Исследование структуры и мембранолитического действия пороформирующих токсинов актиний тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

003067034

Монастырная Маргарита Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И МЕМБРАНОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ АКТИНИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток - 2006

003067034

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Т.Ф. Соловьева

доктор биологических наук профессор В.А. Кратасюк

доктор химических наук профессор В.А. Шибнев

Ведущая организация

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится марта 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022. г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан " / " января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

к.х.н., с.н.с.

Г.И. Прокопенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из важных направлений биоорганической химии и ряда смежных наук является установление молекулярных основ структурной организации и функционирования биологических мембран. Изучение защитной и коммуникативной функций биомембран, осуществляемых на уровне клетки и внутриклеточных компартментов, а также ряда процессов, происходящих при их участии - биосинтеза и секреции белков, функционирования систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетических процессов, требует применения широкого набора биохимических инструментов. Общепризнанными и универсальными инструментами исследования цитоплазматических мембран являются высокоспецифичные соединения белковой природы, продуцируемые как прокариотами, так и эукариотами, которые относят к группам а- и р-пороформирующих токсинов (ПФТ), а также антимикробных пептидов. Созданные природой для разрушения мембран клеток-мишеней эти цитолитические токсины представляют собой удивительные структуры, способные существовать как в водорастворимом, гак и в мембраносвязанном состоянии, в котором они осуществляют свое мембранолитическое действие. Благодаря установлению первичной структуры и пространственной организации многих ПФТ и мембраноактивных пептидов определена ключевая роль конформационных изменений, претерпеваемых их молекулами при переходе из водорастворимого в мембраносвязанное состояние. Предполагают, что состояние так называемой «расплавленной глобулы», характеризующееся переходом гидрофобных трансмембранных областей молекул из белкового кора в мембрану, ответственно за функциональную активность ПФТ. Очевидно, выяснение природы рецепторного взаимодействия мембраноактивных соединений с мембранными белками, впрямую связанное с установлением структуры обеих групп белков, а также молекулярной организации мембран клеток-мишеней, должно способствовать пониманию механизма действия ПФТ.

Цитолизины актиний, принадлежащие к группе актинопоринов, являются наиболее простой моделью а-ПФТ. Способность формировать в мембранах поры, как полагают, лежит в основе кардиостимулирующей, антиопухолевой, антипаразитарной активности этих цитолизинов, что объясняет возрастающий интерес к ним не только как инструментам исследования мембран, но и моделям для дизайна современных высокоспецифичных фармакологических и биотехнологических препаратов направленного действия. ПФТ актиний являются незаменимыми инструментами и уникальными модельными системами для исследования липид-белковых, белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий, т.к. для проникновения в мембрану им не требуется помощь других соединений (например, шаперонов) или участие транслокона, поскольку вся необходимая для этого информация заключена в их собственной структуре. Кроме того, структурное и функциональное подобие некоторым мембранным белкам, таким как порины грамотрицательных бактерий, позволяет использовать ПФТ в качестве моделей для изучения механизма действия поринов из-за значительных трудностей получения последних в виде кристаллов. В то же время топология исследованных к настоящему времени мембранных белков вносит вклад в понимание механизмов взаимодействия с мембраной мембраноактивных водорастворимых белков. Этот факт, а также наличие ряда противоречивых данных, полученных нами, с литературными данными по исследованию структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов, диктуют необходимость поиска и установления структуры новых ПФТ актиний.

Заманчивой целью в исследовании цитолизинов актиний является также определение их экологической и алломональной роли в морском биоценозе, установление структуры анцестрального гена для гомологов и ортологов этих

полипептидов, а также выяснение правомерности гипотезы, представляющей актинопорины видовыми и родовыми хемотаксономическими маркерами.

Целью исследования являлся поиск новых источников цитолитических токсинов среди актиний низкобореапьных и тропических вод, выделение цитолизинов, изучение их свойств, липидной специфичности и механизма действия, а также установление структуры и выяснение структурно-функциональных взаимосвязей цитолизинов (актинопоринов), ингибируемых сфингомиелином.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить новые цитолитические токсины из актиний, обитающих в различных регионах Мирового океана, тропической актинии Radianthus macrodactylus и актиний Японского моря Oulactis crientalis и Metridium senile jimbriatum, определить их физико-химические свойства и биологическую активность;

- определить липидную специфичность выделенных полипептидов и на ее основании установить принадлежность к одной из известных групп цитолизинов актиний;

- изучить мембранолитическое действие цитолизинов на биологические (эритроциты млекопитающих и яйцеклетки морского ежа) и модельные (липосомы и БЛМ) мембраны;

- установить первичную структуру и пространственную организацию актинопоринов;

исследовать конформационную стабильность изотоксина из актинии R. macrodactylus;

- провести сравнительный анализ функционально значимых участков аминокислотной последовательности актинопоринов из актиний родов Radianthus и Oulactis (далее Radianthus или Oulactis цитолизины или актинопорины) и известных актинопоринов тропических актиний.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Актинии, как тропические, так и обитающие в дальневосточных морях, являются перспективным источником биологически активных полипептидов, в частности цитолизинов.

2. По физико-химическим свойствам, липидной специфичности, первичной структуре и механизму действия высокомолекулярные Oulactis и Radianthus цитолизины относятся к актинопоринам (ПФТ актиний) - так называемой группе II цитолизинов, ингибируемых сфингомиелином. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины согласно физико-химическим свойствам и биологической активности относятся к группе 1 — гистаминолитическим цитолизинам, а метридиолизин из М. senile — к lV-й группе цитолизинов, ингибируемых холестерином.

3. В основе мембранолитического действия исследованных цитолизинов актиний 1-й и П-й групп лежит специфическое взаимодействие с липидными компонентами биологических мембран, приводящее к формированию в них ионных каналов (пор). В отличие от них, представитель IV-й группы - Metridium цитолизин в низких концентрациях проявляет пороформирующую активность, а высоких — действует подобно поверхностноактивным соединениям.

4. Аминокислотные последовательности Radianthus актинопоринов имеют высокую степень гомологии с аминокислотными последовательностями актинопоринов актиний семейства Stichodactylidae, a Oulactis актинопоринов - с последовательностями актинопоринов семейства Actiniidae.

5. Различия в гемолитической активности Oulactis и Radianthus актинопоринов, а также известных актинопоринов тропических актиний, принадлежащих к этой группе цитолизинов, обусловлены несовпадением аминокислотных последовательностей функционально важных участков молекул, в частности, Л'-концевого фрагмента и сайта связывания с мембраной.

6. Актинопорины оказывают прямое или опосредованное влияние на некоторые мембранные белки и белки цитоскелета, модулируют разрыв связи актина с липидным матриксом. В основе их многочисленных фармакологических эффектов, помимо лииид-белковых взаимодействий, лежат также белок-белковые взаимодействия с компонентами биологических мембран и цитоскелета.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые в индивидуальном состоянии из дальневосточной актинии О. orientalis и тропической актинии R. macrodactylus выделено четыре высокомолекулярных цитолизина, ингибируемых сфингомиелином, которые отнесены ко II-й группе актинопоринов. Из R. macrodactylus выделено также два низкомолекулярных гистаминолитических цитолизина, подобных известному цитолизину из актинии Те alia felina.

Определена первичная структура Oulactis и Radianthus актинопоринов, причем впервые - для двух цитолизинов, продуцируемых актинией низкобореальных вод. Установлена аминокислотная последовательность А'-конпсвого фрагмента одного из низкомолекулярных Radianthus цитолизинов, отличающаяся от аналогичного фрагмента актинопоринов и имеющая более 80% гомологии с Д'-концсвым фрагментом ингибитора протеиназ из R. macrodactylus.

Методами сравнительного моделирования построены пространственные структуры Radianthus и Oulactis актинопоринов. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Установлено, что Д-конпевые фрагменты аминокислотных последовательностей актинопоринов из дальневосточной актинии на несколько аминокислотных остатков короче, чем таковые актинопоринов из тропических актиний, что позволяет объяснить различия в их гемолитической активности. В связи с этим Oulactis актинопорины представляют собой уникальные природные модели для изучения структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов.

Впервые исследовано мембранолитическое действие высокомолекулярных Radianthus актинопоринов на изолированный фрагмент эритроцита кролика. Показан общий для модельных и биологических мембран механизм литического действия актинопоринов, который заключается в образовании в мембранах пор диаметром около 6-10 Á.

Впервые исследовано действие Metridium цитолизина на модельные мембраны и доказано отсутствие высокой специфичности к мембранному холестерину. Установлено, что метридиолизин, в отличие от Radianthus актинопоринов - типичных каналоформеров, проявляет в низкой концентрации пороформирующую, а в высокой -детергентоподобную активность.

Впервые показано влияние актинопоринов на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, лежащие в основе клеточной пролиферации. Высказано предположение, что в основе фармакологических эффектов, проявляемых актинопоринами, лежит их специфическое связывание как с липидными, так и с белковыми компонентами биологических мембран. В настоящей работе обосновывается новое направление изучения взаимодействия цитолизинов актиний 1-й и II-й групп с белками мембран и цитоскелета, в частности с актином.

Всестороннее изучение структуры и функции пороформирующих токсинов является важной фундаментальной задачей, имеющей большое практическое значение для прикладных исследований, так как позволяет создать теоретическую основу для конструирования лекарственных препаратов направленного действия, таких как эффективные иммуно- и митотоксины, специфически действующие на внутриклеточные мембраны опухолевых клеток или паразитов. Выяснение механизма действия актинопоринов на молекулярном уровне является базой для исследования бактериальных ПФТ, что, безусловно, необходимо для более глубокого понимания

целого ряда процессов, протекающих при действии этих полипептидов на клетки-мишени.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на III Soviet-Svveden Symposium "Biological membranes. Structure and function" (Tashkent, USSR, 1983), IV Soviet-FRG Symposium «Receptors and ion channels» (Moscow, Russia, 1991), XVIII Congreso Nacional de Bioquímica (San Sebastian, Spain, 1993), XIII World Congress of the International Society on Toxinology (Paris, France, 2000), 3rd European Conference on Marine Natural Products (Elmau Castle, Bavaria, Germany, 2002), 23rd IUPAC-2002 International Symposium on the Chemistry of Natural Products (Florence, Italy, 2002), International Symposium on the Chemistry and Biology of Marine Organisms (Kolympari, Greece, 2003), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, Россия, 2003), Объединённой международной научной конференции "Новая геометрия природы" (Казань, Россия, 2003), Международном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, Россия, 2003), XI International Symposium on Marine Natural Products (Sorrento, Italy, 2004), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, Россия, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 25 статей в отечественных и международных журналах и более 40 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, одиннадцати глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 369 источников. Работа изложена на 269 страницах, содержит 21 таблицу и 90 рисунков.

