Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Гладких Ирина Николаевна

Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Кай'шпЛт тасгоЛаМуки

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2008

003171959

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель'

доктор химических наук, старший научный сотрудник Козловская Э.П.

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор,

старший научный сотрудник Соловьева Т.Ф. доктор биологических наук, старший научный сотрудник Пивненко Т II.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии РАН им акад М М Шемякина и Ю А Овчинникова, г Москва

Защита состоится « 2 » июля 2008 г в часов на заседании диссертационного совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г Владивосток, проспект 100-летия Владивостока 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232) 314-050, e-mail science@piboc dvo ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г Владивосток, проспект 100-летня Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН) Текст автореферата размещен на сайте совета http //piboc dvo ru

Автореферат разослан « ЬО » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, старший научный сотрудник

Авилов С А

Актуальность проблемы. Поиск биологически активных природных соединений, специфически взаимодействующих с протеолитическими ферментами и регулирующих их активность, изучение взаимосвязи между их структурой и функцией является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии, так как протеолитические ферменты и процессы протеолиза играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов Известно, что одним из основных способов регуляции действия ферментов является ингибирование их активности В связи с этим, исследование структурно-функциональных особенностей, специфичности и механизма действия ингибиторов протеиназ является фундаментальной задачей, выясняющей молекулярные основы белок-белковых взаимодействий Решение этой задачи может служить основой для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов

К настоящему времени накоплен огромный массив информации о структуре и функциональной активности ингибиторов сериновых протеиназ растительного и животного происхождения В то же время ингибиторам протеиназ морских организмов, в частности, ядовитых кишечнополостных, актиний, посвящено несравнимо меньшее количество публикаций Уже более двадцати лет известно, что в организме-продуценте ингибиторы протеиназ присутствуют совместно с нейро- и цитотоксинами, выполняющими алломональную роль, но до сих пор отсутствует убедительное объяснение этого феномена Это требует расширения знаний как о структуре и механизме действия ингибиторов, так и об их экологической роли в морском биоценозе

Актуальность поиска и установления структуры новых представителей ингибиторов протеиназ актиний связана с обнаружением у ряда представителей этой группы полипептидов новых биологических функций Так установлено, что некоторые ингибиторы протеиназ актиний способны блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, взаимодействовать с ваниллоидным рецептором ТОРУ!, проявлять антигистаминную активность, что свидетельствует об их полифункциональности

Выделение новых ингибиторов из актиний, изучение их структурной организации и механизма действия с помощью современных биохимических, биофизических, молекулярно-биологических, а также методов компьютерного моделирования, позволит понять причины их структурно-функционального многообразия

Цель и задачи исследования. Настоящая работа представляет собой часть исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структурно-функциональных взаимосвязей биологически активных полипептидов морских беспозвоночных Основной целью диссертационной работы являлось выделение, исследование физико-химических характеристик и структурно-функциональных особенностей ингибиторов протеиназ тропической актинии ЯаЖамИиз тасгос/ас1у11и Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи 1) выделить и охарактеризовать ингибиторы из актинии Я тасгос1ас1у1ш, 2) установить аминокислотные последовательности

ингибиторов, 3) изучить пространственную организацию полипептидов, 4) исследовать специфичность ингибиторов, 5) изучить биологическую активность полипептидов Положения, выносимые па защиту

1 Ингибиторы протеиназ InhVJ, Rmln I, Rmln II, выделенные из актинии R macrodactylus, по физико-химическим свойствам относятся к ингибиторам протеиназ семейства Кунитца

2 Аминокислотная последовательность InhVJ имеет высокую степень гомологии с аминокислотными последовательностями ингибиторов не только из кишечнополостных, но также из пресмыкающихся и млекопитающих

3 Ингибитор InhVJ имеет упорядоченную вторичную, жесткую третичную структуру и относится к полипептидам со смешанной a+ß структурой

4 Ингибиторы InhVJ, Rmln I, Rmln II являются высокоспецифичными по отношению к двум сериновым протеиназам и образуют с ними стабильные комплексы

5 Ингибиторы Rmln I, Rmln II проявляют антигистаминную активность, а InhVJ, вероятно, блокирует работу потенциал-зависимого калиевого канала Выделенные полипептиды, таким образом, могут быть отнесены к полифункциональным ингибиторам протеиназ

Научная новизна и практическая иенность работы Выделено три новых ингибитора сериновых протеиназ семейства Кунитца из актинии R macrodactylus Определены аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов ингибиторов Rmln I и Rmln II и полная аминокислотная последовательность InhVJ

Установлено, что выделенные ингибиторы являются высокоспецифичными Впервые определены кинетические и термодинамические характеристики комплексов ингибиторов с трипсином и a-химотрипсином и сделаны выводы об их устойчивости Показано, что Rmln I и Rmln II проявляют антигистаминную активность

В настоящей работе впервые с использованием методов сравнительного моделирования определены сайты связывания InhVJ с трипсином и а-химотрипсином Показано, что ингибитор взаимодействует с активным центром протеиназ по стандартному механизму, а устойчивость комплексов зависит от количества и типа стабилизирующих связей Предсказана возможность взаимодействия ингибитора с потенциал-зависимым калиевым каналом, определены вероятные сайты связывания и сделано предположение о полифункциональности исследуемых полипептидов

Таким образом, выяснение механизма действия ингибиторов необходимо для более глубокого понимания целого ряда процессов, протекающих при участии этих полипептидов in vivo Полученные результаты вносят вклад в исследование структурно-функциональных взаимосвязей ингибиторов протеиназ актиний и являются основой для создания нового поколения лекарственных препаратов направленного действия

Апробация работы. Материалы работы были представлены на XI International Symposium on Manne Natural Products, Sorrento, Italy, 2004, Региональной научной

конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2006, III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007

Публикации По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисов докладов Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 43 рисунка Список литературы включает 197 цитируемых работ

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д х н Козловской ЭП За помощь в проведении отдельных разделов работы автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН д х н Монастырную ММ, к х н Ильину А П , к х н Лейченко Е В , к ф-м н Зелепуга Е А, к х н Вакорину Т И , к ф-м н Лихацкую Г Н, мне Анастюка С Д, мне Черникова О В , а также сотрудников Института биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН, г Москва к х н Гнеденко О В , к х н Мольнара А А и д б н Иванова А С

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение и некоторые физико-химические свойства ингибиторов из актинии Radiaitthus macrodactylus

Ранее из актинии R macrodactylus были выделены и частично охарактеризованы ингибиторы трипсина Jn-IV, In-2B, In-4B, In-5B с молекулярными массами 6170, 13500, 14100 и 14800 Да соответственно Для Jn-IV была установлена полная аминокислотная последовательность В данной работе продолжено изучение структуры и функции ингибиторов протеиназ из R macrodactylus

