Иммунохимическое исследование цитохром Р-540-зависимых монооксигеназных систем митохондрий коры надпочечников тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ ХИМИИ

"'. ЧЕРНОГОЛОВ Алексей Алексеевич

удк 577.152.1.03:677.112.4:543.42 тшунохюгачвсхов исследование цктохром р-4бо-зависнми

м0в00кснгеназных систем митохондрия коры надпочечников Специальность 02.00.Х0. - Биоорганическая химия, химия природных

На правах рукописи

и Физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск 1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси

Научные руководители:

доктор химических наук В.Л. Чацин доктор химических наук С.А. Усанов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор - Д.И. Метелица

доктор биологических наук В.И. Шкуматов

Ведущая организация:

Белорусский государственный университет

Защита диссертации состоится (Я г.

в_ч. на заседании специализированного совета Д 006.22.01.

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу : 220067, Минск, Академгородок, ул. Жодинская Б/2.

С диссертацией мохно ознакомится в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан. .1993 г

Ученый секретарь специализированного _ *

совета, кандидат химических наук н.М. Литвинко

Институт биоорганической химии АН Беларуси

Актуальность теш- Цнтохрсм Р-450-зависимые мшооксигеназы являются одной из наиболее интенсивно изучаемых групп ферментов, что обусловлено их распространенностью, пироким спектрсм катализирует* реакций, принципиальной значимостью в обеспечеюш гсмеостаза в организме человека и животных и перспективой практического использования. Во внутренней мембране митохондрий коры надпочечников локализован!, как мингагум, две цитохрсм Р-450-завиаа«1е ферментше систеш: холестерингцдроксилирухщая, реализующая ключевой этап стероидогснеза - обра-зови.<ие прегненолона - исходного субстрата для синтеза инрокого спектра ' эндогенных стероидов, и а!ста«, гадроксилирукщая стероиды в Неположенна, а такта участвую®« в 18- и 19-гндроксилирогании стероадоэ с образованием альдостерона. Обе системы включают в качестве промежуточных компонентов электронтранспсртной цепи адренсдоксинредуктазу (АР) и адренсдоксин (АД), а специфичность реакций обеспечивается изоферметами цитохрсма Р-450 - Р-450зся и Р-450и. Строгая стерео- и региоспешфгшость Р-450-зависи>мх реакций и их согласованность связали с особенностями мембранной организации злектронтрешатортных комплексов. Важность этих реакций для биосинтеза кортикосгеровдов объясняет повыаемий интерес к изучению организации и функционирования кктоховдриалыых моиоскси-геназных систем и их терминалыых оксидаз - Р-450зсс и Р-450и. Основня? работы в этом направлении наполнены та уровне сояюбилизнрсгаюых и очищенных препаратов белков. В то же время, вопрос о мембранной организации митоховдркальных цитохрсм Р-450-завиаиих систем и приемлемость предложенных моделей мембранной организации микроссмальных цитохрсмоз Р-450 для исследования митохсодриальшх гемопротеинов остается открытым.

Пяль и пллдчи игглалопзнип. Основная задача работы - исследование молекулярной организации холестерин- и Ир-гимрокснлгрукцеП систем в составе внутренней мембраны митохондрий коры надпочечников йжа с пемацыо гамунохимических подходов. Антитела к отдельным белкам н фрагментам молекулы Р-450зсс использстшы в качестве высокоспецифмчных аналитических реагентов для количественного определения ксмпонентов монооксигенаэ, изучения их ориентации в мембране, а также для исследования стрпстуроо-фуниоималыих взаимоопгатстШ в мсискжсягеназнсн катализе.

нчучичп нопнпт. Впервые получены антитела к структурно оформлен»« элементам молекулы Р-450эсс. Показано, что антитела к белкам-компонентам митохокпгиалыых ноноокемгеназных систем могут служить в качестве модуляторов активности эти* систем, ингибируя реакции гидрокоиирования стеронаов. Исследована ро*ь отдельных участков молекулы Р-450асо в моноокелгеназнеч катализе. Газгабогиы системы микроопределения АР, АЦ, Р-450яос и Р-450и и исследпвмю »'* содтт'п»-

в митохондриях коры надпочечников. На основании данных по взаимодействию антител с мембранами предложена модель организации моноокснгегазных систем во внутренней мембЕане митохондрий. Показано, что два крупных дсмена Р-450зсс являются тронс-нембранними. Исследована антигенная структура Р-450зсс и локализованы четыре антигенные детерминанты в молекуле гемопротеина.

1. Получение антител к белкам-кшпонентам монооксигеназных систем митохондрий коры надпочечников и к фрагментам молекулы Р-450зсс - К1, ¡?2 и ГЗ.

2. Исследование влияния полученных антител на реакции гидроксилирования холестерина и 11-дезоксикортикостерона.

3. Разработка методов микроопределения АР, ДЦ, Р-450зсс и Р-450и и определение содержания белков в митохондриях кори (идп очечников.

4. Исследование взаимодействия антител с мотопластами и субмитохоцдриальными частицами.

6. Исследование антигенной структуры Р-450бсс.

включается в тем, что полученные в ней результаты могут служить основой для создания мембраносвязанных монооксигеназных а1стем, обладающих поименной стабильностью и селективностью, а также для разработки методов модулирования активности компонентов монооксигетз при пемощи антител. Разработанные метода определения АР, АД, Р-450зсс и Р-450и могут быть использованы для создания методов дшшостики, основанных на экспресс-анализе этих белков в коре надпочечников, а также для обнаружения продуктов экспрессии генов монооксигеназ в различных биотехнологических системах.

конференции "Цитохрсм Р-450 и охрана внутренней среда человека" (Москва, 1985), Всесаозной конференции "Цитохрсм Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), VII Всесаознсм симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллинн, 1987), V Советско-швейцарсксм симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988), 6-ой Международной конференции по биохимии и биофизике цитохрема Р-450 (Вена, 1988), 14-см Мездугароднсм конгрессе по биохимии (Прага, 1988), V Всесаозной конференции "Цитохрсм Р-450 и модификация макрсиолекул" (Ялта, 1989), Всесаознсм симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), 20-см конгрессе ФЕБО (Будапешт, 1990), VII Международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрема Р-450; Структура и Функция, биотехнологические и экологические аспекты" (Москва, 1991), 9-си Меадународнсм Симпозиуме "№гкроссмы и окисление лекарств" (Иерусалим, 1992).

Практическая ценность диссертациошюй работы

Штериалы диссертации представлялись та Всесаозной

Кубдухцпя!. По основным результатам диссертации опубликовано 9 статей и тезиси 12 докладов ид конференциях.

состоит из введения, трех глав, зактанения и списка литератур».

