Электрохимическое исследование переноса электронов в молекулах адренодоксина и цитохрома Р-450scc из митохондрий коры надпочечников тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

«в 0

■ , н.ч'.вЗ'1.

^ \ г-: АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

Институт виоорганической химии

На правах рукописи

Гурьев Олег Леонидович

УДК 677.152.113:541.138.3

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В МОЛЕКУЛАХ АДРЕНОДОКСИНА И ЦИТОХРОМА Р-450ясс ИЗ КИТОХОНДРИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных ведеетв

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск - 19Р4

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси

Научные рукпиомитечи: (

доктор химических наук В.Л.Чации, кандидат химических наук С.Н.Гнлввич

доктор химических наук П.А.Киселев» доктор биологических наук В.М.Шкуматов

Вяяуая организация;

Институт фотобиологии АН Беларуси, г.Минск

Защита диссертации состоится .^у»» 1894 г. в

на заседании Специализированного совета Д 006.22.01 по зац» докторских диссертаций на соискание ученой степени доктора наук г Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси по адрес 220141, Минск, ул. Ходинская 5/2.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке .Инстит) биоорганической хинин АН Беларуси

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета, кандидат химических наук Н.М.Литвинко

(с) Институт биоорганической химии АН Беларуси

Актуальность пробленм. Электрохимические исследования белковых молекул лежат на стыке современной биоорганнческой хинин и Зиээлектрохимии. Широкое применение методов прямого и эпосредованного медиаторами электрохимического восстановления и окисления металлопротеинов в значительной мере способствует поникни» функционирования физиологических и искусственных электрон-гранспортных цепей, существенно распирает представления о внутри- и межмолекулярном переносе электрона в белках.

Монооксигеназные системы на основе цнтохромов Р-450 привлекают в последние десятилетия пристальное внимание исследователей разных направлений, в том числе и биоэлектрохимиков. К настоящему времени изучено прямое восстановление микросомальных цитохромов Р-450 и бактериального цнтохрома Р-450саго на катодах из ртути и никеля, постигнут существенный прогресс в электрохимическом восстановлении растительных и бактериальных Ферредоксинов. Однако, в научной литературе отсутствуют данные об электрохимических реакциях митохон-чриальных цитохромов Р-450 и Ферредоксинов животного происхождения, тактически нет сведений по электрохимическому моделированию цито-кром Р-450-содержащих стероидгидроксилирующих систем.

Цель работы - 1) поиск экспериментальных подходов к прямому и опосредованному электрохимическому восстановлению адренодоксина [Ад) и цитохрома Р-450всс (Р-450зсс) - металлопротеинов мито-юндриальной холестерингидроксилирующей системы из коры надпо-1ечников; 2) выяснение закономерностей редокс-реакций белков в »лектрохимической ячейке; 3) реконструкция холестерингидроксн-1Ируюдей системы с заменой Физиологических доноров электронов >лектрохимическим источником восстановительных эквивалентов.

Диссертационная работа выполнялась в рамках Республиканской •.омплексной программы фундаментальных исследований "Научные основы ювых биотехнологических процессов" и является Продолжением гтруктурно-функциональних исследований митохондрнальных стероид-•идроксилирующих систем, проводимых в ИБОХ АЙБ.

Научная новизна. Впервые показано прямое электрохимическое юсстановление Ад н Р-450зсе на серебряном катоде, а также установ-ено, что окисленный метилвиологен (МВ) промотнрует прямое юсстановление Ад на твердых электродах. Изучен механизм аблидаемого явления.

Для йд и Р-450зсс предложены вариант непрямого электрохимического восстановления с использованием медиаторов переноса элечтронов. Показана важность локальной области в молекуле йд, содержащей остатки дикарбоиовых аминокислот, для взаимодействия с низкомолекулррнымп реагентами.

i

' Установлено, что Р-450зос образует комплексы с ÍIB, карбокси-метилвиологеном (KMC), сепульхратои кобальта (Со(аер)) и 4,4'-дипнридилом, при этой MB, КМВ и Со(оор) выступают d качестве' высокоспиновых, а 4,4'-дипиридил • инзкоспинового эффекторов.

Доказано, что бинарный комплекс йд-Р-450асс является каталитически компетентным и способен эффективно отцеплять боковую цепь холестерина в отсутствие адренодоксинредуктазы (ЛР). Лд выполняет в комплексе важную эФФекторную Функци», ускоряя перенос электрона на ген.

На основе Р-450зсс, йд и Со(зер) разработана эффективная система бнотрансфорнации холестерина в прегненолон с электрохимическим источником восстановительных эквивалентов.

Практическая ценность. Скорость-димнтируюцей стадией стероидо-генеза у животных и человека является реакция биосинтеза прегненолона из холестерина. Учитывай значимость реакции отцепления боковой цепи холестерина для процессов гнзнедеятельности, несомненный интерес представляет поиск путей синтеза прегненолона с полной или частичной заменой редуктазних компонентов электронг транспортной цепи, а такие использование альтернативных источников восстановительных эквивалентов. Сопряжение электродных и ноноокелгеназных реакций перспективно для разработки бносенсоров на стероиды, ксенобиотики и некоторые продукты дизнедеятельности организмов, а также для создания биореакторов, способных In vitro производить стероидные гормоны, либо избирательно утилизировать вредные для организма человека метаболиты в устройствах типа "искусственная печень".

напрямую . восстанавливаются на серебряном катоде; 2) прямое электрохимическое восстановление Ад промотируется окислемным МБ; 3) Ад восстанавливается Со(зер) по вневнесферному, рН-независимом} ' неханизну; 4) комплекс йд-Р-450зсс каталитически компетентен i отсутствие. АР; 5) йд выполняет важную эФФекторную функцию п(

отнозешта и P-450scc, ускоряя перенос электрона на ген; 6) впервые предложена реконструированная холестерингидроксилирующая система с эл'ктрояимическим источником восстановительных эквивалентов на основе Ад, Р-450зсс и редокс-медиаторов (нейтральный красный (НК), НВ или Со(зер)). В системе с Со(аер) синтез прегненолона из холестерина происходит с наибольшей эффективностью.