Для выделения ингибиторов были использованы водный и водно-этанольный экстракты актинии, так как трипсинингибирующая активность обнаружена в обоих экстрактах Первая схема выделения включала гидрофобную хроматографию полипептидов из водно-этанольного экстракта R maaodactylus на полихроме-1, гель-фильтрационную хроматографию на колонке с Biogel Р-4, ионообменную хроматографию на колонке с SP-Sephadex G-25 и обращенно-фазовую ВЭЖХ на колонке Nucleosil Си Вторая схема выделения состояла из гидрофобной хроматографии полипептидов, содержащихся в водном экстракте актинии, гель-фильтрационной хроматографии и рехроматографии на колонке Superdex™ Peptide 10/30 и обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosil C|g

Применение гидрофобного сорбента полихрома-1 при выделении ингибиторов протеиназ по обеим схемам позволило уже на первой стадии очистки избавиться от липидов, пигментов, солей, а также от высокомолекулярных белков - цитолизинов (по второй схеме), присутствующих в актиниях в значительных количествах и эффективно элюируемых водой В результате разделения полипепгидов водно-этанольного и водного экстрактов актинии на колонке с полихромом-1 были получены фракции полипептидов, обладавшие трипсинингибирующей активностью, элюцию которых осуществляли 20 и 40% этанолом

После упаривания этанола, лиофилизации и растворения в воде эти фракции были использованы для дальнейшего разделения

В результате разделения полипептидов по первой схеме в ходе обращенно-фазовой ВЭЖХ и последующей рехроматографии (рис 1) выделен ингибитор, обозначенный как 1пЬ\0 В результате разделения полипептидов по второй схеме в ходе последней стадии ВЭЖХ были выделены два полипептида, названные 11т1п 1,1Ъп1п II (рис 2)

S к

Я1000 ti

§ 800'

и ff

8 600 у

О 400.

о

Ь!

К 200

3

iL

70

Я 2500'

".2000. @

g

о 1000' и

§ 500*

„40 30 Время мин

60

InhVJ

S

-и-

60 ff* Z

СО

X

о

40 J0 Время мин.

(S0

Рис. 1. (а) ВЭЖХ фракций, полученных после ионообменной хроматографии, на колонке Мис1ео811 С)в (4,6x250 мм) Элюция в градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 60% в 0,1% трифторуксусной кислоте (рН 2,2) в течение 60 минут Скорость элюции - 0,5 мл/мин (б) Рехроматография фракций, соответствующих первому пику, (рис 1а) в тех же условиях

100 Рис 2 ВЭЖХ фракций,

полученных после гель-

фильтрационной рехроматографии, на колонке Мис1ео811 С18 (4,6x250 мм) Элюция в градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 60% в 0,1% 50 Чч трифторуксусной кислоте (рН 2,2) со и скоростью 1 мл/мин в течение 60 минут Отмечены границы объединения активных фракций

10 20 Время, шш.

Гомогенность выделенных полипептидов была доказана комбинацией различных методов ДСН-ПААГ-электрофореза, N-концевого аминокислотного анализа, масс-спектрометрического анализа Для всех трех ингибиторов N-концевым аминокислотным остатком является Gly Согласно данным MALDI TOF MS молекулярные массы ингибиторов InhVJ, Rmln I и Rmln II составляют 6106±2, 6201,6±100 и 6086,5±100 Да соответственно Аминокислотный состав и молекулярные массы выделенных полипептидов и полипептидов из других видов актиний достаточно близки (табл 1) Подобно ингибиторам трипсина из актиний Апетома sulcata, Sttchodactyla helianthus и Anthopleura äff xanthogrammica,

ингибиторы из актинии Я тасго(1ас1у1и5 содержат шесть остатков цистеина, которые, вероятно, образуют три внутримолекулярные дисульфидные связи, и не имеют остатков метионина и триптофана (табл 1)

Наличие такого количества ингибиторов протеиназ у одного вида актинии не удивительно, так как известно из литературных источников, что эти полипептиды существуют в виде изоформ с очень близкими физико-химическими характеристиками

Таблица 1.

Аминокислотный (АК) состав ингибиторов актинии Я тасгос!ас1у!из

А

АК Я тасгос]ас1у1ш Б ИекамИиз 1и1са1а хап/Ио-

Кгатттса

1пЬУ1 Кш1п I ЯшЬН Ь-1У ЭИРИ БНР1-2 БА5 II АХР1-1

Абх 4 4 3 3 4 4 5 9

ТЬг 3 4 3 3 3 3 3 1

Бег 3 4 3 3 3 2 3 2

вЬс 4 4 6 4 4 3 2 3

Рго 5 6 7 4 3 3 4 4

Оу 7 8 6 6 8 8 5 5

А1а 5 4 3 4 2 2 2 6

1/2Сув 6 6 6 6 6 6 6 6

Уа1 1 3 3 3 1 1 2 3

Мй 0 0 0 0 0 0 2 0

Не 3 2 2 3 3 2 3 0

Ьеи 2 2 2 2 1 2 4 2

Туг 2 2 3 4 3 3 2 3

РЬе 5 3 3 4 5 6 0 3

Ьув 3 4 2 3 4 4 2 6

Ню 1 1 1 1 1 1 1 2

А^ 3 3 3 3 4 5 2 2

Тгр 0 0 0 0 0 0 0 0

Число а о 57 60 56 56 55 55 48 57

М Да* 6128,0 6322,8 6096,0 6170,2 6116,5 6204,2 5132,9 6240,5

М Да» 610б±2 6201,6±100 6086,5±100

Приведены средние значения, полученные из двух экспериментов гидролиза в течение 24 ч (результаты гидролиза в течение 48- и 72 ч аналогичны) * Молекулярная масса, рассчитанная исходя из аминокислотного состава, ** молекулярная масса по данным МА1Л51 ТОР МБ

2. Установление №концевой аминокислотной последовательности ингибиторов 11т1п I и Кш1п II

Установление аминокислотных последовательностей выделенных в настоящей работе полипептидов проводилось методами структурной белковой химии Для определения Ы-концевых аминокислотных последовательностей ингибиторов Шп1п I и Ят1п II было проведено восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом и алкилирование образовавшихся сульфгидрильных групп 4-винилпиридином Модифицированные ингибиторы были выделены из реакционной смеси с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке МиЫеоБЙ С^ ¡Ч-концевая аминокислотная последовательность ингибиторов ]1т1п I и Ят1п II (СГСЗЕРГУУОРСКАО- и ОБТСЬЕРЮ/УОРСКА- соответственно) была

установлена методом Эдмана на автоматическом аминокислотном секвенаторе При сравнении с аналогичными фрагментами последовательностей ингибиторов из других видов актиний выявлен высокий процент их гомологии (до 93%)

3. Установление полной аминокислотной последовательности ингибитора InhVJ

Для восстановления и защиты сульфгидрильных групп ингибитор 1пЬ\ЛГ был обработан дитиотреитолом и 4-винилпиридином В результате разделения реакционной смеси с помощью ВЭЖХ были получены четыре фракции с молекулярными массами 6537, 6639, 6647 и 6736 Да (МА1ЛЭ1 ЮТ МЭ), что свидетельствовало о восстановлении дисульфидных связей на 67, 83, 90 и 100% соответственно Фракция, соответствующая восстановлению всех дисульфидных связей была использована для трипсинолиза