Автор искренне благодарен научному руководителю, д.х.н. Э.П. Козловской за неустанное внимание и интерес ко всем этапам данного исследования, ценные советы, глубокий и критический анализ и помощь в данной работе. Автор глубочайше признателен всем сотрудникам лаборатории химии пептидов и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе: к.х.н. Зыковой Т.А., н.с. Вожжовой Е.И., к.х.н. Лейченко Е.В., к.х.н. Ильиной А.П., н.с. Апаликовой О.В., н.с. Лихацкой Т.Н., к.м.н. Исаевой М.П., к.х.н. Вакориной Т.И., м.н.с. Гузеву К.В., к.х.н. Швец Т.В., н.с. Киселевой М.И., вед. инженеру-электронику Кулешу Ю.Г., н.с. Дмитренку П.С., н.с. Ильченко Г.Я., вед. инженеру Тищенко Л.Я., к.х.н. Сове В.В., к.б.н. Бурцевой Ю.В., к.х.н. Мензоровой Н.И., к.б.н. Прокофьевой Н.Г. (посмертно). Автор также благодарен за плодотворное сотрудничество в работе сотруднику Института химии ДВО РАН (г. Владивосток) к.х.н. Рудневу В.С., сотрудникам Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (г. Москва) д.б.н., проф. Иванову А.С. и к.б.н. Мольнару А.А., сотруднику Института биохимии им. А.В. Палладина (г. Киев) к.б.н. Чантурия А.Н., сотруднику Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН (г. Москва) к.б.н. Брежестовскому П.Д., сотрудникам Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино-на-Оке) д.б.н. Шнырову В.Л., к.б.н. Жадан Г.Г., н.с. Емельяненко В.И. и н.с. Кузнецовой С.М., сотрудникам Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва) д.х.н. Назимову И.В., д.х.н., проф. Егорову Ц.А., к.б.н. Липкину А.В. и к.б.н. Барсовой Е.В, сотруднице Института биологии моря ДВО РАН (г. Владивосток) к.б.н. Костиной Е.Е. и сотруднику Зоологического института РАН (г. Санкт-Петербург) к.б.н. Гребельному С.Д.

Используемые сокращения: а.о. - аминокислотный остаток, БЛМ - бислойные липидные мембраны, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ТЕ - гемолитическая единица, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, ДМФХ, ДПФХ-димири-

стоил- и дипальмитоилфосфатидилхолины, ДПФЭ - дипальмитоилфосфатидилэтанол-амин, ДПФС - дипальмитоилфосфатидилсерин, ПОФХ - пальмитоилолеилфосфатидил-холин, ПЦР — полимеразная цепная реакция, ПФТ — пороформирующие токсины, СМ — сфингомиелин, ТФУ - трифторуксусная кислота, ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфати-дилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, X - холестерин, ХЗЦ - холестеринзависимые цитолизины.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 9 глав, описаны общие закономерности структурной организации некоторых представителей а- и р-ПФТ и антимикробных пептидов, водорастворимых соединений белковой природы, продуцируемых рядом бактерий, насекомых, кишечнополостных и других представителей животного мира с целью поражения клеток-мишеней; проанализирована связь структуры и мембранолитической активности ПФТ и антимикробных пептидов; подробно изложены концептуальные основы конформационных изменений, претерпеваемых молекулами этих соединений при переходе из водорастворимого в мембраносвязанное состояние; проведен сравнительный структурный анализ мембранных и мембраноактивных белков и охарактеризованы общие принципы липид-белковых взаимодействий последних с цитоплазматической мембраной.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Актинии, продуцирующие цитолитические токсины, относятся к простейшему уровню организации и вместе с медузами и кораллами образуют тип кишечнополостные (Coelenterata), который насчитывает около 9000 видов. Биологические и биохимические исследования этих животных указывают на важное экологическое значение в морском биоценозе продуцируемых ими токсинов -высокомолекулярных белковых соединений, исполняющих роль агрессивных и оборонительных алломонов. Система алломонов актиний включает токсичные белковые соединения: нейро- и цитотоксины, протеолитические ферменты, высоко- и низкомолекулярные ингибиторы протеиназ. Биологическая роль последних в актиниях во многих случаях до сих пор не ясна. Цитотоксины актиний представлены фосфолипазами и пороформирующими токсинами (ПФТ), мишенями действия которых являются цитоплазматические мембраны клеток эукариот. Большой интерес к изучению структурной организации и функциональной роли этой группы биологически активных полипептидов связан с их уникальной биологической ролью и физиологическим действием.

К настоящему времени описано более 30 видов актиний, принадлежащих к семействам Aiptasiidae, Metridiidae, Actinüdae и Stichodactylidae, причем из каждого вида выделено и охарактеризовано от одного до нескольких цитолитических полипептидов. Наиболее изучены цитолизины, продуцируемые тропическими видами актиний Stichodactyla helianthus, Actinia equina, Actinio tenebrosa, Heteractis magnifica. На основании липидной специфичности и некоторых физико-химических свойств цитолизины актиний принято делить на четыре группы: I - низкомолекулярные цитолизины, проявляющие гистаминолитическую активность (М 5-7 кДа), II -цитолизины, ингибируемые сфингомиелином (М 15-20 кДа), III - цитолизины с фосфолипазной Аг активностью (М 12-45 кДа) и IV - цитолизины, ингибируемые холестерином (А/ 80 кДа).

1. Поиск биологически активных полипептидов - цитолитических токсинов

В связи с установлением практически полной идентичности аминокислотных последовательностей эквинатоксина II (Eqtll) из A. equina и тенеброзина С (ТпС) из А.

tenebrosa, продуцируемых актиниями семейства Actiniidae, была высказана гипотеза, согласно которой актинопорины являются хемотаксономическими маркерами на уровне рода и вида. Проведение широкомасштабного поиска новых источников актинопоринов и установление их первичной структуры является самостоятельной научной задачей, решение которой позволит осуществить проверку этой гипотезы, а также расширить арсенал биохимических инструментов исследования биологических мембран.

В качестве одного из объектов исследования нами выбрана тропическая актиния Radianthus (Heteractis) macrodactylus (семейство Stichodactylidae), широко распространенная в прибрежных водах островов Индийского и Тихого океанов, водные экстракты которой, как было установлено, обладают мощной гемолитической активностью (1400 ГЕ/мг белка). В результате скрининга актиний, обитающих на различных глубинах в Охотском море и литорали о-ва Сахалин, а также в заливе Посьета (Японское море), для дальнейших исследований использованы наиболее массовые виды, М. senile (семейство Metridiidae) и О. orientalis (семейство Actiniidae), водные экстракты которых имеют гемолитическую активность 2,92 и 5,68 ГЕ/мг белка соответственно (табл. 1). Значительные различия в величинах токсической и гемолитической активностей экстрактов умеренно холодных и тропических видов актиний связаны, по нашему мнению, с их средой обитания. Как известно, биота холодных морей несколько беднее, чем теплых тропических, и количество как потенциальных жертв актиний, так и их врагов должно уменьшаться при переходе от тропических к умеренно холодным водам. По-видимому, низкие значения гемолитической и токсической активностей экстрактов актиний, собранных в нижней части шельфа Охотского и Японского морей, могут быть связаны с отсутствием необходимости в экспрессии высокотоксичных алломонов против основных врагов актиний - голожаберных моллюсков. Размеры этих морских животных, обитающих в заливе Посьета и в водах южного побережья Сахалина, не превышают 2-3 см, и моллюски не представляют угрозы для более крупных актиний.

Для всех водных экстрактов исследованных видов актиний установлено наличие «непрямых» гемолитиков, фосфолипаз (табл. 1). Интересной особенностью для исследованных видов оказалось наличие ингибиторов протеиназ в водных экстрактах, хотя большинство известных ингибиторов протеиназ (М 6-7 кДа) выделено из спиртовых экстрактов актиний. Предполагается, что роль этих соединений заключается в защите животного от переваривания протеиназами жертв и/или в предохранении собственных цитолизинов и нейротоксинов, в комплексе с которыми они находятся в организме, от действия эндогенных протеиназ.

2. Выделение цитолитических токсинов, их физико-химические характеристики и биологическая активность

Выделение цитолитических токсинов в индивидуальном состоянии является достаточно трудоемкой и сложной экспериментальной задачей, поскольку водные экстракты актиний содержат смесь белков и пептидов с разнообразной биологической активностью, содержание цитолизинов в которой очень низкое.

Очистку цитолизинов 11-й группы из актиний R. macrodactylus и О. orientalis осуществляли в соответствии с двумя схемами, каждая из которых имеет определенные преимущества. Особенностью первой схемы, включающей гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и ВЭЖХ, является применение гидрофобного носителя политетрафторэтилена (полихрома-1), который сорбирует высокогидрофобные соединения, в частности нейротоксины и ингибиторы протеиназ, и позволяет избавляться от основной массы балластных белков, липидов, пигментов, а также морской соли. Гидродинамические свойства полихрома-1 и его высокая сорбционная емкость обеспечивают возможность

Таблица 1. Сравнительная характеристика биологической активности водных и водно-этанольных экстрактов актиний Японского и

Охотского морей

№ Источник Место сбора, глубина Гемолитическая активность, (ГЕ/мг) Фосфолипазная А2 активность Токсическая активность, (ЛД50), мг/кг мыши Трипсии-ингибирующая активность, (ИЕ/мг)

Н20 Н20 н2о EtOH Н20 ЕЮН

Охотское море, 46°19'7" с.ш.,

1 Actinostola callosa 143°45'П" в.д., 143 м Охотское море, 46°19'8" с.ш., 1,15 + 203,70 5,08 0,82

2 Stomphia sp. 143°51'2" в.д., 188-200м Охотское море, 46°19'6" с.ш., 1,54 + 53,36 2,80 0,84

3 Stomphia coccínea 143°45'15" в.д., 142 м Охотское море, 46°19'6" с.ш., 1,39 + 302,62 3,81 1,61

4 Cribrinopsis similis 143°45'15" в.д., 142 м Охотское море, 46°07'11" 64,93 + 126,4 36,55 55,43 8,74

5 Actinostola sp. с.ш., 143°30'54" в.д., 59-71 м 3,33 + 123,4 213,60 3,72 1,93

6 Metridium senile fimbriatum Oulactis orientalis Охотское море, 46°18'2" с.ш., 142°21'7" в.д., 22-26 м Охотское море, зал. Анива, 2,92 + 118,7 253,16 2,34 0,67

7 (=Anthopleura orientalis) мыс Анастасии, литораль, до 0,5 м 2,65 + " 428,60 4,39 5,68

8 Oulactis orientalis (=Anthopleura orientalis) Японское море, зал. Посьета, 0,5-1 м 5,68 + 100,0 299,34 5,29 1,16

Примечание: «-» — активность не обнаружена.

работы с большим количеством исходного сырья. Недостатком этой стадии является большой объем и низкая концентрация белка активной фракции, однако введение стадии статической хроматографии на целлюлозе КМ-23 позволяет концентрировать разбавленные белковые фракции в 30-40 раз. На рисунках 1 и 2 показаны завершающие стадии выделения цитолизинов по первой схеме.