йпопйачия работы. Основные результаты работы были представлены na Y Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989 г.), YXX Международной конференции "Цитохром Р-450: биохимия и биофизика, биотехнологические и экологические аспекты" (Москва, 1991 г.) и YIII Международной конференции "Цитохром Р-450; биохимия, биофизика и молекулярная биология" (Лиссабон, 1993 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ (4 статьи и 5 тезисов доклада).

Ofi-крм работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. В главе 1 приводится обзор литературных" данных по методам электрохимического восстановления наиболее вироко используемых в практике исследований редокс-белков - переносчиков электронов (цитохромн с, сэ, . Ъв, лластоцианин, азурин и Ферредоксины) н цитохрома Р-450; в общи и чертах обсуждаются количественные закономерности .гомогенного и гетерогенного переноса электрона. В главе 2 представлены результаты исследований и их обсуждение, в главе 3 - экспериментальные методы. Работа изложена на 187 страницах маоинопнсного текста, содержит 45 рисунков и 8 таблиц. Список цитируемой литературы включает 238 ссылок.

1. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Гомогенные Ад (А*х«/Ааво=0,82) и Р-450зсс (Аэвэ/Агво=0,82) из митохондрий коры надпочечников быка выделяли и очииалн согласно методам, разработанным в лаборатории химии белка ИБОХ АН Беларуси; концентрации белковый препаратов определяли спехтрофотомртрически на приборе Specord М40 (Германия). Препарат япо-Ад получтлн обработкой нативного ферредоксина 0,6 ti трияяоруксусной кислотой на холоду.

Формальный редокс-потенцная (Е°') Ад определяли методе;: равновесного потенционетрического, титрования красителем сафранинов t (СТ). Е°' Ад находили по уравнению Нернста.

Электрохимические исследования проводили- в трехэлектрод ной стеклянной .термостатируемой ячейке при температуре, как правило, 25±0,1°С. Рабочим электродом служил диск стеклоугяеродп (СУ) диаметром 0,8 см, вклеенный в тефлоновую трубку. В эксперимента» по прямому электрохимическому восстановлении такхе использовала серебряную проволоку (диаметр 0.Г5 им, длина рабочей части 20 wi). Электродом сравнения слухия насыщенный каломельный электрод (тип 11 401, Radiometer, Дания; Е°'=+0,244 В против нормального водородного электрода), относительно которого приведены экспериментальные и литературные значения потенциалов. Вспомогательный электрод (платиновая проволока) контактировал с содержимым ячейки посредство:: агар-солевого мостика.

Цикяовольтаипероыетрические и хроноамперонетричесхие измерения проводили в 1-1,5 мл 0,1 Н калий-фосфатного буфера, рН 7.С, содержащего ферментативную деокенгеннрующую систему (40 мМ глюкоза, 0,1 мг/ил глюкозооксидаза (Г0) и 0,09 иг/мл каталаза). Поверхность жидкой Фазы ячейки находилась под постоянным слабым тохом аргона.

Циклические вольтанперограммы регистрировали с помощь» полярографов РА-2 (Laboratorni pristroje, Чехо-Словакия) и PPW-1 (Elpan, Польша) и двухкоординатного самописца XY-4103 (Laboratorni pristroje, Чехо-Словакня). В хроноамперометричесхнх эксперимента»: для регистрации кривая ток-время использовали самописец XY-4103 с временной разверткой от полярографа PPW-1.

Константы скоростей второго порядка реакций восстановления редокс-белков медиаторами (к12) определяли хроноамперометричеекм в среАе, содержащей 0,1 X холат натрия, 1 И КС1, 100-170 икМ Ад или 100-120 икМ P-450SCC » 0,02-16 мкИ медиатора.

Комплексообразование P-450scc с низкомолекулярными реагентами изучали методом тандемного спектрофотометрического титрования на приборе Specord М 40 в 0,05 И калий-фосфатном буфере, рН 7,0, при температуре 25±0,1 °С. Низкоспиновую форму Р-450асс получали ферментативным способом и с помощью 0,1 X твина 20.

Р-4503СС- и цитохром с-редуктазную активность Феназиниетосуль-Фата (4-МС) изучали спектрофотометрически в реакционной смеси, со-

держащей 0,05 M калий-фосфатный буфер, рН 7,0, и глюкоэооксидаэную яеоксигенируюдую систему. .Концентрации восстановленных Р-450зсс и цнохрома с определяли спектрофотометрически.

Систему отщепления боковой цепи холестерина реконструировали в условиях аэробного электролиза при потенциале восстановления медиатора (ПК, MB или Со(зер)). Электролиз при контролируемом потенциале проводили в термостатируемой стеклянной ячейке в 0,05 M калий-фосфатном буфере (рН 7,0) при постоянном перемепивании. Реакционная смесь объемом 1-2 мл содержала 5 мкМ Р-450зсс, 50 нк1( холестерин, 0,09 мкКи [4-14С]холестерина, 0,125 мг/мл каталазы, 50 ед/мл супероксиддисмутазы (СОД), а также 10 мкИ Ад (либо ano-АД) и 0,03-0,1 % твина 20. Потенциал рабочего электрода задавали полярографом РА-2. Содержание прегненолона в анализируемых пробах' определяли раднохромагографнческим методом.

2. ПРЯМОЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ Р-450зсс И АД НА ТВЕРДЫХ КАТОДАХ.