Для получения отдельных фрагментов алкилированный 1пЬ\Л1, содержащий согласно данным аминокислотного анализа по три остатка лизина и аргинина, был обработан трипсином Масс-спектрометрический анализ реакционной смеси выявил наличие фрагментов с молекулярными массами 571, 637, 951, 1093, 1314, 2265 и 2818 Да В результате разделения продуктов гидролиза с помощью обращенно-фазовой хроматографии было выделено 7 триптических пептидов (Т1-7) (рис 3)

! 1500

1000'

300-

Т-3 Т-3

Т-1 Т-й

Т-4

L

23

ÜL

Т-7

зо Ti ЛГ Номер фракции

Рис. 3. Разделение гидролизата 1пЬ\М трипсином с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке №1с1ео511 С18 (4,6x250 мм) Элюция в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% в 0,1% трифторуксусной кислоте (рН 2,2) со скоростью 0,5 мл/мин в течение 125 минут

123

Для каждого пептида были установлены молекулярные массы (MALDI TOF MS) и аминокислотные последовательности методом Эдмана на автоматическом аминокислотном секвенаторе (табл 2)

В результате секвенирования было обнаружено у InhVJ всего два остатка Lys, а не три, как определено методом аминокислотного анализа Образование пептидов Т-4 и Т-5 связано, вероятно, с наличием незначительной примеси химотрипсина в препарате трипсина, использованном для реакции Очевидно, это привело к расщеплению связи в молекуле ингибитора между остатками Phe и Не и образованию дополнительных пептидов, что позволило получить перекрывающиеся последовательности пептидов Т4, Т5 и Т7 В

результате ееквенпровання этих пептидов была установлена последовательность С-концевого фрагмента молекулы ингибитора 1пЬ\^

Таблица. 2.

Аминокислотные последовательности триптических пептидов ингибитора 1пЬ\М

Пептид Аминокислотная последовательность Молекулярная масса, Да

Т-1 GS1CLEPK 951

Т-2 WGPCTAYFPR 1314

Т-3 FYFDSETGK 1093

Т-4 CTPF 571

Т-5 IYGGCEGNGNNFETLHACR 2265

Т-6 AICRA 637

Т-7 CTPFIYGGCEGNGNNFETLHACR 2818

На основании сравнения последовательностей триптических пептидов с известной последовательностью ингибитора Jn-IV, выделенного из актинии R macrodactylus ранее, была выведена полная аминокислотная последовательность InhVJ (рис. 4) Таким образом, молекула ингибитора состоит из 56 аминокислотных остатков, а его точная молекулярная масса равна 6106 Да, что хорошо согласуется с данными масс-спектрометрического анализа

На рисунке 4 приведены полные аминокислотные последовательности ингибиторов протеиназ из различных источников Так при сравнении аминокислотных последовательностей InhVJ и Jn-IV выявлен высокий процент их гомологии (91%), причем наибольшая идентичность наблюдается в N-концевом фрагменте молекулы полипептида, в то время как в С-концевом фрагменте обнаружены замены пяти аминокислотных остатков Степень гомологии InhVJ с последовательностями ингибиторов из других видов актиний составляет от 54 до 86% Следует отметить, что ингибиторы протеиназ из актиний, принадлежащих к одному семейству, имеют более высокую степень гомологии, чем ингибиторы из актиний разных семейств Так гомология ингибиторов из актиний R macrodactylus и S hehanthus, представителей семейства Stichodactyhdae, составляет 80-90%, а ингибиторов актиний A äff xanthogrammica и A sulcata, семейства Actinndae, 67% Также обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, продуцируемых такими эволюционно далекими типами организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся (VBPI I) и млекопитающие (С BPI, БПТИ) Степень идентичности последовательностей полипептидов составляет от 37 до 50% По-видимому, в процессе эволюции структурные участки, отвечающие за ингибирующую активность данного класса соединений, практически не претерпели каких-либо существенных изменений

Строение реактивных центров (Рз-Р2-Р|-Р'|-Р'2-Р'з) большинства ингибиторов протеиназ актиний схоже со строением реактивного центра бычьего панкреатического ингибитора трипсина (БПТИ), представителя ингибиторов семейства Кунитца в положении Pi располагаются функционально важные для активности положительно заряженные остатки Lys/Arg (рис 4) Таким образом, полипептиды из актиний A sulcata, S helianthus и A äff xanthogi anímica, подобно БПТИ являются специфичными по отношению к трипсину Однако

в положении Pi полипептидов InhVJ и Jn-IV из актинии R macrodactylus располагается гидрофобный остаток Thr Вероятно, сродство этих ингибиторов к химотрипсин-подобным протеиназам будет меньше по сравнению с БПТИ и ингибиторами из других актиний

Pi

InhVJ QSICLBPKWGPCTAYPPRFYFDSBTGItCTPFIYGGCBGlfGfellTFBTIiHACRAXCRA

Jn-IV GSZCLEPKWQPCTAYPPRFYPDSBTGKCTPFIYGGCBGNSYVSEKIiHACRAICRA

SHPI-1 SXCSBPKKVQRCKQYFPRFYFDSETGKCTPFIYQGCGGNGtroPBTXiHQCRAICRA

SHPI- 2 8FCLBPKRVQRCKGYFPRFYFDSKTQKCTPFIYGGCGONGKHFBTLHÛCRAICRA

SA5 II IHGDCBLPKWQPCRARFPRYYYHSSSKRCBKFIYGGCGGNAKHFHTliEBCBKVCGVRSV

AXPI-I APVNBDCLLjPKKVGPCRAAVPRFYYNSOSGKCBGFTYGQCHANANNFKTKDBCKHACH

AXPI-II ^ENSItCIiLPSDGGVCRGRFTNYYYNSRTRRCBTFRYGGCGGMANNFHTbRQCQATCYSS

VBPI I QDHPKFCYLPADPQRCKAHipRFYYDSASNKCNKFZYGGCPGHANNFKTHDBCRQTCGASA

С. BPI FQTPPDLCQLPQARGPCKAALI,RYFYNSTSNACBPFTYGacaONNBMFBTTEHCLRICBPPQQTDKS

БПТИ HPDFCLBPP YTGPCXARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSABDCHRTCGGA

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей ингибиторов протеиназ InhVJ, Jn-IV (Swiss-prot, PI6344) ингибиторы протеиназ из R macrodactylus SHPI-1, SHPI-2 ингибиторы протеиназ из S hehanthus (Swiss-prot, P31713 и P81129 соответственно) SA5 II ингибитор протеиназ из A sulcata (Swiss-prot, PI0280) AXPI-I, II ингибиторы протеиназ из A aff xanthogrammica (Swiss-prot, Р81547) VBPI I ингибитор сериновых протеиназ из яда гадюки Vípera ammodytes ammodytes (Pir, TIVITl) С BPI ингибитор трипсина из молозива коровы Bos Taurus (Swiss-prot, Р00976) БПТИ бычий панкреатический ингибитор трипсина (Swiss-prot, Р00974) Р| - аминокислотный остаток, соответствующий реактивному центру ингибитора Идентичные аминокислотные остатки отмечены серым цветом Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW

Согласно полученным физико-химическим данным, полипептиды Rmln I, Rmln II и InhVJ можно отнести к семейству Кунитца Ингибиторы этого семейства характеризуются не только наличием гомологичных аминокислотных последовательностей, но и идентичным расположением остатков цистеина и, очевидно, расположением дисульфидных связей Вероятно, представители этого семейства полипептидов ведут свое начало от общего гена-предшественника

4. Изучение пространственной организации ингибитора InhVJ

Для определения содержания элементов вторичной структуры были использованы методы оптической УФ- и КД-спекгроскопии

На рисунке 5 приведен УФ-спектр поглощения полипептида InhVJ в ближней области (230-250 нм) Он характеризуется впадиной при 250 нм и максимумом при 275 нм Светорассеяние в области 320-400 нм составляет <0,5% Отсутствие четко выраженного перегиба в спектре ингибитора InhVJ в области 290 нм, типичного для белков, содержащих остатки триптофана, подтверждает данные аминокислотного анализа об отсутствии триптофана в исследуемом полипептиде Об этом свидетельствует также тот факт, что в спектре второй производной ингибитора (спектр не приведен) не обнаружены отрицательная полоса поглощения при 290 и положительная при 295 нм, которые характерны для остатков триптофана В области 250-260 нм спектра InhVJ наблюдаются плохо разрешенные пики, соответствующие вкладу в поглощение остатков фенилаланина, обычно невидимые в спектрах белков, содержащих триптофан В спектре второй производной ингибитора

присутствуют хорошо разрешенные положительные полосы при 250, 256 и отрицательная при 258 нм, характерные для остатков фенилаланина

t

Рис 5. УФ-спектр поглощения ингибитора InhVJ в 10 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, pH 7,2

260

300

340 нм

Значения А[щ поглощения растворов определены из его УФ-спектра в 10 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, и в 6 М гуанидингидрохлориде, рН 4,0, при максимуме поглощения (X 275 нм) и равны 6,5 и 7,0 соответственно Соответствующие молярные коэффициенты поглощения равны 3970±195 и 4270±210 М'1 см'1 Количество остатков тирозина, оцененное по второй производной УФ-спектра поглощения, составляет 2 Молекулярный коэффициент поглощения, рассчитанный по вкладу двух остатков тирозина и шести остатков цистеина, хорошо согласуется с коэффициентом, определенным по УФ-спектру

На рисунке 6 А приведен спектр КД ингибитора 1пЬ\М в ближней УФ-области (230 -310 нм), области поглощения ароматических хромофоров и дисульфидных связей, который имеет четко выраженную тонкую структуру с отрицательными полосами при 282 и 275 нм, относящимися к остаткам тирозина, и при 268 и 262 нм, обусловленными остатками фенилаланина В спектре КД полипептида присутствует отрицательная полоса высокой эллиптичности при 237 нм Эллиптичность этой полосы выше эллиптичности полос, относящихся к остаткам тирозина и фенилаланина, приблизительно в пять раз Поскольку в молекуле 1пЬ\М согласно данным аминокислотного состава содержится шесть остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи, можно предположить, что данная полоса (при 237 нм) обусловлена вкладом в спектр дисульфидных связей Выраженная тонкая структура спектра КД в ближней УФ-области свидетельствует о существенной асимметрии окружения боковых групп ингибитора, остатков тирозина и фенилаланина, об их жесткой фиксации в молекуле и о высокоорганизованной третичной структуре исследуемого полипептида

Спектр КД ингибитора 1пЬ\М в далекой УФ-области (190 - 240 нм), области поглощения пептидных связей (рис 6, Б), характеризуется минимумом при 200 нм и максимумом при 193 нм В области 225-230 нм на кривой спектра наблюдается отчетливое плечо обусловленное, вероятно, вкладом поглощения дисульфидных групп

Рис 6. Спектры КД ингибитора 1пЬУ1 в 10 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2 при 25 °С (А) - Спектры КД 1пЬУ1 в ближней УФ-области Концентрация полипептида - 0,39 мг/мл, (Б) - Спектры КД 1п1)У1 в далекой УФ-области Концентрация полипептида - 0,0975 мг/мл

Расчет элементов вторичной структуры проведен с помощью пакета программ СБРго (метод Срирама и Вуди), имеющего расширенные наборы различных реперных спектров, включая спектры КД Согласно расчетным данным, молекула ингибитора содержит 14% а-спиралей (7,0 - регулярная и 7,0 - искаженная), 23% р-структуры (15,0 - регулярная и 8,0 -искаженная), 17% р-изгибов и 46% неупорядоченной структуры Таким образом, ингибитор 1п11\М относится к смешанным а/р или а + р полипептидам

5. Определение констант ингибирования

При исследовании полипептидов Ят1п I и Ит1п II было обнаружено, что они

ингибируют как трипсин, так и а-химотрипсин Константы ингибирования (К,) этих соединений по отношению к трипсину и а-химотрипсину были рассчитаны по методу Диксона Было показано, что ингибиторы сериновых протеиназ из различных видов актиний имеют достаточно близкие значения К, (табл 3)

Таблица 3

Константы ингибировання ингибиторов протеиназ из актиний

Источник Ингибитор

трипсин а-химотрипсин

R macrodactylus InhVJ 2,49 10' 2,17 10"

Rmln I 2,4 10' 2,3 108

Rmln II 2,5 10' 3,0 10 s

Jn-IV 9,6 10' не определено

A sulcata SA5II 9,610' не определено

R rhodostoma - 9,5 10 10 3,3 10"

S helianthus SHPI-1 1,1 10 10 2,3 10'

6. Определение антигистаминной активности ингибиторов Rmln I и Rmln II

Известно, что сериновые протеиназы (триптаза и химаза) участвуют в процессах, связанных с иммунным ответом и работой системы комплемента Они выделяются тучными клетками при развитии аллергических реакциях наряду с другими медиаторами, например гистамином (Peng Q et al, 2003) Вероятно, клинические проявления аллергической реакции должны ослабляться или подавляться при введении ингибиторов сериновых протенназ В лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН ранее были выделены два низкомолекулярных цитолизина из актинии R macrodactylus, которые обладали слабой токсичностью и проявляли трипсинингибирующую и антигистаминную активности (Monastyrnaya М et al, 2002) Сравнение физико-химических характеристик этих полипептидов с аналогичными характеристиками ингибиторов протеиназ Rmln I и Rmln II (молекулярная масса, аминокислотный состав, частичная N-концевая аминокислотная последовательность) выявило их сходство

При этом было показано, что Rmln I и Rmln II в концентрации от 10 до 100 мкг на 1 кг веса экспериментальных животных были нетоксичны для них В связи с этим были проведены испытания ингибиторов Rmln I и Rmln II на наличие антигистаминной активности по методу Гацура (табл 4)