1. ПОЛУЧЕПШ И ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ К Шрт'тМ-КОШОНЕНТАМ КГГОКОВДРИАЛЫШК МОНООКСИГЕНАЭШИ СИСТЕМ И ФРДГИИГГАМ МОЛЕКУЛЫ Р-450есс

Получение антител (Лнти-...) к компонентам монооксигеназных систем митохондрий коры надпочечников быка - АР, АД, Р-450зсс и Р-450и - явилось основой комплексного использования разящих нммунохимических методов для изучения функции этих Ферментов и их организации в мембране. 11а первом этапе работы была проведена нм>отохимическая характеристика полученных антител, основная цель которой заключаюсь в исследовании их спещйпяностн. С псмощыо нмпунодиффузии по методу Ухтсрлонн и имнуноблотганга Шло показано, что полученше антитела не проявляют шражотых перекрестных реакций с гетеролопгпыш антигенами. Сравнение иммунохимическнх свойств ряда представителей китохоццриэльшх и кикроссиальшх Р-450-завиаэтих мсиооксигеназ подтверждает значителыые их структурные отличия, тогда как иммунохнмическне свойства Р-450зсс из митохондрий кош 1вдпочечников Сика и плацент« человека очень близки.

Протеолитическая модификация Р-450бсс в растворе трипсином пргаодит к образовании ряда крупных Фрагментов полипептцдной цепи (рис. ■ 1), свидетельствуя о дсмишой структуре мояекуяа гсмопротегаа (СЬззЬсМп еЬ а1., 1985). Натигний гсмопротенн подвергается, при лимитируемом времени обработш, протеолитической атаке только в области Лгагв°-Аэ72в7, в результате чего оСрагуются фрагншпи Г1 и 1^2, С псмацио 1&:муноэлектрофорсза триптического гидролизата Р-450зсо в присутствии Анти-Р-4Б0зсс било показало, что антигенные детерминанта содер.татся как в И, так и в г2. Эти результаты явились предпосылкой для получения антител к Фрагментам полшептндной цепи Р-450зсс и ¥2, а такте аипггел к фрагменту КЗ, представляющему Н-концевую последовательность К2.

Лнти-И и Лнти-Г2 не образуют в условиях икунодиффузт по Ухтср.тсвд прециго1татов с Г2 и И, соответственно, а Лнтн-В"2 и Антн-ГО перекрестно реагируют с ГЗ и ¥2. Все антитела "узнает" Р-450псс, что свидетельствует о совпадении антигенных детерминант Фрагментов и P-450r.ec (»го не исклк-прт газличий в полнен наборе детерАПсигт нзодиротшг.« фрагментов н фогнигуо"'* ичч участков в молекуле гемопротегав) и позволяет предполелггь, что бплип'чст" детерминант сформировано прстяхетимм участят полипеитид»ой пепч Г <ГС!.--"п

_ страниц текста, _рисунков и_ таблиц. Диссертация

I

92

111

250-2^7

V

1

399

450500 (56400 0а;

Г 1 (29800 Ос)

Г 2 (2660Э 0а)

Г 3 (16800 0а)

(9800 0а)

(11100 йа)

ГО (45300 0а)

Рис. 1. Схема трипсинолиза Р-450зсс.

Чтобы определить эффективность и специфичность полученных антител была изучена стероидгвдроксилирумдая активность Р-450зсс и Р-450п в реконструировашых системах в присутствии антител. В предварительных экспериментах установлено, мо йнти-АД и Анти-йР ингибируют реакции гвдроксилирования с участием обоих цито-хрсмов Р-450, но эффективность ингибирования при этсм не превдаает 40% (уменьшение активности при 10-кратнсм молярной избытке антител). Наиболее вирохзнное ингибирование реакций гидроксилирования наблюдается в случае испольэоватм антител к терминальным компонентам - Р-450и (рис. 2) и Р-450зсс (рис. 3). Э}фект зависит от концентрации добавлеиних а}тггел. Так, если в отсутствие антител активность Р-450и, оцененная по скорости образования кортикостерона, составляет 23 мин-1, то в присутствии 2-кратного избытка Лнти~Р-450ц от уменьшается на 46%, составляя 12.5 мин-1. Ингибирование носит слеци}>ический характер, поскольку добавление 10-кратного избытка Янтл-Р-450зсс приводит к снижении активности лишь на 18%, что сравнимо с контрольным эксперимент»«, в котором использовались неиммунные антитела (15%). В присутствии Длти-Р-450осс наблюдается ингибирование холестерингидроксилирухцей активности Р-450всс. При 2-кратном из&ггке антител скорость образования прегнеиолона снижается с 5.8 мин-1 до 1.4 мин-1 (при этсм в присутствии неиммунных антител наблюдается даже некоторая активация реакции). В обоих случаях в присутствии больших избытков специфических антител степень ингибирования достигает 90%.

Для 'того, чтобы оценить функциональное значение дсменов Р-450всс, сформированных М- и С-концевани участками его полипептидной цепи, исследовать влияние антител к И, К2 и К5 т стюсобность Р-450зсс осуществлять ферментативную трана}юр»ицию холестерта в прегненолон.

О 2 4 б 8 10 [Анти-Р-450(11) 1/£Р—450(11)3.

Рис. ?.. Активность Р-450х1 в присутствии Анти-Р-450ц. Количество белков в пробе: 1 толь Р-450и, 5 нмоль АД. 0.4 »моль АР. * - контроль (активность в присутствии неиммунных антител).

0 1 2 3 4 5 6 (Анти-Р-450всс)/ÎP-450sccI, М/М

Рис. 3. Активность Р-450зсс в присутствии Анти-Р-450аос (1). Анти-Fl (2). -F2 (3) и -F3 (4). Количество белков в пробе: 1 нмохь Р-450асс, 4 (моль АД, 1 (моль АР. * - контроль.

тьятана 1 Влияние Анти-Р-450эсс, Анти-Fl, Ahth-F2 и АнпНГЗ на кинетические параметры взашсдействия гемопротеин» с АД и активность Р-450эсс при различных концентрациях АД».

Образец

Взажодействие с АД

[Антитела]/ ---------------------

[Р-450зсс], Апвх, Ка, ц/ы азэо-420 мкм

Активность

Vmax, Km, мин-1 мкМ

Контроль без антител 0 0.117 9.1 (0.995) 20.0 10.0 (0.998)

В присутствии:

- неиммунных антител 2 0.120 8.9 (0.993) 26.6 14.2 (0.995)

4 0.118 9.2 (0.995) 28.4 15.2 (0.994)

- Анти-Р-450эсс 2 0.118 15.6 (0.997) 18.3 26.0 (0.993)

4 0.115 16.8 (0.995) 24.9 43.6 (0.994)

- Анти-Fl 2 0.136 18.6 (0.998) 25.0 32.1 (0.998)

4 0.125 19.6 (0.999) 28.4 52.2 (0.995)

- AHTH-F2 2 0.112 15.5 (0.998) 23.7 33.8 (0.996)

4 0.112 18.9 (0.995) 26.4 41.0 (0.998)

- AHTH-F3 2 0.118 15.8 (0.997) 17.5 31.0 (0.992)

4 0.114 16.2 (0.997) 23.9 48.1 (0.993)

* - Спектрофотсметрическое титрование Р-450зсс АД проводили в кктетах 1 см р 50 мМ натрий-фоефатнсм буфере, рН 7.4, при концентрации Р-450зсс - 2.9 мкМ, твшп 20 - 0.5%, в диапазоне концентраций АД - 4-40 мкН. Активность Р-4М.чсс определяли в системе, содержащей (в овъгне 1 мл) 1 толь Р-450ясс, 0.5 1»тлъ ЛГ в диапазоне [АД]/[Р-450зсс] - 2-20. йлах и Ушах, Кя и кажущуюся Км расоттытчи. используя компьютерную программу Епгрзск 3 (В1озоЛ, СИЛ). В скобглх ИТ-пред™* коэффициенты корреляции для дашых в коорднттпх Лчйнупт^-Г^тгл.