Рис. 1 (а, б). Хроматография гемолизинов, полученных ранее гель-фильтрацией на Акрилексе П-4, на КМ-32 целлюлозе (2,2x50 см), уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0 в градиенте концентрации №0 (0-0,5 М) в рабочем буферном растворе. Объем фракций 6 мл. Отмечены границы объединения фракций, проявляющих гемолитическую активность.

100

Номер фракции

А

2.0

2.0

А

у

О 30 60 мин

60 120 180 Номер фракции

Рис. 2 (а, б, в). Ионообменная ВЭЖХ белковых фракций I, 2 и 5 (рис. I) на колонке и^горас ТБК СМ-38\У (21,5x150 мм), уравновешенной 0,1 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в ступенчатом градиенте концентрации (0,1—1 М) того же буферного раствора за 240 мин.

(г) ВЭЖХ гемолитически активной фракции (а) на носителе с обращенной фазой БИаяогЬ С18 (10x250 мм), уравновешенной 0,1% водным раствором ТФУ, в линейном градиенте концентрации ацето-нитрила (0-60%) в 0,1% водном растворе ТФУ за 60 мин. Скорость элюции 1 мл/мин.

По данным SDS-электрофореза, фракции с высокой гемолитической активностью (1, 2 и 5) содержали полипептиды с молекулярной массой 20 кДа, которые, согласно N-концевым аминокислотным остаткам молекул (Ala, Ser и Gly), были названы RTX-A, RTX-S и RTX-G соответственно. Подобные значения молекулярных масс имеют цитолитические изотоксины из актиний S. helianthus, A. equina, A. tenebrosa, Н. magnifica и большинство цитолизинов актиний, образующих П-ую группу, ингибируемых сфингомиелином цитолизинов, получивших название актинопорины. Молекулярная масса полипептидов в белковых фракциях 3, 4 и 6, проявляющих более низкую гемолитическую активность, составляла 5-7 кДа.

Использование второй схемы выделения, включающей осаждение активных полипептидов ацетоном, гель-фильтрацию, ионообменную (рис. 3) и аффинную (рис. 4) хроматографии для разделения цитолизинов и ингибиторов протеиназ и ВЭЖХ (ионообменную и обращенно-фазовую), позволило получить наряду с высокомолекулярными цитолизинами RTX-A и RTX-S II (рис. 5), два

а _ „ .

1

0

0

1

и----Г—«-■—r -I ■„- _ U о

) 20 40 350 400 450 500 550

А™ - . „,4

Рис. 3 (а, б, в). Хроматография цитолизинов, полученных ранее гель-фильтрацией на Акрилексе П-4, на колонке с целлюлозой КМ-32 (2,2x50 см), уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в линейном градиенте концентрации ЫаС1 (0-0,5 М) в том же буферном растворе (3000 мл). Скорость элюции 24 мл/час, объем фракции 6 мл. Отмечены фракции с гемолитической активностью (1-4) и трипсинингибирующей активностью

(4).

о

о.

i,

0.2 _г О

п

Номер фракции

а280

Рис. 4. Аффинная хроматография белковой фракции 4 (рис. 3, в) на колонке (1,5*12 см) с трипсинсефарозой 4В. Фракции пика А элюиро-ваны 0,1 М аммоний-ацетатным буферным раство-ром, рН 4,0, содержащим 0,3 М №С1 и 0,01 М СаСЬ, а фракции пика Б - 0,1 М НС1, рН 1,2, содержащей 0,5 М №С1 и 0,01 М СаС12. Скорость элюции 120 мл/ч, объем фракций 3 мл. Отмечены фракции полипептидов с гемолитической (пик А) и трипсинингибирующей (пик Б) активностями.

Б

0,5

А

О 30 50 90 110

Номер фракции

низкомолекулярных цитолизина Rml и Rmll (М 5,1 и 6,1 кДа), обладающих незначительной гемолитической активностью (рис. 6).

Аминокислотный состав выделенных по первой и второй схемам цитолизинов с Л'-концевым аланином оказался идентичным, в то время как цитолизины с Л'-концсвым серином различались временами удерживания на носителе, аминокислотным составом и величиной гемолитической активности. Это позволило предположить, что новый полипептид является одной из изоформ Radianthus цитолизинов, поэтому он был назван нами RTX-S Г1. Ранее было установлено, что цитолизины второй группы (актинопорины) принадлежат к мультигенному семейству. Так, например, из актинии А. equina выделены и охарактеризованы эквинатоксины I-V, из Н. magnifica -магнификализины I—III, из S. helianthus - стихолизины I—IV и из A. tenebrosa -тенеброзины А, В, С, для двух из последних Л'-концевым аминокислотным остатком является серии.

а210

%В 100

RTXSI1

50

100

50 150 мин

10 МИН

20

Рис. 5. (а и б) Катионообменная ВЭЖХ фракций пика I и 2 (рис. 3, а и б) на колонке иНгорас ТБК СМ-38\\' (21,5x150 мм), уравновешенной 0,1 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0 (раствор А), в ступенчатом градиенте от 0 (раствор А) до 100% раствора В (1 М аммоний-ацетатный буферный раствор, рН 6,0). Скорость элюции 1 мл/мин. (в) ВЭЖХ ЯТХ-Б И на колонке МиЫеовН С]8 в ступенчатом градиенте от 10 до 65% раствора В (ацетонитрил) в растворе А (0,1% водный раствор ТФУ). Скорость элюции 200 мкл/мин.

а220 2.0Г

1.0

А220

1,0 £

120 180 мин

1.0

¡Rml

'А

30 мин

\)

30 мин

Рис. 6. (А) Ионообменная ВЭЖХ объединенных белковых фракций пика А (рис. 4) на колонке 1Л1горас ТБК СМ-38\У, уравновешенной 0,25 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в ступенчатом градиенте концентрации аммоний-ацетатного буферного раствора (0,25-1 М), рН 6,0, за 240 мин. Скорость элюции 1 мл/мин. Отмечены фракции с гемолитической активностью. (Б) Обращенно-фазовая ВЭЖХ белковых фракции пиков а и б (рис. 6, (А)) на колонке ЗПазогЬ С« (Ю><250 мм). Элюция в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (20-60%) в 0,1% водном растворе ТФУ за 60 мин. Скорость элюции 1 мл/мин. Отмечены гемолитически активные белковые фракции, соответствующие цитолизинам Ит! и ЯтИ.

Из актинии О. orientalis были выделены два высокомолекулярных цитолизина (по первой схеме), названные, согласно принятой классификации цитолизинов, Or-А и Ог-G. Метридиолизин из М. senile был выделен по схеме, описанной в литературе, он имел идентичные литературным физико-химические характеристики (табл. 2.).

Физико-химические характеристики высокомолекулярных Radianthus и Oulactis цитолизинов (молекулярная масса, аминокислотный состав, изоэлектрическая точка) подобны аналогичным характеристикам наиболее исследованных актииопоринов тропических видов актиний (табл. 2). Молекулярные массы изотоксинов RTX-A, RTX-G, RTX-S и RTX-S II, рассчитанные из аминокислотного состава, составляют 17249, 17392, 16671 и 19300 Да соответственно. Согласно данным масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) молекулярная масса Or-А и Or-G равна 15353,7 и 16035,9 Да, a RTX-S II - 19280 Да. Значение изоэлектрической точки Radianthus цитолизинов выше 9,0, наиболее близкие значения р/ имеют стихолизины и магнификализнны. Согласно литературным данным к настоящему времени известен лишь один кислый цитолизин, выделенный из актинии Sagartia rosea, величина р/ которого составляет 4,7.

Для аминокислотного состава высокомолекулярных Radianthus и Oulactis цитолизинов характерно высокое содержание основных и гидрофобных аминокислот, тирозина, а также наличие четырех остатков триптофана, как и для большинства актииопоринов (исключение составляют стихолизин IV с тремя и эквинатоксип II с пятью остатками триптофана). Отсутствие цистеина в составе высокомолекулярных Radianthus и Oulactis цитолизинов указывает на их принадлежность к группе II цитолизинов, актинопоринам.

Молекулярная масса Rml и Rmll по данным SDS-электрофореза в градиенте плотности ПААГ составляет 5100 и 6100 Да (табл. 2). Для аминокислотного состава этих полипептидов характерно отсутствие остатков триптофана и метионина, а также наличие четырех остатков цистеина, что позволяет предположить наличие в молекуле двух внутримолекулярных дисульфидных связей. Сравнительный анализ физико-химических характеристик Rml и Rmll и низкомолекулярного цитолизина из актинии Т. felina, теалиатоксина (М 7800 Да), относящегося к первой группе цитолизинов актиний, показал, что они имеют подобный аминокислотный состав и близкие значения молекулярных масс и изоэлектрических точек.

Установлено, что прединкубация с экзогенным сфингомиелином ингибирует гемолитическую активность актииопоринов. Мембранолитическое действие Radianthus и Oulactis цитолизинов также блокируется дисперсией СМ, причем для достижения 100%-ного ингибирования требуется эквимолярное количество этого липида. Такой же эффект оказывает нормальная сыворотка крови, содержащая СМ. Обработка эритроцитов кролика стафилококковой сфингомиелиназой предотвращает их гемолиз Radianthus цитолизинами, что указывает на прямую зависимость функциональной активности цитолизинов от наличия в молекуле фосфосфинголипида фосфорилхолиновой группировки.

Величины гемолитической активности Oulactis цитолизинов Or-А и Or-G, определенные на эритроцитах мыши, на два порядка ниже величины активности цитолизинов тропических видов (табл. 2). Различия в величинах удельной гемолитической активности цитолизинов тропических видов (табл. 2) могут быть объяснены, по-видимому, различным содержанием сфингомиелина в используемых эритроцитах млекопитающих.

Изучение липидной специфичности метридиолизина, отнесенного к группе IV цитолизинов актиний, ингибируемых холестерином, показало, что 90% его гемолитической активности ингибируется более чем тысячекратным молярным избытком холестерина, а также фосфатидилхолина, что отличает этот цитолизин от высокоспецифичных сфингомиелинингибируемых Radianthus и Oulactis цитолизинов.

Методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое 8Юг показано, что высокоочищенные препараты ЯсаНапЛиз и Ои1асИз цитолизинов не проявляют ферментативной активности (фосфолипазной Аг, С, Д и сфингомиелиназной). В процессе выделения эти цитолизины были отделены от полипептидов с фосфолипазной активностью на стадии ионообменной хроматографии. Высказано предположение, что фосфолипазы и цитолизины, продуцируемые представителями различных видов семейства Сшс1апа, являются сртологами, имеющими общий анцестральный ген.

Значения острой токсичности высокомолекулярных цитолизинов актиний для млекопитающих на порядок ниже тех же значений для ракообразных. Аналогичная картина наблюдается и для нейротоксинов актиний, что, по-видимому, связано с их апломональной ролью.

