Некоторые аспекты топогенеза цитохрома Р450SCC быка в гетерологических системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

/ч

_ Московский орденов Ленина, Октябрьской революции и Трудового красного знамени Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.352.4

САВЕЛЬЕВ Александр Сергеевич Некоторые аспекты топогенеза цитохрома Р450зсс быка в

ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных

веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1997

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лузиков В.Н.

доктор биологических наук, профессор Виноградов А.Д.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Ротанова Т.В.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Защита состоится 28 октября 1997 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 26 сентября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Формирование клеточных органелл -процесс чрезвычайно сложный, требующий участия всевозможных вспомогательных белков, функции которых в клетке зачастую только этим участием и ограничиваются. Сказанное можно проиллюстрировать на примере митохондрий, биогенез которых сравнительно хорошо изучен.

Известно, что подавляющее большинство митохондриальных белков (80-90%) синтезируется в цитоплазме в виде предшественников с И-конце-вой адресующей препоследовательностью, которые пост-трансляционно переносятся в органеллы. В целом, механизм белкового импорта предусматривает участие цитоплазматических факторов, поддерживающих белковые предшественники в транспортно-компетентной форме, транслоцирующих комплексов внешней и внутренней мембраны, а также системы шаперонов, локализованной в матриксе. Как правило, наличие у белка специфической адресующей последовательности, а также способности обратимо разворачиваться являются необходимыми и достаточными условиями для его импорта в митохондрии. Другими словами, согласно современным представлениям, механизм импорта универсален и вряд ли может быть органо- или видо-специфическим. Тем не менее, оказалось, что такого рода ограничения на импорт вполне могут иметь место. В частности, это касается предшественника цитохрома Р450зсс - резидентного белка митохондрий коры надпочечников, отвечающего за конверсию холестерина в прегненолон, продукта гена СУР11А1.

Ранее была продемонстрирована неспособность этого белка импортироваться в сердечные митохондрии, что послужило основанием для предположения, согласно которому пре-цитохром Р450зсс импортируется только в митохондрии стероидогенных тканей. Однако, в последние годы было

з

показано, что он способен включаться в митохондрии COS-1 клеток in vivo, а также в изолированные растительные митохондрии. Хотя при синтезе в COS-1 клетках цитохром P450scc, в принципе, проявлял холестерингидрок-силазную активность, оставалось неясным насколько эффективен его импорт в гетерологические митохондрии, т.е. какая доля молекул принимает каталитически активную'форму, где они локализованы внутри органелл и т. д. Иными словами, является ли именно импорт в митохондрии лимитирующей стадией в топогенезе этого белка или же какие-то затруднения возникают на стадиях его встраивания во внутреннюю митохондриальную мембрану (обычное место локализации этого белка), связывания гема или. формирования третичной структуры.

Кроме того, изучение импорта пре-цитохрома P450scc в гетерологические митохондрии представляет интерес для выяснения судьбы чужеродных белков, попадающих в эти органеллы в результате ошибочного адресования, что имеет место при некоторых патологических состояниях клетки. С другой стороны, решение ряда биотехнологических проблем связано именно с импортом чужеродных белков (в том числе цитохрома P450scc) в митохондрии.

Цель работы.' Целью настоящей работы явилось изучение особенностей биогенеза цитохрома P450scc быка в митохондриях дрожжевых клеток, а также выяснение роли митохондриальных протеиназ и шаперонов в этом процессе.

Научная новизна и практическая ценность. С помощью генно-инженерных подходов показана возможность управления топогенезом цитохрома P450scc путем модификации или замены его адресующей препоследовательности Изучен биогенез цитохрома P450scc быка в дрожжевых митохондриях. Показано, что лимитирующей стадией этого многостадийного процесса 'является встраивание белка во внутреннюю митохондриальную мембрану. В

л.

частности, модифицированная форма пре-цитохрома Р450бсс с препоследо-вательностью субъединицы IV цитохром с оксидазы дрожжей эффективно импортируется в дрожжевые митохондрии, но только незначительная часть импортированного белка приобретает ферментативно активную форму. Новоимпортированный цитохром Р450эсс подвергается протеолизу под действием митохондриальной протеиназы Р1гп1р. То или иное нарушение протеолиза ведет к агрегации белка. Как протеолиз, так и агрегация контролируются митохондриальной системой шаперонов - причем оба процесса возможны только после диссоциации цитохрома Р450зсс от тС-Ьзр70.