Прямое восстановление Р-450яоо и Ал на кдтояе из серебра. Прямое электрохимическое восстановление Р-450ясе и Ад изучали методом циклической вольтамперометрии. Поскольку хромофорные группы Р-450зсс и Ад имеют низкий редокс-потенциал и в восстановленном состоянии могут окисляться Оз. исследования проводили в анаэробных условиях, на катодах с достаточно высоким перенапряжением выделения водорода. Эксперименты с Р-450зсс и Ад обнаружили, что на серебряном катоде в первом цикле развертки потенциала как гемопротеин, так и ферредоксин подвергаются восстановительным редокс-преврпщенням при -0,7— -1,1 и -0,7 В, соответственно (рис. 1, кривая 2 и рис.' 2, кривая 2). Характер вольтамперограмм, согласно общепринятым критериям, свидетельствует о необратимости электродных реакций Р-450зсс и, в особенности. Ад. Возможно, они сопровождаются разрывом химических связей и наруиением нативной структуры белковых глобул. Наличие двух катодных максимумов (при -0,75 и -1 В) на вольтамперограмме Р-450зсс, вероятно, отражает динамику процесса денатурации гемопротенна. Во втором цикле развертки пртеншплл максимумы, обусловленные разрядом Г-450эес и Ад, прпктичгс».'» исчезают (рис. 1, кривая 3 и рис. 2, крит>ая 3, соотпетсттк'нжО . По<ч?

Рис. 1. Последовательные цикли- Рис. 2- Последовательные циклические вольтамперограммн 10 мкМ ческие вольтамперограммн 20 мкМ Р-450зсс (2-3) на серебряном ка- ' Ад (2-3) на серебряном катоде; годе; 1 - фоновая кривая. Ско- 1 - Фоновая кривая. Скорость рость развертки потенциала - 0,1 развертки потенциала - 0,1 Ъ/с. В/с.

1 ч анаэробного электролиза при потенциалах -0,7 — -X В контро лируемые спектрально концентрация и степень окисленности исследуе мых белков в объеме ячейки не меняются.

По-видимому, при разряде первых порций Р-450всс и Ад и поверхности катода формируется .слой денатурированных белковы молекул, препятствующий дальнейаему участию в реакции основно массы ферредоксина и гемопротеина. Механизм необратимых редокс превращений Р-450зсс и Ад окончательно не выяснен; наряду с хроме Форными группами в электродных реакциях могут участвовать остати Суз, хелатирующие гемовое хелезо Р-450зсс и [2Ге-28]кластер Ад.

понимания механизма электродных реакций в ячейке нами иэуче1 ад орбция Ад, ГО и каталаэы на поверхности стеклоуглеродного k&toj с помощью редокс-эонда - ферроцендикарбоновой кислоты (ФДК). На ( 4'ДК обратимо окислялась с потенциалами анодного (Ере) н катодно; (Ere) пиков, соответственно, 0,4& и 0,36 В (рис. 3, кривая 2 Предварительная циклическая развертка потенциала рабочего злектро, от -0,2 до -0,66 В в течение 30 мин в присутствии Г0 и катала приводила к ухудшению параметров восстановления ФДК (рис. 3, крив 3), сгндетельствун об адсорбции белков на поверхности СУ. Добавя пне Лд на фоне ГО и каталазы с аналогичной разверткой потенция существенно не изменяло параметры реакций редокс-зонда (рис.

С

Рис. 3. Влияние на циклическую вольтанперограмму 82 мкИ ФДК (2) адсорбции на поверхности стеклоуглерод-ного катода ГО и каталазы

(3) и ГО, каталазы и Ад

(4); 1 - фоновая кривая. Скорость развертки потенциала - 0,005 В/с.

0,8 0,6 0,4 0.2 Е, В

0

кривая 4), что говорит о преимущественной адсорбции каталазы и Г0. Очевидно, реальной рабочей поверхностью в рассматриваемых случаях слуяит СУ с адсорбированными молекулами белков, а восстановление редокс-зоида происходит а порах адсорбированного слоя.

мв как промотор прямого_электроккнического_восстановления_йд^

1рми обнаругена способность окисленного МВ промотировать прямое электрохимическое восстановление Ад при потенциалах, близких к равновесному. В отсутствие МВ, как и ожидалось. Ад не проявляет электрохимической активности на СУ в области потенциалов от -0,2 до -0,85 В (рис. 4, кривая 1). При субмикромолярной концентрации !® на (икловольтамперограмме наблюдается слабая каталитическая волна >осстаковления эффектора в области -0,7 В (рис. 4, кривая 2). 1альнейпее увеличение концентрации МВ приводит к появлению хороно сраженного пика, который при этом неожиданно сиенается в анодную )бласть потенциалов (рис. 4, кривые 3 и 4) и разделяется на пик I, ютенцнал которого близок к потенциалу пика восстановления •,

I пик XI, соответствующий, как мы полагаем, прямому электрохими-[ескому восстановлению Ад (рис. 4, кривая 5). Пик II при 1асынаюдих концентрациях 1(В стабилизируется при потенциале около 0,52 В, что весьма близко к Е°* Ад, найденному нами потенциометри-:ески (-0,509 В). Доказательствами участия Ад в наблюдаемом едоке-превращении (пик II) слукат: а) при концентрации МВ больше О мк!1 величина пикового тока не зависит от МВ. Следовательно, ни В, ни какие-либо электрохимически активные примеси в препарате иологена не участвуют прямо в электродной реакции; б) ппкопнй ток рямо пропорционален квадратному корню из скорости развертки иотгм-

Рис. 4. Циклические вольтамле-рограммы 100 мкМ Ад в отсутствие П) ив присутствии (2-5) возрастающих концентраций MB | (соответственно, 0,4, 2, 10 и I 200 мкМ). Скорость развертки 1 потенциала - 0,005 В/с.

