Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома P450scc (CYP11A1) в гетерологических системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

□03452Э8Т

На правах рукописи

МИНЕНКО АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома Р4508СС (СУР11А1) в гетерологических системах

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2008 л ^ , > р,' '

003452987

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета

имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Лузиков Валентин Николаевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Ковалева Ирина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент

Сергиев Петр Владимирович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится 25 ноября 2008 г. в 16.00 на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 октября 2008 г.

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении топогенеза митохондриальных белков, синтезируемых как в цитозоле, так и в самих оргаиеллах. Детально изучен транслокационный аппарат митохондрий (белковые транслоконы ТОМ, Т1М23, Т1М22), механизмы прохождения импортируемых полипептидных цепей через митохондриапьные мембраны. Установлены общие принципы импорта белковых предшественников в митохондрии, их распределение по субмитохондриальным компартментам (хотя и для достаточно ограниченного числа традиционных белков-моделей). Вместе с тем, в топогенезе митохондриальных белков остается множество проблем, решение которых требует дополнительных исследований. В частности, это касается механизмов встраивания белков в митохондриальные мембраны и, особенно, во внутреннюю мембрану, в которой сосредоточены компоненты, отвечающие за эксклюзивные функции митохондрий. Особый интерес представляет включение в митохондриальные мембраны белков, не имеющих отчетливо выраженных топогенных сигналов. К числу таких белков относится цитохром Р450йсс (СУР11А1), который содержится во внутренней мембране митохондрий стероидогенных органов и отвечает, в сопряжении с адренодоксином и NADPH: адренодоксин-оксидоредуктазой, за ключевую стадию синтеза всех стероидных гормонов млекопитающих (превращение холестерина в прегненолон). Особенностью СУР11А1 как субстрата для импорта является так же то, что он является гемопротеином и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гем.

Изучение топогенеза митохондриального цитохрома СУР11А1, который в силу отсутствия характерных топогенных сигналов не может встраиваться в мембрану ни по одному из охарактеризованных к настоящему моменту молекулярных механизмов, должно способствовать расширению современных представлений о митохондриальном белковом импорте.

Целью работы является экспрессия в дрожжевых клетках гибридных форм СУР11А1 с различными адресующими сигналами для изучения особенностей его топогенеза в митохондриях и выбор гибридного белка для использования в штамме трансгенных дрожжей, способных осуществлять ключевую стадию синтеза стероидных гормонов.

Научная новизна и практическая значимость работы. В основе данной работы лежат два основных подхода. Во-первых, использование дрожжевых клеток для экспрессии различных рекомбинантных форм цитохрома Р450зсс (СУР11А1) в качестве модельной системы, позволяющей прояснить критические моменты топогенеза этого белка. Во-вторых,

конструирование рекомбииантных форм СУР11А1 с различными топогенными сигналами, позволяющими управлять его импортом в митохондрии и митохондриальной компартментализацией.

Были сконструированы и исследованы гибридные белки с сигналами котранслокационного встраивания в мембрану митохондрий ААС-тСУР11А1, 01ЛЗ(1-72)-тСУР11А1 и Вс81(1-83)-тСУР11А1. Для того чтобы стимулировать перенос гибридного белка в матрикс был сконструирован гибрид с предшественником матриксного белка стероидогенных митохондрий - адренодоксина - ргеАс1-шС¥Р11А1. Также проводилось изучение гибридов СохЩ1-25)-тСУР11А1 и 8и9((1-112)-тСУР11А1. Сравнение внутримитохондриальной локализации и ферментативной активности различных гибридных белков, экспрессированных в дрожжевых клетках, позволило сделать предположение о том, что наиболее вероятным для природного топогенеза СУР11А1 является котранслокационный способ встраивания во внутреннюю митохондриальную мембрану, а не механизм реэкспорта. Для гибрида Сох1У(1-25)-шСУР11А1 показано, что при импорте в дрожжевые митохондрии с дефицитными по компоненту РАМ-комплекса (Рат17) происходит более эффективное формирование холофермента, что также свидетельствует в пользу котранслокационной модели встраивания цитохрома.

Наиболее активные варианты гибридных белков - ААС-тСУР11А1 и Вс81(1-83)-тСУР11А1 могут быть использованы для создания трансгенных микроорганизмов, выполняющих критическую стадию стероидогенеза млекопитающих, а именно, превращение холестерина в прегненолон, что представляет значительный интерес для биотехнологии.

Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, касающиеся механизма встраивания цитохрома Р450всс (СУР11А1) во внутреннюю митохондриальную мембрану и созданы активные гибридные белки на основе СУР11А1, которые возможно использовать для создания трансгенных дрожжей, способных осуществлять ключевую стадию синтеза стероидных гормонов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», четвертом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006 г.) и на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.). Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы и выводы. Материал иллюстрирован 31 рисунком и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 127 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Цитохром СУР11А1 (Р4505СС) является одним из ключевых ферментов стероидогенной системы млекопитающих. В митохондриях стероидогенных органов СУР11А1 совместно с адренодоксином и адренодоксинредуктазой осуществляет первую стадию синтеза стероидных гормонов - отщепление боковой цепи холестерина с образованием прегненолона. СУР11А1 синтезируется в цитоплазме в виде предшественника с сигнальной препоследовательностью, импортируется в митохондрии и после процессинга становится белком внутренней митохондриальной мембраны с активным центром, направленным в матрикс.

Согласно современным представлениям митохондриальные белки, синтезирующиеся с сигнальной препоследовательностью, переносятся в матрикс митохондрий при взаимодействии комплексов Т1М23 и РАМ , либо включаются в процессе транслокации во внутреннюю мембрану, если комплекс РАМ диссоциирован от Т1М23. Как правило, в последнем случае импортируемые белки содержат трансмембранный домен, расположенный вблизи от сигнальной препоследовательности. Для некоторых политопных белков внутренней мембраны, синтезирующихся в виде предшественников, показано включение полипептидной цепи в мембрану при участии Оха1р по механизму ре-экспорта, то есть после полного переноса в матрикс митохондрий.

Согласно анализу аминокислотной последовательности СУР11А1 не имеет трансмембранных доменов, которые могут осуществлять остановку транслокации полипептидной цепи. На основании этого можно предполагать, что СУРПА1 является субстратом для совместной работы комплексов Т1М23 и РАМ в процессе перемещения через внутреннюю мембрану в матрикс. Однако, согласно работам по изучению его топологии в митохондриях надпочечников млекопитающих, СУР11А1 является интегральным мембранным белком, поскольку не экстрагируется из мембран карбонатом натрия. Другая отличительная особенность СУР11А1 как субстрата для митохондриального импорта состоит в том, что он является гемопротеином, и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гем. Теоретически СУР11А1 может встраиваться во внутреннюю мембрану либо посредством свободного от РАМ Т1М23-комплекса в процессе транслокации, либо после переноса полипептидной цепи в матрикс с помощью Т1М23-РАМ суперкомплекса, с последующим встраиванием во внутреннюю мембрану, то есть по механизму ре-экспорта. В обоих случаях неясно, какова природа «сортирующего» сигнала СУРПА1.

* TIM 23 - транслоказа внутренней мембраны; РАМ - комплекс переноса полипептидных цепей в матрикс.

Ранее было показано, что при импорте в дрожжевые митохондрии предшественник СУР11А1 преимущественно проскальзывает в матрикс и малоэффективно встраивается в мембрану, при этом мембранная форма функционально активна. Для того чтобы увеличить эффективность встраивания СУР11А1 во внутреннюю мембрану митохондрий дрожжей ранее был использован сигнал ре-экспорта 9 субъединицы дрожжевой Ро-АТФ-азы (из дрожжей №иго«рога сгаяяа) (рис.1). Хотя гибридный белок 5и9(1-112)-тСУР11А1 связывался с мембраной митохондрий, он проявлял низкую каталитическую активность.

На основании полученных данных была высказана гипотеза, что стадия полного переноса белковой последовательности СУР11А1 в матрикс не является необходимой в процессе его топогенеза, а скорее наоборот, для созревания холоформы важно постоянное взаимодействие полипептидной цепи с мембраной.

Для подтверждения этой гипотезы нами была сконструирована серия плазмид, кодирующих гибриды на основе тСУР11А1 с адресующими последовательностями интегральных белков внутренней мембраны дрожжевых митохондрий, включающихся в мембрану котранслокационно - то есть без стадии переноса в матрикс, а именно ААС-тСУР11А1,01ЛХ1-72)-тСУР11А1 и Вс81(1-83)-тСУР11А1 (рис.1).

ААС-тСУР11А1 представляет собой гибрид зрелой формы СУР11А1 с полноразмерным белком-переносчиком адепиновых нуклеотидов, содержащим 6 трансмембранных доменов. Гибридный белок ВЬО(1-72)-шСУР11А1 содержит адресующий сигнал мембранного белка ОЬО (дегидрогеназы О-лактата), состоящий из сигнальной препоследовательности и следующего за ней трансмембранного домена. Сигнал обеспечивает расположение белковой глобулы в межмембранном пространстве (останавливает транслокацию белка в И-ш-С-от ориентации). Вс51(1-83)-тСУР11А1 -гибридный белок с адресующим сигналом белка внутренней мембраны Всз1р, основная часть полипептидной цепи которого экспонирована в матрикс. Сигнал имеет в своем составе трансмембранный домен и внутреннюю неотщепляемую сигнальную последовательность, и обеспечивает И-оШ-С-ш ориентацию белка во внутренней мембране.

Для того чтобы, наоборот, в большей степени простимулировать проскальзывание полипептидной цепи в матрикс, был сконструирован гибрид с предшественником адренодоксина - матриксного белка митохондрий стероидогенных органов млекопитающих - ргеАс1-тСУР11А1 (рис.1). Ранее было показано, что предшественник адренодоксина с необычно длинной (60 аминокислотных остатков) препоследовательностью, содержащей большое количество положительно заряженных аминокислотных остатков, успешно импортировался и процессировался в митохондриях нестероидогенных тканей. Основываясь

на таких свойствах предшественника адренодоксина, можно было предполагать, что гибрид ргеАс!-тСУР11А1 будет транслоцирован в матрикс.

121 157 192 219 2М 25В 287 312 3

ААС-тСУР11А1 и Ц] IЛ| И rvJ Ю [Л Ю. шСУР11А1 Л/Х

4« 68 II

Вс51(1-83)-тСУР11А1 ^]Щ^Щ\/\,гг1СУР11А1У\/\

И

Сох1У(1-25)-тСУР11А1 NтСУР11А1"\/\/Л_/\У

ОШ(1-25)-тСУР11А1 1/У\/\.тСУР11А1У\/\

37 67 М "2

ЭиЭО -112)-тСУР 11А1 П^ГЦ" тСУР1Щ-\/\/

60 184

ргеАс)-тСУР11А1 NАс1 JЛJЛJ\S'тСУР11

Рис.1. Схематическое изображение гибридиых белков. Спирали - сигнальные препоследовательности, прямоугольники - трансмембранные домены.

Для изучения эффективности формирования холофермента СУР11А1 при использовании различных адресующих сигналов для направленного встраивания в митохондриальные компартменты гибридные белки были гетерологически экспрессированы в дрожжевых клетках и изучены их импорт в митохондрии, процессинг, включение в мембрану, внугримитохондриальная локализация и холестеринмонооксигеназная/лиазная активность. Ранее охарактеризованный гибрид 5и9(1-112)-тСУР11А1, имеющий сигнал, приводящий к встраиванию полипептидной цепи СУРПА1 по механизму ре-экспорта, был также включен во все эксперименты для сравнения.