Т

-0.1 0 0,1 0,2 0,3 1 / (АДРЕНОДОКСИН ], шЛГ1

Риг. 4. Зависимость спектральных изменений низкослиновой Формы Р-450асс от концентрации АД. Условия см. в подписи к таблице 1.

0 -без антител, 1 - [Анти-,>-450зсс]

1 - [Анти-Р-450асо/[Р-450зсс] = 2.

2 - то же = 4.

1/1АДРЕНОДОКСИН), икМ-1

Рис. 5. Зависимость активности Р-450и от концентрации АД, Рекоиструировангая система: 0.5 нмоль Р-450и, 0.4 имоль ЙР, 100 мкМ 11-дезоксиксртикостерон.

0 - без антител,

1 - [Алти-Р-450и]/[Р-450113 = 0.2, 2 - то 2е = 0.6.

Как следует из рис. Э, антитела к Фрагментам ингибируют реакцию превращения холесгерша в прегненолон. ЭДфективность ингибирования Дити-Р-450зсс и Анти-К1 совпадает, а Йнти-Е2 и Д1гги-]ГЗ опас^гоаот меньший ингибируюций эффект. Во всех случаях ингиоирование не я- "■яется полили. Эти данные позволяют предположить, что в предаете катализа оба домена молекулы гемопротегоа принимают участие в ферментативном акте. Это также указывает на дюимичное взаимодействие отдельных участков полипептвдноП цепи Р-450зсс и не согласуется с моделью молекулярной организации, согласно которой одна часть молекулы Р-450зсс представляет собой каталитический дсиен, а вторая отвечает за взаимодействие с мембраной.

Механизм нигибирующего действия штггел слалхп и включает, по-видимему, как непосредственное взашодействие с 4ункцио!пльно важными участками молекулы Р-450зсс, так и кои^ормадаонше перестройки молекулы. Антитела не влияют 1н восстановление Р-450зсс дитионитом I атрия и его взаимодействие с холестеринсн. Эти результаты позволили сделать предположение о тем, что - чтите та наруиают электро'кя транспорт, препятствуя взаимодействию гьиопротеша с АД. Это бшо проверено титрованием низкослиновой Формы Р-460есс, подученной при дссаметш к гемопротеину твина-20, АД, являющимся шсокосгисиз! эФ^екторсм Р-450зсс.

Как следует из рис. 4 и таблицы 2, в присутствии антител к Р-450аоа и трем Фрагментам его полипептидной цепи умеиьгается амплитуда спектральных изменен'-'», характеризующих спин'-цй переход в области 390-420 >м, причем характер этих •вменений (увеличение Кз при слабо изменяхщейся Авах) свидетельствует в пользу конкуренции антител и АД связывание' с Г - ЛОаоо. Это гсчорит о тем, что антигенные детерминанты Р-450эсс и участки, отвечающие за взаимодействие с АД, могут, по крайней мере частично, перекрываться. Нарушение взаимодействия Р-450асо с АН является, по-видимому, основным объяснением ингибируюцего влияния антител 1« активность Р-450асс, поскольку, как следует из таблицы 1, эффект определяется соотношением антител и АД. Такое предположение подтверждается тем, что, как показано в случае Р-450и, степень ингибирования активности зависит от соотношения ДД: генопротеин и при больших молярных избытках АД (более 20:1) ингибнругадий эффект Анти-Р-450и не проявляется (рис. 5).

Такт обраэсм, антитела к обоим цитохремам Р-450 могут служить высокоспеци))ИЧ№Ми реагентами для изучения белок-белкошх взаимодействий, являясь эффективными модуляторами активности этих гемопротеинов.

2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКСВ-КОМПОНЕНТОВ ЦИТОЯРОМ Р-450-ЗАВИС1МИ МОНСХЖСИГЕНАЗШИ СИСТЕМ ВО ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЕ МИТОХОВДКЮ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ

Основные исследования мембранной организации цитохрем Р-450-завиа»ых монооксигеназных :смплексов выполнены, в основном, на микроссмальных системах. В результате анализа данных о первичной структуре, ограниченного протеолиэа, химической модификации и нммунохимкческого определения поверхностных участков белков был предложен ряд моделей мембранной организации мнкроссмалыых цитохромоэ Р-450, большинство из которых предусматривает наличие в Н-концевой области одного-двух трансмембранных участков, тогда как основная часть молекулы экспонирована на поверхности мембраны.

Топология компонентов монооксигетазных систем в мембране имеет принципиальное значение для осуществления стеровдогенеэа. До настоящего времени с уверенность» мсино било утверждать, что НАОРН-связывающий дсмен АР расположен га поверхности внутренней мембраны, обращенной в матрикс. Что хе касается гемопрот шов, то имелось предположение, основанное на результатах ограниченного протеолиэа обработанных ультразвуке« препаратов митохондрия, о тем, что определений участки цитохрема Р-450 могут быть экспонированы в матрикс (ОигсМП & К1я"-а, 1979). Получение антител к отдельном компонентам монооксигетзшх комплексов, а также к Фрагментам молекуя.1 Р-450зсс открыло воэчсасности для исследования

А

А

0.2- а

2

0.1-6

2

О

О

-0.2

-0.1

400

460

600 НМ 400

460

600 НМ

ЕИС,—JL. Фсгиентативное (1) и виическое (2) восстановление цитохрсма Р-450 в митопластах (А) и СМЧ (Б). О - базовая линия. ОН били псшучеш ультразвуковой обработкой митопластов на приборе Virscnlc (Virtis, США) с последующей промывкой меибган 50 мМ натрий-фосфатн>м буферсн, рН 7.4.

особенностей организации этих белков во внутренн S мембране митохондрий, включая изучение их стехиометрии и ориентации в мембране.