О -0,2 -0.4 -0,8 -0,8 -1,0 Е. В

циала; в) пиковый ток прямо пропорционален концентрации Ад. Таким образом, скорость реакции восстановления определяется линейной диффуэие;, молекул Ферредоксина к поверхности катода.

Методом циклической вольтамперометрии с переносом рабочего электрода в свежий Фоновый электролит нами установлено, что MB в данных условиях не полммеризуется н не адсорбируется прочно на стеклоуглеродном катоде. Необходимо также учесть, что восстановление Ад в промотируемых условиях происходит ухе при первом цикле развертки потенциала после внесения MB. По-видимому, промоторной активностью обладает мономерная Форма MB, непрочно адсорбированная на катоде.

Характер зависимости параметров восстановления Ад от концентрации MB доказывает, что для эффективного переноса электронов на активный центр Ферредоксина требуется определенная плотность молекул виологена на поверхности катода. В оптимальных условиях молекула Ад ориентируется относительно поверхности электрода так, что обеспечивается перенос электрона на [2Fe-2S^кластер без перенапряжения при потенциалах, близких к равновесному. На основании полученных результатов можно предположить существование комплекса Ад-ИВ-СУ, который формируется только во время развертки потенциала, когда под действием электрического поля поверхность СУ приобретает отрицательный заряд.

Электрохимическое восстановление Ад на СУ в условиях промо-тироланнв MB можно охарактеризовать как близкое к необратимому (ЕРо * зависит от скорости развертки потенциала, анодный пик слабо papasen). Тец не менее, циклические вольтамперогрлммы Ад полностью

о

Рис. Г>. Влияние комплексообра-зования Ад с Р-450зсс на восстановление йд в условиях про-иотирования MB: 1 - 150 мкМ йд и 50 икИ MB; 2 - 150 мкМ Ад, 50 мкМ MB и 130 мкМ Р-450зсс; 3 - то же, что и (2), но в присутствии 1 М KCl и 0,4% хо-дата натрия. Скорость развертки потенциала - 0,005 В/с.

-0,2

-0,4

Е, В

-0,6

-0,8

воспроизводились в течение 0 часов. Для малых скоростей развертки потенциала, когда пик реокнслекня Ад более выражен, можно приблизительно оценить 31/2=-0,515 В (Е1»о=-0,56 В, ЕРЛ=-0,47 В), что хороао соотносится с К°'. найденным нами потенционетрически. Гетерогенная константа скорости ка*. определенная с учетом электрохимической необратимости процесса, составила (1,7*0,2)х10-« см/с, а коэффициент переноса «¿=0,8*0,1, что близко к известным для Ферре-доксинов из литературы значениям.

Одним из объяснений необратимого восстановления Ад может быть то, что в результате редокс-реакцни Ферредоксин изменяет свою кокфоркация, ' а это иоает приводить к различной скорости переноса электронов для окисленной и восстановленной Форм белка, либо к диссоциации Ад кз комплекса АД • КВ • СУ.

Введение в электрохимическую ячейку Р-450зсс приводило к исчезновению пика восстановления Ад (рис. 5, кривая 2). Сам гемопротеин не способен электрохимически напрямую восстанавливаться э присутствии МВ (данные не представлены). Отмечается лишь некоторый рост тока каталитического восстановления МВ, который, как 5удет показано ниже, может выступать медиатором переноса электронов »ля Р-450асс. Диссоциация белкового комплекса с увеличением ионной :илы, особенно в присутствии детергента, вновь приводит к появлению (а циклической вольтамперограмне пика восстановления Ад (рис. 5, сривая 3). По-видимому, участок связывания Ад с естественным 1КЦептором электронов и участок взаимодействия с промотором |ерекрывавтся или близки. Этот результат такие подтверждает :пецифичность ориентации Ад в комплексе с МВ на поверхности катода.

Неианиэм_прояотируеного ИВ поггтяиртии>;у.»п ftr. Д5П Е11ССие|ШС

механизма действия промотора, нами мссаедоган ряд елнФаткческиг t; ароматических аминов. Перхлорат тетраСутиаакаония, 1,<-Дг.с:«'.но-бутан, р-аминодиметиланилин, иинохсааии, о-фёнантролии и 2,2'-лиридилдисульфид не проявляй какой-либо промоторной активности. 4,4'~дипиридил показал слабу» активность при потенциалах иксе -0,75 В. Только К MB, отлмчаюцийся от MB двумя концевыми карбоксильным:: группами оказался, как и MB, хороанм промотором. Характерной особенностью МБ и КМВ является наличие ароматической система 5Т-электронов, разделяющей два положительно заряженных четвертичных атома азота. На основании полученных данных можно предположить следующий механизм Функционирования промотора. Под действие» электрического поля дикатионы MB притягиваются к поверхности катоде и образуют (при некоторой достаточной плотности) слой, способный к электростатическим, ароматическим ÎT-ÏI и ион-дипольным взаимодействиям с аминокислотными остатками Яд. Молекула белка ориентируется отрицательно заряженным эяектропперсносяцим участком в сторону электродной поверхности и удерживается в комплексе Ад-НВ-СУ вплоть до стадии разряда. При этом четвертичные атомы азота MB экранируют отрицательные заряды на белковой глобуле и на поверхности катода, а протяженная система ароматических ÎT-связей образует проводящий мостик мезду редокс-центром белка и электродом. .

3. КИНЕТИКА РЕАКЦИЯ АД С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕДИАТОРАМИ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ.

Редокс-реакции низкомолекулярных соединений с металлопротеинамн являются важным источником сведений о закономерностях переноса электронов в белках. Получаемые кинетические и активационные параметры способствуют пониманию не только структурно-Функциональных особенностей редокс-преврадений активных центров белков, но и связанных с этим процессов, происходяцих во всей молекуле в целой.