Таблица 2. Некоторые физико-химические характеристики цитолизинов актиний

ЛДзо, мг/кг, (в/в) Гемолити-

Вид актинии Цитолизины M, кДа Р/ ческая активность, ГЕ/мг белка Ингиби-рование

Heteractis магнификализин I 19,0 9,4 0,140 3,6х104 СМ

magnifica магнификализин II 19,0 10,0 0,320 ЗЗхЮ4 »

магнификализин III 19,0 9,1 »

Stichodactyla helianthus стихолизин I стихолизип II стихолизин III 17,6 17,6 17,5 8,7 9,5 9,7 0,100 0,91хЮ4 3,14хЮ4 4,82x104 СМ » »

стихолизин IV 19,2 9,8 1,67x10" »

Actinia equina эквипатоксин I 19,0 9,8 0,023 см

эквинатоксин II 19,0 10,5 0,035 3,61х104 »

эквинатоксии III 19,0 10,5 0,083 »

Actinia тенеброзин А 19,8 9,4 7,1х105 см

tenebrosa тенеброзин В 19,4 2,3x105 »

тенеброзин С 20,2 >10 1,7x105 »

Oulactis Ог-А 15,3 16,36 2,9х102 см

orientalis Or-G 16,0 3,2х102 »

Radianthus RTX-S II 19,28 10,0 0,007* 3,6х104 см

macrodactylus RTX-A RTX-S 20,0 20,0 9,8 9,8 0,005* 0,005' 3,5х104 5,0x104 1,0x104 20 » »

RTX-G Rml 20,0 5,1 10,5 9,2 0,01* >10 »

R ш II 6,1 9,3 >10 25

Teaiia felina теалиатоксин 7,8 9,0 + -

Metríilium

senile метридиолкзин 80 5,7 5,0 ЗхЮ3 X

* Внутрибрюшинная инъекция Radianthus цитолизинов экспериментальным мышам.

Мембранолитическое действие двух фракций высокомолекулярных Radiantlms цитолизинов с относительно низкой токсичностью (20 мг/кг) (А и Б), полученных ионообменной хроматографией, исследовано также на мышах с привитой карциномой Эрлиха (асцитный вариант). Антиопухолевое действие фракции А (400 ГЕ/мышь) и фракции Б (300 ГЕ/мышь) проявлялось уже через 12 суток лечения - опухоль не обнаруживалась у 40% животных первой группы и 100% второй. Продолжительность жизни экспериментальных мышей в результате лечения

цитолизинами фракции Б увеличивалась на 80% по сравнению с продолжительностью жизни животных, леченных цитолизинами фракции А. Установлено, что цитотоксическая доза (1С50) гомогенных препаратов КТХ-А, ЯТХ-Б и ЯТХ-0 составляет 6,0, 1,25 и 10 мкг/мл соответственно.

Принадлежность полипептидов Ягп1 и ЯтН к 1-й группе цитолизинов актиний была подтверждена данными по их биологической активности. Подобно теалиатоксину, они обладают невысокой гемолитической активностью (табл. 2), значения которой на три порядка ниже, чем у высокомолекулярных ЯасИап11гш цитолизинов. Кроме того, низкомолекулярные ЯасИаШИиз цитолизины, как и теалиатоксин, проявляют гистаминолитическую активность: при совместном введении цитолизинов и дигидрохлорида гистамина экспериментальным крысам наблюдалось увеличение латентного периода развития «микрошока» и уменьшение времени десенсибилизации по сравнению с контрольной группой животных.

Таким образом, согласно физико-химическим характеристикам, липидной специфичности и биологической активности выделенные цитолизины можно отнести к трем группам: низкомолекулярные КасИапМш цитолизины Кт! и ЯтП - к группе I, высокомолекулярные Лао?/аи//ги.у и Ои1асШ цитолизины ЯТХ-А, ЯТХ-Э, ЯТХ-БН, КТХ-в, Ог-А и Ог-в - к группе II (актинопоринам) и метридиолизин - к группе IV.

3. Изучите мембранолитического действия цитолизинов на модельные

мембраны

Удобной моделью для получения информации о механизмах включения в искусственные липидные системы пороформирующих белков и пептидов являются липосомы различного липидного состава и степени гетерогенности. Нами был использован один из наиболее простых и эффективных способов - изучение ионной проницаемости липосом по выходу ионов К+. В качестве моделей использовались как многослойные, так и однослойные липосомы. Применение ионоселективного К+ электрода позволило осуществить непрерывную регистрацию транспорта ионов К+ не только через модельные, но и через биологические (эритроцитарные) мембраны.

Зависимость литического действия КТХ-А от наличия в мембране СМ изучали на липосомах, сформированных из общей фракции фосфолипидов яйцеклеток морского ежа $1гоп§у1осеШгоШ$ 1Мегте<Лиз, в мембранах которых СМ практически отсутствует (рис. 7). Показано, что даже высокие концентрации цитолизина не влияют на проницаемость таких мембран, в то время как введение в состав мембран липосом 5% СМ значительно увеличивает чувствительность липосом к действию ИТХ-А. Сравнение действующих концентраций цитолизина на вышеописанные липидные модели показывает, что его специфичность по отношению к СМ на три порядка выше, чем к остальным липидным компонентам. Результаты исследования

Рис. 7. Выход ионов К+ из липосом, индуцируемый ЯТХ-А. Состав липосом: 5% (по массе) СМ, 12,5% X, 82,5% фосфолипидов яйцеклеток морского ежа (кривая 1) или 12,5% X и 87,5% фосфолипидов яйцеклеток морского ежа (кривая 2). Стрелкой показан момент контрольного добавления гликозида голотурина А, пороформирующего токсина из голотурии. Концентрация ЯТХ-А 50 мкг/мл (кривая 2), 0,050 мкг/мл (кривая 1). Состав среды, подобный составу солей в морской воде: 405 мМ ШС1, 1 мМ КС1, 10 мМ СаС12, 53 мМ МеС12, 2,25 мМШНСОз, 31 мМ MgS04.

К+, мкМ

мембранолитического действия ЯТХ-А на системах многослойных липосом хорошо согласуются с экспериментальными результатами исследования полиморфизма липидов в модельных и биологически?: мембранах, анализ которых проведен Василенко И.А. и Боровягиным В.Л. (1990 г.) Показано, что в жидкокристаллической фазе происходит образование изоморфных структур, дестабилизирующих мембрану. Хотя, как известно, СМ повышает микровязкость гидрофобной части липидного матрикса и увеличивает устойчивость мембраны, его включение в липосомы, сформированные из фосфолипидов яйцеклеток морского ежа, способствует, по-видимому, образованию жидкокристаллической фазы благодаря способности СМ принимать в присутствии X и ФХ динамическую форму обратного конуса. Литературные данные свидетельствуют о том, что актинопорины способны модулировать в многослойных липосомах, состоящих из бинарных или тройных смесей ФХ, СМ и ПОФХ, полиморфные превращения липидов. Последние сопряжены с нарушением организации бислойной липидной мембраны и с появлением неламеллярной гексагональной Нц-фазы, облегчающей образование пор актинопоринами. Наличие этой фазы в многослойных липосомах, модифицированных эквинатоксином II, обнаружено методами РТШ-спсктроскоппи и 'Н и 3 Р ЯМР-спектроскопии.

Рисунок 8 (а) демонстрирует кинетику выхода ионов К+ из липосом, содержащих 5% СМ, при действии различных концентраций ЯТХ-А. Зависимость индуцированной ионной проницаемости липосом от концентрации, отраженная в полулогарифмических координатах (рис. 8 (б)), имеет экспоненциальный характер в области насыщения, что типично для каналоформеров. При увеличении содержания СМ в липосомах до 25% заметно увеличивается скорость начального выхода ионов К+ из липосом, но диапазон действующих концентраций цитолизина не изменяется, что может свидетельствовать либо об увеличении скорости связывания 11ТХ-А с мембраной и, соответственно, уменьшении времени формирования каналов, либо об увеличении количества формируемых каналов при изменении соотношения липид:белок.

320

К+, мкМ

160

мин

-!д С (г/мл)

Рис. 8. (а) Выход ионов К* из липосом (3,5 мг/мл) при действии различных концентраций ЯТХ-А, нг/мл: (1) - 340, (2) - 149, (3) -127,5, (4) - 85, (5) - 42,5, (6) -17; (б) зависимость выхода ионов К+ из липосом (за 10 мин) от концентрации токсина. Состав липосом (по массе): 5% СМ, 12,5% X, 82,5% общей фракции фосфолипидов яйцеклеток морского ежа. Состав среды в липосомах: 100 мМ КС1, 1 мМ НЕРЕБ-Трис буфер, рН 7,4. Состав наружной среды: 100 мМ №С1, 1 мМ КС1, 1 мМ НЕРЕБ-Трис буфер, рН 7,4.

Кроме того, увеличение СМ в мембране может также стимулировать образование жидкокристаллической фазы и появление дефектов в мембранном интерфейсе на границе между несмешивающимися липидными фазами, а также способствовать изменению толщины мембраны. Предполагается, что накопление актинопорина и предшествующее образованию пор связывание с мембранными фосфолипидами происходит в местах таких дефектов. Известно, что молекулы СМ, уплотняя упаковку молекул фосфолипидов в пределах бислоя, имеют определенное

преимущество при связывании с полипептидом в пределах образуемых протеолипидных доменов благодаря более сильным по сравнению с другими фосфолипидами водородным связям.

Значительную роль в индуцировании мембраноактивными соединениями ионной проницаемости мембран оказывает поверхностный мембранный потенциал (ф0), создаваемый в водной фазе поверхностными зарядами фосфолипидных головок. Влияние поверхностного потенциала мембраны на активность ЯТХ-А изучено путем введения в липидный состав мембран катионных и анионных детергентов, добавляемых в концентрациях меньших, чем критическая концентрация мицеллообразования. Так, введение цетилтриметиламмония бромида позволило создать на мембране потенциал до +70 мВ, а введение додецилсульфата натрия - потенциал до -40 мВ. Для создания положительного и отрицательного потенциалов были использованы также стеариламин и дицетилфосфат соответственно. Зависимость, показанная на рисунке 9, может быть объяснена в рамках теории Гуи-Чепмена снижением или увеличением скорости трансмембранного переноса ионов К+ вследствие изменения их примембранной концентрации при изменении величины и знака поверхностного потенциала мембраны.

Рис. 9. Кинетика выхода ионов К+, индуцированного ИТХ-А (66 нг/мл), из липосом. Состав липосом (по массе): 5% СМ, 12% X, 73% ФХ, 10% стеариламина (1) или БОБ (додецилсульфата натрия) (3); 5% СМ, 12,5% X, 77,5% ФХ, 5% дицетил-фосфата (2) или ЦТАБ (цетилтриметиламмония бромида) (4). Измерения проводили в отсутствие (1, 2) и в присутствии в среде 10"4 М ЗОБ (3) или 10"4 М ЦТАБ (4). Концентрация липидов — 1 мг/мл. Остальные условия см. в подписи к рис. 8.

