D., Kolattukudy P.E.Specific inhibition of mature fungal serine proteinases and metalloproteinases by their propeptides. J Bacteriol. (1996) 178(8): 2211-2215.

109. Winther J.R., Sorensen P., Kielland-Brandt M.C. Refolding of a carboxypeptidase Y folding intermediate in vitro by low-affinity binding of the proregion. J Biol Chem. (1994) 269(35): 22007-22013.

110. Паберит Н.Ю., Панк M.C., Лийдерс M.A., Ванаталу К.П. Очистка и свойства нейтральной металлопротеазы из термофильной бактерии Bacillus brevis. Биохимия (1984) 49(2): 275-284.

111. KakudoS., Yoshikawa К., Tamaki М., Nakamura Е., Teraoka Н. Secretory expression of a glutamic-acid-specific endopeptidase (SPase) from Staphylococcus aureus ATCC12600 in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. (1992) 38: 226-233.

112. Мосолова O.B., Руденская Г.Н., Степанов B.M., ХодоваО.М., ЦаплинаИ.А. Glu,Asp-специфичная протеиназа актиномицетов. Биохимия (1987) 52: 414-422.

113. Demidyuk I.V., Nosovskaya Е.А., Tsaplina I.A., Karavaiko G.I., Kostrov S.Y. Purification and characterization of serine protease of the Glu,Asp-specific enzyme family from Thermoactinomyces species. Biochemistry (Moscow) (1997) 62: 171-175.

114. Хайдарова H.B., Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Glu,Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris. Биохимия (1989) 54: 46-53.

115. Svendsen I., Jensen M.R., Breddam К. The primery structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus. FEBS Lett. (1991) 292: 165-167.

116. Kitadokoro K., Tsuzuki H., Okamoto H., Sato T. Crystal structure analysis of a serine proteinase from Streptomyces fradiae at 0.16-nm resolution and molecular modeling of an acidic-amino-acid-specific proteinase. Eur J Biochem. (1994) 224(2): 735-742.

117. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., ItskovichE.L., BalabanN.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., StepanovV.M. Glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedins, strain 3-19. (1997) FEBS Lett. 404: 241-244.

118. Svendsen I., Breddam K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis. Eur J Biochem. (1992) 204: 165-171.

119. Niidome Т., Yoshida N., Ogata F., Ito A., Noda K. Purification and characterization of an acidic amino acid-specific endopeptidase of Bacillus subtilis obtained from a commercial preparation (protease type XVI, Sigma). J Biochem. (1990) 108: 965-970.

120. Klessen C., Schmidt K.H., Gumpert J., Grosse H.H., Malke H. Complete secretion of activable bovine prochymosin by genetically engineered L forms of Proteus mirabilis. Appl Environ Microbiol. (1989) 55(4): 1009-1015.

121. Laplace F., Muller J., Gumpert J., Malke H. Novel shuttle vectors for improved streptokinase expression in streptococci and bacterial L-forms. FEMS Microbiol Lett. (1989) 53(1-2): 89-94.

122. Laplace F., Egerer R., Gumpert J., Kraft R., Kostka S., Malke H. Heterologous signal peptide processing in fusion interferon synthesis by engineered L-forms of Proteus mirabilis. FEMS Microbiol Lett. (1989) 50(1-2): 59-63.

123. Gumpert J., Cron H., Plapp R., Niersbach H., Hoischen C. Synthesis and secretion of recombinant penicillin G acylase in bacterial L-forms. J Basic Microbiol. (1996) 36(2): 89-98.

124. Gumpert J., Taubeneck U. Characteristic properties and biological significance of stable protoplast type L-forms. Experientia Suppl. (1983) 46: 227-241.

125. Shinde U., Fu X., Inouye M. A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones. J Biol Chem. (1999) 274(22): 15615-15621.

126. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Gaida A.V., Osterman A.L. Affinity chromatography of proteolytic enzymes on silica-based biospecific sorbents. J Biochem Biophys Methods. (1981) 5(3): 177-186.

127. Christianson D.W., Mangani S., Shoham G., Lipscomb W.N. Binding of D-phenylalanine and D-tyrosine to carboxypeptidase A. J Biol Chem. (1989) 264(22): 12849-12853.

128. TeplyakovA., Polyakov K., Obmolova G., Strokopytov В., Kuranova I., Osterman A., Grishin N., Smulevitch S., Zagnitko O., Galperina O. Crystal structure of carboxypeptidase T from Thermoactinomyces vulgaris. Eur J Biochem. (1992) 208(2): 281-288.

129. Osterman A.L., Stepanov V.M., Rudenskaia G.N., Khodova O.M., Tsaplinal.A. Carboxypeptidase T-intracellular carboxypeptidase of Thermoactinomycetes a distant analog of animal carboxypeptidase. Biokhimiia (1984) 49(2): 292-301.

130. Narahashi Y. The amino acid sequence of zinc-carboxypeptidase from Streptomyces griseus. J Biochem. (Tokyo) (1990) 107(6): 879-886.

131. Gray G.L., Baldridge J.S., McKeown K.S., Heyneker H.L., Chang C.N. Periplasmic production of correctly processed human growth hormone in Escherichia coli: natural and bacterial signal sequences are interchangeable. Gene (1985) 39(2-3): 247-254.

132. Vieira J., Messing J. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. (1991) Gene 100: 184-194.

133. Морозова И.П., Юсупова М.П., Гололобов М.Ю., Королькова Н.В., Ходова О.М., Степанов В.М. (1993) Биохимия 85: 1420-1429.

134. Gololobov M.Yu., Morozova I.P., Voyushina T.L., Timokhina E.A., Stepanov V.M. Substrate specificity of the serine proteinase from Bacillus subtilis, strain72. (1991) Biochemistry (Moscow) 56: 230-240.

135. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. (1989) Molecular cloning; 2-nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.3, New York, NY.

136. Юсупова М.П, Котлова E.K., Тимохина E.A., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидов аргинина хромофорных субстратов металлопротеиназ и карбоксипептидаз. Биоорганическая Химия (1995) 21(1): 33-38.125

137. Честухина Г.Г., Загнитько О.П., Клепикова Ф.С., Степанов В.М. Внеклеточные сериновые протеиназы В. thuringiensis эволюционируют существенно медленнее соответствующих эндотоксинов. Биохимия (1985) 50: 1724-1732.