Гибридный белок, в котором 114 Ы-концевых аминокислотных остатков цитохрома Р450зсс заменены на адресующую последовательность и трансмембранный участок субъединицы 9 Н^АТФазы (рД8и9-ДР450БСс), импортируется в дрожжевые митохондрии и связывается с мембраной таким образом, что полипептидная цепь Р450бсс развернута и экспонирована в матрикс. ДБи9-ДР4505сс подвергается протеолизу под действием мембранной У1а10рЛЛа12р протеиназы, причем этот процесс также контролируется митохондриальной системой шаперонов. Последнее обстоятельство предполагает существование некоторого общего механизма удаления из митохондриального матрикса полипептидных цепей неспособных свернуться в третичную структуру и вследствие этого склонных к агрегации, что представляет потенциальную опасность для клетки. При этом участие той или иной протеиназы определяется локализацией полипептидной цепи, подлежащей удалению, а система шаперонов, по-видимому, поддерживает такой полипептид в растворимом виде.

Факт существования хорошо описанных заболеваний, вызванных ошибочным адресованием белков в митохондрии, придает несомненную практическую значимость изучению роли протеиназ в формировании митохондрий и других клеточных органелл.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и одна подана в редакцию. Результаты работы были доложены на IV симпозиуме Химия протеолитических ферментов (Москва, 1997 г.) и на II съезде Биохимического общества Российской академии наук (Пущино, 1997 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на LOS страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит {¿э рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Модификация N-конца предшественника цитохрома P450scc снимает тканеспецифические ограничения на его импорт в митохондрии сердца.

Первый из примененных подходов для решения поставленной задачи заключался в следующем. Белок - предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) - экспрессировали в клетках Escherichia coli, используя систему QIAexpress фирмы QIAGEN, и после выделения рекомбинантного белка (6His-pP450scc) из клеточного лизата с ним проводили эксперимент по импорту в митохондрии in vitro. Применение системы QIAexpress обеспечивало модификацию пре-цитохрома P450scc - введение на N-конец адресующей препоследовательности 13 дополнительных аминокислотных остатков, из которых 8 несли положительный заряд (Рис. 1). Согласно современным представления, такая модификация должна была увеличить 'силу' адресующего сигнала.

Эксперименты по импорту 6His-pP450scc в изолированные митохондрии печени крысы, в которые, как известно, природный пре-цитохром P450scc может импортироваться, показали, что добавочные аминокислотные

+ ++++++ +* +

Ме1 Аг§ в1у Бег Шв Шэ Ш Мб Иб 0\у Не А^ Ме1 Ьеи А1а А^ С1у Ьеи

+ +

Рго Ьеи Arg Бег А1а Ьеи Уа1 Ьуэ А1а СуБ Рго Рго Не Ьеи Бег ТЬг Уа1 С1у С1и + + +

й1у Тф в1у Шб Иб Arg Уа! ТЬг в1у С1и в!у А1а в!у

тР450зсс

Рисунок 1. Модифицированная препоследовательность 6Шз-рР450зсс. Стрелкой обозначено начало природной препоследовательности рР450зсс.

остатки не препятствуют ни импорту белка, ни его последующему процес-сингу. Аналогичный эксперимент с изолированными митохондриями сердца крысы, а также с митохондриями дрожжей показал способность 6Из-рР450зсс импортироваться и в митохондрии этих типов. Таким образом, тезис о тканеспецифичности импорта пре-цитохрома Р450бсс неприменим к его модифицированной форме 6Ш5-рР450зсс. По-видимому, присоединение обогащенного положительно заряженными аминокислотными остатками пептида к Ы-концу рР450зсс могло способствовать более легкому проникновению адресующей препоследовательности внутрь гетерологических митохондрий.

Тем не менее, изложенный выше подход оказался неэффективным для решения поставленной задачи, поскольку он не позволял оценить возможность формирования холофермента цитохрома Р450бсс в таких митохондриях. Поэтому на следующем этапе работы цитохром Р450зсс экспрессиро-вали в клетках дрожжей БассИаготусез сегеч'тае.