Поскольку ранее бьио показано, что при экспрессии в дрожжах предшественника СУР11А1 в митохондриях образуется несколько процессированных форм белка, что усложняет интерпретацию результатов, для контроля (в качестве аналога предшественника) был использован гибрид Сох1У(1-25)-тСУР11А1 (рис.1), имеющий типичный отщепляемый матриксный сигнал IV субъединицы дрожжевой цитохрома с-оксидазы. В целом, как было показано ранее, поведение предшественника цитохрома и гибрида СохГУ(1-25)-тСУР11А1 аналогично при импорте в дрожжевых митохондриях.

Хотя СУР11А1 - белок митохондрий стероидогенных органов млекопитающих, представляется оправданным использовать гетерологическую дрожжевую систему для

изучения его топогенеза по нескольким причинам. Большинство современных знаний о процессах импорта белков в митохондрии были получены с использованием дрожжевых систем импорта белков in vitro. Позднее было показано, что многие из молекулярных компонентов, впервые идентифицированные в дрожжах, сейчас обнаружены у разных видов животных, и состав основных компонентов транслоказ и главных рецепторов в сущности тот же самый. Одной из важных причин выбора дрожжевой системы для проводимых исследований являются хорошо изученные сигналы импорта, используемые дрожжевыми белками для компартментализации в митохондриях. Доступность соответствующих антител и мутантов по разным компонентам транслокационных комплексов делает проведние таких исследований более целесообразным на дрожжах. Один из таких мутантов с нарушением функционирования РАМ-комплекса был использован в данной работе для изучения влияния мутации на встраивание гибридных белков в дрожжевые митохондрии.

С другой стороны, «аномальное» поведение митохондриального белка стероидогенных органов млекопитающих CYP11A1 в дрожжевых митохондриях может пролить свет на различия между системами импорта белков в дрожжах и млекопитающих. Кроме того, гетерологическая экспрессия гибридных белков на основе цитохрома CYP11A1 представляет значительный интерес для биотехнологии.

Экспрессия гибридных белков.

Создание плазмид для экспрессии гибридных белков в дрожжевых клетках проводили в два этапа. Первоначально осуществляли конструирование кДНК гибридных белков в бактериальной плазмиде pGEM-4Z, содержащей кДНК зрелой формы цитохрома (pGEM-4Z/mCYPllAl), путем встраивания по EcoRI-BamHl сайтам полилинкера кДНК различных сигнальных последовательностей. На втором этапе проводили переклонирование кДНК гибридов в дрожжевой вектор pYeDP/1-8/2. Полученными плазмидами трансформировали дрожжевые клетки штамма 2805. Трансформированные клоны выращивали в течение 16 часов на минимальной SD среде, затем клетки осаждали и переносили в SG среду, содержащую галактозу, для индукции промотора GAL10-CYC1, на 12 часов. Из клеток трансформированных дрожжевых штаммов выделяли митохондрии. Полученные митохондриальные фракции анализировали с помощью денатурирующего электрофореза с последующим иммуноблоттингом. Гибридные белки идентифицировали по электрофоретической подвижности и с помощью антител к CYP11А1 (рис.2, А).

Рис.2. А. - Экспрессия гибридных белков (результаты иммуноблоттинга). Верхняя часть нитроцеллюлозного фильтра прокрашена антителами к тСУР11А1. Нижняя часть фильтра прокрашена антителами к белку Р]'С (контроль нанесения). (I) СУРНА!, выделенный из коры надпочечников млекопитающих (56,4 кДа); (2-7) лизаты митохондрий дрожжевых клеток, трансформированных плазмидами: (2) рУеБР/ААС-тСУРПА!; (3) рУеВР/Вс81(1-83)-тСУР11А1; (4) рУеОР/Сох1У(1-25)-тСУР11А1; (5) рУеОРЯ)1ЛЭ(1-72)-тСУР11А1: (6) рУеОР/8и9( 1 -112)-шСУР 11А1; (7) рУеОР/ргеАё-тСУР 11А1.

Б. - Уровни экспрессии гибридных белков. Представлены средние значения уровней экспрессии ± доверительный интервал, в размерности - нмоль СУР11А1/мг митохондриального белка. Для каждой фракции митохондрий проводилось 5-7 независимых измерений.

Показано, что в трансформированных клетках осуществляется экспрессия гибридных белков, которые обнаруживаются при фракционировании дрожжевых клеток во фракции митохондрий. При этом их молекулярные веса, рассчитанные по подвижности в полиакриламидном геле, близки к предсказанным для гибридов ААС-гпСУР! 1А1, Все 1(1— 83)-шСУР11АI и процессированных форм гибридов Сох1У(1-25)-тСУР11А1, 8и9(1-112)-тСУР11А1, Ш)(1-72)-тСУР11А1 и Ас1-тСУР!1А1. В случае гибридов Сох1У(1-25)-тСУР11А1 и ОЦЭ(1-72)-тСУР11 А| обнаруживается незначительное количество предшественников (рис.2. А). Процессинг белков с отщепляемыми препоследовательностями свидетельствует о том, что они достигают митохондриального матрикса, где происходит созревание под действием митохондриальной процессирующей пептидазы МРР. Содержание гибридных белков в митохондриях оценивали по результатам иммуноблоттинга с помощью программ БспЬт^е и Ое15сап У5.1. В качестве калибровочного стандарта был использован СУР11А1, выделенный из коры надпочечников млекопитающих (рис.2, Б).

Определение внутримитохондриальной локализации гибридных белков. Карбонатная экстракция митохондриальных белков.

Тоногенные сигналы, содержащие трансмембранные сегменты - Всз1(1-83), 01Л)(1-72) и полноразмерный белок ААС, были использованы при конструировании гибридных белков для того, чтобы обеспечить включение домена СУР11А1 во внутреннюю митохондриальную мембрану в процессе транслокации. Сигнал 5и9(1-112), напротив, осуществляет встраивание СУР11А1-домена во внутреннюю мембрану после транслокации в матрикс. Для увеличения вероятности проскальзывания полипептидной последовательности в матрикс, был сконструирован гибрид СУР11А1 с предшественником матриксного белка митохондрий млекопитающих адренодоксина (ргеАс!).

Для того чтобы определить, осуществляется ли встраивание гибридных белков в мембрану, применяли метод карбонатной экстракции, то есть обработку фракции митохондрий раствором Ш^ССЬ (рН 11,5), что приводит к разрушению митохондриальных мембран и нейтрализации зарядов на их поверхностях. После высокоскоростного центрифугирования супернатант содержит растворимые и ассоциированные с мембранами белки, а осадок - интегральные мембранные белки. Супернатант и осадок, полученные после карбонатной экстракции митохондрий, анализировали методом иммуноблоттинга с использованием антител к СУР11А1. Контроль за чистотой получаемых фракций осуществлялся с помощью антител к белкам-маркерам - интегральному белку внутренней мембраны КС и растворимому белку матрикса 55(21.

Как и предполагалось, после щелочной экстракции митохондрий гибридные белки ААС-тСУР11А1, Вс51(1-83)-тСУР11А1, а так же процессированные формы гибридных белков 0иЭ(1-72)-тСУР11А1 и 5и9(1-112)-тСУР11А1 обнаруживалась во фракции мембранных белков, как и интегральный белок внутренней мембраны Р1С (рис.3, А), что указывает на то, что данные гибриды становятся интегральными мембранными белками после импорта в митохондрии.

В случае гибридов СохГУЦ-гЗЗ-тСУР! 1А1 и ргеАс]-тСУР11А1, использованные для импорта последовательности не содержали трансмембранных доменов и, следовательно, включение этих белков в мембрану могло бы происходить исключительно за счет потенциальных сигналов остановки транслокации, либо сигналов для включения в мембрану после переноса в матрикс, в последовательности собственно тСУРИ А1 домена.

А

A AC-mCYPl IА1 Bes I (1 -83)-mCYPl 1А1

1ЩЯ ..J ЧШ0 -Pie- v*

мое мое

Su9( 1 -112)-mCYP 11А1 DLD( 1 -72)-mC YP11АI ____Ww

-SSQI______

- PiC—««.

мое мое

CoxIV( 1 -25)-mC YP11A1

SSQI — PiC-

мое

Б

Ad-mCYPI 1A! Карбонатная экстракция Озвучивание

■(]!■!, IT

— SSQI-

- PiC — .

мое мое

Рис.3. А. - Фракционирование митохондрий, содержащих гибридные белки, методом карбонатной экстракции. Б. - Изучение взаимодействия гибридного белка Ad-mCYPllAl с внутренней митохондриальной мембраной. Митохондрии были обработаны карбонатом натрия (левая панель) или озвучены в 10мМ буфере трис-HCI (pH 7,2), содержащим 500мМ KCl, с последующим разделением на фракции осадка и супернатанта высокоскоростным центрифугированием.

Нитроцеллюлозные фильтры прокрашивали поликлональными антителами к CYP11A1 и белкам дрожжевых митохондрий SSQI (матриксный белок) и PiC. М — лизат митохондрий; О - осадок; С - супернатант.

Полученные ранее данные о преимущественной агрегации зрелой формы тСУР1 1 А] после процессинга в матриксе гибрида Сох1Уи~25)-тСУР11А1 делают данный экспериментальный подход неинформативным для этого гибрида (рис.3, А). Гибридный белок Ас1-тСУР11А1 после экстракции митохондрий карбонатом натрия был обнаружен исключительно в растворимой фракции (так же как 85(21 - белок митохондриального матрикса) (рис.3, Б). В то же время Ас1-тСУР11А1 не экстрагируется из мембран после озвучивания митохондрий в присутствии 500мМ КС1 (рис.3, Б). Согласно использованным критериям, Ас1-тСУР1 1А1 является прочно ассоциированным с мембраной периферическим белком, а не интегральным мембранным белком. Поскольку адренодоксин является растворимым матриксным белком, связывание с мембраной, по-видимому, опосредовано СУР11А1-доменом. Поведение Ас1-тСУР11А1 в подобных экспериментах аналогично

поведению белка Тш44 - периферического белка внутренней мембраны дрожжевых митохондрий.

Таким образом, адресующие последовательности, содержащие трансмембранные домены, обеспечивали эффективное встраивание гибридных белков в мембрану. В то время как, согласно проведенным тестам процессированный гибрид Ас1-тСУР11А1 с растворимым матриксным белком является периферическим мембранным белком.

Ограниченный протеолиз мнтохондрнальных фракций протеиназой К.

Стандартным экспериментальным подходом для изучения внугримитохондриальной локализации белков, импортированных в дрожжевые митохондрии, является ограниченный протеолиз митохондрий, содержащих разрывы в наружной мембране - митопласты. При такой обработке протеолизу должны подвергаться белки межмембранного пространства, а если обработку проводить в присутствии детергента, то деградируют и белки, локализованные в матриксе. Данный метод использовали для определения внутримитохондриальной топологии гибридных белков (рис.4). В данных экспериментах следили также за поведением белков-маркеров матрикса (55<21 или №^е1), внутренней мембраны (Р1С) и межмембранного пространства (01Х) - белок межмембранного пространства, заякоренный во внутренней мембране). Концентрацию протеиназы К и время обработки подбирали таким образом, чтобы сохранялась интактность внутренней мембраны. Как выяснилось, домен тСУР11А1 в данных условиях обработки довольно устойчив к действию протеиназы К, что может быть следствием его автономного сворачивания в гибридных белках после включения гема.

В случае Вск1(1-83)-тСУР11А1 обработка митопластов протеиназой К приводит к отщеплению фрагмента примерно в 45 аминокислотных остатков, что соответствует по размерам части адресующей последовательности Все 1(1-83), экспонированной в межмембранное пространство, в то время как остальная часть молекулы остается защищенной от действия протеиназы. При обработке митопластов протеиназой в присутствии детергента происходит деградация гибридных молекул. В целом, в экспериментах по ограниченному протеолизу поведение гибрида Вс51(1-83)-тСУР11А1 аналогично поведению нативного дрожжевого белка Вся1р, в котором основная часть полипептидной цепи, следующая за трансмембранным сегментом, экспонирована в матрикс.