Влияние значения рН среды на вызванный цитолизином ЯТХ-А выход ионов К+ из липосом, содержащих СМ, показан на рисунке 10. Известно, что при инкубации в средах в широком диапазоне значений рН мембраны липосом не разрушаются, не изменяется и их проницаемость. Увеличение выхода ионов К+ из липосом при значениях рН выше 4,0 может быть связано с протонированием отрицательно заряженных карбоксильных групп, рК которых находится в этой области, и нейтрализацией положительно заряженных остатков лизина и аргинина, которые, как будет показано ниже, экспонированы в формируемую цитолизином водную пору. Мембранотропное действие ЯТХ-А, как и стихолизина II из актинии 5. 1геИап1Ии$, зависит от величины рН (максимально в щелочной области). При этом

Рис. 10. рН-зависимость выхода ионов К+ из липосом при действии ЯТХ-А (50 нг/мл) за 5 мин (в % от полного выхода). Состав липосом (по массе): (1) 5% СМ, 12,5% X, 82,5% общей фракции фосфолипидов яйцеклеток морского ежа. (2) 5% СМ, 12,5% X, 77,5% ФХ, 5% дицетилфосфата. Кривая - результат аппроксимации экспериментальных данных полиномом 4-й степени (по методу наименьших квадратов). Состав среды формирования липосом: 100 мМ КС1, 5 мМ НЕРЕБ-Трис буферный раствор, рН 7,4; состав среды инкубации липосом: 100 мМ ШС1, 1 мМ КС1, 5 мМ НЕРЕЗ-Трис буферный раствор, рН 7,4. Концентрация липидов - 2 мг/мл.

различия в липидиом составе липосом, при условии постоянного содержания в них сфингомиелина, не влияют на величину ионной проницаемости, вызываемой действием цитолизинов.

Выход ионов К+ из липосом, индуцируемый метридиолизином, не зависит от присутствия в составе мембран холестерина (рис. 11), что согласуется с полученными нами результатами изучения липидной специфичности этого цитолизина. Существует мнение, что мембранный холестерин способствует процессу самоассоциации метридиолизина на мембранах клеток-мишеней.

К+, %

Рис. 11. Кинетика выхода ионов К из липосом (в % от полного выхода) при действии метридиолизина (14 мкг/мл). Состав липосом (по массе): 5% СМ (1, 2), 5% дицетилфосфата (1,2), 77,5% ФХ (1) или 90% (2), 0% X (2) или 12, 5% (1). Состав среды формирования липосом: 100 мМ КС1, 5 мМ Трис-НС1 буферный раствор, рН 7,4; Состав среды инкубации липосом: 100 мМ №С1, 1 мМ КС1, 5 мМ Трис-НС1 буферный раствор, рН 7,4. Концентрация липидов - 2 мг/мл.

Электрические характеристики каналов, образуемых в мембранах КасИатИт, Огйасйь цитолизинами и метридиолизином, установлены методом регистрации электрической проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ) в режиме фиксации потенциала.

Показано, что действующие концентрации ЛасИаШкив цитолизинов КТХ-А и ЯТХ-ЗП на БЛМ различного липидного состава зависят от наличия и количества СМ в мембране (рис. 12, 13), а также от длины углеводородного радикала липида. Так, при одинаковой концентрации действующего цитолизина ИТХ-А проводимость мембран, сформированных из а-моноэруцина (С22), приблизительно в 2 раза выше проводимости мембран, сформированных из а-моноолеина (С^). При введении СМ (С20) в мембраны из а-моноолеина в соотношении 1:1 эффект сохраняется. Полученные данные можно объяснить тем, что увеличение длины углеводородного радикала фосфолипида благоприятствует образованию жидкокристаллической фазы, которая, в свою очередь, предпочтительна для образования пор цитолизинами.

Согласно современным воззрениям введение СМ в мембраны, содержащие X, должно приводить к уплотнению липидов и формированию липидных микродоменов, рафтов, способствующих разделению фаз в мембране. Предполагается, что образующиеся при этом на границе раздела фаз дефекты облегчают контакт цитолизина с липидным интерфейсом, вследствие чего концентрация полипептида, необходимая для формирования каналов, может снижаться.

1 2 3 Ig С (нг/мл)

Рис. 12. Зависимость проводимости БЛМ от концентрации RTX-A в водной среде (0,1 М KCl, pH 7,0, 21°С). Токсин введен по обе стороны мембраны. Каждая точка соответствует среднему значению проводимости пяти измерений через 15 мин после формирования мембраны. Потенциал на мембранах 20 мВ. (1) 0,3% а-моноолеин в н-гептане; (2) 0,3% а-моноолеин + 0,3% X + 0,3% СМ (1:1:1) в н-октане; (3) 0,3% а-моноолеин + 0,3% СМ (1:1) в н-гептане. Наклон кривых: (1) — 3,8; (2)-3,9; (3)-4,3.

Независимо от состава и наличия в БЛМ сфингомиелина изменение проводимости мембран пропорционально четвертой степени концентрации цитолизина в водной среде (рис. 12) как при одностороннем, так и при двустороннем его введении в ячейку с мембраной. Это означает, что элементарная проводящая структура представляет собой агрегат, состоящий из четырех молекул полипептида. Ранее было показано, что проводимость каналов, формируемых в БЛМ стихолизином II, пропорциональна третьей и четвертой степени его концентрации.

а

Рис. 13. Зависимость проводимости каналов, образуемых цитолизином 1ПХ-8 II, от его концентрации (а, б, в). Мембраны сформированы из 1% МО (моноолеин) + 1% СМ (10:1) в н-гептане. Состав среды: 0,1 М ЫаС1, 5 мМ Трис-НС1 буферный раствор, рН 7,2. Цитолизин введен в водную фазу с одной стороны мембраны. Указаны действующие концентрации 11ТХ-8 II. Мембранный потенциал 40 мВ.

Аналогичный характер мембранотропного действия проявляют цитолизины Ог-А и Ог-й (рис. 14, а, б, в). Однако проводимость каналов, формируемых в БЛМ Он/ас/ю цитолизинами, значительно ниже, чем каналов, образуемых в мембранах актинопоринами тропических видов актиний.

а

15 с 0,6 нСм|—

20 _________!■? мкг/мп

б

0,08 нСм I П ЛЧ*

[ 0,3 мкг/мл

40 МВ/Т1 1,2 нСм | 10 мВ_] в

1,2нСм| 10 мВрТл)—0,5 мкг/мл

Рис. 14. Зависимость проводимости каналов, формируемых ОиЫсйь цитолизинами, от их концентрации (а-в) и потенциала, приложенного к мембране (б). Мембраны сформированы из 1% МО + 1% СМ (10:1) в н-гептане. Состав среды: 0,1 или 1 М №С1, 10 мМ НЕРЕБ-Трис буферный раствор, рН 7,2 или 8,0. Цитолизины введены по обе стороны мембраны. Указаны действующие концентрации цитолизинов.

Нанограммовые количества ЯТХ-А как при одно-, так и двустороннем введении вызывают дискретные флуктуации тока через образуемые им одиночные ионные каналы (рис. 15), время нахождения которых в открытом состоянии составляет около 10-40 мин и зависит от величины потенциала, приложенного к мембране. Можно предположить, что снижение проводимости не связано с выходом канала из мембраны, а обусловлено его переходом в низкопроводящее состояние, т.к. проводимость мембраны не снижается после перфузии цис- отделения ячейки раствором, не содержащим цитолизина ЯТХ-А, что свидетельствует о его необратимом встраивании.

Рис. 15. Дискретные изменения тока через БЛМ при действии RTX-A. Состав БЛМ: 0,3% а-моноэруцина + 0,3% СМ (1:1) в н-гептане. Токсин в концентрации 8 нг/мл введен по обе стороны мембраны. Состав среды: 0,1 М KCl, pH 7,0, 21°С. Указан потенциал на мембране.

Проводимость каналов выше при положительном потенциале со стороны введения ЯТХ-А (рис. 16). Асимметричность относительно нуля вольт-амперной характеристики указывает на несимметричное распределение полипептида в пределах бислоя, а различия в величине проводимости при изменении полярности - на изменение конфигурации канала или его устья, либо на перераспределение ионов вблизи него. Нелинейность вольт-амперной характеристики свидетельствует о том, что при увеличении трансмембранного напряжения каналы начинают закрываться, но не выходят из бислоя, а подвергаются потенциалозависимым изменениям конформации или ориентации в мембране.

Г

3,6 пА

30 с

-100 мВ

пА

30

10

160 мВ

Рис. 16. Зависимость проводимости одиночного канала, образованного ЯТХ-А (100 нг/мл), от потенцшта на мембране (а), вольт-амперная характеристика одиночного канала (б). Токсин введен со стороны электрода, знак потенциала которого указан на рисунке. Состав среды и мембран см. в подписи к рис. 12(1).

Исследование проницаемости каналов для органических катионов (тетраметил-, тетраэтил- и тетрабутиламмония) позволило оценить размер канала, формируемого в БЛМ ЯТХ-А. В то время как первые два иона проникают через каналы и не влияют на проводимость БЛМ, последний обратимо блокирует их (рис. 17). Можно считать, что поперечное сечение канала превышает размер иона тетраэтила.ммония и незначительно отличается от размера иона тетрабутиламмония, равных, согласно молекулярным моделям, 7,5 и 11 А соответственно.

Рис. 17. Блокирование каналов, образуемых ЯТХ-А, тетрабутиламмонием (ТБА). Раствор содержит 0,1 М КС1. Потенциал на БЛМ 50 мВ. (1) введение в г/г/с-отделение 5 мМ ТБА-НБС^, (2) перфузия г/ыс-отделения раствором 0,1 М КС1, (3) контрольное введение с цис-стороны 5 мМ КаН8С>4, вызванное отсутствием хлорида ТБА.

0,1 наЦ

1 мин

Таким образом, физико-химические характеристики и результаты исследования мембранотропного действия НасИаШИш и Ои1асИ.ч цитолизинов свидетельствуют о том,

что они относятся ко Н-й группе цитолизинов актиний - актинопоринам. Установлено, что при наличии общих закономерностей величина проводимости формируемых актинопоринами каналов зависит от многих факторов, таких как величина и знак потенциала, приложенного к мембране, липидный состав, среда формирования каналов, градиент концентрации ионов на мембране и др.

Изучение влияния низкомолекулярного ИасИатНиз цитолизина КтП на проводимость мембран различного липидного состава (рис. 18) показало, что токсин, подобно актинопоринам, вызывает дискретные флуктуации тока через БЛМ, состоящие из смеси липидов (рис. 18, в), но его действующие концентрации на два порядка выше, чем концентрации КТХ-А, индуцирующие аналогичное увеличение проводимости БЛМ.

Рис. 18. Влияние ЯтИ на проводимость БЛМ различного липидного состава. Мембраны сформированы из 1% МО в н-гептане (а); 1% МО + 1% X (1:1) в н-гептане (б); 1% МО + 1% X + 1% СМ (1:1:1) в н-гептане (в). Состав водной фазы: ЮОмМ №С1, 5мМ НЕРЕЭ-Трис буферный раствор, рН 7,5. Указаны концентрации КтП и мембранный потенциал.