Таблица 4

Антигистаминная активность ингибиторов протеиназ из актинии R macrodactylus

Концентрация мг/г, (в/в) Латентный период развития «микрошока», мин Период десенсибилизации, мин

Гистамин Rmln I, Rmln II (1 1)

0,02 - 90±4

0,02 0,01 5±1 54±4

0,02 0,02 7±1 25±4

В эксперименте использовали самок беспородных крыс, которым вводили раствор смеси ингибиторов Лт1п I и ЯгЫп II (в соотношении 1 1) и 0,1% раствор гистамина в хвостовую вену, так как незначительные различия в аминокислотном составе, значениях молекулярной массы и частичной аминокислотной последовательности позволяют предполагать наличие антигистаминной активности у обоих полипептидов После инъекции

0,01 мг/г полнпептидов и 0,1% раствора гистамина наблюдали увеличение латентного периода развития «микрошока» на 3 мин и уменьшение времени десенсибилизации на 36 мни При увеличении дозы полипептидов до 0,02 мг/г период развития «микрошока» продлевался на 5 мин, а период десенсибилизации уменьшался на 65 мин

Таким образом, было установлено, что Rmln I и Rmln II ослабляют клинические проявления развития аллергической реакции, то есть обладают антигистаминной активностью Характер влияния ингибиторов на эффект торможения развития аллергической реакции является дозозависимым

7. Масс-спектрометрический анализ комплексов ингибиторов протеиназ Rmln I и Rmln II с трипсином и а-химотрипсином

Образование устойчивых комплексов Rmln I и Rmln II с трипсином и а-химотрипсином было подтверждено масс-спектрометрическим анализом на MALDI TOF масс-спектрометре Показано, что в реакционной смеси присутствуют как нативный ингибитор Rmln II (сигнал с молекулярной массой 6079,5 Да), трипсин (сигнал с молекулярной массой 23303 Да), так и устойчивый комплекс Rmln II/трипсин (сигнал

29324.2 Да) При анализе комплексов Rmln I, II/a-химотрипсин были получены сигналы нативных ингибиторов протеиназ (6171,9 Да и 6047,7 Да), а-химотрипсина (25254,7 Да и

25304.3 Да) и их комплексов 31462,4 Да и 31518,6 Да соответственно

8 Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа

Исследование специфичности ингибитора InhVJ по отношению к различным протеиназам было проведено с помощью оптического биосенсора с эффектом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

InhVJ был иммобилизован на карбоксиметидцекстрановой подложке стандартного оптического чипа СМ5 (рис 7) Количество иммобилизованного белка составило 460 RU (0,46 нг/мм2)

При пропускании через измерительную кювету ферментов (трипсин, а-химотрипсин, плазмин, тромбин, калликреин, папаин и пепсин) в концентрациях от 10 до 400 нМ наблюдалось взаимодействие InhVJ только с трипсином (Тр) и а-химотрипсином (ХТр) Таким образом, данный ингибитор является специфичным по отношению к двум сериновым протеиназам - к трипсину и а-химотрипсину, и не взаимодействует с остальными, перечисленными выше, протеиназами

о 4000 oZ

of

^ЗООО ¡0

и 1000

Рис. 7. Иммобилизация InhVJ на оптическом чипе СМ5 Стрелками указаны добавки 1 -0,2 М EDC /0,05 М NHS, 2 -HBS-буфер, 3 - раствор InhVJ (100 мкг/мл) в 10 мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,0, 4 - 1 М раствор этаноламина, рН 8,5 Им -количество иммобилизованного белка

1000 D 2000 Время, с

3000

Сенсограммы связывания Тр и ХТр в различных концентрациях с иммобилизованным ингибитором (1п1Л^1т) представлены на рис 8 Были рассчитаны константы скорости образования (к,) и диссоциации (кд) комплексов ингибитора с трипсином и а-химотрипсином, а также константы ассоциации (КА) и диссоциации (Ко или К,) этих комплексов при 25 "С (табл 5) Константы диссоциации комплексов ингибитора с трипсином и а-химотрипсином отличаются на порядок Как видно из таблицы, такое различие обусловлено величиной константы скорости диссоциации этих комплексов

i0° Время, с

500 Время, с

Рис. 8. Сенсограммы взаимодействия протеолитических ферментов с иммобилизованным ингибитором (ЫЛ^ш) при 25 °С (А) Взаимодействие Тр с 1п1М|т в диапазоне концентраций от 10 до 200 нМ 1 - 200 нМ, 2-90 нМ, 3-40 нМ, 4-30 нМ, 5-20 нМ, 6-10 нМ (Б) Взаимодействие ХТр с 1п1Л^1т в диапазоне концентраций от 40 до 400 нМ 1 - 400 нМ, 2 - 300 нМ, 3 - 200 нМ, 4 - 120 нМ, 5 - 90 нМ, 6 - 40 нМ

Температурная зависимость взаимодействия 1п1^|П, с Тр и ХТр была исследована в диапазоне температур от 10 до 30 °С и в интервале концентраций от 10 до 400 нМ Расчет изменения энергии Гиббса (ДО) для реакций комплексообразования был выполнен по уравнению, АО = -ЯТ 1пКд Температурная зависимость Дй реакции комплексообразования 1пЬШ1т с Тр и ХТр удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка Изменения энтальпии (ДН) и энтропии (ДЭ) были определены из уравнения (Дй = ДН - Т ДЭ)

и составили для пары 1п)1У.1|т/Тр 44,15 ккал/моль и 165,6 кал/(моль К), для пары 1пЬ"\/Л,т/ХТр - 77,29 ккал/моль и 276,3 кал/(моль К) соответственно

Таблица 5

Кинетические параметры реакции комплексообразования 1пЬУ1/Тр и ХТр

Комплекс k„ M с 1 kd, с 1 KA(k./k„)M 1 KD(k«,/k.)M

InhVJ,m/Tp 8,56 104 6,31 103 1,36 107 7,38 108

InhVJ, m/XTp 2,39 104 2,37 102 1,01 105 9,93 10 7

Таким образом, полученные с помощью метода биосенсорного анализа данные свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия ингибитора InhVJ с двумя протеиназами - трипсином и а-химотрипсином, что отличает данный ингибитор от других представителей семейства Кунитца Специфичность исследуемого ингибитора также значительно отличается от специфичности ингибитора SHPI-1 из S helianthus Последний ингибирует не только сериновые протеиназы, трипсин (К, 1,1 Ю'10 М), плазмин (К, 2,7 10 9 М), химотрипсин (К, 2,3 10 9 М) и калликреин (К, 8,5 108 М), но и цистеиновые протеиназы, бромелаин, папаин, а также аспарагиновые протеиназы, пепсин (К, 2,5 10"8 М) и протеиназу из Mucor miehei (Delfin J et al, 1996)

Для выяснения молекулярных основ взаимодействия ингибиторов с ферментами и выяснения природы их специфичности необходимо знание пространственной организации молекул ингибиторов В настоящее время для получения пространственных структур биополимеров широко применяются методы сравнительного моделирования

9. Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым К+-каналом

Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым калиевым каналом проводилось с использованием методов сравнительного моделирования

В настоящее время известна единственная пространственная структура ингибитора протеиназ из актинии S helianthus - SHPI-1 (код PDB 1SHP), установленная методом 'Н-ЯМР-спектроскопии Сравнение аминокислотных последовательностей InhVJ и SHPI-1, проведенное с помощью программы CLUSTALW (рис 4), выявило высокую степень их гомологии - 86%, что позволило использовать структуру этого ингибитора в качестве прототипа Теоретическая модель ингибитора протеиназ InhVJ была построена с помощью сервера SWISS-MODEL (рис 9) После минимизации энергии с помощью программы МОЕ с использованием потенциала сил OPLS-AA энергия молекулы составила -1987 кДж/моль Таким образом, получена теоретическая модель ингибитора высокой точности (rmsd=0,14A)

Рис. 9. Теоретическая модель пространственной структуры ингибитора сериновых протеиназ актинии Л тасгоЛас/уки Обозначены положения дисульфидных связей в структуре ингибитора

Содержание элементов вторичной структуры в модели рассчитывали с помощью программы Мо1то1 Подобно структуре Б11ТИ структура ГпЬУД содержит две а-спирали, расположенные на И- и С-концах молекулы, два антипараллельных р-стренда и две большие петли (неупорядоченная структура) Показано, что данные по содержанию элементов вторичной структуры, полученные с применением компьютерных расчетов, согласуются с экспериментальными данными, полученными с помощью методов оптической спектроскопии (табл 6)

Таблица 6

Содержание элементов вторичной структуры ингибиторов и ЭНРЫ

Тип структуры Модель 1пЬУ) в растворе* БНРМ**

а-Спираль, % 11,0 14,0 20,0

р-Струкгура, % 18,2 23,0 14,5

Неупорядоченная структура, % 70,8 63,0 65,5

* — Элементы структуры рассчитаны на основании данных, полученных методом оптической спектроскопии

** - Элементы рассчитаны для структуры, установленной методом ЯМР (РОВ 1БНР)

Анализ внутримолекулярных контактов ингибитора был проведен с использованием программы МОЕ Показано, что молекулу стабилизируют три дисульфидные, две ионные, восемь водородных связей и пять гидрофобных взаимодействий Количество связей и взаимодействий в молекулах трех ингибиторов семейства Кунитца приведено в таблице 7 Наличие трех дисульфидных связей в молекулах и их одинаковое расположение является характерным признаком ингибиторов этого семейства Высокое содержание дисульфидных связей обеспечивает стабильность молекул по отношению к действию различных агентов (Т°С, рН среды, некоторые химические вещества) Показано, что при нейтральных значениях

рН температура денатурации БПТИ составляет около 100 "С Ингибитор устойчив в растворе 6 М гуанидинхлорида

Таблица 7.

Внутримолекулярные контакты ингибиторов протеиназ

Ингибитор протеиназ Водородные связи Гидрофобные взаимодействия Ионные связи Дисульфидные связи

InhVJ*(Ä macrodactylus) 8 5 2 3

SHPI-1 **(S hehanthus) 12 5 2 3

БПТИ***(5 taums) 9 2 1 3

* - теоретическая модель ингибитора,

** - структура ингибитора в растворе, полученная методом ЯМР спектроскопии, *** - кристаллическая структура

С помощью программы МОЕ было проведено сравнение молекулярной поверхности и распределения электростатического потенциала трех ингибиторов семейства Кунитца Показано, что молекулярные поверхности ингибиторов InhVJ и SHPI-1 практически идентичны (гомология аминокислотных последовательностей составляет 86%) Различия в структурах InhVJ и БПТИ более существенны, и процент гомологии составляет 38% Наличие на поверхности молекулы БПТИ большого количества экспонированных в окружающую среду положительно заряженных остатков Arg/Lys коррелирует, вероятно, с высоким значением константы ингибирования (Kl) по отношению к трипсину (6 1014 М) Однако размер и упаковка молекул трех ингибиторов отличаются незначительно Построенная модель InhVJ может быть использована для изучения возможных взаимодействий ингибитора с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым калиевым каналом

Моделирование структур комплексов ингибитора InhVJ с ферментами проводили методом молекулярного докинга с помощью программы GRAMM с параметрами высокого разрешения (1,7 А) Так было показано, что комплексы, образующиеся при взаимодействии ингибитора с активным центром протеиназы, имеют наиболее низкую энергию (рис 10)

Согласно полученным результатам при взаимодействии InhVJ с активным центром трипсина (код PDB 2РТС) образуется водородная связь между аминокислотными остатками НеЗ (InhVJ) и Serl95 (активный центр трипсина) Структуру комплекса стабилизируют две ионные, семь водородных связей и два гидрофобных взаимодействия (табл 8)

Комплекс а-химотрипсин-InhVJ по сравнению с комплексом трипсин-InhVJ стабилизируют лишь две водородные связи и одно гидрофобное взаимодействие (табл 8) Вероятно, это влияет на ингибирующую способность InhVJ по отношению к а-химотрипсину и приводит к увеличению значения К,

При анализе суперпозиции комплексов InhVJ и БПТИ с а-химотрипсином было обнаружено, что молекулы ингибиторов лежат относительно активного центра фермента в разных плоскостях, но петли активных центров ингибиторов ориентированы одинаковым образом

Рис. 10. (А) Модель структуры комплекса 1пЬ\М с трипсином (Б) Суперпозиция моделей комплекса 1п11\М и БПТИ с а-химотрипсином (код РБВ 1Т7С) Структуры молекул показаны в виде ленточных диаграмм Указаны аминокислотные остатки активных центров протеиназ

Таблица 8.

Межмолекулярные контакты, стабилизирующие комплексы ингибитора с сериновыми протеиназами*

Комплексы Ионные связи Гидрофобные взаимодействия Водородные связи

Asn97-His48

Serl46-Ser24

Трипсин-InhVJ Thrl79-Glu25 Aspl94-Ser2 Vall7-Leu5 Leu99-Ile53 Serl47-Glu25 Tyrl51-Asn40 Serl90-Ser2 Serl95-Ile3 Cys220-Ser24

а-Химотрипсин-InhVJ - Metl92-Phel7 Cys58-Argl9 Tyr94-Gly39

-Первый аминокислотный остаток соответствует протеиназе, второй - ингибитору

Известно, что актинии являются источником высокоселекгивных блокаторов ионных каналов Из актинии A sulcata были выделены уникальные бифункциональные соединения, названные каликлидинами Эти соединения способны одновременно ингибировать активность трипсина (ингибитор семейства Кунитца) и блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, относящиеся к типу Kv 1 2 (Schweitz Н et al, 1995) Экспериментально пространственная структура каликлидинов к настоящему времени не установлена