редокс-медиаторов с Ад определяли хроноамперометрическим методом. Результаты представлены в таблице 1. Там же даны и активационные параметры восстановления Ад НК и Со(зер). Зависимость константы

Таблица 1. Константы скорости и некоторые активационные параметры реакций Ад с медиаторами переноса электронов.

Восстановитель ki2, ДН, AS, я-

н- -îc-i кДх- Дж-К- i. M

поль" 1 моль- i

Со(зер) 1, ,9x103 26,8 -59,5 оо

HIC 1, , 1x10= 30,2 -83,7 0 ,32

СТ 1, , ЗхЮ3 - - 0 ,32

ИВ 3, ,2x103 - - 0 ,32

КНВ 1, 4x10s - - 0 ,32

'.из скорости восстановления Ад Со(зер) от температуры в координатах Эйрннга представлена на рис. G. Значения энтальпии и энтропии ак:ивац):м реакций Лд с лнзко.чолекулярными реагентами находятся в

пределам литературных данных для других фер-редоксинов (от 1,3 до 07,9 кДх- моль-1 и от -154,9 до 121,4 Дж-моль^К-1, соответственно) . Перенос электрона с АР на Ад характеризуется приблизительно вдвое большей величиной изменения активационной энтальпии (54,4 кДж-моль-1) и меньпей величиной изменения активационной энтропии (-47,7 Дх*моль-1 К-*) (Lambeth & Kanin, 1979).

Трактовка механизма редокс-реакций Ад с медиаторами может бить сделана на основе теории внепнесферного переноса -Маркуса. Теория постулирует существование активированного промежуточного состояния, которое обладает характеристиками как исходных реагентов, так и продуктов реакции. В этом состоянии реорганизация растворителя вокруг зарядов дает сравнительно большой отрицательный вклад энтропии в изнененне свободной энергии, в сочетании с предсказываемой положительной величиной изменения энтальпии в' процессе реорганизации орбиталей. Анализ данных таблицы 1 позволяет предположить внепнесФерный механизм- переноса

электрона в реакциях Ад с низкомолекулярными редокс-реагентами.

nIL. Литературные сведения по рН-зависимости восстановления Ад носят противоречивый характер. Данные различных групп исслелг-сттплей однозначно говорят только о тон, что в присутствии АР Ал

зависит от рН при значениях последнего больпе 7,2. Нами и-эуч^нч зависимость ki2 скорости восстановления Лд Со(п»р)от ill. Л л Ai

3.2

3.4

1/Т, х 10"3

3.6

6.0

,ki2, x Ю^-'с*1

0,1

ионная сила, М

0,2

7.0

рн

0.0

Рис. в. Зависимость констант! kxz скорости восстановления Л) Со(зер) от температуры в координатах Эйринга.

Рис. 7. Влияние рН на константу kiz скорости восстановления Лд Со(зер).

Рис. П. Зависимость констант! kiz скорости восстановления А. Со(зер) от ионной силы.

скорость его восстановления СоСзер)2-1, не зависела от рН в интерва значений 6-8 (рис. 7).

Возможно, молекулярные механизмы электрохимического и ферме тативного восстановления Ад имеют отличия. Первый, рН-независимы наблюдается в отсутствие физиологического донора электронов и связан с протежированием какого-либо аминокислотного остатк Второй, зависимый от рН, реализуется в комплексе с АР и сопрялен переносом протона.

Влияние ионной силн на реакцию восстановления Ад Со(зев). I понинания механизма транспорта электронов в белках вагчым остает вопрос, каким образом редокс-партнер узнает электрон-переносяс область на поверхности белковой глобулы и чем контролирует взаимодействие белок-реагент: общим или локальным зарядами без

(или сочетанием обоих Факторов).

В системе Aa-Coísep)2* увеличение ионной силы приводило к снижению величины kia (рис.' 8), что характерно для реакций противоположно заряженных реагентов. Исходя из этой зависимости по уравнению Уэрланда-Грэя O/her land & Gray, 1976), считывающего вневнесферний характер переноса электронов, ми рассчитали эффективный заряд молекулы Лд. Он составил -7,7. По данным аминокислотного анализа суммарный заряд молекулы белка с полипептидноЯ цепь» из 114 аминокислотных остатков и окисленным [21Ге-23]кластером равен -12,5.

Полипептидная цепь молекулы Лд имеет Фрагмент с больиим содержанием отрицательно заряженных аминокислотных остатков (между Лзр72 и Азр86 (Tana)ca et al, 1973)). Этот фрагмент участвует в Формировании на поверхности белкл контактной области, через которую происходит перенос.электронов на [2Ре-28]кластер в нативных условиях. На основании экспериментов по изучению зависимости кгг восстановления Ад Со(зер) от ионной силы можно заключить, что эффекты ориентации и сближения Ад с Со(сер) зависят от заряда электрон-переносящей связывающей области, а не от суммарного заряда молекулы в целом. Поэтому найденная нами величина эффективного заряда Ад значительно отличается от величины, определяемой из аминокислотного состава.

4. РЕАКЦИИ F-4503CC С ННЗХОНОЛЕКУЛЯРНХСЯ! РЕАГЕНТАМИ.

К настоящему времени Р-450эсс сравнительно хороио исследован с точки зрения его структурной организации, физико-химических, имнунохимических и Функциональных свойств, однако возможности применения искусственных редокс-реагентов для моделирования функциональных свойств гемопротеина изучены недостаточно. За редким исключением (Усанов и соавт., 1985), практически нет сведений о кинетике восстановления этого белка низкомолекулярными медиаторами переноса электронов. Мало литературных данных и о влиянии ннзкомолекулярних соединений, не относящихся к субстратам Р-450зсс или их аналогам, на спиновое состояние железа гема.

Кшт.тлил_р.чехтуомчического иосстаноялс-ния ,Р-450зсс иеднатргаия

н-'Т'еносп ;«ле;:тТ":1.'!ог1. Константы скорости jx-акций иосстаиои-гени:!