Гибрид Ас1-тСУР11А1 при обработке протеиназой остается полностью интактным в митопластах и подвергается протеолизу при добавлении детергента. Принимая во внимание то, что гибрид ргеАс1-тСУР11А1 процессируется в митохондриях и то, что адренодоксин является растворимым белком матрикса, можно сделать вывод, что гибрид ргеАс1-тСУР11А1

переносится через внутреннюю мембрану митохондрий и связывается с мембраной со стороны матрикса.

Все 1 (1 -83)-тСУР 11АI

протсинача К тритон Х-ИХ)

56.4 кДа —

Мае)- л ПЬО — Р1С-1

протсинача К тритон Х-100

5&4 кДа —

3341- -г>м:>—

— + —

ААС-тСУР 11А1

КС-»

БиОЯ! 12)-тСУР 11А1

протсинача К . тритон Х-100 .

М.4 кДа —

5501— --

ИС-.

Л11-1пСУР]|А1

ОЫЗ( |-72)-тСУР 11АI

Сох|У(|-25]-тСУР 11А1

56.4 «Да —¡«а

Рис.4. Изучение внутримитохондриальной локализации гибридных белков методом ограниченного протеолиза. Митопласты, содержащие исследуемые гибридные белки, после обработки протеиназой К (+ 1% тритон Х-100) анализировали методом иммуноблоттинга. Нитроцеллюлозные фильтры прокрашивали антителами к СУР11А1 и белкам дрожжевых митохондрий: 5501 или М»е1 (белки матрикса), РЮ (белок внутренней мембраны) и межмембранному домену ИЬО.

Гибридный белок 01ЛЭ(1-72)-тСУР11А1 подвергается протеолизу уже при обработке интактных митопластов, при этом образуется фрагмент, соответствующий по электрофоретической подвижности СУР11А1 и взаимодействующий с антителами к нему (рис.4). По всей видимости, образование свободного домена тСУР11А1 происходит в результате отщепления 01ЛЭ(1-72) в составе гибрида под действием протеиназы К. Для нативного белка дегидрогеназы Б-лактата (М^О) в аналогичных экспериментах происходит отщепление основного растворимого домена от мембранной части белка. Однако в отличие от растворимого домена ВЦ), тСУР11А1-домен ассоциирован с мембраной, поскольку он остается в осадке митопластов после протеолитической обработки и осаждения. Обработка протеиназой митопластов, содержащих гибридный белок ААС-тСУР 11А1, как и в случае ОЬО(1-72)-тСУР11А1, приводит к образованию шСУРИА! домена. По всей видимости,

гибридные белки 01ЛХ1-72)-тСУР11А1 и ААС-тСУР11А1 встроены во внутреннюю митохондриальную мембрану таким образом, что они доступны для протеиназы К со стороны межмембранного пространства, так же как и

Менее очевидными являются результаты, полученные для гибридных белков Сох1У(1-25)-тСУР11А1 и 5и9(1-112)-тСУР11А1 (рис.4). Данные гибриды обнаруживаются в митохондриях в процессированной форме и в то же время они практически не подвергаются протеолизу. Скорее всего, это является результатом их транслокации в матрикс, где они преимущественно подвергаются агрегации, как было показано ранее в нашей лаборатории. Для гибрида 8и9(1-112)-тСУР11А1, в отличие от ТЛ£>(1-12)-тСУРПА!, образование небольшого количества тСУР11А1-домена наблюдалось только после лизиса внутренней мембраны, что свидетельствует о том, что белки имеют противоположную ориентацию относительно внутренней мембраны.

Таким образом, из данных экспериментов следует, что использованные для внутримитохондриального сортинга последовательности обеспечивают предсказанную локализацию тСУР11А1 домена гибридных белков в различных митохондриальных компартментах.

Каталитическая активность гибридных белков в митохондриях.

Для того чтобы оценить какое влияние оказывает способ встраивания с помощью различных сигналов митохондриального импорта на формирование холоцитохрома СУР11А1, проводили измерение ферментативной активности гибридных белков в митохондриальных фракциях в реакции отщепления боковой цепи молекулы холестерина. Энзиматическую активность измеряли при добавлении белков-партнеров - адренодоксина (А<3) и адренодоксинредуктазы (А(Ж), а также компонентов КАОРН-регенерирующей системы. В качестве субстрата для реакции использовали 22Я-гидроксихолестерин.

Активность гибридных белков рассчитывали в 10"4 нмолей прегненолона, образующегося за минуту на мг митохондриального белка (рис.5, А). Исходя из оцененного уровня экспрессии гибридных белков (рис.2. Б), рассчитывали их молекулярные активности (мин"1) (рис.5, Б). Перед измерением митохондриальные мембраны обрабатывали 0,3% эмульгеном 913 в буфере БНКСЬ, что приводит к нарушению интактности мембран. Как было показано эмульген 913 в такой концентрации не влияет на активность СУР11А1. В качестве отрицательных контролен использовали пробы митохондрий без добавления Ас1 и АЖ.

А

| Контроли: без Ad и AdR

1

Л

üJl

^ v

0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

:

+1

гЬ

rh

А

Рис.5. Каталитическая активность гибридных белков во фракциях митохондрий. Представлены средние значения активностей ± доверительный интервал, в размерности - А. 10" нмоль прегненолона, образующегося за минуту на мг исходного митохондриального белка. Б. - мин 1 (молекулярная активность). Для каждой фракции митохондрий проводилось 3-7 независимых измерения.

Сравнение молекулярных активностей гибридных молекул во фракции митохондрий показало, что гибриды, содержащие сигнал остановки транслокации в мембране, а именно AAC-mCYPI I AI, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1 и DLD(l-72)-mCYPl 1A1 обладали большей активностью, чем Su9( 1—112)-raCYPl I AI, встраивающийся в мембрану по механизму реэкспорта (рис.5, Б). Гибридный белок Ad-mCYPllAI не проявлял активности в реакции отщепления боковой цепи холестерина. Напротив, ранее в нашей лаборатории было показано, что при экспрессии в клетках E.coli гибрида Ad-mCYPllAI, по крайней мере, определенная доля молекул встраивается в мембрану, и домен mCYPllAl проявляет активность в реконструированной системе. Следовательно, решающее влияние на проявление цитохромом CYP11A1 активности оказывает встраивание его полипептидной цепи в мембрану.

Ранее было показано, что гибрид CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1, как и предшественник цитохрома pCYPIJAl, при импорте в дрожжевые митохондрии проскальзывает в матрикс, где преимущественно агрегирует. При этом лишь некоторая часть молекул встраивалась во внутреннюю мембрану, по-видимому, котранслокационно, и проявляла активность. Достаточно высокая ферментативная активность гибрида CoxIV(l-25)-mCYPllAI (рис.5), импортированного в митохондрии, может быть следствием того, что гибрид процессирован и N-концевой довесок не оказывает ингибирующего влияния на ферментативную активность домена.

В целом полученные данные указывают на то, что встраивание цитохрома СУР11А1 в мембрану является необходимым для формирования холофермента и, по-видимому, осуществляется котранслокационно, а не по механизму ре-экспорта.

Характеристика СУР11А1 домена в составе гибрида ААС-тСУР11А1.

Как следует из экспериментов по измерению энзиматической активности, гибрид ААС-тСУР! 1А1 в митохондриях проявляет самую высокую активность среди гибридных белков (рис.5). В связи с этим было детально охарактеризовано взаимодействие с мембраной и сворачивание тСУР) IА1 домена в составе данного гибридного белка. После обработки протеиназой К митопластов содержащих ААС-тСУРПА1 происходит отщепление домена тСУР11А1 (рис.4), что было использовано для оценки степени взаимодействия шСУР11 А1-домена гибрида с мембраной методом карбонатной экстракции.

После карбонатной экстракции фракции митопластов обработанных протеиназой, содержащих гибрид ААС-тСУР11А1, домен тСУР11А1 обнаруживается в нерастворимой фракции (рис.6. А), так же как СУРПА1 в митохондриях стероидогенных органов. Таким образом, по крайней мере в случае гибрида ААС-тСУР11А1 показано, что тСУР11А1-домен включается в мембрану.

А Б

Трипсин — + +

56.4 кДа -

— тСУР11А1 у Ф1

35<31 —

Р1С --^ Ф2

МОС 123

Рис.6. Изучение встраивания в мембрану митохондрий и сворачивания домена тСУР11А1 в составе гибридного белка ААС-тСУР11А1. А. - Карбонатная экстракция митопластов, содержащих гибридный белок ААС-тСУР! 1А1, после обработки протеиназой К. Нитроцеллюлозный фильтр прокрашивали антителами к СУР11А1 и белкам дрожжевых митохондрий 88(21 (матриксный белок) и ИС. М - лизат митохондрий; О - осадок; С -супернатант. Б. - Обработка трипсином митохондриий, содержащих гибридный белок ААС-тСУР! 1А1. Митохондрии до обработки трипсином (1), после обработки трипсином (2) и обработанный трипсином очищенный цитохром шСУР11А1 (3).

Ограниченный трипсинолиз является одним из удачных методологических подходов используемых для оценки конфирмационного состояния цитохрома ШСУР11А1. При обработке трипсином (в условиях ограниченного трипсинолиза) нативного цитохрома тСУРПА! происходит расщепление по сайту А^250-А8п257 с образованием двух

фрагментов: Ф| и Фт с молекулярными весами 29 кДа и 26 кДа, соответственно. Было показано, что трипсин-чувствительный сайт в митохондриях из коры надпочечников млекопитающих экспонирован в матрикс.

Обработка трипсином митопластов, содержащих ААС-тСУР11А1, приводит к образованию двух фрагментов размером 29 кДа и 26 кДа (рис.6, Б), соответствующих специфическим фрагментам, образующимся при обработке трипсином нативного цитохрома.

Как следует из полученных результатов, при осуществлении импорта цитохрома в митохондрии с помощью белка ААС, тСУР11А1-домен встраивается в мембрану и правильно сворачивается.

Таким образом, формирование холоцитохрома в дрожжевых митохондриях происходит более эффективно при использовании для импорта в митохондрии адресующих последовательностей, обеспечивающих включение тСУР11 А1-домена в мембрану.

По-видимому, постоянное взаимодействие с мембраной важно для созревания белка, то есть присоединения гема, сворачивания и включения в мембрану. Действительно, в эукариотических клетках последняя стадия синтеза гема осуществляется ферментом феррохелатазой во внутренней мембране митохондрий. И впоследствии гем встраивается в активные центры ферментов во внутренней мембране митохондрий, межмембранном пространстве и цитоплазме. При этом содержание гема в матриксе незначительно. Учитывая природную локализацию цитохрома СУР11А1 и тот факт, что импортируемые в митохондрии полипептидные цепи белков находятся в развернутом состоянии при транслокации, можно предполагать, что включение гема в апоцитохром происходит во внутренней митохондриальной мембране.

Экспрессия гибридных белков ргеЛс1-тСУР11Л1 и Сох1У(1-25)-тСУР11А1 в штаммах УРН499 и УРН499 раш17Д.

Результаты по импорту гибридных белков на основе цитохрома тСУР11А1 с разными адресующими препоследовательностями указывают на то, что в природной системе встраивание цитохрома во внутреннюю мембрану митохондрий происходит в процессе транслокации. Однако в дрожжах при импорте в митохондрии цитохрома с собственной препоследовательностью или гибридного белка Сох1У(1~25)-тСУР11А1 данные белки преимущественно проскальзывают в матрикс после процессинга.