При однократной замене буферного раствора в экспериментальной ячейке наблюдается исчезновение флуктуаций тока через БЛМ (рис. 18, б). Это позволяет высказать предположение о слабом и обратимом характере взаимодействия КтП с липидным бислоем, содержащим СМ, что отличает его от актинопорина КТХ-А, связывающегося

Рис. 19. Влияние Rmll (200 нг/мл) на проводимость БЛМ до его отмывки (а) и после отмывки (б). Состав мембран, водной фазы и потенциал на мембране см. в подписи к рис. 18 (в).

Несмотря на отсутствие специфического связывания со сфингомиелином, как было установлено дифференциальной сканирующей калориметрией (см. ниже глава 4), при взаимодействии с мембраной цитолизин ЯшП формирует в ней поры. Очевидно, этому благоприятствует значительный положительный заряд (р/ 9,2) и высокая гидрофобность молекулы ЯшИ, однако наличие в ней дисульфидных связей может препятствовать переходу в конформационное состояние, способствующее необратимому связыванию с липидным матриксом, чем и объясняется легкость отмывки цитолизина от БЛМ. Наличие у низкомолекулярных цитолизинов актиний антигистаминной активности косвенно указывает на возможность их взаимодействия с белковыми рецепторами цитоплазматических мембран.

Введение метридиолизина в водный раствор, омывающий БЛМ, вызывает увеличение ее проводимости (рис. 20), причем эффект не зависит от липидного состава мембраны и в случае двустороннего введения менее выражен. В средах с высокой ионной силой (1 М1ЛС1) действие метридиолизина отсутствует вплоть до

1000 нг/мл

80 пСм

1000 нг/мл jo мв

600 пСм|_

5с

200 нг/мл

с БЛМ необратимо.

20 мВ\

500

250

ПА

0 5 10 15

мин

Рис. 20. Зависимость проводимости БЛМ, модифицированной метридиолизином (1,3 мкг/мл), от времени при его одностороннем (I) и двустороннем (2) введении. Состав мембран: • - 2% азолектин в н-декане; о - 2% азолектин + 1% холестерин (1:1) в н-декане. Состав среды: 0,1 М ЫС1, 0,01 М аммоний-ацетатный буферный раствор, рН 6,0. Потенциал на мембране 66 мВ.

концентраций токсина, достигающих 100-120 мкг/мл (1,5 мкМ). При разведении среды методом отмывки на одной мембране проводимость БЛМ начинает возрастать. На предельной чувствительности установки были зарегистрированы отдельные скачки трансмембранного тока величиной 0,1-0,2 пА и временем жизни не менее 30 сек (рис. 21), которые можно объяснить возникновением единичных проводящих структур или началом деструкции липидного матрикса мембраны под воздействием метридиолизина. Дальнейшее непрерывное увеличение проводимости БЛМ свидетельствует либо о формировании большого числа каналов, либо о продолжающемся процессе деструкции мембраны.

/ц

J

У

То,1 пА 25 с

Рис. 21. Дискретные изменения тока через БЛМ, индуцируемые метридиолизином, добавленным по обе стороны мембраны. Состав БЛМ и среды см. в подписи к рис. 20. Указан потенциал на мембране.

107 мВ

Симметричная вольт-амперная характеристика БЛМ, модифицированной метридиолизином (рис. 22, кривая 1), показывает, что формируемые им каналы потенциалозависимы. Значительные изменения в действии метридиолизина на БЛМ наблюдаются при добавлении в раствор ионов уменьшается на 2-3 порядка

интегральная проводимость (рис. 23) и изменяется вольт-амперная характеристика БЛМ (рис. 22, 2). Появление участка с отрицательным динамическим сопротивлением при потенциале выше 50 мВ указывает на значительный положительный заряд и наличие потенциального барьера в устье проводящих структур. При высоком положительном

потенциале, приложенном к мембране (107 мВ), потенциальный барьер и блокируют каналы.

ПА

ионы Ьа

преодолевают

40

20 Г/У

-80 -40 40 80

7/ -20

-40

Рис. 22. Вольт-амперные характеристики БЛМ, модифицированных метридиолизином (1,3 мкг/мл), введенным по обе стороны мембраны, без добавления (1) и с добавлением 0,5 мМ ЬаСЬ с одной стороны мембраны (2). Остальные условия см. в подписи к рис. 20.

ЬаС13

10 20 МИН

Рис. 23. Изменение трансмембранного тока при действии метридиолизина на БЛМ (1), ионов Ьа3+ (2) и Р" (3). Стрелками указаны моменты добавления токсина и солей: М - метридиолизин (конечная концентрация 1,3 мкг/мл), ЬаСЬ (конечная концентрация 1 мМ), (конечная концентрация 3,5 мМ). Остальные условия см. в подписи к рис. 20. Напряжение на мембране 107 мВ.

Напряжение, противоположное по знаку и равное по величине, деблокирует каналы. Анионы Р также деблокируют канал, модифицированный катионами Ьа3+, даже при значительном запирающем напряжении (рис. 23, кривая 3).

Исходя из размера гидратированного иона лантана (5 А) и учитывая незначительное уменьшение проводимости БЛМ в присутствии сахарозы (размер молекулы ~5 А), можно предположить, что диаметр пор, первоначально образуемых метридиолизином и проницаемых для электролита, близок к этой величине. Отсутствие четкой концентрационной зависимости проводимости БЛМ, индуцированной метридиолизином, свидетельствует о том, что его механизм действия отличен от такового высоко- и низкомолекулярных КасИапЛт цитолизинов. В высоких концентрациях этот токсин способен влиять на проводимость мембран подобно поверхностноактивным соединениям, нарушающим упаковку липидов в мембране. Причина таких отличий, возможно, кроется в физико-химических свойствах метридиолизина, его высокой молекулярной массе и заряде (р/ 5,7). Более низкое, чем у КасИапЛиз цитолизинов, электростатическое взаимодействие метридиолизина с мембраной коррелирует с величиной его гемолитической активности (табл. 2).

Мембранолитическое действие ИасИап&из цитолизинов и метридиолизина было исследовано также на биологических мембранах. В качестве одной из моделей использованы эритроциты (кролика, собаки, человека). Кинетические кривые выхода ионов К+ и гемоглобина (рис. 24, а и б) свидетельствуют о значительном опережении (приблизительно на порядок) выхода ионов К+ при действии различных концентраций ИТХ-А: при концентрации цитолизина 500 нг/мл время полувыхода (I/:) для ионов К+ составляет 30 сек, а для гемоглобина - 5 мин. Как видно, диапазон действующих концентраций актинопорина на эритроциты и липосомы (рис. 8, а) аналогичен.

400

К+, МКМ

200

Рис. 24. Выход ионов К+ (а) и гемоглобина (б) из эритроцитов кролика (1%-ная суспензия) при действии ЯТХ-А: концентрация, нг/мл: (1) - 1000, (2) - 500, (3) -250, (4) - 125, (5) - 70, (6)- 35. Состав среды: 0,9% №0, 1 мМ КС1, 10 мМ глюкоза, 5 мМ Трис-НС1 буферный раствор, рН 7,4.

Согласно литературным данным цитолизины актиний действуют лишь на клетки эукариот, что косвенно свидетельствует об их специфическом взаимодействии со сфингомиелином, который, как известно, является неотъемлемым компонентом цитоплазматических мембран эукариот, но отсутствует в мембранах прокариот.

Исследовать влияние СМ на пороформирующую активность цитолизина оказалось возможным с помощью уникальной биологической модели - яйцеклеток морского ежа S. intermedins (рис. 25, кривая 1), в мембранах которого аминофосфолипиды представлены в основном церамидами, а СМ отсутствует или имеется в следовых количествах. Контрольное добавление голотурина А к яйцеклеткам, не чувствительным к действию RTX-A, и индуцированный им выход ионов К+ из эритроцитов (кривая 2) показывают, что пороформирующая активность цитолизина, в отличие от таковой гликозида, зависит от присутствия в липидном составе мембран сфингомиелина. Таким образом, зависимость пороформирующей активности актинопоринов от наличия и количества СМ в составе мембран, обнаруженная в экспериментах на искусственных моделях, характерна и для биологических мембран.

К , мкМ

О 4

8 мин

Рис. 25. Выход ионов К из яйцеклеток морского ежа 51. intermedius (1) и эритроцитов кролика (2) при действии КТХ-А. Состав среды: (1) - подобен составу солей в морской воде: 405 мМ №С1, 1 мМ КС1, 10 мМ СаС12, 53 мМ МвС12, 2,25 мМ ШНСОз, 31 мМ MgS04; (2) - см. в подписи к рис. 24. Концентрация ЯТХ-А: 50 мкг|мл (1), 100 нг/мл (2). Стрелкой показан момент добавления к яйцеклеткам голотурина А.

Известно, что количество СМ составляет чуть менее 20%, а в сумме с ФХ -около половины общего количества фосфолипидов эритроцитарной мембраны, причем оба липида находятся преимущественно в ее наружном слое. Сложная молекулярная организация эритроцитарной мембраны, несимметричное распределение в ней фосфолипидов, наличие мембранных белков, стабилизирующих липидную структуру, общий отрицательный заряд мембраны могут влиять на пороформирующую активность актинопоринов, ее зависимость от значения рН среды (рис. 26) и от наличия двухвалентных катионов (рис. 27), стимулирующих, как известно, полиморфные превращения липидов в мембранах.

Рис. 26. рН-Зависимость активности ЯТХ-А, определенная по выходу ионов К+ из эритроцитов кролика за 5 мин (в % от полного выхода). Состав среды эритроцитов: 100 мМ №С1, 1 мМ КС1, 50 мМ НЕРЕв-Трис буферный раствор, рН 7,4. Объем 1%-ной суспензии эритроцитов 3 мл. Цитолизин (125 нг) добавлялся в суспензию после инкубации в 5 мкл буферного раствора.

4 мин

Рис. 27. Влияние двухвалентных катионов на кинетику выхода ионов К+ из эритроцитов человека при действии RTX-A. Состав среды: 150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 5 мМ Трис-HCl буферный раствор, pH 7,4 (1-3) в присутствии 1 мМ СаС12 или MgCl2 (2), 1 мМ EDTA (3). Штриховой линией показано изменение выхода ионов К+ из эритроцитов в присутствии EDTA (этилендиамин-тетрауксусной кислоты) при добавлении в среду СаС12 (указано стрелкой) до концентрации 1 мМ.

Для мембранолитического действия метридиолизина на эритроциты кролика характерно наличие большого латентного периода (3-4 мин) (рис. 28), отсутствующего у цитолизинов П-й группы.

Рис. 28. Выход ионов К+ (а) и гемоглобина (б) из 1%-ной суспензии эритроцитов (1 мл) при действии метридиолизина (концентрация 28 (кривая 1), 22 (2), 12 (3), 8 (4), 6 (5), 3 (6) мкг/мл). Состав среды см. в подписи к рис. 24.