P-450scc ннзкомолекулярными медиаторами, наПденше методом хроно-ампероие", ии, представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, бимолекулярные константы реакций Р-450зсс с 1!К, СТ, ИВ и Со(пер) характеризуются небольшими значениям» и легат в пределах 102-10° ц-1-c-i. Наибольшая величина ki2=l,lxl05 М-*с-х получена для реакции гемопротеина с 4>МС. В рассматриваемых реакциях на гем переносится только один электрон. Одноэлектронное восстановленне Р-450зсс естественным редокс-партнером - Ад, характеризуется величиной ltia около 10s М-1с-х. Таким образом, перенос электронов с медиаторов

менее эффективен, чем с Ферредок-сина (за исключением ФИС) и свидетельствует о неспецифичности этих реакций.

Можно предположить, что низкая скорость восстановления Р-450зсс может быть обусловлена рядом причин: 1) низкая разность между Е°' гемопротеина и реагентов; 2) электростатическое отталкивание реагентов и положительно заряженных остатков днзннов в молекуле гемопротеина; 3) значительная по-груаеиность гена внутрь белковой глобулы.

Реакции кояпдркгообрлзованип Р-4 50ассс Со( seo) ■ 4 ■ л'-днгиридило;!. КП н КИП. Как отмечалось визе, реакция восстановления гемопротеина ФМС характеризуется сначительно более высокой величиной lus по сравнению с другими .реагентами. Возможно, это связано с комплекнеобразованней ФМС и Р-450зсс, которое установлено нами методом КД-спектроскопии. По-видимому, комплсксообразосанне повывает Е°' Р-450зсс и позволяет реализовать транспорт электронов с медиатора на гем. 1

Показано, что Co(sep), НЗ и КНВ ЕУзавают при титровании низкоспиновой формы P-450OÇC (Р-450ооо(нс)), полученной ферментативным путем, спектральные изменения, характерные для лигандов цитохрома Р-450 I типа - рост поглоаения при 380 им и уменыаение его при 420 нм (рис. 9; для MB и КМВ не показано). Таким образом, они cu-

Таблица 2. Константы скорости реакций восстанозления Р-450зсс медиаторами переноса электронов.

Вогттановнтель kiz, M-ic-1 ,M

НК 1,27x103 0, ,32

СТ 5,52x10a 0, ,32

ФМС 1,06x10a 0, ,32

MB 3,6x10a 0, ,32

Со(зер) ?,06xl0z 0, ,32

0,004

2001 o Wl

-o,oo< ■ , 150-о.ооз. '

Рнг. Я- Результаты титрования Р-450асо(пс) Co(spp). I - изменения в разностных спектрах поглощения Р-450зсс(нс), вызываемые Co(oep); II - данные титрования Р-450осс(нс)

Со(аер) в координатах двбйиых обратных величин.

-\>,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 1/lCe(C0p}J, Mil"1

*:тупаэт еисокоспиноеими эффекторами Р-450всо. Такой же результат подучен к для Форки Р-450всс(нс), нндуцнросанной ненонным детергентом тайном 20 (данные не показаны). 4,4'-дипирнднл проявлял себя как лиганд II типа, так как при титровании высокоспинового ?-4Б0зса спектры поглощения характеризовались максимумами при 420 им и минимумами при 390 нм (данные не показаны). Константы диссоциации комплексов находятся в пределах от 4,4 до 33,7 м!1 в случае Со(зер), MB н КПЗ. Для 4,4*-д:ткридила Ко = 324,7 мМ. Полученные нами данные свидетельствует о слабой силе взаимодействий лнгандов с P-450SCO.

Восстановление Р-450япп я Индианой алектоо^тт>анспоотиой система на основе ГО и ФКС. Способность ФКС акцептировать электроны с- Г0" (Kulya et el, 1903) . и восстанавливать Р-450ясо позволИ^а'нам"' сконструировав анаэробную электроктрансп ортную цепь глюкбза— ГО—~?~ис--~Р-450зсс с глюкозой в качестве источника восстановительных эквивалентов в (рис. 10, кривая 1). Введение в систему окисленного Ад увеличивало начальную скорость восстановления ' гемо-протеина в 7-10 раз (рис. 10, кривая 2). В контрольных электро-хнмичеегчх и спектрофотометрнческих (данные не показаны) экспериментах Ад не восстанавливался ФИС. Следовательно, окисленный Ад слухнт не только восстановителем в полной ферментативной системе, но и эффектором по отноэени» к- своему физиологическому партнеру, стимулирующим в модельной системе перенос электрона с ФМС на гем. По отношению к цитохрему о окисленный Ад не проявлял эффекторной Функции. Таким образом, ускорение переноса электрона на гем в при-

Рис. 1». Кинетика анаэробного восстановления Р-450зсс в модельной системе, содержащей 5 мкМ Р-450зсс, 60 мкМ ФИС и Ферментативную деоксигенирую-щую систему: 1 - в отсутствие Ад; 2 - в присутствии 5 мкМ Ад.

сутствии Ад свойственно Р-460аоо, но не цитохрому с.

б. РЕКОНСТРУКЦИЯ 205,22Н-К0ЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛИРУШВП СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ Р-450ВСО И АД С ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ ИСТОЧНИКОМ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ЭКВИВАЛЕНТОВ.