Для построения теоретической модели пространственной структуры каликлидина в качестве прототипа был выбран Кунитц домен 1 (KD1) ингибитора пути тканевого фактора 2 (TFPI-2) (код PDB 1ZR0D), степень идентичности с которым составляет 56% Теоретическая модель пространственной структуры каликлидина 1 высокой точности (rmsd=0,08 А) из актинии A sulcata получена методом сравнительного моделирования с помощью сервера SWISS-MODEL Структура каликлидина имеет характерную для ингибиторов семейства Кунитца упаковку молекулы и консервативно расположенные три дисульфидные связи

Полученная модель может быть использована для изучения взаимодействия с калиевым каналом, структура которого недавно установлена методом рентгеноструктурного анализа (LongS et al, 2005)

Методом молекулярного докинга с помощью программы GRAMM получена структура комплекса калиевого канала с ингибитором и определен возможный сайт связывания каликлидина 1 с калиевым каналом Показано, что каликлидин 1 взаимодействует с внешним вестибюлем калиевого канала и блокирует вход в селективный фильтр канала Структура комплекса стабилизирована одной ионной, четырьмя водородными связями и одним гидрофобным взаимодействием

Для ингибитора InhVJ, который также относится к семейству Кунитца, в настоящее время отсутствуют экспериментальные данные о влиянии на активность калиевых каналов Поэтому образование комплекса ингибитора InhVJ с потенциал-зависимым калиевым каналом типа Kv 1 2 было предсказано с использованием методов компьютерного моделирования Так было показано, ингибитор InhVJ, подобно каликлидину 1, взаимодействует с внешним вестибюлем калиевого канала и блокирует вход в селективный фильтр канала (рис 11)

Рис 11. Модель комплекса ингибитора 1п1ЛМ с калиевым каналом Ку 1 2 (А) - вид сбоку на область селективного фильтра, (Б) - вид сверху на внешний вестибюль канала Молекула 1п1ЛО показана в виде молекулярной поверхности Фрагмент структуры канала Ку 1 2 (код РБВ 2А79), используемый для докинга, показан ленточной диаграммой

Установлено, что структуру комплекса ингибитора с калиевым каналом стабилизируют одна водородная и одна ионная связи Согласно суперпозиции комплексов каликлидина 1 и ингибитора 1пЬУ1 с калиевым каналом Ку 1 2 сайты связывания ингибиторов с калиевым каналом перекрываются, но ориентация ингибиторов во внешнем вестибюле калиевого канала различна На основании полученных результатов можно предположить, что ингибитор 1пЬУ1, подобно каликлидину, блокирует работу калиевого канала Ку 12 Блокирующее действие ингибитора 1п11У1 на калиевый канал должно быть слабее, чем каликлидина, поскольку комплекс стабилизируется меньшим числом связей (табл 9)

А

Б

Таблица 9

Межмолекулярные контакты, стабилизирующие комплексы каликлидина 1 и 1пЬ\М с потенциал-зависимым калиевым каналом Ку 1 2

Комплексы Ионные связи Гидрофобные взаимодействия Водородные связи

ау159-А8п24

Каликлидин 1- Ку 1 2 аиВб-ЬувЗг МеИ61-Ие34 Туг162-5ег26 01у159-8ег27 01у159-А^29

1ПЬУ.Г-КУ12 С1и136-Аг§19 - 8ег137-Н1548

* - Первый аминокислотный остаток соответствует ингибитору, второй - калиевому каналу

Таким образом, можно предположить, что ингибитор 1пЬУ1 обладает бифункциональными свойствами - ингибирует активность сериновых протеиназ и блокирует работу потенциал-зависимого калиевого канала По-видимому, ингибитор 1п11\М может быть отнесен к блокаторам калиевых каналов второго типа, выделенных из актиний Однако эти результаты, несомненно, требуют экспериментальных доказательств

ВЫВОДЫ

1 Из актинии Л тасгос!ас1у1т выделены и охарактеризованы три новых ингибитора сериновых протеиназ (ЫЛЛГ, И.т1п I и Ят1п II) Установлено, что полипептиды относятся к семейству Кунитца

2 Установлены аминокислотные последовательности Ы-концевых фрагментов ингибиторов Кт1п I, Ят1п II и полная аминокислотная последовательность ингибнтора 1пЬУ1 Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, выделенных из таких эволюционно далеких типов организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся и млекопитающие

3 Выявлены различия в строении реактивных центров ингибиторов Показано, что замена одного аминокислотного остатка в реактивном центре ингибиторов приводит к уменьшению их ингибирующей активности

4 Исследована пространственная организация ингибитора 1пЬУ1 на уровне вторичной и третичной структуры Показано, «по 1пЪ\7 имеет упорядоченную вторичную, жесткую третичную структуру и относится к белкам со смешанной а+(3 структурой

5 Изучены специфичность ингибиторов и особенности их взаимодействия с протеиназами Показано, что ингибиторы МгУ.!, 11т1п I и Шп1п II являются высокоспецифичными полипептидами ингибируют активность только двух сериновых протеиназ, трипсина и а-химотрипсина Установлено, что ингибиторы образуют комплексы с протеиназами в стехиометрическом соотношении 1 1 Рассчитаны константы ингибирования, определены кинетические и термодинамические характеристики комплексов ингибитор-протеиназа

6 Установлено, что ингибитор 1п1ЛМ взаимодействует с сериновыми протеиназами в области их активных центров Количество и тип связей, стабилизирующих комплексы, вероятно, определяет ингибирующую способность полипептида

7 Обнаружено, что ингибиторы 111п1п I и Ят1п II проявляют антигистаминную активность Показано, что характер влияния ингибиторов на эффект торможения развития аллергической реакции является дозозависимым Предсказана возможность взаимодействия 1пЬУ1 с потенциал-зависимым калиевым каналом Таким образом, выделенные полипептиды могут быть отнесены к полифункциональным ингибиторам протеиназ

1 Сокотун (Гладких) И Н , Ильина А П , Монастырная М М , Лейченко Е В , Еськов А А, Анастюк С Д, Козловская Э П Ингибиторы протеиназ тропической актинии Radianthus macrodactylus выделение и характеристика // Биохимия 2007 Т 72, вып 3 С 368-374

2 Сокотун (Гладких) И Н, Лейченко Е В , Вакорина Т И, Еськов А А, Ильина А П, Монастырная М М, Козловская Э П Ингибитор сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus выделение и физико-химические свойства // Биоорганическая химия 2007 Т 33, N4 С 1-8

3 Сокотун (Гладких) И Н, Гнеденко О В , Лейченко Е В, Монастырная М М , Козловская Э П , Мольнар А А, Иванов А С Исследование взаимодействия ингибитора трипсина из актинии Radianthus macrodactylus с различными протеиназами // Биомедицинская химия 2006 Т 52, вып 6 С 595-600

4 Sokotun (Gladkikh) I, Il'ina A, Monastyrnaya M, Kozlovskaya E Two new proteinase inhibitors from sea anemone, Radianthus macrodactylus // XI International Symposium on Manne Natural Products proceed - Sorrento, Italy 2004 P 42

5 Сокотун (Гладких) И H , Лейченко Е В , Монастырная М М, Гнеденко О В , Мольнар А А, Иванов А С, Козловская Э П Выделение, свойства и ферментативная специфичность ингибитора протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus II Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» сб тез докл - Владивосток 2006 С 93,

6 Гладких И Н , Лейченко Е В , Лихацкая Г Н , Монастырная М М , Козловская Э П Структура нового ингибитора сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus II III Российский симпозиум «Белки и пептиды» сб тез докл - Пущино

Основные публикации по теме диссертации

2007 С 10

Соискатель

Гладких И Н

Гладких Ирина Николаевна

Изучение структуры и механизма действия иншбиторов сериновых протеиназ из актинии НаскашЬич таиоНасМиь

Автореферат

Подписано в печать 27 05 2008 г Формат 60x90/16 1 уч -изд л Тираж 100 экз Заказ № 99 Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» Г Владивосток, ул Западная, 10

1. Введение.