Чтобы уменьшить влияние компонентов внешней мембра>ы и сделать доступной цитозольную поверхность внутренней мембрана для антител в работе были использованы митопласты - митохондрии, лишенные внешней мембраны в результате об£в-ботки дигитонинсм. До 85 % полученных митопластов по дани« электронной микро-•скопии сохраняли естественную ориентацию внутренней мембраны. В качестве препаратов с обратной ориентацией мембраны использовались субмитохондриальные частицы (СОТ), полученные обработкой митопластов ультразвуком. Целостность мембранжх препаратов определялась и в условиях Ферментативного восстановления мембра-носвязанного цитохрсма Р-450 (рис. 6). При добавлении к суспензии митопластов NADH3, ВД и ЙР восстанавливается не более 7% р-450 (Р-450зсс и Р-450и). Это свидетельствует о тем, что NAIFH-сБяэывакпий участок и АД-связлааккая область в молекуле ДР, а также АЦ-связывагацие участки двух цитохремоз Р-450, обрацешые в матрикс, не доступны антителам. Это подтверждается тем, что в СЫЧ, как в присутствии экзогенных АР и АД, так и без них при добавлении 1IADH! наблюдается за рак терний спектр карбонильного кскплекса восстановленной формы Р-450, причем до 50Х белка восстанавливается в данной системе.

Данные о количественном содержании и соотношении отдельных компонентов моно-оксигеназных систем достаточно противоречивы. Это связано с тем, что суцеству-юцие спектральные методы позволяют определять только суммарный Р-450. Другие « методы основаны № предварительном наделении белков или определении их

в

КОЛИЧЕСТВО ВЕЛКЯ В ПРОБЕ, нг

Рис. 7. Калибровочные графики для определения АР (А), АЦ (Б), Р-450зсс (В) и Р-450и (Г) (графики 1). После нанесения образцов, нитроцеллолозние Фильтры обрабатывали антителами соответствующей спец!*{>ичности и [12В1]белксн А. Графики 2 1а рис. В и Г - связывание для Р-450зсс и Р-450и в присутствии Лнти-Р-450и и Анти-Р-450зсс, соответственно.

специфических активностей. В ранних исследованиях (Копя et о1., 1974) для АР и АД Олла ггрсдлссг.енз стехиометрия 1:7.6. Шло показано, что еоотналеше АГ:АД:Р~ 450зсс может составлять 1:10:10 (ОЬазЫ & Ошга, 1978). Для гуспргюго Р-450, АЦ и АР било также предложено соотнсгаение 8:3:1 (Напикод1и & Пашков 1и, 1905).

Для прямого определения белковых компонентов митохоцлртльнмх I «ггоург** р-450-зависимых систем был разработан един из вариантов ТЕтдсфа^нто рп1м">-I то-глголоппеского аюлиза (П!А), основанный |а физической горении шггиггнгв т шггроцеллюлозных фильтрах с последугаяей оОтбеткой Фнльтроп лтигр.пии соответствукцей специфичности (рис. 7). В качестве униит^ч-чот

Содержание Р-450зсс, Р-450ц, АД и АР в митохондриях II митопластах.

Концентрация,

Антиген*'

мг/мл су- нмольДсл мг/мг об- нмоль/мг об-

спензиИ*"* суспензии** щего белка щего белка

Р-450зсс Р-450И АД АР

Цитохрсм Р-450***

0.540 0.425 0.304 0.164

9.57 7.71 25.33 3:23 13.51

0.046 0.036 0.026 0.014

0.82 0.66 2.16 0.28 1.15

Нитопласти

Р-450зсс Р-450и АД АР

Цитохрсм Р-450***

0.264 0.181 0.160 0.104

4.68 3.28 13.33 2.05 8.48

0.042 0.029 0.026 0.017

0.75 0.53 2.14 0.33 1.36

* - Молекулярная масса Р-450зсс - 56400 Да, Р-.50ц - 55100 ¡¡а, АД - 12000 Дз,

АР - 50700 Да. ** - Концентрация общего белка в суспензии митохондрий, определенная методе« Ьонгу ег а1. (1951) составляла 11.7 мг/мл, в суспензии нитопластов - 6.23 мг/мл.

*** - Концентрацию суммарного цитохрема Р-450 (Р-450зсс + Р-450ц) определяли спектрофотсметрически из разностных спектров мембранных структур, обработаншх дитионитсм натрия и СО (Е«оо-4эо = 91 м)-1-1ог1).

•для количественного определения связашихся антител бил использован [12В1]белок А из Б^.р1]у1ососсиз сшгеаз. Как следует из приведенных на рис. 7 калибровочных Графиков, радиоактивность фильтров для всех использованных антигенов прямо пропорционалыа количеству антигена в диапазоне 0.5-20 нг, что соответствует 9-350 фмолям Р-450зсс и Р-450и, 40-1700 (¡нолям АД и 10-400 фмолям АР.

Сравнение с известными методани позволяет сделать швод о тем, что разработанные тест-системы являются наиболее чувствительными при определении АР и АД и одними из наиболее чувствительных при определении Р-450зсс. В условиях анализа не наблюдалось перекрестной реакции Анти-Р-450зсс и Анти-Р- 450ц с гетерологичными гемопротеинами (графики 2 на рис. 7В и 7Г), что позволило количественно охарактеризовать оба цитохрема Р-450 в мембраншх препаратах.

Результаты определения содержания компонентов цитохрсм Р-450-зависиных моноокемгеназ в митохстцриях и митопластах, представленные в таблице 2, ■ свидетельствуют, что суммарно эти белки составляют более 12% митохондриального белка, причем массовая доля гемопротеинов является наибольшей (8.2%), а < количество Р-450зсс превшает количество Р-450ц в 1.4 раза. Рассчитанное из данных микроопределения молярное соотношение АР, ад, Р-450и и Р-450зсс

составляет 1:7.7:2.4:2.9 в митохондриях и 1:6.4:1.6:2.3 в нитопластах. Поскольку d условиях РИА детектируется иммунореактивный белок, а не только хрсяофор-содержацие форм, то, чтов.4 учесть содержите спектрально необнаружлвлсмого белка в контрольных образцах (концентрацию которых обьнно определяли спектро-фотсиетрически), истюльзооаншх для построешш калибровочных зависимостей, параллельно проводили определите концентрации белков в этих образцах с псмсщно аминокислотного анализа. С -учетсн поправочных коэффициентов, полученных в рез» .штате анализа и отрааахщих огганичения спектрсфютометрического определения концентрация стандартов, стехиометрия АР, АД, Р-450ц и Р-450зсс мтегат Оль представлена: 1:7.9:1.9:2.7 - для митохондрий и 1:6.8:1.3:2.2 - для китоплас-тов. Сравнение результатов РИА P-450scc и Р-450и и спектрофотсметрического определения суммарного цитохрема Р-450 свидетельствует, что спектрально детектируемые формы составляют до 00% иимунореактизного белка. Эти отличия связаны, по-вцд>мому, с тем, что в митохоццриях имеются дополнительно апо-цитохрсны Р-450, а также не подвергайся прсцесашгу предшественники генопротеиноз.

Для изучения сриентац!!! белков в составе естествеших мембран применяются различные методические подходы, основанные, 1сак правило, га использовании реагентов, не проникающих через мембраны. Антитела взаимодействуют с мембранными белками в мягких условиях, позволяюсцих изучать истинное расположение молекул! белка в мембране, причем возможности такого подхода определяются специфичностью антител. Ранее антитела были успешно использованы для нммуногнстокимического анализа, а также исследования ориентации цитохрсти Р-450 в микроотгальной мембране (Frey et al., 1935; Da [«ros-Chiarandini et al., 1987).