Хотя механизмы импорта белков в митохондрии консервативны для эукариот, имеются данные о существовании различий между системами импорта у дрожжей и млекопитающих. Важное отличие заключается в том, что дрожжевой белок Т1ш44

(компонент РАМ-комплекса) прочно ассоциирован с внутренней мембранной со стороны матрикса, a Tim44 млекопитающих локализован преимущественно в растворимой фракции матрикса. В дрожжевых митохондриях Tim44 и три других мембранных белка Pamló, Paml7 и Pain 18 осуществляют координацию взаимодействия митохондриального шаперона mtHsp70 и TIM23 комплекса. Как только предшественник появляется из канала, mtHsp70 связывается с ним и перемещает в матрикс, гидролизуя АТФ. То, что Tim44 в митохондриях млекопитающих в основном обнаружен в матриксе, означает, что, по-видимому, в этой системе шаперон mtHsp70 не связан с комплексом TIM23. Соответственно в этом случае, по всей видимости, главным образом реализуется модель пассивного импорта полипептидных цепей. То есть модель, согласно которой mtHsp70 только связывается с полипептидными цепями белков, предотвращая их обратное движение, а их перенос в матрикс осуществляется за счет разности потенциалов мембраны, очевидно медленнее, чем при активном использовании АТФ.

Если предполагать, что встраивание цитохрома осуществляется котранслокационно, как следует из предыдущих экспериментов, то оно происходит без участия РАМ-комплекса, осуществляющего перенос белковых цепей в матрикс.

Одним из недавно охарактеризованных компонентов этого комплекса является белок Рат17. Мартин ван дер Лаан и соавторы* показали, что Раш17 играет важную роль в процессе переноса белков с отщепляемой аминокислотной последовательностью в матрикс митохондрий. Так в мутантном штамме с делецией гена, кодирующего белок Рат17, происходило нарушение импорта белков с отщепляемой последовательностью в матрикс (снижение скорости транслокации и процессинга in vitro), в то время как на котранслокационное встраивание белков в мембрану мутация влияния не оказывала. Штамм YPH499 рат17А и контрольный штамм дикого типа YPH499 (WT) были любезно предоставлены авторами для работы в нашей лаборатории. В этих штаммах была осуществлена экспрессия гибридных белков с отщепляемыми матриксными препоследовательностями, preAd-mCYPl 1А1 и CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 с тем, чтобы оценить их поведение в условиях возможно более близких к системе импорта млекопитающих.

Дрожжевые клетки штаммов YPH499 paml7h и YPH499 трансформировали плазмидами pYeDP/Cox(l-25)-mCYPllAl и pYeDP/preAd-mCYPllAl. Трансформированные клоны выращивали в течение 16 часов на SD среде, затем клетки осаждали и переносили в SG среду, содержащую галактозу, для индукции промотора GAL10-CYC1, на 12 часов. Рост клеток и индукцию осуществляли при 24°С.

' van der Uan М et al (2005) Mol Cell Biol, 25, 7449-7458

18

Ad-mCYPilAl

А

2S05 WT Р.11П17Л E.coli

12 3 4

Б

WT рат17Д

— SSQI— -PiC-

мое мое

в

250 VC 200-| 1501,»-С

X

с;

WT pam 17 д

CoxIV(l-25) - mCYPl 1A1

2805 WT pam ] 7Д

56 А кДа-

I 2 3

WT pam 17Д

— SSQI— -РЮ-

мое мое

« 600

| 500

J 400

X

300

о :оо

-г" 100

WT pam 17л

Рис.7. А. - Экспрессия гибридных белков preAd-mCYPllAI и CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 в штаммах YPH499 (WT) и YPH499 рат17А. Нитроцеллюлозные фильтры прокрашивали антителами к CYP11A1. Митохондрии из трансформированных плазмидами pYeDP/preAd-mCYPllAl и pYeDP/CoxIV(l-25)-mCYPl 1 AI дрожжевых клеток штаммов: 2805 (1), YPH499 (WT) (2) и YPH499 рат17А. (3); гомогенат клеток E.coli, экспрессирующих гибрид зрелой формы адренодоксина с mCYPl 1 AI (4).

Б. - Карбонатная экстракция митохондрий штаммов YPH499 (WT) и YPH499 ратПК, содержащих гибриды Ad-mCYPllAl и CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1. Нитроцеллюлозные фильтры прокрашивали антителами к CYP11А1 и белкам дрожжевых митохондрий SSQ1 и PiC. М-лизат митохондрий; О - осадок; С - супернатант.

В. - Каталитическая активность гибридных белков Ad-mCYPllAl и CoxIV(l-25)-mCYPHAl во фракции митохондрий YPH499 (WT) и YPH499 рат!7А. Активность представлена в размерности - 10 4 нмоль прегненолона, образующегося за минуту на мг исходного митохондриального белка.

Данные иммуноблоттинга выделенных митохондриальных фракций приведены на рис.7. А, из которого видно, что электрофоретическая подвижность preAd-mCYPl 1А1 такая же, как в образцах экстрактов клеток E.coli, экспрессирующих гибрид зрелой формы адренодоксина с mCYPl 1А1, и в митохондриях дрожжевого штамма 2805. То есть основная часть гибридных молекул в митохондриях мутантного штамма подвергается процессингу,

как и в митохондриях из контрольного штамма. Гибридные молекулы Сох1У(1-25)-тСУР11А1 в мутантном штамме также обнаруживаются преимущественно в процессированной форме. Несмотря на то, что клетки мутантного штамма росли несколько медленнее, уровни экспрессии обоих гибридных белков были близкими в митохондриях дикого и мутантного штаммов.

Далее полученные препараты митохондрий подвергали карбонатной экстракции, а также использовали для измерения ферментативной активности в реакции отщепления боковой цепи холестерина.

Применение метода щелочной экстракции также не позволило обнаружить явных различий между поведением белков Ас1-тСУРПА1 и Сох1У(1-25)-тСУР11А1 в митохондриях дикого и мутантного штаммов. Как и в описанных ранее экспериментах с митохондриями штамма 2805, гибрид Ас1-тСУР11А1 был обнаружен после фракционирования в растворимой фракции, а СохГ/(1-25)-тСУР11А1 во фракции осадка мембран (рис.7, Б).

Энзиматическая активность гибрида СохГУ(1-25)-тСУР11А1 оказалась существенно выше в митохондриях мутантного штамма (рис.7, В). Более высокие значения активности полученные в рат!7А митохондриях указывают на то, что в этом случае большая часть молекул встроилась в митохондриальную мембрану. То есть ограничение импорта гибридного белка в матрикс в штамме УРН499 рат17А приводит к более эффективному встраиванию белка в мембрану в процессе транслокации и, следовательно, к более эффективному формированию холофермента.

В то же время гибридный белок Ас1-тСУРПА1 не проявляет активности в митохондриях обоих штаммов (рис.7, В). Видимо в этом случае природа используемой для митохондриального импорта последовательности такова, что мутация не оказывает заметного влияния на процесс переноса гибридного белка в матрикс митохондрий.

Таким образом, данные эксперименты с мутантным штаммом УРН499 рат17А являются дополнительным подтверждением того, что встраивание цитохрома СУР11А1 в природной системе происходит котранслокационно.

Заключение.

Анализ аминокислотной последовательности СУР11А1 показывает отсутствие протяженных гидрофобных участков, которые могут выполнять роль топогенных сигналов для встраивания во внутреннюю мембрану в процессе транслокации или после импорта в матрикс. Тем не менее, изучение его топологии в митохондриях коры надпочечников

млекопитающих показало, что белок связан с внутренними мембранами таким образом, что не экстрагировался карбонатом натрия, что предполагает его включение в липидной бислой. В настоящее время, предполагается, что взаимодействие СУР11А1 с мембранной осуществляется посредством аминокислотных остатков в составе петли между р и С спиралями - Р-в петли, которая обеспечивает включение полипептидной цепи в липидный бислой без его полного пересечения. При гетерологической экспрессии в митохондриях дрожжей предшественник СУР11А1 лишь частично процессировался и малоэффективно встраивался в митохондриальную мембрану. В основном белок проскальзывал в матрикс, где подвергался деградации или агрегировал.

Поэтому для импорта цитохрома в митохондрии использовали различные адресующие последовательности дрожжевых белков, которые могли бы способствовать более эффективному встраиванию СУР11А1 в мембрану дрожжевых митохондрий.

Были сконструированы и исследованы гибридные белки ААС-тСУР11А1, 01Л)(1-72)-тСУР11А1, Вс81(1-83)-тСУР11А1 и ргеАс!-тСУР11А1. А так же исследованы гибриды Сох1У(1-25)-тСУР11А1 и 5и9((1-112)-тСУР11А1.

Показано, что использование различных адресующих сигналов обеспечивает предсказанную внутримитохондриальную локализацию гибридных молекул. Формирование холоцитохрома осуществляляется с большей эффективностью в гибридах, предназначенных для включения во внутреннюю мембрану митохондрий в ходе транслокации, чем в гибридах, предназначенных для включения в мембрану по механизму ре-экспорта.

Можно предположить, что при импорте в митохондрии стероидогенных тканей млекопитающих СУР11А1 распознается как субстрат для Т1М23 комплекса свободного от РАМ, что обеспечивает его включение в мембрану. Эндогенным сигналом для встраивания посредством Т1М23 может быть встраивание гема в апо-СУР11А1 в мембране. С другой стороны, современные взгляды на взаимодействие СУР11А1 с мембранной подразумевает, что основная часть белка располагается в матриксе, что позволяет предположить, что РАМ комплекс все-таки участвует в переносе полипентидной цепи через внутреннюю мембрану, однако, вероятно, менее эффективно митохондриях стероидогенных тканей, что позволяет полипептидной цепи СУР11А1 взаимодействовать с мембраной в процессе переноса.

Действительно, для гибрида Сох1У(1-25)-тСУР11А1 показано, что при его импорте в митохондрии дефицитные по компоненту РАМ-комплекса (Рат17) происходит более эффективное формирование холофермента, по всей видимости, за счет встраивания белка в мембрану в процессе транслокации.

Поскольку в митохондриях млекопитающих Тт144 в основном обнаружен в матриксе, это означает, что шаперон п«Ньр70 не связан с комплексом Т1М23, и в этой системе, по всей

видимости, главным образом реализуется модель пассивного импорта полипептидных цепей. То есть модель, согласно которой основной движущей силой импорта в матрикс является разность потенциалов мембраны, а шШьр70 только связывается с полипептидными цепями белков, предотвращая их обратное движение. Кроме того, в основе механизма удерживания в мембране может лежать сниженная дыхательная активность митохондрий, в которых проходит стероидогенез. В результате низкое содержание АТФ в матриксе должно приводить к уменьшению активности тШврТО по протаскиванию белка в матрикс митохондрий.

В целом полученные данные указывают на то, что встраивание цитохрома СУР11А1 в природной системе происходит котранслокационно, то есть в процессе переноса его полипептидной цепи через мембрану.

Одной из задач данной работы был выбор гибридного белка, активного в реакции отщепления боковой цепи холестерина, для создания штаммов микроорганизмов способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов.

В рамках решения данной задачи была проведена проверка возможности функционального сопряжения цитохрома СУР11А1 млекопитающих в составе гибридных белков с вероятными редокс-партнерами (гомологом адренодоксина млекопитающих -ферредоксином УаЫ, и гомологом адренодоксинредуктазы - белоком АгЫр) дрожжей штамма 5. сеге\чи'ше 2805, которая показала, что электронно-транспортная цепь дрожжевых митохондрий не может поддерживать функционирование СУР11А1. Соответственно, при создании трансгенных штаммов в них также должны быть экспрессированы белки-партнеры цитохрома - А<3 и АсИ*. Основным критерием при выборе гибридных белков для создания трансгенного штамма была высокая ферментативная активность. Кроме того, гибридные белки не должны быть агрегированы, поскольку штаммы экспрессирующие такие белки могут быть не устойчивы в течение продолжительного времени культвирования. Так, ранее в нашей лаборатории, было показано, что экспрессия гибридного белка Сох1У(1-25)-тСУРПА! в дрожжах приводит к инактивации дыхательной цепи митохондрий (скорость клеточного дыхания снижается на 30-40%) и/или нарушению механизма сопряжения. Таким образом, для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки ААС-шСУР11А1 и Вс51(1-83)-тСУР11А1.