Экспрессия модифицированной формы цитохрома Р450зсс с препоследователыюстыо субъедшшцы IV дрожжевой цитохром с оксидазы (рСох1У-Р4505се) в дрожжах.

Для экспрессии в дрожжах 5. сегеушае модифицированной формы цитохрома Р450бсс (ген СУР11А1), была создана плазмида рУеОР/рСох1У-

Р450зсс на основе шаттл-вектора рУеОР 1-8/2. Эта плазмида была введена в клетки 5". сегеушае штамм 2805. Митохондриальные фракции, полученные из коры надпочечников и из дрожжевых клеток, трансформированных плазмидами рУеБР/рСох1У-Р450зсс и рУеБР, после индукции промотора в течение 18-20 ч анализировали с помощью Вестерн-иммуноблоттинга, используя ^в-фракцию антисыворотки к цитохрому Р450зсс.

В митохондриях клеток, трансформированных плазмидой рУеВР/рСохГУ-Р450зсс, обнаруживали белок с молекулярной массой 51 кДа (рис. 2А, дорожка 2), что соответствует молекулярной массе зрелого цитохрома Р450зсс коры надпочечников быка. В митохондриях контрольных клеток, трансформированных вектором без вставки, соответствующая полоса отсутствовала (рис. 2А, дорожка 1). Из сравнения результатов иммуноблот-тинга препаратов митохондрий трансформированных дрожжевых клеток и митохондрий коры надпочечников быка (рис. 2А, дорожки 2 и 3) видно, что (а) имеющийся в дрожжевых митохондриях и реагирующий с антителами к цитохрому Р450бсс апо-белок идентичен по электрофоретической подвижности зрелому цитохрому Р450зсс быка и (б) содержание рекомбинантного белка в дрожжевых митохондриях примерно равно содержанию цитохрома Р450эсс в митохондриях коры надпочечников.

Следовательно, рСох1У-Р450зсс, синтезирующийся в клетках 5". сегеушае, транслоцируется в митохондрии, используя адресующую препоследовательность субъединицы IV дрожжевой цитохром с оксидазы, и правильно процессируется с образованием белка, идентичного по размеру зрелой форме цитохрома Р450эсс быка. Тем не менее, несмотря на его высокое содержание в дрожжевых митохондриях нам не удалось зарегистрировать характерный разностный (восстановленная СО-форма против восстановленной формы) спектр гемопротеина Р450зсс даже при использовании

А

Б

Р450зсс

1 2 3

Рисунок 2. Экспрессированный в дрожжах рСохГУ-Р450Бсс импортируется в митохондрии (А), но его процессированная форма имеет очень низкое сродство к дрожжевой митохондриальной мембране (Б). Анализ методом иммуноблотгинга. (А) Экспрессия

рСох1У-Р4505сс в дрожжах: 1 - мнтохондрни дрожжевых клеток, трансформированных плазмидой рУеБР (контрольные митохондрии), 2 - митохондрии дрожжевых клеток, трансформированных плазмидой рУеОР/рСох1У-Р450зсс, 3 - митохондрии коры надпочечников. Слева - молекулярные массы белков-маркеров в кДа. (Б) Относительное содержание цитохрома Р4505СС во фракции внутренней митохондриальной мембраны (ультразвуковые СМЧ): 1,2- митохондрии и СМЧ коры надпочечников быка, соответственно, 3, 4 - митохондрии и СМЧ трансформированных дрожжей, соответственно.

значительных количеств митохондрий (до 4,5 мг митохондриального белка на мл пробы). Митохондрии коры надпочечников в идентичных условиях дают четкий спектр цитохрома Р450бсс. Эти данные предполагают, что количество ферментативно активного цитохрома Р450зсс в дрожжевых митохондриях должно быть невелико (см. далее).