Реконструкция кплегтрриигияр'оксилируютей систем» на основе Р-450зпп. йя и мелиаторои переноса электронов НК и МВ Исследования электрохимического восстановления Р-450всс и Ад низкомолекулярными медиаторами позволили нам реконструировать в электрохимической ячейке холестерингидроксилирующую систему на основе электронтранспортной цепи НК—••Ад—*-Р-450аоо. При насыщающей концентрации медиатора и постоянном потенциале стеклоуглеродного катода -0,69 В в присутствии экзогенного холестерина часть генерируемых на катоде восстановительных эквивалентов расходуется продуктивно - на синтез прегненолона. По данным радиохромато-граФичегкого анализа, прегненолон является единственным стероидным продуктом реакции и накапливается прямо пропорционально времени аэробного электролиза (рис. 11). Удаление любого из компонентов реконструированной _ системы полностью блокирует синтез прегненолона (таблица 3). Добавление в реакционную смесь СОД и каталазы практически не влияет на скорость образования конечного продукта, что позволяет исключить неспецифическое окисление холестерина с участием Ох>- и Н2О2. Катион-радикал МБ«* в тех же условиях не является эффективным медиатором переноса электрьиов (рис. 11). Следует отметить» что.хотя Р-450вос И Восстанавливается Формой - ККвоо в

Р-450яссвос, мкМ

20

время, ш»н

отсутствие Ад, однако редокс-цепь НК—>-Р-450асс не обладает моно-оксигеназной активностью (таблица 3). Данный результат соответствует представле-

Таблица 3. Реконструкция холестерингидроксили- ниям о важной эФ-руюцей системы на основе Р-460асс, Ад и НК. 4»ект<" ной роли Ад

в каталитическом цикле Р-450зсс.

Известно, ■ что Ад с удаленным в мягких условиях Г2?е-28 5 кластером (апо-Ад) не может быть донором

электронов, но сохраняет, способность образовывать комплекс с

Р-450ясо подобно нативному ферредоксину. Проверка эффепторных свойств апо-Ад в комплексе с Р-450зсс при наличии в реакционней среде неспецифчческого донора электронов - НК показала)?-.-, что апо-Ад не может заменить Ад в реконструированной системе- (таблица 3). Для успевного моделирования эффекторной функции Ферредовсяна, очевидно, необходимо выяснить молекулярные механизмы^- переноса электрона и сопутствующих ему конформационных перестроек в комплексе Ад-г'-450зсс. Как следует из навих данных, для проведения Ферментативной реакции отщепления боковой цепи холестерина не обязательно наличие всех белковых компонентов нативной холестерин-гидроксилирующей системы. Комплекс Ад-Р-450зсс каталитически компетентен в отсутствие АР при наличии неспецифического донора электронов.

Компоненты системы Образование пргкенолона, нмоль/3 ч электролиза

Полная (НК+Ад+Р-460всс) 9,1

Ад+Р-450асо 0

HK+P-450SCO 0

НК<-апо-Ад+Р-450асс 0

НК+Ад 0

Полная+СОД+каталаза в,5

Сравнение эффективности использования НК, !!В и Со(зер) в качестве медиаторов переноса электронов ь реконструированной 203,22П-холестерингидроксилируюдеП системе представлено в таблице 4. Анализ данных показывает, что !Ш наименее пригоден для использования. Это связано, вероятно, с больной скоростью гчекиелг-ния молекудярним кислородом ^тнец-рпд^.еллд КВ-* (kohct",iiïj

^прегненолон, нмоль

прегненолон, нмоль

50 100 150 время, шш

Кинетика образования прегненолона реконструированной нонооксигеназной системой на основе Р-450зсс, Ад и редокс-меди-атор—э: 1 - НК; 2 - MB. Концентрации медиаторов - 100 мкМ.

10 20 вреиа, мин

Кинетика образования пг^гненолона реконструированной нонооксигеназной системой на основе Р-450зсс, Ад и Со(зер). Плодадь рабочего электрода: 1 -0,5 см2; 2-1 см2.

ресжисления более 10е М-^с-1). Применение НК ограничено низкой растворимостью реагента в водных растворах (до концентраций около

0,1 мМ), хотя рекон-

Габлица 4. Реконструкция 205,22В-холестерин гидроксилирующей системы с электрохимическим источником восстановительных эквивалентов.

Медиатор Е, В • Температура, Содержание

прегненолона,

нмоль/30 мин

электролиза

ИВ» -0, ,86 26 0.5

Co(sep)« -0, ,86 25 17,6

Со(зер)" -0, ,86 .35 42,2

МВЬ -0, ,72 25 0,2

НКЬ -0, ,69 25 1.2

»-концентрация медиатора 6 мМ; ь-концентрация медиатора 0,1 мМ.

струированная система обладает лучшим выходом прегненолона по сравнению с МВ-содер-Еацей (таблица 4). Со(зер) имеет низкую константу .скорости реокисления молекулярным кислородом (43 ц-1С-1). Следует отметить и достаточно хорошую растворимость Co(sep) в водных буферных растворах (до концентраций в несколько десятков мМ). Таким образом,

Со(зер) является предпочтительным медиатором в реконструированной холестерингидроксилирующей системе в сравнении с MB и НК.

Кинетика накопления прегненолона в оптимизированных условиях в реконструированной электроферментативной системе на основе Со(зер) представлена на рис. 12. Начальная стадия реакции хапктеризуется лаг-фазой (рис. 12, кривая 1), что связано, по-вйдимому, с накоплением в реакционной среде промежуточных восстановленных Форм реагентов и, в первую очередь, - Co(aep)z+. Протяженность лаг>-фазн уменьшается с увеличекием площади поверхности рабочего СУ электрода (рис. 12, кривая 2)." Выход конечного продукта реакции прегненолона, составляет около 905! за 20 мин электролиза.

Реконструкция холестерингидроксилирующей системы в электрохимической ячейке с заменой редуктазных компонентов на Со(зер) оказалась высокоэффективной. В лучиих экспериментах число оборотов P-450SCC по холестерину в стационарной Фазе реакции составило 1,05 мин~х.

ВЫВОДЫ

1. Прямое электрохимическое восстановление адренодоксина и цитохрома Р-4503СС на серебряной катоде протекает необратимо и сопровождается адсорбцией денатурнрованннх белков на поверхности катода.