выводы.

1. Сконструированы плазмиды для экспрессии в дрожжах гибридных белков ААС-mCYP11А1, Bes 1 (l-83)-mCYP 11А1, DLD(l-72)-mCYP 11А1 и preAd-mCYP 11А1.

2. Показано, что AAC-mCYPl 1А1, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1, CoxlV(l-25)-mCYPUAl, DLD(l-72)-mCYPl 1A1, Su9(l-112)-mCYPl 1 Al и preAd-mCYPl 1AI эффективно импортируются в митохондрии в дрожжевых клетках, при этом белки ААС-mCYPllAl, Bes 1 (l-83)-mCYP 11А1, CoxlV(l-25)-mCYPl 1A1, DLD(l-72)-mCYPl 1A1 и Su9(l-112)-mCYPllAl проявляют энзиматическую активность в реакции отщепления боковой цепи молекулы холестерина с образованием прегненолона.

3. Установлено, что использование сигналов котранслокационного встраивания для импорта цитохрома mCYPUAl в дрожжевые митохондрии приводит к более эффективному формированию холофермента, чем использование сигналов ре-экспорта. Для гибрида CoxIV(l-25)-mCYPUAl показано, что формирование холофермента происходит более эффективно в митохондриях, дефицитных по компоненту РАМ-коплекса Рат17, чем в митохондриях контрольного штамма.

4. Встраивание mCYPllAl в мембрану является необходимой стадией для образования каталитически активного белка.

5. Для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки AAC-mCYP 11А1 и Bes 1 (l-83)-mCYP 11А1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миненко А.Н., Лузиков В.Н., Ковалева И.Е. Использование адресующей последовательности дрожжевой дегидрогеназы D-лактата для встраивания CYPUA1 во внутреннюю мембрану дрожжевых митохондрий. Биохимия/Biochemistry (Moscow), 2006, том 71, вып. 1, стр. 42 - 49.

2. A.N. Minenko, L.A. Novikova, V.N. Luzikov , I.E. Kovaleva. Import of hybrid forms of CYP11A1 into yeast mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (2008), 1780, mill 30.

3. Миненко A.H. Изучение топогенеза цитохрома P450scc в дрожжевых митохондриях. Материалы XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004». Секция Биология, отделение биохимия, издательство Московского университета, Москва, стр.106 - 107.

4. I.E. Kovaleva, A.N. Minenko, V.N.Luzikov. Insertion of mammalian CYP1IA1 fused to the yeast AAC protein into the inner membrane of yeast mitochondria. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics, and Bioinformatics; Dallas, TX, USA, May 31 - June 5, 2005.

5. A.N. Minenko, I.E. Kovaleva and V.N. Lusikov. Efficient import of a recombinant form of mammalian cytochrome P450scc into yeast mitochondria. 30,h FEBS Congress - 9"1 IUBMB Conference Budapest, Hungary 2"d-7lh July, 2005, L3 Genomics in Protein Biotechnology / Protein Biotechnology L3-028P.

6. Миненко A.H., Ковалева И.Е., Лузиков B.H. Экспрессия ключевого компонента холестеринмонооксигеназной/лиазной системы (CYP11A1) в дрожжах в составе гибридного белка. Материалы четвертого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино 6-7 декабря 2006г., издательство ООО «МАКС Пресс», стр. 158-159.

7. Ковалева И.Е., Миненко А.Н., Новикова Л.А., Лузиков В.Н. Экспрессия цитохрома CYP11A1 в дрожжах в составе гибридных белков. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, г. Новосибирск, 11-15 мая 2008г., издательство «АРТА», стр. 169 (281).

8. I.E. Kovaleva, A.N. Minenko, L.A. Novikova, V.N.Luzikov. Import of hybrid forms of CYP11A1 into yeast mitochondria». 9th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnology, Nice, France - June 8-12,2008, P-71.

Заказ № 194/10/08 Подписано в печать 23.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. п л. 1,5

//г ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 j www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Основы импорта белков в митохондрии.

1.2 Транслоказа внешней мембраны (ТОМ - комплекс).

1.2.1 Рецепторы ТОМ-комтекса.

1.2.2 Центральный транспортный канал.

1.3 SA М компл тс.

1.4 Импорт небольших белков межмембранного пространства.

1.5 Транслоказа встраивания (TIM22-комплекс).

1.6 Транслоказа переноса (Т1М23-комплекс).

1.6.1 РАМ—комплекс.

1.7 Встраивание предшественников во внутреннюю мембрану.

1.8 Митохондриалъная прогрессирующая пептидаза.

1.9 Сигналы митохондриалъного импорта.

1.10 Общая характеристика цитохрома CYP11A1.

1.11 Механизм действия холестеринмонооксигеназной/лиазиой системы.

1.12 Топогепез и топология CYP11A1 в мембране.

1.13 Взаимодействие CYP11A1 с адренодоксином.

1.14 Узнавание субстрата и канал доступа.

1.15 Активный центр CYP11А1.

1.16 Импорт CYP11А1 в гетерологические митохондрии.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и ферменты.

2.1.2 Использованные клеточные штаммы и нпазмиды.

2.2 Методы.

2.2.1 Методы работы с ДНК.

2.2.2 Выделение ДНК.

2.2.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.2.4 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК (мини - щелочной метод).

2.2.5 Рестриктный анализ.

2.2.6 Препаративная рестрикция плазмидной ДНК.

2.2.7 Выделение фрагментов ДНК из агарозпого геля.

2.2.8 Модификация концевых участков ДНК.

2.2.9 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.2.10 Лигирование.

2.2.11 Секвенирование.

2.2.12 Методы работы с клетками Е. coli.

2.2.13 Условия роста штаммов Е. coli.

2.2.14 Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli.

2.2.15 Трансформация клеток Е. coli с применением CaCli.

2.2.16 Трансформация клеток Е. coli методом электропорации.

2.2.17 Фракционирование клеток Е. coli с использованием French Press.

2.2.18 Получение спектров рекомбинантных белков.

2.2.19 Методы работы с клетками S. cerevisiae.

2.2.20 Условия роста штаммов S. cerevisiae.

2.2.21 Трансформация клеток S. cerevisiae.

2.2.22 Выделение митохондрий из дрожжевых клеток.

2.2.23 Определение содержания белка по Лоури.

2.2.24 Электрофорез по Лэммли.

2.2.25 Иммуноблоттииг.

2.2.26 Щелочная экстракция митохондриальных белков.

2.2.27 Озвучивание митохондий в KCL.

2.2.28 Получение митопластов.

2.2.29 Обработка митохондрий и митопластов протеиназой К.

2.2.30 Трипсинолиз.

2.2.31 Определение ферментативной активности рекомбинантных белков.

2.3 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков AAC-mCYPllAl, Bcsl(I-83)-mCYPl !А 1 и DLD(l-72)-mCYPllAl в дроэ/сжевых клетках.

2.4 Конструирование плазмиды pYeDP/preAd-mCYP 11А1 для экспресии гибридного белка preAd-mCYP 11А1 в дрожэюевых клетках.

2.5 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков ASu9(67 -112)mCYPllAl и AAC-mCYPl 1А1 в бактериальных клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.6 Постановка задачи.

2.7 Экспрессия гибридных белков.

2.8 Определение виутримитохондриалъной локализации гибридных белков.

2.8.1 Карбонатная экстракция мипгохондриачьных белков.

2.8.2 Определение внутримитохондриальной локализации гибридных белков.

2.9 Каталитическая активность гибридных белков в митохондриях.

2.10 Характеристика CYP11А1 домена в составе гибрида АА C-mCYPl 1А1.

2.11 Экспрессия гибридных белков в бактериальных клетках.

2.12 Экспрессия гибридных белковpreAd-mCYPllAl и CoxIV(I-25)-mCYPlJAJ в штаммах YPH499 и YPH499рат17А.

В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении топогенеза митохондриальных белков, синтезируемых как в цитозоле, так и в самих органеллах. Детально изучен транслокационный аппарат митохондрий (белковые транслоконы ТОМ, ТТМ23, TIM22), механизмы прохождения импортируемых полипептидных цепей через митохондриальные мембраны. Установлены общие принципы импорта белковых предшественников в митохондрии, их распределение по субмитохондриальным компартментам (хотя и для достаточно ограниченного числа традиционных белков-моделей). Вместе с тем. в топогенезе митохондриальных белков остается множество проблем, решение которых требует дополнительных исследований. В частности, это касается механизмов встраивания белков в митохондриальные мембраны и, особенно, во внутреннюю мембрану, в которой сосредоточены компоненты, отвечающие за эксклюзивные функции митохондрий. Особый интерес представляет включение в митохондриальные мембраны белков, не имеющих отчетливо выраженных топогенных сигналов. К числу таких белков относится цитохром P450scc (CYP11A1). который содержится во внутренней мембране митохондрий стероидогенных органов и отвечает, в сопряжении с адренодоксином и NADPH: адренодоксин-оксидоредукгазой, за ключевую стадию синтеза всех стероидных гормонов млекопитающих (превращение холестерина в прегненолон). Особенностью CYP11A1 как субстрата для импорта является так же то, что он является гемпротеином и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гем.

Изучение топогенеза митохондриального цнтохрома CYP11А1, который в силу отсутствия характерных топогенных сигналов не может встраиваться в мембрану ни по одному из охарактеризованных к настоящему моменту молекулярных механизмов, должно способствовать расширению современных представлений о митохондриальном белковом импорте.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Основы импорта белков в митохондрии.

Митохондрии составляют приблизительно 20% массы эукариотической клетки и содержат, в зависимости от вида организмов, от 500 до 2000 различных белков, распределенных между четырьмя компартментами: внешняя мембрана, межмембранное пространство, внутренняя мембрана и матрикс [1]. В дрожжах только восемь, а у человека только 13 митохондриальных белков кодируется в геноме органеллы и синтезируется в матриксе. Более 98% митохондриальных белков кодируется ядерными генами и синтезируются как белковые предшественники на цитоплазматических рибосомах.

Различают два основных класса предшественников, принципиально отличающихся по типу используемых сигналов импорта в митохондрию [2J. К первом классу относят предшественники матриксных белков, содержащих на N-конце отщепляемую аминокислотную препоследовательность. Большинство представителей второго класса белков - многочисленные переносчики метаболитов, локализованные во внутренней мембране митохондрии и содержащие от трех до шести гидрофобных доменов [3].

N-концевая препоследовательность предшественников первого класса состоит из 10 - 80 аминокислотных остатков, которые протеолитически удаляются в матриксе. Препоследовательность содержит положительно заряженные гидрофобные и гидроксилированные аминокислотные остатки. Характерной чертой препоследовательности является способность образовывать амфифильную а-спираль, которая представляет' собой положительно заряженную поверхность с одной стороны и гидрофобную поверхность с другой стороны [4, 5].

Кроме этих основных классов, существуют несколько специфических типов предшественников для белков внешней и внутренней мембран и белков межмембранного пространства.

Основой для специфического распознавания и переноса предшественников через внешнюю мембрану митохондрий является комплекс мембранных белков ТОМ. Транслоказа внешней мембраны - ТОМ комплекс (от англ. translocase of outer membrane), включает в себя белки-рецепторы и центральный транспортный канал

GIP (от англ. general import pore), через который проходят предшественники всех типов (рис.1) [6].