При фракционировании митохондрий было обнаружено, что относительное содержание апо-цитохрома Р450бсс во фракции внутренней митохондриальной мембране (ультразвуковые СМЧ), полученной из дрожжей, значительно меньше такового в СМЧ, приготовленных из коры надпочечников (рис. 2Б, дорожки 2 и 4). Детальное изучение локализации цитохрома Р450зсс в митохондриях из трансформированных дрожжей показало, что

белок находится преимущественно в виде агрегатов, в которых он, очевидно, лишен нативной третичной структуры и, следовательно, спектральных характеристик цитохрома P450scc.

Тем не менее, количества белка, обнаруживаемого в СМЧ из трансформированных дрожжевых клеток, оказалось достаточно, чтобы эта субклеточная фракция проявляла холестерингидроксилазную активность в отношении 22(11)-гидроксихолестерина в реконструированной системе, включающей очищенные препараты адренодоксина и адренодоксинредуктазы, а также NADPH-регенерирующую систему. Удельная активность холестерингид-роксилазы дрожжевых СМЧ составляла 0.008-0.02 нмоль прегненолона, образующегося за мин на 1 мг белка СМЧ (данные четырех независимых экспериментов по экспрессии pCoxIV-P450scc в дрожжах).

Таким образом, несмотря на эффективный импорт pCoxIV-P450scc в дрожжевые митохондрии его процессированная форма имеет очень малое сродство к дрожжевой митохондриальной мембране. Вследствие этого белок преимущественно агрегирует в матриксе, и лишь очень незначительная часть встраивается во внутреннюю митохондриальную мембрану, приобретая нативную конформацию.

Роль митохондриальных протеиназ и системы шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc.

Для того, чтобы выяснить детали гетерологического импорта цитохрома P450scc в дрожжевые митохондрии, мы воспользовались классической схемой синтеза/импорта белков in vitro.

[358]-меченый предшественник цитохрома P450scc получали в безклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика с использованием мРНК, синтезированной с Sp6 промотора плазмиды pTUT/pP450scc

(Новикова и др., 1994). С радиоактивномеченым предшественником проводили далее стандартный эксперимент по импорту in vitro. Оказалось, что пре-цитохром P450scc со своей собственной препоследовательностью легко импортируется в дрожжевые митохондрии и процессируется в них. При этом зрелая форма апо-цитохрома P450scc обнаруживалась в матриксе, что свидетельствует о затрудненности ее встраивания в дрожжевую мито-хондриальную мембрану. Такое положение вещей полностью согласуется с поведением белка при экспрессии гибрида pCoxIV-P450scc в дрожжевых клетках и находится в противоречии с локализацией цитохрома P450scc в митохондриях из коры надпочечников.

Принимая во внимание вышесказанное, можно предположить, что импортированный апо-цитохром P450scc не приобретает в гетерологических митохондриях нативную конформацию и, следовательно, может деградировать в митохондриальном матриксе как развернутый белок. Такого рода деградация под действием сериновой АТФ-зависимой протеиназы Pimlp была показана ранее для модельных гибридных белков (Wagner et al., 1994). Судьба обеих форм импортированного в дрожжевые митохондрии цитохрома P450scc прослеживалась в ходе следующего эксперимента. После импорта и последующего снятия трансмембранного потенциала с помощью валиномицина митохондрии инкубировались при 37°С в присутствии АТФ-регенерирующей системы. Такая инкубация приводила к уменьшению суммарного количества цитохрома P450scc во времени (рис. 3), хотя интактность митохондрий при этом не нарушалась, что оценивалось по содержанию цитохром с пероксидазы (ССРО) - белка межмембранного пространства. Кроме того, деградация апо-цитохрома P450scc полностью прекращалась при полном отсутствии АТФ в среде инкубации (рис. 3).

К настоящему моменту в дрожжах в митохондриальном матриксе идентифицированы две АТФ-зависимые протеиназы. Это уже упоминав-

п

120

20 -

0

0 10 20 30 40 50 60

т—■—i—1 i—■—I" ■ I

Время, мин

+АТФ

-АТФ

Рисунок 3. Импортированный in vitro в дрожжевые митохондрии апо-цитохром P450scc деградирует АТФ-зависимым образом. После импорта и разобщения мембранного потенциала валиномицином митохондрии осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере для импорта и инкубировали при 37°С в присутствии АТФ-регенирирующей системы (+ АТФ) или в условиях полного отсутствия АТФ в матриксе (-АТФ). В указанное время отбирали апиквоты, митохондрии в пробах обрабатывали трипсином, осаждали центрифугированием и митохондриальные белки анализировали электрофорезом по Лэммли с последующими авторадиографией и/или иммуноблоттированием. Относительное количество белков оценивалось лазерным денситометрированием.