Для изучения ориентации ЛР, АД, P-450scc и Р-450и митопласш и СЗП инкубировали с возрастающими количествами антител соответстЕутсасй специфичности. Количество связавшихся антител определяли после инкубации суспензии с иэб^тксм [12В1]белка А и гадисметрии мембран. Как следует из рис. О, Лнти-Р-450?сс и Лнтн-ДР связываются с митопластами, причем количество свпзлвяихся антител определяется их соотнесением с мембратшн белксн, достигая гаапения при 4О-Р0-кратных изОлгках антител. В то тв время, связывание Анти-АД и Airrn- Р-450и с китопластемн не прешзает 7.5%. В последнем случае тблэддгмее рклст^я!*? радиоактивности в мембраны хорапо коррелирует с содг-рхшигм в прртрптпх китопластоп су>горного Р-450, способного фернентативно црсстжгтллтться, и normt бьггь объяснено взаимодействием антител с разругает*»™ нембрпнаии. В слу-п<-же Лнти-Р-450зсс и Днти-АР характер связывания угазлист m их сгтянгфитесгср вза«<одействие с экспонировании« га шгтозольнсЯ поверхности вчутгенней мембгош полипептцщыми фрагме»гтами белков. Получ^шме m мигстипегч дле»"»

150

100

ч у: с; ш

я £

ш гх

X

а т х> га о= ю о

20 40 60

25 20 15 10 5 0

В

г 2

20 40

60

150

100

50

25 20 15 10 5 0

б —♦ 3

—>2

—° 1

Э 20 40 60

Г —» 3

1 ^ —- 2

—в 1

0

20 . 40

60

1д6 / МЕМБРАННЫЙ БЕЛОК, бсо/бсо

РИС. 8. Связывание Анта-АР (А), Анти-ДЦ (Б), Анти-Р-450зсс (В) и Анти-Р-450и (Г) с митопластали (графики 1) и ОН (графики 2). Суспензюо мембран В 10 КМ трис-НС1 буфере, рН 7.4, содерэадем 0.3 М сахарозу и 2% бычьего сывороточного альбумина инкубировали с возрастающий количествами специфических антител в течение 2 ч при 2°С. Затем образцы промывали, инкубировали с [12В1]белксм А, центрийггировалн и радисметрировали осадки. Графики 3 - связывание антител с СМЧ, рассчитанное с учетсм данных таблицы 3.

позволили сделать предварительная вывод о транокмбраннсм расположении Р-450зсс во внутренней мембране митохондрий. Чтобы проверить это предположение, выло

Табтаця а. Распределение компонентов монооксигедазных систем меяду растворимой и мембранной фракциями митопластов, обработанных ультразвукам'*.

Фракция, нг белка в пробе Относительное содер-

Белск --------------------------------------------------------хаиие белка в мсм-

растворимая мембранная ранной Фракции, %

Р-4503СС 4.4 10.0 71.1

Р-45011 4.5 5.0 52.6

АД 7.6 2.4 24.0

»АР 4.2 2.1 33.3

* - После ультразвуковой обработки мембранн}'ю фракцию отделяли центрифугированием и определяли количество белков в соотоетс+вукпих радиоиммуноллгических системах.

исследовано взаююдействие антител с СШ, содержащими внутрешваэ мембрану с доступной для антител матриксной поверхность».

Ультразвуковая обработка митопластов приводит к резкому увеличению связывания Анти-Р-450х1 и Анти-АЦ. При этсм уровень связывания Анти-АР И Лнти-Р-4б0зСс с ОЯ существенно не меняется по сравнению с митопластами. Таю ¡Л образом, almrteia ко всем компонентам стеровдгвдрокаиируквдх систем специфически взаимодействуют с* эпитогеии соответстпукиих белков, экспонироватыми Ha MatpHKCHoft ЬоЬё{>й1ости внутренней мембраны, где, по-еиддасму, и реализуются осноёные Srarti белс;<-белковых взаимодействий. Различия в характере связывания А..ги-£-450асо И fittfU-Р-45011 с митопластами свидетельствуют о специфичности ИаюльзойаййоЬ! иммуно'химического подхода и указывают на уникальшй гарактер Мембранной организации этих гемопротеинов.

Amлиз графиков m рис. 8 свидетельствует, что Мако*си!ЫцЙ Уровень связывания антител определяется количествен и доаупяоетуо и!<>фНореактйиюГо белка в мембране. Поэтому отцествешым факторен, влияящм ia конеч)Ый результат, пвл,.этся удаление части белков из мембраны в процессе ультразвуковой обработки. Определение содераания компонентов монооксигеназ в митопластах и ОН показалй, что по сравнению с митопластами в ОН удельное содержание АР ка 67%, АД - ю 76$, Р-450эсс - на 29%, а Р-450и - in 47% шкв (таблица 3).

Эти данные, отрастание потери белков при ультразвуковой обработке, позволим заключить, что при интерпретации результатов связывания антител с ОН необходжо учитывать Фактор со любилизаци белков из мембраш. Достоверчвя оценка связывания антител при условии отсутствия удаления белков в процессе получения ОН, представляется затруднительной. Одтако, если предположить жиунохммичесВДа гомогенность компонентов иснооксигеназшх -систем и однородность их организации в мембране, то результаты по связывание антител с ОН могут №ь пред ста шили " в'

14 12 10 а б 4 1

Рис. 9. Связывание Лнти-Р1 (Л), /Ъггн-К? (Б) и Л)ГП1-РЗ (В) с митопластаыи (графики 1), и СНЧ (графики 2).

О 10 20 30

/ МЕМБРАННЫЙ БЕЛОК, Вес/ВЕО грЩчя'.ов, отличающихся от исходных лнаь тем, что каждое полученное ж ахти клгга лы I о значение связывания (рис. В. графики 2) пересчитано с учетом соотгетсгкунднх коэффициентов пропогииотлыюстл, отрожшэдих количество белка в глств01«40й фракции: 3.03 - для АР, 4.16 - для АД. 1.41 - для Р-450ясс и 1.09 для Г-450и. Приведенные на рис. 8 графики 3 носят услошый характер, но Ш ололлют оценить воэмеяное связывание антител с ОН при отсутствии

<-<,о-Ли»плшт1 белков из мембршы.

Для и с след тал ния {«сполсяетш отделыых участков молекулы Р-450всс <щ|<>сш<>лыю м^лш еяло изучено, в описанных выше условиях, взаимодействие с иитиииспки 11 он антител к фрпгжмггам П. П. и КЗ. Как следует из рис. 9, тин П и Мти ГС, о*-и1фг|рски в-уннолспстпуют как с мигошистами, так и с ОИ. 'ПО П".".и*ччуч*т поисмо^гчмзло сгнснтпцио гемопротеит. Принципиально ваяыч

яэляется тот (¡акт, что, в отличие от Aimi-F2, Ajitii-F3 связываются только с СНЧ. Это означает, что Фрагмент F3 зкспонирован преимущественно в матрикс и подтверждает правомерность использованного иммунохимического подхода для анализа укладки полилептидной цепи гемопротегап в мембране.