Рис.1. Основные пути импорта белков в митохондрии.

В дальнейшем предшественники, которые состоят из /3-листов и имеют бочкообразную третичную структуру, встраиваются во внешнюю мембрану, как было недавно обнаружено [7], посредством SAM-комплекса (от англ. sorting and assembly machinery). Для импорта некоторых белков, имеющих специфические цистеиновые мотивы, необходимы белки Mia40 и Ervl [8].

Внутренняя мембрана содержит два транслокационных комплекса - TIM23 и Т1М22-комплексы (от англ. translocase of inner membrane). TIM22 - посредник во встраивании во внутреннюю мембрану гидрофобных белков-переносчиков метаболитов [9], TIM23 транспортирует предшественники с отщепляемой препоследовательностью. При этом предшественники переносятся в матрикс митохондрий при взаимодействии комплексов TIM23 и РАМ (от англ. presequence translocase-associated motor) [10], либо включаются в процессе транслокации во внутреннюю мембрану, если комплекс РАМ диссоциирован от TIM23 [4]. Как правило, в последнем случае импортируемые белки содержат трансмембранный домен, расположенный вблизи от сигнальной препоследовательности.

Необходимо отметить, что белки-предшественники транспортируются в митохондрию только в песвернутой, либо частично свернутой конформации. Подобные состояния поддерживаются с помощью шаперонов цитоплазмы и шапероноподобных белков митохондрии, связывающихся с предшественниками [5]. Связывание с шаперонами также препятствует агрегации предшественников, содержащих гидрофобные домены, в водной среде цитозоля и межмембранного пространства. Кроме того, шапероны способствуют распознаванию предшественников мембранными рецепторами митохондрии.

3 выводы.

1. Сконструированы плазмиды для экспрессии в дрожжах гибридных белков AAC-mCYPl 1А1, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1, DLD(l-72)-mCYPl 1А1 и preAd-mCYPllAl.

2. Показано, что AAC-mCYPl 1A1, Bcsl(l-83)-mCYPllAl, CoxIV(l-25)-mCYPllAl, DLD( 1 -72)-mCYP 11A1, Su9(l-112)-mCYPl 1A1 и preAd-mCYPl 1A1 эффективно импортируются в митохондрии в дрожжевых клетках, при этом белки AAC-mCYPl 1А1, Bcsl(l-83)-mCYPllAl. CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1, DLD(l-72)-mCYPllAl и Su9(l-112)-mCYPl 1A1 проявляют энзиматическую активность в реакции отщепления боковой цепи молекулы холестерина с образованием прегненолона.

3. Установлено, что использование сигналов котранслокациопного встраивания для импорта цитохрома mCYPl 1А1 в дрожжевые митохондрии приводит к более эффективному формированию холофермента, чем использование сигналов ре-экспорта. Для гибрида CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 показано, что формирование холофермента происходит более эффективно в митохондриях, дефицитных по компоненту РАМ-коплекса Рат17, чем в митохондриях контрольного штамма.

4. Встраивание mCYPl 1А1 в мембрану является необходимой стадией для образования каталитически активного белка.

5. Для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки AAC-mCYPl 1А1 и Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1.

2.13 Заключение.

Анализ аминокислотной последовательности CYP11A1 показывает отсутствие протяженных гидрофобных участков, которые могут выполнять роль топогенных сигналов для встраивания во внутреннюю мембрану в процессе транслокации или после импорта в матрикс. Тем не менее, изучение его топологии в митохондриях коры надпочечников млекопитающих показало, что белок связан с внутренними мембранами таким образом, что не экстрагируется карбонатом натрия, что предполагает его включение в липидной бислой [58].

В настоящее время предполагается, что взаимодействие CYP11A1 с мембранной осуществляется посредством аминокислотных остатков в составе петли между F и G спиралями - F-G петли, которая обеспечивает включение полипентидной цепи в лппидный бислой без его полного пересечения [62, 74].

При гетерологической экспрессии в митохондриях дрожжей предшественник CYP11A1 лишь частично процессировался и малоэффективно встраивался в митохондриальную мембрану. В основном белок проскальзывал в матрикс, где подвергался деградации или агрегировал [95, 96, 98]. Поэтому для импорта цитохрома в митохондрии использовали различные адресующие последовательности дрожжевых белков, которые теоретически могли бы способствовать более эффективному встраиванию CYP11A1 в мембрану дрожжевых митохондрий.

Было показано, что сконструированные в рамках данной работы белки ААС-mCYPllAl, Bcsl(l-83)-mCYPl 1 Al, DLD(l-72)-mCYPllAl и pAd-mCYPl 1А1, a также белки CoxIV(l-25)-mCYPllAl, Su9(l-112)-mCYPl 1 Al и mCYPllAl при экспрессии в дрожжевых клетках импортируются в митохондрии (рис.21, 26).

Гибридные белки с трансмембранными доменами в составе адресующих сигналов- AAC-mCYP 11 Al, Bcsl(l-83)-mCYPllAl, DLD(l-72)-mCYPl 1А1 и Su9(l-112)-mCYPl 1A1 - встраиваются во внутреннюю мембрану и обеспечивают предсказанную локализацию mCYPllAl-домена относительно внутренней митохондриальной мембраны.

Карбонатная экстракция митопластов, содержащих гибридный белок ААС-mCYPllAl после обработки протеиназой К (процедура приводящая к освобождению домена mCYPllAl от ААС) показала, что по крайней мере в данном конкретном случае добавление последовательности с трансмембранными доменами способствовало включению собственно CYP11A1 в мембрану (рис. 28). Домен CYP11A1 в данном случае не экстрагировался карбонатом натрия так же как цитохром в своей природном окружении. Кроме того домен CYP11A1 в составе гибридного белка AAC-mCYPl 1А1 правильно сворачивается, образуя в результате ограниченного трипсинолиза фрагменты характерные для нативного цитохрома.

Напротив, при использовании для импорта цитохрома в митохондрии предшественника растворимого матриксного белка preAd, включения гибрида во внутреннюю мембрану не происходит — гибрид после щелочной экстракции был обнаружен исключительно во фракции растворимых белков (рис.22, Б). Однако Ad-mCYPl 1 Al не экстрагируется из мембран при обработке митохондрий ультразвуком в высокой концентрации соли, что указывает на прочное взаимодействие гибрида с мембранной, наиболее вероятно, посредством CYP11A1 домена. Поведение Ad-mCYPllAl в экспериментах по фракционированию аналогично поведению в подобных экспериментах другого митохондриального белка Tim44, который ассоциирован с внутренней мембраной [122]. Принимая во внимание то, что гибрид preAd-mCYPllAl процессируется матриксной пептидазой (МРР) и результаты экспериментов по ограниченному прогеолизу, можно сделать вывод, что гибрид preAd-mCYPl 1 Al ассоциирован с внутренней мембраной со стороны матрикса. Таким образом, когда CYP11А1 импортируется в митохондрии с помощью предшественника матриксного белка (гибрид preAd-mCYPllAl), который, очевидно, является субстратом для TIM23/PAM суперкомплекса, правильное включение CYP11A1 домена в мембрану не происходит.

Сравнение ферментативных активностей гибридных белков измеренных на митохондриальных фракциях при добавлении Ad и AdR показало, что гибриды, содержащие сигнал остановки транслокации в мембране, а именно AAC-mCYPl 1 Al. Bcsl(l-83)-mCYPllAl и DLD(l-72)-mCYPl 1А1 обладали большей активностью в реакции отщепления боковой цепи холестерина, чем гибридный белок с сигналом реэкспорта Su9( 1-112)-mCYP 11А1.

Гибрид Ad-mCYPllAl не проявлял ферментативную активность во фракции митохондрий. Напротив, при экспрессии Ad-mCYPl 1 Al в клетках E.coli значительная часть гибридных молекул встраивается в мембраны и проявляет активность [109]. Полученные данные подтверждают предложение о том, что стадия полного переноса белковой последовательности CYP11A1 в матрикс не является необходимой в процессе его топогенеза, а скорее наоборот, для созревания холо-формы важно постоянное взаимодействие полипептидной цепи с мембраной. По-видимому, постоянное взаимодействие с мембраной важно для созревания белка, то есть присоединения гема, сворачивания и включения в мембрану. В эукариотических клетках последняя стадия синтеза гема осуществляется ферментом феррохелатазой, расположенной во внутренней мембране митохондрий. Учитывая, природную локализацию цитохрома CYP11A1 (встроен во внутреннюю мембрану и его акшвный центр направлен в матрикс), можно сделать вывод о том, что включение гема в апо-цитохром происходит во внутренней мембране.

Экспрессия белка ASu9(67-112)-mCYPllAl в бактериальных клетках -модельной системе не имеющей митохондрий - показала, что сигнал Su9(67—112) не оказывает заметного влияния на проявление mCYPl 1А1 -доменом активности. Таким образом, невысокая активность гибрида Su9(l-112)-mCYPllAl в митохондриях обусловлена, скорее всего, механизмом встраивания гибридного белка. В свою очередь, активности гибридных белков AAC-mCYPllAl, Bcsl(l-83)-mCYPl 1А1 и DLD(1—72)-mCYPllAl встраивающихся по котранслокационному механизму в митохондриях выше, чем у гибрида Su9(l-112)-mCYPllAl, даже несмотря на то, что N-концевые сигнальные довески этих белков, возможно, оказывают снижающее влияние на активность mCYPl 1А1-домена.

Сравнивая удельные активности белков не имеющих сигнальных довесков в митохондриях - зрелого mCYPl 1А1 и процессированной формы CoxIV(l-25)-mCYPllAl - мы видим, что активность CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 ниже. Это можно объяснить тем, что отщепляемый сигнал Сох(1-25) обеспечивает вынужденный импорт цитохрома в матрикс, где, как было показано ранее в нашей лаборатории [98], белок агрегирует и лишь небольшая его часть встраивается в мембрану.

Можно предположить, что при импорте в митохондрии стероидогенных тканей млекопитающих CYP11A1 распознается как субстрат для TIM23 комплекса свободного от РАМ, что обеспечивает его включение в мембрану. Эндогенным сигналом для встраивания посредством TIM23 может быть встраивание гема в апо-CYP11A1 в мембране. С другой стороны, современные взгляды на взаимодействие CYP11A1 с мембранной подразумевают, что основная часть белка экспонирована в матрикс, что позволяет предположить, что РАМ комплекс все-таки участвует в переносе полипепгидной цепи через внутреннюю мембрану, однако, вероятно, менее эффективно митохондриях етероидогенных тканей, что позволяет полипептидной цепи CYP11А1 взаимодействовать с мембраной в процессе переноса.

Действительно, для гибрида CoxIV(l-25)-mCYPl 1А1 показано, что при его импорте в митохондрии, дефицитные по компоненту РАМ-комплекса (Раш17), происходит более эффективное формирование холофермента, по всей видимости, за счет встраивания белка в мембрану в процессе транслокации.

В митохондриях млекопитающих Tim44 в основном обнаружен в матриксе [121], что вероятно означает, что шаперон mtHsp70 не связан с комплексом TIM23, и в этой системе, по всей видимости, главным образом реализуется модель пассивного импорта полипептидных цепей. То есть модель, согласно которой основной движущей силой импорта в матрикс является разность потенциалов мембраны, а mtHsp70 только связывается с полипептидными цепями белков, предотвращая их обратное движение [23]. Кроме того, в основе механизма удерживания в мембране может лежать сниженная дыхательная активность митохондрий, в которых проходит стероидогенез [100]. В результате низкое содержание АТФ в матриксе должно приводить к уменьшению активности mtHsp70 по протаскиванию белка в матрикс митохондрий.

В целом полученные данные указывают на то, что встраивание цитохрома CYP11A1 в природной системе происходит котранслокационно, то есть в процессе переноса его полипептидной цепи через мембрану.