шаяся растворимая сериновая Pimlp протеиназа и гетероолигомерный мембранный Ytal0p/Ytal2p комплекс, являющийся металлопротеиназой. Для того чтобы выяснить, какая из этих протеиназ ответственна за деградацию апо-цитохрома P450scc, был проведен ряд экспериментов с митохондриями из различных мутантов дрожжей, дефицитных по протеолитическим активностям Pimlp или Ytal0p/Ytal2p. Деградация апо-цитохрома P450scc была полностью блокирована как в митохондриях из штамма с разрушенным геном Р1М1 (Apiml) так и в митохондриях, содержащих только протеолити-чески неактивный вариант Pimlsl0,SAp (рис. 4А). В качестве контроля в последнем случае использовались митохондрии из штамма (Apiml), в котором экспрессировалась Pimlp дикого типа (Apiml iPimlp). Этот штамм, имеющий pet фенотип и лишенный митохондриальной ДНК, неспособен выполнить большинство митохо'ндриальных функций. Тем не менее, в таких

"1—■—I—'—I—■—I—■—г О 10 20 30 40 50 60

сз 2 о си X о

и

я я а я к

л *

о, и

е* о о и о я

>д ц

и н 5

О

о я

о4

120

100 80

о ю ■ч-

СЦ

си

о си

20

\ \

V

V

0 10 20 30 40 50 60

Время, мин

" 4р;т//Рт11810,5Ар Лрт1

Арт1Г?\т\р

Время, мин Ау1аЮАу1а12/УЫ0Е559%УЫ2ЕШ%

—■— \УТ

ЛугаЮ Лрт1

Рисунок 4. Апо-цитохром Р450зсс деградирует в дрожжевых митохондриях под действием протеиназы Рш11р. (А) Протеолиз апо-цитохрома Р4505СС полностью блокирован в митохондриях, содержащих протеолитический мутант Рип1р (ф//и//Р!т151015Ар), но протекает в митохондриях с немутированной Рцп1р (Лр1т1/?\т\р). (Б) Протеолиз апо-цитохрома Р45(Ьсс имеет место в митохондриях с протеолитически неактивным Уш10р/УЫ2р комплексом (Ау1а10Ау1а12П\а 10Е!59°рУ1а 12Еб|4рр). (В) Апо-цитохром Р450бсс образует агрегаты в отсутствии протеиназы Р1ш1р (Ар1т1), но не в отсутствии УшЮр/УЫгр комплекса (Ау1а10). Все пробы анализировали как описано в легенде к Рис. 3.

митохондриях деградация апо-цитохрома P450scc имела место, хотя и была менее эффективной, если сравнивать с деградацией в митохондриях из штамма дикого типа (рис. 4Б).

Аналогично, деградация апо-цитохрома P450scc происходила в митохондриях из штамма, экспрессирующего только мутированные YtalOp и Ytal2p, в которых консервативный остаток глютаминовой кислоты, ответственный за связывание Zn2+, был заменен на остаток глютамина (рис. 4Б). В данном случае штамм Ayta 10 Ay ta 12/Y tal0E559QpYtal2E614Qp также имел pet фенотип, и пониженная скорость протеолиза в таких митохондриях могла быть следствием низкого содержания АТФ в митохондриальном матриксе несмотря на наличие в среде инкубации АТФ-регенирирующей системы.

Ранее было показано, что в отсутствии Pimlp развернутые белки образуют агрегаты в митохондриальном матриксе. Мы проверили, так ли это в случае апо-цитохрома P450scc. После 15 минутной инкубации при 37°С белок агрегировал в митохондриях из Apiml штамма, но не в митохондриях из Ayta 10 штамма, характеризующегося отсутствием функционального Ytal0p/Ytal2p комплекса (рис. 4В).