Эксперименты по связываю«) антител с мембрагами не позволили шяавггь расположение области, соединяхщей оба дсмега P-450scc, которая соответствует трипсин-чувствительному участку Arg200-Asi267. Для решения этого вопроса '' использовали ограниченный протеолиз мембранных структур трипсином с последуквдм нденпфгсацисй образующихся пептидных продуктов иммуноблоттингсм в присутствии специфических гштител к Р-4Б0осс и его фрагментам F1 и F2 (рис. 10).

При протеолитической обработке 1атнвных митопдастов не образуется иммунохинически детектируемых продуктов с молекулярной массой меньшей, чем у P-450scc (рис. 10, образец 2). В то же время, трипсинолиз СНЧ с последующим разделение!« растворимой и мембраносвязанной белковых фракций центрифугированием, приводил к исчезновению во фракции мембран зоны специфического окрашивания ia уровне 50000 Д1 и появлею® зон in уровне 29300 и 26600 Ш, соответсгеуквдх фрагментам F1 и F2, образующимся при тршташолиэе растворимого гемопротеина. Прозедеглый иинуноблоттинг в присутствии Лнти-Fl и Ahth-F2 показал, что образующееся при обработке C2N трипсином пептидные проду ш Р-450зсс кммунохимически идентичны Фрагментам полилептидной ц,пи Р-450зсс F1 и F2. Эти результаты позволяют сделать вывод о тем, что петля, свяэлаагацая дсмень» гемопротеина в области Arg2BO-Asn2B'T, обращена в матрикс.

Результаты по связыванию антител и ограниченному протеолизу мембран позволяют предложить схему расположения отделыых компонентов монооксигеназ во внутренней мембране митохондрий (рис. 11), соглато которой Р-450асс и АР пронизывают мембрану, а АД расположен на матриксной поверхности мембраны, являясь nepi 1«рическим мембранным белксм.

Полученные данные свидетельствуют в пользу участия как N-, так и С-концевой области Р-450зсс во взаимодействии с мембраной и позволяют говорить, что в случае митохочдриальных цитохрсиов Р-450 (по крайней мере, Р-450гес) its реализуется модель молекулярной организации, предлагаемая для микроссмальных, гемопротеинов, согласно которой N-концевая последовательность осуществляет взаимодействие с мембраной, а большая часть молекулы форшрует обровеншй в водную фазу каталитический домен, (Nelson & Strobel, 1988, 1989; Edwards R., 1989). Проведенный по методам Chou & Faanan (1978) и Kyte & Doolltle (1982) расчет элементов вторично; структуры свидетельствует, что, в отличие от микроссмалымх гемопротеинов, у Р-450асс не имеется протяжен)« х Л-спигальшх

Р-450

вес-F0?.

F3

ДСН-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 1 2 3 4 6 6

Янти- P-450scc 1 2 3 4 5 6

ед S3 а

F

Р-4бОе

F0? Fi :

а

"htm- Fl 1 2 3 4 5 6

б

Янти ( -F2

1 2 3 4 5 6

i «ав

— вво сет

.....i -JLSL..

£цСд_Огтаниченндй протеолиз мемброносвязанного Р-450зсс трипошем. А -

'.»лектрсФореэ в присутствии додецил сульфата ютрип. Образцы содержали: 1 -спицылый препарат Р-450аос (11 мкг), обработанный трипсином в течение 20 мин при соотнсгаении Р-4Ь0зсс/трипсин 100:1 (контроль, содерэавдй Fl и F2); 2 -кигшлаегш (56 мкг мембранного белка) обработанные трипотсм при соотндаенин с«-жж/тр1псин 800:1 в течение 80 мин; 3 и 4 - растворимая и мембранная фракции пкгартга Off, обработанного трипсином 800:1 в течение 20 мин; 5 и 6 -соопчгсстяуят образцам 9 и 4, но время обработки трипсином било увеличено до 80 мин. С, В и Г - ^(уноСлотпшг в присутствии Анти-Р-450зсс, Анти-Fl и Airm-F2,

l'KTPCTCTlf mío.

у и ст* mi в Н Kctnienoft последовательности, о наиболее гидрофоб! ые участки rnaio.«f>t»'fW нг*ч«у«гспк»м)»с> » центрольной и С-ко»ыеяой областях молекулы.

МЯТРИКС

цитозоль

рис. 11. Схема молекулярной организации цитохром Р-450-завиамих монооксигенаэ во внутренней мембране митохондрий по даням анализа вэашодействия антител с митопластеда и СМЧ.

Что касается Р-450и, то полученгеге результата отражают только отчествование доступных для анпггел эпитопов ш жтриксной поверхности внутренней исмброт. Вопрос об особенностях мембранной организации Р-450и остается открытам. Расчет гидрофобных участков в молекуле Р-450и свидетельствует об определенной гсиологии в их расположении между этим гемопротеинсм и Р-450зсо. Однако, как следует из атлиза содержания белков в мембранах, обработан«« ультразвуком, Р-450и менее жестко связан с мембраной по сравнению с Р-450зсс (таблида 3). Появившиеся данные о генетической и функциональной гетерогенности цитохрскя Р-450и свидетельствуют, что в стероидогенезе на стадиях lip- и 18-, 19-гндроксилирования участвуют различше молекулярные формы гемопротеита (Kiruta et al., 1988; Osishtaa et al., 1989).

Высокая степень ультразвуковой солобилизации fiP при наличии ишунохимически детектируемых участков на обеих поверхностях мембраны может свидетельствовать в пользу существования даух пулов флавопротеина - гаестко и лабильно связанного с мембраной и подтверждает сделанное предполсяюние о гетерогенности организации этого белка в мембране (Sahara et al., 1982; Himtarhi <i Ichitaw% 1982). Однако, природа и Функциотльное зтчение возможной гетерогенности АР в cocrotw мембраны остаются неизвестнши.

Пат: гсшме данные свидетельствуют о тем, что цитофсм Р-450-к1сиая!1й менсоксигеназы митохонг-рнального тага могут иметь отличную от »ппсгосотльних моноокенгенаэ мембранную организации, что ссг.тдсуется с раз.имими «рнюони траис.1' .тцин, характерными для митохондриалынх и микроотолыых бч.-коп.