Одной из задач данной работы был также выбор гибридного белка, активного в реакции отщепления боковой цепи холестерина, для создания штаммов микроорганизмов способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов.

В рамках решения данной задачи была проведена проверка возможности функционального сопряжения цитохрома CYP11A1 млекопитающих в составе гибридных белков с вероятными редокс-партнерами дрожжей штамма S. cerevisiae 2805 (гомологом адренодоксина млекопитающих - ферредоксином Yahl [123], и гомологом адренодоксинредуктазы — бел оком Arhlp [124]), которая показала, что электронно-транспортная цепь дрожжевых митохондрий не может поддерживать функционирование CYP11A1. Соответственно, при создании дрожжевых трансгенных штаммов в них также должны быть экспрессированы белки-партнеры цитохрома - Ad и AdR. Основным критерием при выборе гибридных белков для создания трансгенного штамма была высокая ферментативная активность. Кроме того, гибридные белки не должны быть агрегированы, поскольку штаммы в этом случае могут быть не устойчивы в течение продолжительного времени культвирования. Так, ранее в нашей лаборатории [95], было показано, что экспрессия гибридного белка CoxIV(l-25)-mCYPllAl в дрожжах приводит к инактивации дыхательной цепи митохондрий (скорость клеточного дыхания снижается на 30-40%). Высокую активность имеет зрелый белок mCYPllAl, экспрессированный в клетках дрожжей, однако его локализация в митохондриях не ясна, и можно предполагать, что определенная часть белковых молекул агрегирована в матриксе. Кроме того, по имеющимся данным, mCYPllAl при экспрессии в дрожжах обнаруживается не только в митохондриях, но и в цитоплазматической мембране и мембранах ЭПР [125], что также может оказывать неблагоприятное воздействие на жизнеспособность клеток. Таким образом, для создания штамма трансгенных дрожжей способных осуществлять первую стадию синтеза стероидных гормонов наиболее перспективными представляются гибридные белки AAC-mCYPllAl и Bcsl(l -83)-mCYPllAl.

1. М. Bohnert, N. Pfanner, М. van der Laan, A dynamic machinery for import of mitochondrial precursor proteins, FEBS Lett 581 (2007) 2802-2810.

2. N. Bolender, A. Sickmann, R. Wagner, C. Meisinger, N. Pfanner, Multiple pathways for sorting mitochondrial precursor proteins, EMBO Rep 9 (2008) 4249.

3. C. Sirrenberg, M.F. Bauer, B. Guiard, W. Neupert, M. Brunner, Import of carrier proteins into the mitochondrial inner membrane mediated by Tim22, Nature 384 (1996) 582-585.

4. M. van der Laan, M. Rissier, P. Rehling, Mitochondrial preprotein translocases as dynamic molecular machines, FEMS Yeast Res 6 (2006) 849-861.

5. N. Pfanner, N. Wiedemann, Mitochondrial protein import: two membranes, three translocases, Curr Opin Cell Biol 14 (2002) 400-411.

6. P. Rehling, K. Brandner, N. Pfanner, Mitochondrial import and the twin-pore translocase, Nat Rev Mol Cell Biol 5 (2004) 519-530.

7. N. Pfanner, N. Wiedemann, C. Meisinger, T. Lithgow, Assembling the mitochondrial outer membrane, Nat Struct Mol Biol 11 (2004) 1044-1048.

8. P. Rehling, N. Pfanner, C. Meisinger, Insertion of hydrophobic membrane proteins into the inner mitochondrial membrane—a guided tour, J Mol Biol 326 (2003) 639-657.

9. W. Neupert, J.M. Herrmann, Translocation of proteins into mitochondria, Annu Rev Biochem 76 (2007) 723-749.

10. Y. Abe, Т. Shodai, Т. Muto, К. Mihara, H. Torii, S. Nishikawa, T. Endo, D. Kohda, Structural basis of presequence recognition by the mitochondrial protein import receptor Tom20, Cell 100 (2000) 551-560.

11. N. Pfanner, A. Chacinska, The mitochondrial import machinery: preprotcin-conducting channels with binding sites for presequences. Biochim Biophys Acta 1592 (2002) 15-24.

12. K. Ilill, K. Model, M.T. Ryan, K. Dietmeier, F. Martin, R. Wagner, N. Pfanner, Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins see comment., Nature 395 (1998) 516-521.

13. N. Wiedemann, N. Pfanner, M.T. Ryan, The three modules of ADP/ATP carrier cooperate in receptor recruitment and translocation into mitochondria, EMBO J 20 (2001)951-960.

14. M. Kurz, H. Martin, J. Rassow, N. Pfanner, M.T. Ryan, Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Mol Biol Cell 10 (1999) 2461-2474.

15. S.J. Habib, T. Waizenegger, A. Niewienda, S.A. Paschen, W. Neupert, D. Rapaport, The N-terminal domain of Tob55 has a receptor-like function in the biogenesis of mitochondrial beta-barrel proteins, J Cell Biol 176 (2007) 77-88.

16. S.A. Paschen, W. Neupert, D. Rapaport, Biogenesis of beta-barrel membrane proteins of mitochondria, Trends Biochem Sci 30 (2005) 575-582.

17. C.T. Webb, M.A. Gorman, M. Lazarou, M.T. Ryan, J.M. Gulbis, Crystal structure of the mitochondrial chaperone TIM9.10 reveals a six-bladed alpha-propeller, Mol Cell 21 (2006) 123-133.

18. N. Mesecke, N. Terziyska, С. Kozany, F. Baumann, W. Neupert, K. Hell, J.M. Herrmann, A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import, Cell 121 (2005) 1059-1069.

19. M. Rissler, N. Wiedemann, S. Pfannschmidt, K. Gabriel, B. Guiard, N. Pfanner, A. Chacinska, The essential mitochondrial protein Ervl cooperates with Mia40 in biogenesis of intermembrane space proteins, J Mol Biol 353 (2005) 485-492.

20. S.A. Paschen, U. Rothbauer, K. Kaldi, M.F. Bauer, W. Neupert, M. Brunncr, The role of the TIM8-13 complex in the import of Tim23 into mitochondria, EMBO J 19(2000) 6392-6400.

21. N. Pfanner. A. Geissler, Versatility of the mitochondrial protein import machinery, Nat Rev Mol Cell Biol 2 (2001) 339-349.

22. F. Мою, C. Sirrenberg, H.C. Schneider, W. Neupert, M. Brunner, The TIM17.23 preprotein translocase of mitochondria: composition and function in protein transport into the matrix, EMBO J 18 (1999) 3667-3675.

23. M.F. Bauer, C. Sirrenberg, W. Neupert, M. Brunner, Role of Tim23 as voltage sensor and presequence rcceptor in protein import into mitochondria, Cell 87 (1996) 33-41.

24. M. Meinecke, R. Wagner, P. Kovermann, B. Guiard. D.U. Mick, D.P. Hutu, W. Voos, K.N. Truscott, A. Chacinska, N. Pfanner, P. Rehling, Tim50 maintains thepermeability barrier of the mitochondrial inner membrane, Science 312 (2006) 1523-1526.

25. M. van der Laan, N. Wiedemann, D.U. Mick, B. Guiard, P. Rehling, N. Pfanner. Л role for Tim21 in membrane-potential-dependent preprotein sorting in mitochondria, CurrBiol 16 (2006) 2271-2276.

26. C. Voisine, E.A. Craig, N. Zufall, O. von Ahsen, N. Pfanner, W. Voos, The protein import motor of mitochondria: unfolding and trapping of preproteins are distinct and separable functions of matrix Hsp70, Cell 97 (1999) 565-574.

27. P.D. D'Silva, B. Schilke, W. Walter, A. Andrew, E.A. Craig, J protein cochaperone of the mitochondrial inner membrane required for protein import into the mitochondrial matrix, Proc Natl Acad Sci U S A 100 (2003) 1383913844.

28. P.R. D'Silva, B. Schilke, W. Walter, E.A. Craig, Role of Paml6's degenerate J domain in protein import across the mitochondrial inner membrane, Proc Natl Acad Sci U S A 102 (2005) 12419-12424.

29. E.E. Rojo, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, Sorting of D-lactate dehydrogenase to the inner membrane of mitochondria. Analysis of topogcnic signal and energetic requirements, J Biol Chem 273 (1998) 8040-8047.

30. J.M. Herrmann. W. Neupert, R.A. Stuart, Insertion into the mitochondrial inner membrane of a polytopic protein, the nuclear-encoded Oxalp, EMBO J 16 (1997) 2217-2226.

31. E.E. Rojo, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, N-terminal tail export from the mitochondrial matrix. Adherence to the prokaryotic "positive-inside" rule of membrane protein topology, J Biol Chem 274 (1999) 19617-19622.

32. A.B. Taylor, B.S. Smith, S. Kitada, K. Kojima, H. Miyaura, Z. Otwinowski, A. Ito, J. Deisenhofer, Crystal structures of mitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences, Structure 9 (2001)615-625.

33. Y. Gavel, G. von Heijne, Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides, Protein Eng 4 (1990) 33-37.

34. J. Martin, K. Mahlke, N. Pfanner, Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import. Delta psi drives the movement of presequences, J Biol Chem 266 (1991) 18051-18057.

35. C.M. Lec. J. Sedman, W. Neupert, R.A. Stuart, The DNA helicase, Hmilp, is transported into mitochondria by a C-terminal cleavable targeting signal, J Biol Chem 274 (1999) 20937-20942.

36. B.S. Glick, A. Brandt, K. Cunningham, S. Muller, R.L. Hallberg, G. Schatz, Cytochromes cl and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism, Cell 69 (1992) 809-822.

37. K. Hahne, V. Haucke, L. Ramage, G. Schatz, Incomplete arrest in the outer membrane sorts NADH-cytochrome b5 reductase to two different submitochondrial compartments, Cell 79 (1994) 829-839.

38. C. Knox, E. Sass, W. Neupert, O. Pines, Import into mitochondria, folding and retrograde movement of fumarase in yeast, J Biol Chem 273 (1998) 25587-25593.

39. О. Hechter, G. Pincus, Genesis of the adrenocortical secretion, Physiol Rev 34 (1954)459-496.

40. A.V. Grinberg, F. Hannemann, B. Schiffler, J. Muller, U. Heinemann, R. Bernhardt, Adrenodoxin: structure, stability, and electron transfer properties, Proteins 40 (2000) 590-612.

41. D. Werck-Reichhart, R. Feyereisen, Cytochromes P450: a success story. Genome Biol 1 (2000) REV1EWS3003.

42. M. Newcomb, P.H. Toy, Hypersensitive radical probes and the mechanisms of cytochrome P450-catalyzed hydroxylation reactions, Acc Chem Res 33 (2000) 449-455.

43. T. Omura, R. Sato, The Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes. I. Evidence for Its Hemoprotein Nature, J Biol Chem 239 (1964) 2370-2378.

44. I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A.M. Stock, S.A. Maves, D.E. Benson. R.M. Sweet, D. Ringe, G.A. Petsko, S.G. Sligar, The catalytic pathway of cytochrome p450cam at atomic resolution, Science 287 (2000) 1615-1622.

45. A. Di Cerbo, A. Biason-Lauber, M. Savino, M.R. Piemontese, A. Di Giorgio, M. Perona, A. Savoia, Combined 17alpha-Hydroxylase/17,20-lyase deficiency caused by Phe93Cys mutation in the CYP17 gene, J Clin Endocrinol Metab 87 (2002) 898-905.

46. T. Omura, A. Ito, Biosynthesis and intracellular sorting of mitochondrial forms of cytochrome P450, Methods Enzymol 206 (1991) 75-81.