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что протео-лиз импортированного апо-цитохрома P450scc опосредуется растворимой Pimlp и подтверждают тот факт, что он находится в дрожжевых митохондриях в развернутом состоянии.

О деградации развернутых белков в митохондриальном матриксе известно также, что этот процесс возможен только при наличии функционирующих шаперонов Ssclp (mt-hsp 70) и Mdjlp - гомологов бактериальных DnaK и DnaJ, соответственно (Wagner et al., 1994). Для того чтобы выяснить роль митохондриальной системы шаперонов в деградации апо-цитохрома P450scc мы воспользовались митохондриями из температурочувствительных мутантов sscl-3, mdjl-7 и mgel-3. При инкубации таких митохондрий,

Время, мин §

—55С]-3 —■— тсЦ1-7 —' mgel-3

Рисунок 5. Протеолиз апо-цитохрома Р450бсс требует функционирования митохондри-альной системы шаперонов. (А) Деградация апо-цитохрома Р450зсс нарушена при непермиссивной температуре (37°С) в митохоидриях из температурочувствительных мутантов тс!/1-7, mgel-3. (Б) Агрегация апо-цитохрома Р450зсс имеет место в

митохондриях из 55с1-3 и тс!] 1-7 мутантов, но не наблюдается в митохондриях из mgel-3 мутанта. Все пробы анализировали как описано в легенде к Рис. 3.

содержащих импортированный апо-цитохром Р450бсс, при 37°С его протеолиз не наблюдался ни в одном из трех случаев (рис. 5А). В тоже время белок агрегировал в митохондриях из мутантов и тф1-7, но не в митохонд-

риях из мутанта (рис. 5Б). Такое поведение белка-субстрата нахо-

дится в полном соответствии с предполагаемой схемой взаимодействий в системе шаперонов и может объясняться следующим образом. По-видимому, агрегация в митохондриях из первых двух мутантов является результатом затрудненного связывания апо-цитохрома Р450зсс с гЩ-Ьзр 70, в комплексе с которым белок-субстрат поддерживался бы в растворимом виде. Образовавшись, агрегаты устойчивы к действию Рип1р, по крайней мере, в данных экспериментальных условиях. С другой стороны, в отсутствии нару-

шается диссоциация комплекса ano-P450scc-mt-hsp70, что предотвращает как образование агрегатов, так и протеолиз.

Представленные выше данные могут быть суммированы следующим образом. После импорта апо-цитохром P450scc, по-видимому, остается связанным с mt-hsp 70, как это следует из общего механизма импорта, причем это взаимодействие носит обратимый характер и опосредуется белками Mdjlp и Mgelp. Поскольку апо-цитохром P450scc по неизвестным причинам не встраивается в мембрану и не сворачивается в нативную третичную структуру, он подвергается протеолизу под действием протеи-назы Pimlp. Если его связывание с mt-hsp 70 нарушено (например, в мутантах sscl-З и mdjl-7), то белок агрегирует, и последний процесс протекает быстрее, чем деградация.

Вариант цитохрома P450scc с N-концевым трансмембранным доменом деградирует под действием Ytal0p/Ytal2p протеиназы при участии митохондриальной системы шаперонов.

Слабое сродство апо-цитохрома P450scc к внутренней митохондриальной мембране дрожжей может быть искусственно преодолено введением в его полипептидную цепь гидрофобного участка, играющего роль трансмембранного домена в каком-нибудь хорошо изученном мембранном белке. Приняв в соображение это обстоятельство и рассчитывая индуцировать таким образом сворачивание цитохрома P450scc после его импорта в дрожжевые митохондрии, мы создали плазмиду, позволяющую экспресси-ровать in vitro гибридный белок, в котором на N-конце лишенного 75 N-концевых аминокислотных остатков зрелого цитохрома P450scc находились адресующая препоследовательность и первый трансмембранный домен субъединицы 9 ЬГ-АТФазы Neurospora crassa (pASu9-AP450scc).