2. Окисленчый метнлвиологен промотирует пряное восстановление адренодоксина на стеклоуглеродном катоде. Реакция контролируется диффузией адренодоксина и по характеру близка к необратимой, при этом белок сохраняет натнвное состояние. Перенос электрона с катода на адренодоксин происходит через участок поверхности белковой глобулы, оеуцествлягашй взаимодействие с цитохромом P-450SCC.

3. Перенос электрона na [2I'o-2S]n*acTep в реакции адренодоксина с сепульхратом кобальта происходит по внепнссферному механизму. Для взаимодействия адренодоксина с низкомолекулягиим реагентом г<а:пое значение имеют электростатические контакты катиона сспульчг'Дта кобальта с отрицательно заряг'.-ннимн г.тпцокпеотнпчи остатками п локальной ?лгктротраислортно!'<

области на поверхности молекулы ферредоксина.

'4. Мет:«виологен, карбоксиметилвиологен, сепульхрат кобальта и 4,4'-дипиридил образуют комплексы с цитохромом Р-450асс, при этом метилвиологеи, карбоксиметилвиологен и сепульхрат кобальта . выступают в качестве высокоспиновых, а 4,4*-дипири-дил - низкоспинового эффектора цитохрома Р-450асс.

5. Адренодоксин выполняет важную эффекторную функцию, ускоряя перенос электронов на гем цитохрома Р-450аос.

6. Комплекс адренодоксин-цитохром Р-450асс каталитически компетентен в отсутствие адренодоксинредуктазы при наличии неспецифического донора электронов,

7. Реконструирована холестерингидроксилируювая система на основе цитохрома P-450SCC с электрохимическим источником восстановительных эквивалентов и заме."ой адренодоксинредуктазы на ред-окс-медиаторы нейтральный красный, метилвиологен или сепульхрат кобальта, реконструированная система, содерхацая сепульхрат кобальта, имеет максимальное число оборотов фермента по холестерину, равное 1,05 мин-1.

Основные результаты диссертации излохены в следующих работах:

1. Гурьев О.Л., Гилевич С.Н., Чащин В.Л. Реконструкция холестерингидрокаивют-ющей системы из митохондрий коры надпочечников на основе цитохрома P-450scc, адренодоксина и редокс-медиатора нейтральный кгааыЯ // Y Всесаозн. конференция "Цитохрси Р-450 и модификация макромолекул" : Яхта, 10-15 ноября, 1989, С. 69-70.

?.. Гурьев О.Л., Гилевич С.Н., Чадин В.Л. Реконструкция холестерингидроксилигу-вцей систоы из митохондрий кори надлсмечникслз на основе цитохрома P-450scc, адрен^поксина и редокс-медиатора нейтральный краашй // Бмохжия. - 1990. -Т. 55, H 9. - С. 1553-1562.

3. Gllevich S.N., Guryev O.L. Evaluation of electron transfer distances In cytochrome P-4503CC and adrenodaxin from adrenal cortex mitoojondrla // YII In ternaticual Conference "Biochemlatry & Biophysics of Cytochrane P-450" : Abstracts. Moscow, August, 4-9, 1991. - Moscow. 1991. P. 38.

4. Guryev O.L., Gllevich S.H., Chashchln, V.L. Fhenazine dyes as electron trana-fer-slunting probes In the reconstituted cholesterol hydroxylase // YII In ternntlonnl Conference "Biochnmistry & Blqpfojlca of Cytochrome P-450":

Abstracta, Moscow, August, 4-9, 1991. - Ho 3COM. 1991. P. 39.

5. Gilevich S.U., Guryev O.k. Direct electrochemical reduction of adrenodoxin and certain hescproteina prometed ty mettyl vio logen // YII International Conference "Biochemistry & Biophysics of Cytochrome P-4S0": Abstracta, Moscou, August, 4-9, 1891. - Mdsocm. 1991. P. 106.

6. Gilevich S.U., Guryev O.t,. Evaluation of electron transfer distances in cytochrome P-450scc end adrçnodoKin fron adrenal cortex mitochondria // in: Orbo-chrome P-450: DiorVaistry 4 Biophysics, Proc. of Yllth International Conference "Bicchsaistry a Bioptoaics of Cytochrome P-450": EHa. A.I.Archakov a a.I.BacJrasnova. №>soow, nKD-Ti'C Joint Stock Cotrçony, 1S92. P. 63-65.

7. Guryev O.L., Gilevich S.Ni, Chad-chin, V.L. Fhenaîine dyes as electron trans-fer-shmtijn3 probs3 in the reconstituted cholesterol hydroxylase // in: Gyto-chrate P-450: Biochemistry & Biophysics. Proc. of Yllth International Conference "Biochemistry a Biosfyaica of Cytochrome P-450": Bis. A. I.Archshov a G.I.Bachmsnova. tfoscow, WOO-TliC Joint Stock Ccnsny, 1992. P. 66-68.

3. Gilevich S.N., Guryev O.L. Direct electrochemical reduction of adrenodoxin and certain heracproteina promoted by rretlyl vio Losen // in: Cytochrome P-450: Biochemistry 4 Biopfvsics, Proc. of Yllth International Conference "Biochemistry & Bicpfyaica of CJrtochron» P-450": Bis. A.I.Archokov & G. I.B&chmmo-va. Moscou, INOO-TNC Joint Stock Ccrrpony, 1992. P. 622-524.

9. Guryev O.L., Gilevich S.N. Manifestation of high catalytic activity of cytochrome P-450acc supported by adrenodoxin end electrón transfer mediator, cobalt sepulchrate // YIII International Conference an C&iÂbfSane P450: Eiochenistry, Biophysics and ttoleailar Biology: Abstracts, LiiStSffT.'Pbrtuga 1, October, 24-28, 1993. - Lisbon. 1993. P. 172.