Согласно проведенным исследованиям при действии обеих групп цитолизинов актиний на эритроциты первоначально образуются небольшие, проницаемые для ионов К+ структуры. Индуцируемый ЯТХ-А выход гемоглобина (67 А) начинается в результате осмотического лизиса эритроцитарной мембраны, после выхода из клетки 90% ионов К+. По-видимому, гемолиз, индуцируемый метридиолизином, начинается уже после выхода из эритроцитов около 60-70% ионов К+ и происходит вследствие потери целостности липидного матрикса.

Сравнительное исследование действия НасИапЛия цитолизинов 1-й и 11-й групп на эритроцитарную мембрану показало, что для достижения одинаковых значений проницаемости мембраны для ионов К+ требуется в 30-50 раз большая концентрация низкомолекулярного цитолизина ЯшН, чем актинопорина КТХ-А (рис. 29, б).

Рис. 29. Кинетика выхода ионов К+ из эритроцитов при действии актинопорина RTX-A (а) и цитолизина Rmll (б). Концентрации RTX-A: 0,05 (кривая 1), 2 (2), 2,5 (3) и 4,0 (4) нМ; концентрации Rmll: 62,5 (1) и 125 (2) нМ.

Методом точечной фиксации потенциала проведено изучение характеристик канала, формируемого актииопорином RTX-A в изолированном фрагменте мембраны эритроцита кролика, который сохраняет стабильность на протяжении длительного времени. В эритроцитарном фрагменте, выделенном из мембраны в конфигурации «1И1Уе-ом/», в которой цитоплазматическая сторона мембраны находится в наружном растворе, создаются идеальные условия для фиксации напряжения при протекании токов через одиночные каналы. Добавление RTX-A в экспериментальную камеру вызывает скачкообразное увеличение амплитуды выходящего тока (рис. 30), соответствующее встраиванию белковых молекул в мембрану.

Рис. 30. Характер изменения тока при встраивании в эритроцитарную мембрану RTX-A (1,2 нМ). Указан потенциал на мембране.

Через несколько минут наступает разрушение фрагмента. Характер действия актинопорина на фрагмент эритроцитарной мембраны подобен его действию на БЛМ. В обоих случаях одинаковые действующие концентрации токсина индуцируют близкие по величине дискретные изменения тока.

Примеры скачков тока (рис. 31) при последовательном образовании пор примерно одинаковой проводимости (а) и вольт-амперные характеристики мембранного фрагмента (б), имеющие линейный характер и соответствующие образованию одной, двух и четырех элементарных пор, показывают, что элементарная проводящая структура имеет строго определенные размеры. Эти результаты согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении проводимости БЛМ, модифицированных актинопорином, которые показывают, что канал формируется четырьмя молекулами полипептида.

3 пА|_ 500 мс

flJT

3 nAL

100 мс

Рис. 31. Примеры скачков тока через одиночные каналы, формируемые в мембранном фрагменте ЛТХ-А (а) и вольт-амперные характеристики (б), соответствующие образованию одной, двух, четырех элементарных пор с проводимостью 290 (1), 587 (2) и 1175 (З)пСм.

О 20 40 мв

Согласно величине проводимости канала, образуемого RTX-A в эритроцитарной мембране и равной 300-400 пСм, его диаметр составляет около 6-10 А. Вольт-амперная характеристика одиночного канала в асимметричных условиях, при которых входящий ток переносился ионами калия, а выходящий - ионами натрия, носит линейный характер, указывающий на близкую для ионов калия и натрия селективность канала. Это свидетельствует о некоторых отличиях в характеристиках каналов, образуемых RTX-A в эритроцитарной мембране и в БЛМ, где проводимость каналов равна 150 пСм в 0,5 М КС1 и 90 пСм в 0,5 М NaCl.

Таким образом, действие Radianthus цитолизина RTX-A на биологическую мембрану приводит к образованию длительно живущих пор диаметром около 10 А, в результате чего на мембране исчезает градиент ионов калия. Клетка теряет потенциал покоя и становится проницаемой для гемоглобина, что приводит к лизису мембраны.

В отличие от зрелых яйцеклеток морского ежа 5. intermedius, мембраны которых устойчивы к действию цитолизинов, ооциты, обработанные RTX-S II (в концентрации 10 мкг/мл, что составляет 280 ГЕ/мл), находились через 20 ч развития лишь на 13-й стадии «ранней гаструлы», в то время как контрольные — на 15-й стадии «средней гаструлы». Обнаруженный эффект торможения дробления ооцитов при действии цитолизина свидетельствует о его участии в процессах клеточной пролиферации. Следует отметить, что ввиду отсутствия сфингомиелина в мембранах яйцеклеток можно сделать вывод, что цитолизин RTX-S II связывается с другими мембранными или клеточными компонентами. Показано, что в отличие от сфингомиелинингибируемых цитолизинов холестеринзависимый метридиолизин лизирует ооциты уже на ранних стадиях их развития. На следующем этапе настоящей работы была предпринята попытка выяснить природу взаимодействия цитолизинов с липидными и белковыми компонентами эритроцитарной мембраны.

4. Изучение липиднои специфичности и липид-белкового взаимодействия ЛаЛ'ал/Л/« цитолизинов методом ДСК

Для исследования механизма взаимодействия цитолизинов 1-й и П-й групп с мембранами нами впервые был применен высокочувствительный метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), который позволил оценить влияние исследуемых полипептидов на термотропное поведение мембранных липидов в простых липидных системах (водных дисперсиях), установить наличие липид-белковых, а также белок-белковых взаимодействий в эритроцитарной мембране.

Калориметрические исследования чистой водной дисперсии сфингомиелина и его смеси с цитолизином ЯТХ-А показали, что средняя температура фазового перехода СМ (Тт) одинакова как для липида, так и для его смеси с цитолизином (рис. 32). При увеличении содержания белка в смеси наблюдается уширение и уменьшение размера эндотермы фазового перехода между гелевой и жидкокристаллической фазами. Такое взаимодействие белков с липидами, как правило, неполярное и характеризуется уменьшением энтальпии денатурации белка.

Рис. 32. Кривые изменения теплоемкости (теплопоглощение) СМ и смеси СМ:КТХ-А в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,4. Образцы предварительно инкубировались при 37°С в течение 30 мин. Молярное соотношение СМ:ЯТХ-А указано на рисунке. Скорость сканирования 1 К/мин. Вертикальная полоса 500 Дж/К-кг.

Зависимость изменения энтальпии денатурации, связанная с фазовым переходом липида, от молярного отношения ЯТХ-А'.СМ в липид-белковых смесях (рис. 33) является линейной функцией. Экстраполяция прямой зависимости к АН(|=0 позволяет оценить количество молекул СМ, извлеченных молекулой [1ТХ-А из кооперативного перехода. Согласно данным калориметрических термограмм молекула ЯТХ-А связывает шесть молекул СМ, в то время как по данным РТШ-спектроскопии молекула

20 40

Температура, °с

\ СМ:ИТХ-А

\ Ь3

0 0,05 0.1 0,15

Молярное отношение, ЯТХ-А:СМ

Рис. 33. График зависимости изменения энтальпии денатурации от концентрации компонентов в смеси ЯТХ-А:СМ.

актинопорина EqtП связывает, девять молекул СМ. Известно, что интегральные мембранные белки извлекают из кооперативного перехода до сорока липидных молекул. При изучении взаимодействия КТХ-А с такими фосфолипидами, как ДПФХ, ДМФХ и ДПФЭ, подобная зависимость не обнаружена, что подтверждает полученные ранее результаты, указывающие на специфическое связывание ЯТХ-А со сфингомиелином.

При калориметрии липид-белковых смесей в широком диапазоне температур наблюдаются эффекты, обусловленные денатурацией цитолизина, при этом температурная зависимость теплоемкости липид-белковой смеси (рис. 34, А, кривая 2) на 20°С выше, чем у чистого денатурированного цитолизина (кривая 1). При охлаждении или повторном нагревании и сканировании второй пик не обнаруживается. Величина изменения энтальпии фазового перехода СМ остается практически прежней, что свидетельствует о воздействии денатурированного полипептида на липиды. Уменьшение энтальпии денатурации с 290 до 200 кДж/моль указывает на высокую конформационную лабильность молекулы ГП'Х-А и способность находиться как в водной, так и в сильно гидрофобной среде фосфолипидов.

Рис. 34. Температурная зависимость теплоемкости (А) и положения >.п,ах в спектре триптофановой флуоресценции 280,4 нм) (Б) цитолизина КТХ-А (кривая 1) и смеси КТХ-А-СМ (молярное отношение 1:20) (кривая 2) в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,4. Вертикальная полоса 500 Дж/К-кг. Скорость сканирования 1 К/мин. Стрелками указаны величины температуры денатурации и пост-денатурационного изменения теплоемкости КТХ-А.

Величина пост-денатурационного изменения теплоемкости молекулы (ЛС/.<1=36 кДж/моль), отражающая число контактов между неполярными группами и растворителем во время денатурации, почти в два раза меньше величины ЛСр1 для водорастворимого состояния молекулы (78 кДж/моль). Полученные результаты коррелируют с данными собственной белковой флуоресценции молекулы ЯТХ-А, взаимодействующей со сфингомиелином. Красный сдвиг в спектре триптофановой флуоресценции полипептида отражает переход хромофоров в более мобильное окружение в результате термически индуцированной денатурации молекулы (рис. 34, Б).

Поскольку ранее нами было установлено, что прединкубация низкомолекулярных ЯасИамИив цитолизинов Кт! и Кт11 с дисперсией экзогенного сфингомиелина не уменьшает их исходную гемолитическую активность, для выяснения природы взаимодействия с липидами было проведено калориметрическое исследование смеси ЯшП с водными дисперсиями основных фосфолипидных компонентов эритроцитарных мембран - ДПФХ, ДМФХ, ДПФЭ, ДПФС и СМ.

На рисунке 35 (А) показаны калориметрические кривые чистых ДПФХ липосом и их смесей с цитолизином КтП. Средняя температура фазового перехода липида в присутствии цитолизина изменяется незначительно, но при увеличении содержания ЯтН наблюдается уменьшение размера эндотермы фазового перехода между гелевой и жидкокристаллической фазой, как и в случае высокомолекулярного цитолизина, что отражает наличие неполярных взаимодействий между липидом и белком.

Рис. 35. (А) Кривые изменения теплоемкости чистого ДПФХ и смеси ДПФХгЯтП в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,4. Образцы инкубировались 30 мин при 37°С. Указано молярное соотношение ДПФХгЯтН. Вертикальная полоса 1 Дж/К-моль. Скорость сканирования 1 К/мин. (Б) Зависимость энтальпии денатурации от концентрации (молярного отношения) компонентов в смеси ДПФХгИтП.

Температура, °С

Зависимость изменения энтальпии денатурации, обусловленной фазовым переходом ДПФХ, от молярного соотношения ЯтП-.ДПФХ в смеси (рис. 35, Б) является линейной функцией. Экстраполяция прямой зависимости к ДН^-О показала, что количество молекул ДПФХ, связывающихся с цитолизином, равно 10±2. Отсутствие подобной зависимости в случае ДПФЭ, ДПФС и СМ указывает на связывание низкомолекулярного цитолизина только с ДПФХ и ДМФХ.