1б

Такой гибридный белок импортировался в дрожжевые митохондрии. После импорта процессированная форма ASu9-AP450scc обнаруживалась во внутреннем компартменте, т.е. в матриксе или на обращенной в матрикс стороне внутренней митохондриальной мембраны. Кроме того, значительная часть (более 70%) ASu9-AP450scc не экстрагировалась из мембраны 0.1 M раствором карбоната натрия. Тем не менее, даже будучи присоединенным к мембране цитохром P450scc не приобретал нативную структуру и его развернутая полипептидная цепь была экспонирована в матрикс, что тестировалось ограниченным трипсинолизом озвученных дрожжевых митохондрий, содержащих ASu9-AP450scc (Ou et al., 1986 и Усанов и др., 1990).

Принимая во внимание мембранную локализацию и развернутое состояние ASu9-AP450scc, представлялось чрезвычайно интересным выяснить, какая протеиназа будет ответственна за его деградацию. Для этого мы провели с синтезированным in vitro гибридным белком и с митохондриями из дрожжевых мутантов ряд экспериментов, аналогичных таковым с ^модифицированным апо-цитохромом P450scc.

В отличие от апо-цитохрома P450scc деградация ASu9-AP450scc была полностью блокирована в митохондриях с протеолитически неактивным Ytal0p/Ytal2p комплексом (рис. 6А). В тоже время этот процесс имел сходную кинетику в митохондриях, содержащих немутированную протеи-назу Pimlp и в митохондриях, несущих Pimlp с замененным на аланин остатком серина в активном центре (рис. 6Б). Из рис. 6А и 6Б видно, что разрушение гена PIM1, являющееся причиной pet фенотипа, вызывает некоторое снижение скорости протеолиза ASu9-AP450scc. Однако, это было связано скорее с дефицитом внутримитохондриального АТФ, чем с частичным вовлечением Pimlp в деградацию гибридного белка. Действительно, введение Pimlp в митохондрии из Apiml штамма не стимулировало

и к я я

к

о, и Ч о и и о

Я л •С! и н к о о

120

^ 100

о о

о

VI

Л <

i

3

сл <

120

0 10 20 30 40 50 60 Время, мин

— АуШ10АуШ12Г{Ы0Е559%ЧЫ2ША% -я— \>/Т

"Г-1—Г-1—I—'—I—1—г О 10 20 30 40 50

Время, мин

—• 4Р1'т//Р1т1р —' ф1Ы/Рш11810,5Ар

Рисунок б. Импортированный Д8и9-ДР450зсс деградирует под действием УЫОрЛЧаПр комплекса. (А) Протеолиз Д5и9-ДР450зсс блокирован в митохондриях, несущих протеолитически неактивный УЫОрЛЛаИр комплекс. (Б) Протеиназа Рип1р не оказывает влияния на этот процесс. Все пробы анализировали как описано в легенде к Рис. 3.

протеолиз мембранного Д8и9-АР450Бсс (рис. 6Б). Таким образом, можно сделать вывод, что главная роль в этом процессе принадлежит мембранному У1а10рЛЪ12р комплексу.

Как и в случае апо-цитохрома Р450зсс, была изучена роль системы шаперонов в протеолизе мембранного ДБи9-ДР450зсс, осуществляемом У1а10р/У1а12р протеиназой. Оказалось, что деградация этого белка полностью блокирована при непермиссивной температуре в митохондриях из мутантов 55сУ-3, тф'1-7 и mgel-3 (рис. 7).

По-видимому, после импорта Д8и9-АР450зсс встраивается во внутреннюю мембрану, используя трансмембранный домен субъединицы 9 НГ-АТФазы и оставаясь при этом связанным с ш1-Ьзр70. Деградация ДБи9-ДР450зсс под действием У1а10р/У1а12р комплекса требует предвари-

о X

к ^ юо

п - _ - 4

а.

а> о

Ч и

о м

о о

И

§ =

8 < а

тсЦ1-7

35С1-3

1—■—г-'—г-*~~1—1—г 0 10 20 30 40 50 60

Время, мин

Рисунок 7. Участие митохондриальной системы шаперонов в деградации ДЗи9-ДР450зсс. Все пробы анализировали как описано в легевде к Рис. 3.