3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИММУНОРЕАКТИВШК УЧАСТКОВ В МСШЕХУЛЕ P-450scc

Установление антигенной структуры белке» - необ'-дамый этап в изучении их молекулярной организации, функциональной ¿активности, эволюции и к-^сс^мкации. Представление а»ггиг"чшх детермшант в элементах первичной сгруктуры и установление их корреляции с функциональной нагрузкой, которую несут даннь.. структур)we элементы, позволяет оценить связь мевду струлурой и функцией. Из результатов, приведенных в главе 1 следует, что эффективность гвдроксилирования « стероидов резко снижается при добавлении антител к P-450scc и Р-450ц причем этот зффект может реализошваться на ровне взаимодействия гемопротеинов с АД. Ранее с пемадио двух основных подходов - химической моди^икапчи остатков лизина mrraptuH анги ~мдсм (Адамович Т.Б. и соавт., 1989) и структурного изучения полученного с пемацью ¿^функционал .¡их peareirros ковалентного комплекса "АД-Р-450асс" (Турко И.В, и соавт., 1968) - было показано, что ферредоксин-связывакидя область Формируется рядом участков, расположенных в М- и С-концевы.. частях молекулы Р-450аоо, а именно последовательностями [<eues-Thr223 и Leu^e-Gly418. Эти ддшые стали предпосылкой для поиска корреляции мевду антигенными областями и Функционально активными участками молекулы гемопротеина. Для решения этой задачи бил локализован ряд антигенных детермшант в полипептиа»ой цепи Р-450аос.

Для иссдедоваю.. антигеннсЛ структура Р-450асс использовали иммунохиническиЛ анализ продуктов химс .оптического гидролиза Р-450зсс (1.4 мкмоля Р-450зсс). *Чыбор в качестве источника пептидного материала химотриптического гидролизата Р-450аоо обусловлен тем, что он содержит ряд растворимых в водных буферах пептидов, ююзадих достаточную длину для Формирования антигенных детерминант и перскриткщнх болыыую часть предполагаемых АД-связываюцих участков. Продукты пиролиз.» разделили последовательно на биогеле Р-4 в 50% уксусной кислоте. «¡рашснмоЗиэовой ВЖ на колонке U1 tra spbare-OD6 и катионообменной хрсмдто1Т0фнеЙ на Ultruall Сх. Па каждой стадии для дальнейшего разделения и ■пылим отбирлли только фракции, содержащие пептиды, взаимодействующие с Анти-P-4S0ecc в условиях проводившихся параллельно иммунсферментного анализа и KtiihM. ¡ого . муноблоттинга.

Атлнз гомогенности Фракций и идентификацию nerr пои осуществляли етаил'хткиип MiiTCW»Mti структурной химии - определением N-концевых аминокислот днюмыым методом, аминокислотным анализом и секвснироианием пептидов по методу ZtViim. Поело глад хрсматогр>"¥ЫЙ и рехрематографий били выделены 4 •ыкужчтктшими flrviKumt в количествах, необхешиих для анализа их структуры.

Л> 'н^кислоття последо-чтельность и количествен»«! выход иммунореактивиых ггет.^дов Р-450зсс.

Пептид Выход, Аминокислотная последовательность нмоль

Р1 Р2 РЗ Р4

4.1 Л£зпгзв-1дуа-А1а-01и-Цуз-Туг241

6.9 Ьси^ч-Ц-з-ВегЧии-Цгз-^ ■> ги^а

6.0 А1а30 1-Мг1-<51у-Агв-Азр-Рго-А1а-П1езва

3.5 5ег^во-Бег-рго-Азр-игэ-Р1»-Азр-Рго-ТЬг-Ага-Тгр400

1

51 гендншзш в нют« ижгозугаш) игн/л унтчгжтсу 151 с^л^г®дш^нта-ет пк

201 КЯПЪУРШЛТТЕЬ УШЛЛКТгШ Г/МШГ тЛШКГГЕ ггдюш

251 ККТЕтШШЬУСШЕЙМЛЕ^^

301 тгаигсомжетишгаАнжгеш^

351 ВУПЯПУРЕ5Р1,УЮРУЛ П-АКТГ.УОУЛ тмзтРАШхтюккпгтл

401 /дгааыидахдгсмглдаш^хлЕ^ 451 атяа"таь1ьтР1ЖРШ,уштаоЕ1тал

Рмс. 12. Антигенные участки в полипегггкдной цепи Р-450асс . Для

сравнения показаны остатки лизина, участвующие по данным Адамович Т.Б. и соавт. (1989), в реализации взаимодействия гемопротеина с АД (К) и пептиды Р-450зсс, выделенные из когалотюго комплекса "АИ-Р-450эсс" (Турко И.В. и соавт., 19Э8) (1АТ...).

Агалиэ полученных фракций показал, что они представляют пептиды Р-450зсс, соответствующие последовательностям гемопротеина: Азп23в-ТУг241, Ьеи2вв-Ьеи272, Л1аяв1-ГЬе-?чя, БегЗВ0-Тгр400 (таблица 4). " Количественшй выход имму! юрезктитих пептидот вал невысок, что мажет бить связано с тем, что пептиды Р2, РЭ и Р4, как и, по-видимому, ряд иммунореактивиых фракций, полученшх в количествах, недостаточных для полного структурного анализа, представляют собой промежуточные продукты гидролиза, дэльнейяап деградация которых приводит к появлению коротких пептнаов, не обладают« антигенными свойствами. Сравнение локализованных антигенных детер-иппнт с участками, отвечающими, по данным других авторов, б молекул» гемопротеит за взаимол. ,1ствие с АД (рис. 12), позволяет предположить, что антигенные детермнюнты Р-450зсс, По крайней -пере '«дсти-шо, совпадают с згими участками или перекрываются с ними, что согласуется с результатами.

спектрофотснетрического титрования гемопротеина АД в присутствии антител.

Обращает внимание тот Факт, что три из четырех иммунореактившх участков расположена во Фрагменте ]ГЗ, который, как показано, экспонирован преимущественно в' иатрикс. Это свидетельствует в пользу вовлечения указанных участков во взаимодействие с АД. Креме того, как следует из результатов расчета профиля гиарофильности Р-450эсо, проведенного по методу Норр & МосхЗз (1981), пептиды Р1 и Р2 расположены в предсказанных антигенных областях молекулы гемопротеина. Высокая концентрация положительно заряженных аминокислотных остатков в указанных * участках (р1 пептидов составляет: для Азп23в-Туг2«1 - 9.4, Ьеа23в-Ьеи272 - 9.9, А1а8в1-РЬеавв - 6.6, 8егзв0-Тгр40° - 6.6) подтверждает даюые о существенной роли остатков лизина и аргинина в кемгиек(»образовании Р-450асс с АД.

ВЫВОДЫ

»

1. Получены антитела к белкам-компонентам монооксигеназшх систем митохондрий коры надпочечников и антитела к Фрагментам молекулы р-450зсс - К1, Р2 и ]?3.

2. Показано, что антитела к Р-450зсс, И, Т2 и Р-450и ингибируют (до 90%) гидроксилирование холестерина и 11-дезоксикортикостерона, соответственно.

3. Разработаны нетоды микроопределения АР, АД, Р-450зсс и Р-450ц и определено содержание белков в митохондриях кори надпочечников. Показано, что стехиометрия этих белков во внутренней мембране митохондрий составляет 1:6.8:2.2:1.3.

4. Исследовано взаимодействие антител с митопластами и субмитохондриальньйи частицами. На основе полученных дашых предложена модель молекулярной организации монооксигеназшх систем во внутренней мембране митохондрий.