47. P.F. Churchill, Т. Kimura, Topological studies of cytochromes P-450scc and P-45011 beta in bovine adrenocortical inner mitochondrial membranes. Effects of controlled tryptic digestion, J Biol Chem 254 (1979) 10443-10448.

48. J.J. Huang, Т. Kimura, Studies on adrenal steroid hydroxylases. Oxidation-reduction properties of adrenal iron-sulfur protein (adrenodoxin), Biochemistry 12 (1973) 406-409.

49. W.J. Ou, A. Ito, K. Morohashi, Y. Fujii-Kuriyama, T. Omura, Processing-independent in vitro translocation of cytochrome P-450(SCC) precursor across mitochondrial membranes, J Biochem 100 (1986) 1287-1296.

50. H. Blum, J.S. Leigh, J.C. Salerno, T. Ohnishi, The orientation of bovine adrenal cortex cytochrome P-450 in submitochondrial particle multilayers, Arch Biochem Biophys 187(1978) 153-157.

51. H. Kamin, C. Batie, J.D. Lambeth, J. Lancaster, L. Graham, J.C. Salerno, Paramagnetic probes of multicomponent electron-transfer systems, Biochem Soc Trans 13 (1985)615-618.

52. S.A. Usanov, A.A. Chernogolov, V.L. Chashchin. Is cytochrome P-450scc a transmembrane protein?, FEBS Lett 275 (1990) 33-35.

53. M.J. Headlam, M.C. Wilce, R.C. Tuckey, The F-G loop region of cytochrome P450scc (CYP11A1) interacts with the phospholipid membrane, Biochim Biophys Acta 1617 (2003) 96-108.

54. D. Schwarz, V. Kruger, A.A. Chernogolov, S.A. Usanov, A. Stier, Rotation of cytochrome P450SCC (CYP11A1) in proteoliposomes studied by delayed fluorescence depolarization, Biochem Biophys Res Commun 195 (1993) 889-896.

55. D. Schwarz, W. Richter, V. Kruger, A. Chernogolov, S. Usanov, A. Stier, Direct visualization of a cardiolipin-dependent cytochrome P450scc-induced vesicle aggregation, J Struct Biol 113 (1994) 207-215.

56. R.C. Tuckey, H. Kamin, Kinetics of the incorporation of adrenal cytochrome P-450scc into phosphatidylcholine vesicles, J Biol Chem 257 (1982) 2887-2893.

57. D.W. Seybert, J.R. Lancaster, Jr., J.D. Lambeth, H. Kamin, Participation of the membrane in the side chain cleavage of cholesterol. Reconstitution of cytochrome P-450scc into phospholipid vesicles, J Biol Chem 254 (1979) 12088-12098.

58. J.D. Lambeth, D.W. Seybert, H. Kamin, Phospholipid vesicle-reconstituted cytochrome P-450SCC. Mutually facilitated binding of cholesterol and adrenodoxin, J Biol Chem 255 (1980) 138-143.

59. D. Schwarz, P. Kisselev, W. Pfeil, S. Pisch, U. Bornscheuer, R.D. Schmid, Evidence that nonbilayer phase propensity of the membrane is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450SCC, Biochemistry 36 (1997) 14262-14270.

60. К. Kusano, М. Sakaguchi, N. Kagavva, M.R. Waterman, T. Omura, Microsomal p450s use specific proline-rich sequences for efficient folding, but not for maintenance of the folded structure, J Biochem 129 (2001) 259-269.

61. K. Kusano, N. Kagawa, M. Sakaguchi, T. Omura, M.R. Waterman, Importance of a proline-rich sequence in the amino-terminal region for correct folding of mitochondrial and soluble microbial p450s, J Biochem 129 (2001) 271-277.

62. K.H. Storbeck, P. Swart, A.C. Swart, Cytochrome P450 side-chain cleavage: insights gained from homology modeling, Mol Cell Endocrinol 265-266 (2007) 65-70.

63. I.A. Pikuleva, Putative F-G loop is involved in association with the membrane in P450scc (P450 11A1), Mol Cell Endocrinol 215 (2004) 161-164.

64. V. Sivozhelezov, C. Nicolini, Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor, J Theor Biol 234 (2005) 479-485.

65. K.H. Storbeck, P. Swart, S. Graham, A.C. Swart, The influence of the amino acid substitution I98K on the catalytic activity of baboon cytochrome P450 side-chain cleavage (CYP11A1), Endocr Res 30 (2004) 761-767.

66. S.E. Graham, J.A. Peterson, How similar are P450s and what can their differences teach us?, Arch Biochem Biophys 369 (1999) 24-29.

67. P.A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E.F. Johnson, D.E. McRee, Mammalian microsomal cytochrome P450 mono oxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity, Mol Cell 5 (2000) 121-131.

68. N.V. Strushkevich, T.N. Azeva, G.I. Lepesheva, S.A. Usanov, Role of positively charged residues lys267, lys270, and arg411 of cytochrome p450scc (CYP11A1) in interaction with adrenodoxin, Biochemistry (Mosc) 70 (2005) 664-671.

69. M. Tsujita, Y. Ichikawa, Substrate-binding region of cytochrome P-450SCC (P-450 XIA1). Identification and primary structure of the cholesterol binding region in cytochrome P-450SCC, Biochim Biophys Acta 1161 (1993) 124-130.

70. D.F. Lewis, P. Lee-Robichaud, Molecular modelling of steroidogenic cytochromes P450 from families CYP11, CYP17, CYP19 and CYP21 based on the CYP102 crystal structure, J Steroid Biochem Mol Biol 66 (1998) 217-233.

71. S. Graham-Lorence, J.A. Peterson, P450s: structural similarities and functional differences, FASEB J 10 (1996) 206-214.

72. E.F. Johnson, The 2002 Bernard B. Brodie Award lecture: deciphering substrate recognition by drug-metabolizing cytochromes P450, Drug Metab Dispos 31 (2003) 1532-1540.

73. S.T. Woods, J. Sadleir, T. Downs, T. Triantopoulos, M.J. Headlam, R.C. Tuckey, Expression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462, Arch Biochem Biophys 353 (1998) 109-115.

74. S. Nagano, T.L. Poulos, Crystallographic study on the dioxygen complex of wild-type and mutant cytochrome P450cam. Implications for the dioxygen activation mechanism, J Biol Chem 280 (2005) 31659-31663.

75. M.F. Matocha, M.R. Waterman, Discriminator}' processing of the precursor forms of cytochrome P-450scc and adrenodoxin by adrenocortical and heart mitochondria, J Biol Chem 259 (1984) 8672-8678.

76. V.N. Luzikov, L.A. Novikova, J. Whelan, M. Hugosson, E. Glaser, Import of the mammalian cytochrome P450 (see) precursor into plant mitochondria, Biochem Biophys Res Commun 199 (1994) 33-36.

77. A.S. Savelev, L.A. Novikova, V.L. Drutsa, L.V. Isaeva, A.A. Chernogolov, S.A. Usanov, V.N. Luzikov, Synthesis and some aspects of topogenesis of bovine cytochrome P450scc in yeast, Biochemistry (Mosc) 62 (1997) 779-786.

78. E.E. Rojo, R.A. Stuart, W. Neupert, Conservative sorting of FO-ATPase subunit 9: export from matrix requires delta pH across inner membrane and matrix ATP. EMBO J 14 (1995) 3445-3451.

79. I.E. Kovaleva, L.A. Novikova, P.A. Nazarov, S.I. Grivennikov, V.N. Luzikov, Effects of various N-terminal addressing signals on sorting and folding of mammalian CYP11A1 in yeast mitochondria, Eur J Biochem 270 (2003) 222229.

80. G. Cauet, D. Balbuena, T. Achstetter, B. Dumas, CYP11A1 stimulates the hydroxylase activity of CYP11B1 in mitochondria of recombinant yeast in vivo and in vitro, Eur J Biochem 268 (2001) 4054-4062.

81. N.R. Orme-Johnson, Distinctive properties of adrenal cortex mitochondria, Biochim Biophys Acta 1020 (1990) 213-231.

82. E. Amann. B. Ochs, K.J. Abel, Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli, Gene 69 (1988) 301-315.

83. C. Cullin, D. Pompon, Synthesis of functional mouse cytochromes P-450 PI and chimeric P-450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Gene 65 (1988) 203217.

84. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, Мир. Москва 1984.

85. Д. Гловер, Клонирование ДНК, Мир, Москва 1988.

86. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. , Наука, Новосибирск 1990.

87. Н.С. Birnboim, J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res 7 (1979) 1513-1523.

88. A. Wada, P.A. Mathew, H.J. Barnes, D. Sanders, R.W. Estabrook, M.R. Waterman, Expression of functional bovine cholesterol side chain cleavagecytochrome P450 (P450scc) in Escherichia coli, Arch Biochem Biophys 290 (1991)376-380.

89. P.A. Nazarov, V.L. Drutsa, W.L. Miller, V.M. Shkumatov, V.N. Luzikov, L.A. Novikova, Formation and functioning of fused cholesterol side-chain cleavage enzymes, DNA Cell Biol 22 (2003) 243-252.

90. A.A. Vinogradova, V.N. Luzikov, L.A. Novikova, Comparative study of topogenesis of cytochrome P450scc (CYP11A1) and its hybrids with adrenodoxin expressed in Escherichia coli cells, Biochemistry (Mosc) 72 (2007) 208-214.

91. M. Akiyoshi-Shibata, T. Sakaki, Y. Yabusaki, H. Murakami, H. Ohkawa, Expression of bovine adrenodoxin and NADPH-adrenodoxin reductase cDNAs in Saccharomyces cerevisiae, DNA Cell Biol 10 (1991) 613-621.

92. G. Daum, P.C. Bohni, G. Schatz, Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome с peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria, J Biol Chem 257 (1982) 13028-13033.

93. O.H. Lowry, N.T. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall, Protein measurement with the Folin phenol reagent, J Biol Chem 193 (1951) 265-275.

94. U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

95. H. Towbin, T. Staehclin, J. Gordon, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A 76 (1979) 4350-4354.

96. A.N. Minenko, V.N. Luzikov, I.E. Kovaleva, Use of the Addressing Sequence of Yeast D-Lactate Dehydrogenase for Insertion of CYPllAlp into the Inner Membrane of Yeast Mitochondria, Biochemistry (Mosc) 71 (2006) 32-38.

97. H. Folsch, B. Guiard, W. Neupert, R.A. Stuart, Internal targeting signal of the BCS1 protein: a novel mechanism of import into mitochondria, EMBO J 15 (1996) 479-487.

98. T. Kumamoto, A. Ito, T. Omura, Characterization of a mitochondrial matrix protease catalyzing the processing of adrenodoxin precursor, J Biochem 100 (1986) 247-254.

99. N.J. Hoogenraad, L.A. Ward, M.T. Ryan, Import and assembly of proteins into mitochondria of mammalian cells, Biochim Biophys Acta 1592 (2002) 97-105.

100. M.H. Barros, F.G. Nobrega, YAH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to human adrenodoxin, Gene 233 (1999) 197-203.

101. T. Lacour, T. Achstetter, B. Dumas, Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p4501 lbeta monooxygenase system, J Biol Chem 273 (1998) 23984-23992.

102. С. Duport, В. Schoepp, Е. Chatelain, R. Spagnoli, В. Dumas, D. Pompon, Critical role of the plasma membrane for expression of mammalian mitochondrial side chain cleavage activity in yeast, Eur J Biochem 270 (2003) 1502-1514.

103. S.A. Usanov, A.A. Chernogolov, V.L. Chashchin, Immunochemical study of cholesterol-hydroxylating cytochrome P-450. Topology of the peptide chain of the heme protein in the phospholipid membrane., Biokhimiia 54 (1989) 916-925.

104. H.A. Dailey, Terminal steps of haem biosynthesis, Biochem Soc Trans 30 (2002) 590-595.