тельной диссоциации комплекса белка с шапероном. Ингибирование

последнего процесса, например, в отсутствии функционирующего Т^е1р, блокирует протеолиз Д8и9-АР450зсс. С другой стороны, стабильность белка в митохондриях из 55С/-3 и тс^1-7 мутантов может быть объяснена его агрегацией, происходящей из-за нарушенного связывания с пи-Ьзр70 и устойчивостью образовавшихся агрегатов к протеолизу.

Таким образом, представленные выше данные обнаруживают удивительное сходство в деградации развернутых белков под действием Р1т1р и У1а10рЛЧа12р комплекса. Кроме того, они предполагают существование

I :

универсального механизма 'удаления из митохондриального матрикса полипептидных цепей, склонных к агрегации и вследствие этого представляющих

помеху для функционирования митохондрий и жизнедеятельности клетки в целом.

Выводы.

1. Показано, что увеличение положительного заряда адресующей препоследовательности в рР450зсс снимает тканеспецифический запрет на его импорт в сердечные митохондрии.

2. Модифицированная форма рР450зсс с препоследовательностью субъединицы IV цитохром с оксидазы дрожжей эффективно импортируется в дрожжевые митохондрии, но имеет ограниченную способность встраиваться во внутреннюю митохондриальную мембрану и приобретать фермента-тивно активную конформацию.

3. Новоимпортированный цитохром Р450бсс подвергается протеолизу под действием митохондриальной протеиназы Рт1р.

4. При нарушении протеолиза (в частности, при Арт1 мутации) происходит агрегация.

5. Протеолиз и агрегация контролируются митохондриальной системой шаперонов, включающей белки 35с1р (пй-НэрТО), МёДр и Mgelp.

6. Гибридный белок, в котором 114 Ы-концевых аминокислотных остатков цитохрома Р450эсс заменены на адресующую последовательность и трансмембранный участок (112 аминокислотных остатков) субъединицы 9 РГ-АТФазы N. сгавза (рА8и9-ДР450зсс), импортируется в дрожжевые митохондрии, связывается с мембраной, однако, домен Р450бсс развернут и экспонирован в матрикс.

7. Д8и9-ДР450зсс подвергается протеолизу под действием мембранной У1а10р/У1а12р протеиназы, причем этот процесс также контролируется митохондриальной системой шаперонов.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Novikova, L.A., Savel'ev, A.S., and Luzikov, V.N. A modified form of the cytochrome P450scc precursor: a new approach in studies on protein import into mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Communs. (1994), 203, 866-873.

2. Новикова, Л.А., Савельев, A.C., Звягильская, P.A., Лузиков, В.Н. Импорт модифицированной формы предшественника цитохромаР4505сс в митохондрии из различных источников. Биохимия. (1995), 60, 995-1004.

3. Novikova, L.A., Savel'ev, A.S., Zvyagil'skaya, R.A., and Luzikov, V.N. Modification of the Targeting Presequence of the Bovine Cytochrome P450see Precursor Lifting Tissue-specific Restrictions on Its Mitochondrial Import. FEBS Letters. (1996), 378, 182-184.

4. Савельев, А.С., Новикова, Л.А., Друца, В.Л., Исаева, Л.В., Черноголов, А.А., Усанов, С.А., Лузиков, В.Н. Синтез и некоторые аспекты топогенеза цитохрома P450scc быка в дрожжах. Биохимия. (1997), 62, 908-916.

5. Лузиков, В.Н., Савельев, А.С., Новикова, Л.А., Лангер, Т., Нойперт, В. Роль протеиназ в биогенезе митохондрий: контроль за импортом чужеродных белков. Материалы IV симпозиума "Химия протеолитических ферментов" (г. Москва, 1997), с. 39.

6. Лузиков, В.Н., Новикова, Л.А., Савельев, А.С., Ковалева, И.Е., Лангер, Т., Нойперт, В. Гетерологический импорт белков в митохондрии. Тезисы симпозиальных докладов II Съезда биохимического общества Российской

академии наук (г. Пущино, 1997), с. 72.

7. Savel'ev, A.S., Novikova, L.A., Kovaleva, I.E., Luzikov, V.N., Neupert, W., and Langer, T. Topogenesis of bovine CYP11A1 in yeast mitochondria: roles of mitochondria chaperones and proteases. J. Biol. Chem. (1997), (submitted).