2. Литературный обзор. Протеолитические ферменты и способы регуляции их активности.

2.1. Классификация протеолитических ферментов.

2.1.1. Сериновые протеиназы.

2.1.2. Химотрипсинподобные протеиназы: характеристика и физиологическая активность.

2.2. Способы регуляции активности протеолитических ферментов.

2.2.1. Зимогены - неактивные предшественники протеиназ.

2.2.2. Регуляция активности протеиназ с помощью ингибиторов.

2.2.2.1. Классификация ингибиторов протеиназ по механизму действия.

2.2.2.2. Общая характеристика ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.3. Пространственные структуры ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.4. Доменные структуры ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.5. Каноническая конформация связывающей петли.

2.2.2.6. Семейство Кунитца.

2.3. Ингибиторы протеиназ актиний.

2.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы протеиназ актиний.

2.3.2. Эквистатин - высокомолекулярный ингибитор протеиназ актинии Actinia equina.

2.3.3. Биологическая роль и применение ингибиторов протеиназ актиний.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Выделение и некоторые физико-химические характеристики ингибиторов протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus.

3.2 Установление аминокислотной последовательности ингибиторов протеиназ

3.2.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности ингибиторов Rmln I и Rmln II.

3.2.2. Установление полной аминокислотной последовательности ингибитора InhVJ.

3.3. Изучение пространственной организации ингибитора InhVJ.

3.4. Определение констант ингибирования.

3.5. Определение антигистаминной активности ингибиторов сериновых протеиназ Rmln I и Rmln II.

3.6. Изучение взаимодействия ингибиторов с протеолитическими ферментами

3.6.1. Масс-спектрометрический анализ комплексов ингибиторов протеиназ Rmln I и Rmln II с трипсином и а-химотрипсином.

3.6.2. Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа.

3.7. Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым К+-каналом.

3.7.1. Построение модели пространственной структуры ингибитора InhVJ.

3.7.2. Теоретическое предсказание структуры комплексов ингибитора InhVJ с трипсином, а-химотрипсином и потенциал-зависимым К+-каналом.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

5. Выводы.

Поиск биологически активных природных соединений, специфически взаимодействующих с протеолитическими ферментами и регулирующих их активность, изучение взаимосвязи между их структурой и функцией является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии, так как протеолитические ферменты и процессы протеолиза играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов. Известно, что одним из основных способов регуляции действия ферментов является ингибирование их активности. В связи с этим, исследование структурно-функциональных особенностей, специфичности и механизма действия ингибиторов протеиназ является фундаментальной задачей, выясняющей молекулярные основы белок-белковых взаимодействий. Решение этой задачи может служить основой для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов.

К настоящему времени накоплен огромный массив информации о структуре и функциональной активности ингибиторов сериновых протеиназ растительного и животного происхождения. В то же время ингибиторам протеиназ морских организмов, в частности, ядовитых кишечнополостных, актиний, посвящено несравнимо меньшее количество публикаций. Уже более двадцати лет известно, что в организме-продуценте ингибиторы протеиназ присутствуют совместно с нейро- и цитотоксинами, выполняющими алломональную роль, но до сих пор отсутствует убедительное объяснение этого феномена. Это требует расширения знаний как о структуре и механизме действия ингибиторов, так и об их экологической роли в морском биоценозе.

Актуальность поиска и установления структуры новых представителей ингибиторов протеиназ актиний связана с обнаружением у ряда представителей этой группы полипептидов новых биологических функций. Так установлено, что некоторые ингибиторы протеиназ актиний способны блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, взаимодействовать с ваниллоидным рецептором TRPV1, проявлять антигистаминную активность, что свидетельствует об их полифункциональности.

Выделение новых ингибиторов из актиний, изучение их структурной организации и механизма действия с помощью современных биохимических, биофизических, молекулярно-биологических, а также методов компьютерного моделирования, позволит понять причины их структурно-функционального многообразия.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств ингибиторов, выделенных из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению их аминокислотных последовательностей, исследованию пространственной организации, специфичности, а также изучению механизма действия и биологической активности этих полипептидов.

5. Выводы

1. Из актинии R. macrodactylus выделены и охарактеризованы три новых ингибитора сериновых протеиназ (InhVJ, Rmln I и Rmln II). Установлено, что полипептиды относятся к семейству Кунитца.

2. Установлены аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов ингибиторов Rmln I, Rmln II и полная аминокислотная последовательность ингибитора InhVJ. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, выделенных из таких эволюционно далеких типов организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся и млекопитающие.

3. Выявлены различия в строении реактивных центров ингибиторов. Показано, что замена одного аминокислотного остатка в реактивном центре ингибиторов приводит к уменьшению их ингибирующей активности.

4. Исследована пространственная организация ингибитора InhVJ на уровне вторичной и третичной структуры. Показано, что InhVJ имеет упорядоченную вторичную, жесткую третичную структуру и относится к белкам со смешанной а+Р структурой.

5. Изучены специфичность ингибиторов и особенности их взаимодействия с протеиназами. Показано, что ингибиторы InhVJ, Rmln I и Rmln II являются высокоспецифичными полипептидами: ингибируют активность только двух сериновых протеиназ, трипсина и а-химотрипсина. Установлено, что ингибиторы образуют комплексы с протеиназами в стехиометрическом соотношении 1:1. Рассчитаны константы ингибирования, определены кинетические и термодинамические характеристики комплексов ингибитор-протеиназа.

6. Установлено, что ингибитор InhVJ взаимодействует с сериновыми протеиназами в области их активных центров. Количество и тип связей, стабилизирующих комплексы, вероятно, определяет ингибирующую способность полипептида.

7. Обнаружено, что ингибиторы Rmln I и Rmln II проявляют антигистаминную активность. Показано, что характер влияния ингибиторов на эффект торможения развития аллергической реакции является дозозависимым. Предсказана возможность взаимодействия InhVJ с потенциал-зависимым калиевым каналом. Таким образом, выделенные полипептиды могут быть отнесены к полифункциональным ингибиторам протеиназ.