5. Показано, что два домена Р-450зсс - К1 и ¥2 - достушы в мембране для спс-ш»!ически« антител, а связываксвя эти домены петля в районе Аг82ВО-Азп2вт и Ы-концевая последовательность БЗ (фрагмент В"3) экспонированы в матрикс.

6. Локализовав антигешые детерминанты Р-450асс, актированные последова-тсльностями Лтгя"-ТУг241, Ьеи^а-Ьеи272, А1п'в1-ЕЪ|эЭва и Бвг^о-Тгр«0«.

Оснспчые результаты диссертации изложен! в следующих работах:

1. Уоитп С.А., Черноголов А.А. Иммунохюмический анализ холестерин-и'личсси.ич^крчго нигохрема Р-450 из митохондрий коры надпочечников. Получение лнгчтг* к локмпм Г1 и Т2. // Р сб. : Цитохрсм Р-450 и охрана внутренней среды •г 1 1« гл. Темп-! л'*'"'Л'''1. Ц'лсино. 1РЯ5. С. 6Г>.

гг

2. УсановС.А., Черноголов А.Л., Ахрем А.А., Чащин В.Л. Иммунохимическая ха^ктеристика холестершпичроксилигуидего цитохрома Р-450. Моноспеци^ические антитела к доменам F1 и F2. // Биохимия. 1987. Т. 52. N 1. С. 110-122.

3. Усанов С.А., Черноголов А.Л., Петрашин А.И., Ахрем А.А., Чащин В.Л. !!ммунохимическое исследование холестердагидроксилирующей систегы. Топология и стехиометрия компонентов электронтранспортмой цепи в полипептидной мембране. // Биологические мег'гд)!». 1937. Т. 4. N 10. С. 1102-1116.

■ 4. Чашм В.Л., Черноголов А.А., Усанов С.А., Дхрем А.А. Структурные исследования и модель молекулярной организации стероадгидроксилиругадих систем. // В сб.: Цитохром Р-450 и о чат окружающей среды. Тезисы докладов. Новосибирск. 1987. С. 37.

5. Чащин В.Л., Черноголов А.А. Исследование антигенной структуры и топографии холестерингидроксилирукщего цитохрсиа Р-450 митохондрий коры надпочечников. // В сб. : VII [>сееаэз:ий симпозиум по химии белков и пептидоь. Тезисы докладов. Таллинн. 1987. С. 130-131.

6. Усанов С.А., Черноголов А.А., Чащин В.Л., Ахрем А.А. Стехиометрия и топология белков-компонентов монооксигегазных систем митохондрий корм надпочечников. // В сб. : V Советско-швейцарский симпозиум "Биологические мембраны: структура и Функции". Тезисы докладов. Рига. 1988. С. 114.

7. Chemcgolov А.А., Chashchln V.L., Usanov S.A. Ьтипосц.лп1са1 studies of cytochrome P-450see. ТЪо role of polypeptide chain fragmenta in шепоохуйспазч catalysis. // In. : 14th International Ccngress of Biochemistry. Abstracts. Prague, Czechoslovakia. 1988. P. 99.

8. Ussitov S.A., Chernogolov A.A., Manovich T.B., TbrkoI.V., Pikuleva I. A., Chashchin V.L. Molecular aspects of structure-function interrelations in cytochrome P-450scc system. // In: Cytochrome P-450:Bicch«r,istry and Biophysics (Ed.. I. Sbuster). Lcndon:Taylor & Francis. 1989. P. 121-124.

9. УсановС.А., Черноголов А.А., Чащин В.Л. 1!ммунохимическое исследование холестеринпцдроксилнрукщего цитохрема Р-450. Топология полкпептидной цени гемопротеида в фосфолипидной мембране. // Биохимия. 1989. Т. 54. N 6. С.916-925.

10. Usarrov S.A., Chernogolov А.А., Chashchin V.L. Inhibitory domain-specific antibodies to cytochrome P-450scc// FEES Letters. 1989. V. 255, H 1. P. 125-128.

11. Черноголов A.A., СМеттан Г., ЛапкоА.Г., Лунев В.Е., Усансв С. А. Цитохром Р-450Ир: структурная и иммунохювггеская характсристиха. // В сб: Цитохром Р-450 и модификация макромолекул. Тезисы докладов. Ялта. 1989. С. 265-2С6.

12. Усанов С.А., Черного.'. jB А.П., Нонкакосхи П., Ланг И., Пассанен М., Раунио X., Пелконен О. Нолестерингидроксилирукпий цитохром Р-450 китохоидрий кЫи

юдпочечников бьжа и плаценты человека: иммунохимические свойства и структурная характеристика. // Биохимия. 1990. Т. 55. N 5. С. 665-877.

13. Усанов С.Л.. Черноголов A.A., Чадин В.Л. Молекулярная организация митохондриальных коносксигеназных сисге-t коры надпочечников. // В сб.: Всесоюзный симпозиум "Химия белков". Тезисы докладов. Тбилиси. 1990. С. 31.

14. Chcmosolov A.A., Usanov S.A. Immunochemical mapping of f erred ax ln-blndin<j altes In cytochrome P-450scc. // In: 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS). Abstracts. Budapest, Hungary. 1990. P. 209.

15. UsanovS.A., Cherncgolov A.A., Cbashchin V.L. Ia cytochroire P-450scc a tranancmbrone protein? // FEBS Letters. 1S90. V. 275. N 1,2. P. 33-35.

16. Chernogolov A.A., Adamovich T.B., UsanovS.A. Inmanocheinica'l mapping of ferredoxin-bindirifj sites in cytochrome P-450scc. // In: Vllth International Conference "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450". Abstracts. Moscow, 1991, P. 37. .

17. Qiernogolov A.A., LapUoA.G., UsanovS.A. Structural and iimunochemioal analysis of cytoclircino P-45011p from bovine adrenal cortex mitochondria. // In: Vllth International Conference "Bioclcfflistry and Biophysics of Cytochrome P-450". Abstracts. Moscow, 1991, P. 37.

10. Cliernceolov A.A., Hudecek J., Anzenbacher P., Usancrv S.A. Caieuter prediction of the secondary structure of cytochromes P-450scc and P-45011/з. // In: Vlltli International Ccnfcreacc "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450". Abstracts. Moscow, 1991, P. 144.

19. Chcrnceolov A.A., Adamovich T.B., UsanovS.A. Immunochemical mapping of ferredoxin-bindinß sites in cytochrome P-450scc. // In: Proceedings of the Vllth International Conference "Bioclicmistry and Biophy3iC3 of Cytochrome P-450", Moscow, 1991, P. Б7-59.

20. Cliemc«olav A.A., Lapko A.G., UsanovS.A. Structural and iimunochcmic»l analysis of cytoc)iromo P-45011p from bovir.o adrenal cortex mitoclicndria. // In: Proooodinan of tlio Vllth International Conference "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450", Hoooow, 1991, P. 60-62.

21. CliornceoJov A.A., Usanov S.A. Interaction of cytochrane bo with mitochondrial cytochrcmoa P-450. // J. Basic & Clinical Phyoyol. & Pharmacol. 1M2, v. Э, Г. 109. :