Эффекты, обусловленные денатурацией КтП при нагревании липид-белковых смесей, отражает рисунок 36. В отличие от высокомолекулярных цитолизинов температурная зависимость избыточной теплоемкости липид-белковой смеси ниже всего на 0,5°С теплоемкости цитолизина ЯшП, находящегося в водорастворимом состоянии.

&Сс

1,2 1.0

'я 0,8

0,6

Рис. 36. Температурная зависимость теплоемкости (А) и интенсивности флуоресценции при 300 нм в Б относительных единицах 280,4 нм) (Б) для КтП ^ (кривая 1) и смеси ДПФХ:Ят11 при молярном

¿> 2 соотношении 30:1 (кривая 2) в 20 мМ натрий-

° ^^ фосфатном буферном растворе, рН 7,4. Вертикальная полоса 1 кДж/К-кг.

20 40 60 80 100 Температура, °С

Термопереход для липид-белковой смеси калориметрически необратим и не наблюдается при охлаждении и повторном нагревании, но величина изменения энтальпии для термоперехода ДПФХ остается равной соответствующей величине первого прогрева даже после денатурации цитолизина, связанного с ДПФХ. Эти результаты коррелируют с данными собственной белковой флуоресценции молекулы Rmll (рис. 36, Б). Температурный интервал денатурации полипептида одинаков как для Rmll, так и для смеси его с липидом. Тушение белковых хромофоров в липид-белковой смеси соседними тушителями при температурах >60°С значительно выше, чем в случае Rmll, что свидетельствует о различном конформационном состоянии полипептида в исследуемых системах и, очевидно, о его специфическом связывании с липидом.

Несмотря на широкомасштабные исследования гемолитического действия цитолизинов актиний, до сих пор не было выяснено, какое влияние они оказывают-на различные компоненты эритроцитарной мембраны. ДСК теней эритроцитов человека и собаки, модифицированных цитолизином КТХ-А (рис. 37), позволила получить неопровержимые доказательства взаимодействия цитолизинов актиний не только с липидными, но и с белковыми компонентами эритроцитарной мембраны.

Калориметрические кривые теней эритроцитов человека и собаки, связанные с денатурацией определенных мембранных белков и белков цитоскелета (рис. 37, кривые 1 и 3), значительно изменяются после обработки теней цитолизином (рис. 37, кривые 2 и 4). Модификация теней эритроцитов цитолизином ИТХ-А вызывает появление дополнительного пика теплопоглощения с максимумом при 36°С, незначительное уменьшение интенсивности А-перехода и сдвиг С-перехода, связанного с денатурацией актина (кривая I), одного из основных структурных белков эритроцитарного цитоскелета, в область более низких температур на 1,5°С. В случае теней эритроцитов собаки модификация цитолизином не вызывает таких существенных изменений теплопоглощения (кривые 3 и 4), наблюдается лишь сдвиг на 2°С в область более низких температур С-перехода, что также указывает на денатурацию актина.

В

Рис. 37. Калориметрические кривые теней эритроцитов человека (1, 2) и собаки (3, 4) в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,4. 1 и 3 - интактные, 2 и 4 - модифицированные цитолизином ЯТХ-А эритроциты. Вертикальная полоса 100 Дж/К-кг.

30 50 70 Температура, °С

3

д

Рис. 38. Денситограммы БОБ-электрофореза в градиенте плотности ПААГ (полиакриламидного геля) (5-20%) теней эритроцитов собаки и человека, а - интактные, б - модифицированные ЮХ-А эритроциты собаки, в - интактные, г -модифицированные ЯТХ-А эритроциты человека, д - чистый ЮГХ-А.

93 64 43 31 20 кДа

Электрофореграммы теней эритроцитов (рис. 38) отражают произошедшие при калориметрии изменения в содержании белковых компонентов модифицированных

теней эритроцитов человека и собаки - полное исчезновение полосы 5, принадлежащей актину (Л/43 кДа), и появление новой полосы, соответствующей белку с М20 кДа (б, г), что указывает на наличие цитолизина в эритроцитарной мембране. О включении RTX-А в эритроцитарную мембрану человека свидетельствуют нарушения А-, В- и С-переходов, связанных с белками полос 1, 2, 2.1, 5, 3, 4.1 и гликофорином, появление нового низкотемпературного перехода, характеризующего наличие нарушений во взаимодействиях и других компонентов цитоскелета. Возможно, происходящие в процессе формирования пор локальные деформации бислоя приводят к появлению в мембране гексагональной Нц-фазы. Как известно, эта фаза вызывает изменения молекулярной организации липидного матрикса бислоя, в результате чего происходит нарушение связи актина с мембраной. Это подтверждают обнаруженные изменения белкового каркаса цитоскелета (рис. 37, 38), спектрии-актиновый комплекс которого связан с белком полосы 3 и гликофорином эритроцитарной мембраны с помощью специальных белков, анкирина и белка полосы 4.1. Не исключено, что встраивание RTX-A в эритроцитарную мембрану ускоряет трансмембранную миграцию аминофосфолипидов из внутреннего слоя в наружный, что также приводит к нарушениям связи актина с мембраной. Необходимо отметить, что некоторые цитолизины, в частности RTX-A, индуцируют колебательные процессы БЛМ (Чантурия А.Н., 1990), сопровождающие латеральную диффузию липидов и появление в мембране изоморфных фаз.

Подобно высокомолекулярному цитолизину RTX-A низкомолекулярный цитолизин Rmll также незначительно меняет калориметрические кривые интактных теней эритроцитов собаки (рис. 39, А, кривая 2). Смещение в область низких температур А- и С-переходов, уменьшение их интенсивности, а также исчезновение актина на электрофореграмме (рис. 39, Б) свидетельствуют об аналогичной природе взаимодействия с мембраной высоко- и низкомолекулярных цитолизинов актиний.

Появление дополнительной полосы на электрофореграмме (М около 30 кДа) связано, очевидно, с ассоциацией нескольких молекул Rmll, происходящей либо в растворе, либо в мембранном интерфейсе, на что косвенно указывает небольшая величина энтальпии денатурации цитолизина. Подобное явление характерно для антимикробных пороформирующих пептидов.

40 ео 80 Температура, °С

Рис. 39. (А) Калориметрические кривые интактных (кривая 1) и модифицированных RmII (кривая 2) теней эритроцитов собаки в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,4; разница между ними (кривая 3) как функция температуры. Вертикальная полоса 100 Дж/К-кг сухого веса мембраны. (Б) 8Б8-электрофорез интактных (а) и модифицированных RmII (б) теней эритроцитов собаки. Слева показана номенклатура электро-форетических полос белков мембраны и цитоскелета, справа - молекулярные массы стандартов (в кДа), стрелкой - новая полоса, соответствующая М приблизительно 30 кДа.

Полученные результаты указывают на существенные различия в структурной организации цитоплазматических мембран эритроцитов человека и собаки и свидетельствуют о том, что высокомолекулярные и низкомолекулярные цитолизины актиний представляют собой полезные инструменты исследования молекулярной

организации цитоплазматических мембран эукариотов, а также липид-белковых и белок-белковых взаимодействуй в мембранах.

5. Установление аминокислотной последовательности Radianthus и Oulactis

актинопоринов

Несмотря на огромный интерес к ПФТ актиний к настоящему времени установлена полная аминокислотная последовательность лишь 10 представителей группы, большинство из которых, Eqtll, IV и V актинии A. equina, Stl и StlI - S. helianthus, HmglII - H. magnifica, PSTX-20A - Phyllodiscus semoni, SrcI - S. rosea, -методами молекулярного клонирования.

Аминокислотная последовательность Л'-концевых фрагментов Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G (ATFRVLAK- и GAIIAGAA-), высокомолекулярных Radianthus актинопоринов RTX-A (ALAGAIIAGAGLGLKILIEVLGEG- -VKVKI-), RTX-S II (SAALAGTITLGASLG-) и низкомолекулярного цитолизина Rmll (GGICLEP-VVGPD/TPA-) установлена автоматическим методом Эдмана.

Сравнение /^-концевых фрагментов Or-А и Or-G с аналогичными фрагментами аминокислотных последовательностей актинопоринов тропических видов (рис. 40), выполненное с помощью программы CLUSTALW, позволило сконструировать для установления полной аминокислотной последовательности Oulactis актинопоринов прямые специфичные пргймеры (Dirl и Dir2) к Л'-концевым участкам последовательностей Or-G и Or-А и обратный праймер (Rev) к высокогомологичному для всех известных последовательностей актинопоринов С-концевому участку (табл. 3).

Рис. 40. Сравнение аминокислотных последовательностей Л'-концевых фрагментов актинопоринов: Or-А, Or-G из О. orientalis, RTX-A, RTX-SII из R. macrodactylus, Hmgl, HmglI из H. magnifica, StnIII из S. helianthus, Eqtll из A. equina и Tn С из A. tenebrosa. Идентичные аминокислотные остатки в последовательностях выделены черным цветом.

Таблица 3. Олигонуклеотидные праймеры*, использованные для ПЦР-амплификации

Праймер Структура (5'—>3')

Dirl GCT-ATT-ATT/C/A-GCN-GGN-G

Dir2 ACN-TTC-C/AGN-GTN-CTT/G-GCN-AA

Dir3 CCA/T-GGT-GCG/A-ACT/G-GGC-G

Rev ATG-CCA-TCC-A/GTT-A/GTC-NCC

'Синтез праймеров осуществлен в НПО «Евроген» (Москва).

При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами Dirl, Dir2 и Rev в качестве матрицы были использованы полноразмерная кДНК-библиотека и геномная ДНК актинии О. orientalis. Для выбора оптимальных параметров реакции было проведено несколько ПЦР с последовательным повышением температуры отжига праймеров от 40 до 65°С. Электрофоретический анализ продуктов реакций показал, что наиболее эффективная амплификация фрагментов ожидаемой длины (около 430 п.о. для Or-G и 400 п.о. для Or-А) достигается при температуре отжига 60°С. Неспецифическая

A¡X¡RV¡¡A¡¿

амплификации при этой температуре не происходит. Полученные в результате амплификации фрагменты клонированы по тупым концам в плазмидный вектор pTZ19R, обработанный эндонуклеазой рестрикции Hindll. Рекомбинантные клоны Escherichia coli штамма DH5ct отобраны при помощи сине-голубой селекции на среде, содержащей X-Gal и IPTG.

Для подтверждения наличия в отобранных клонах рекомбинантной вставки определенной длины применен метод ПЦР «на колониях» с использованием универсальных праймеров. Отобранные этим методом клоны далее секвенировали. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность Or-G (143 а.о.) и Ог-А (135 а.о.) (рис. 41). Идентичность нуклеотидных последовательностей фрагментов Or-А и Or-G, полученных амплификацией кДНК и геномной ДНК, свидетельствует, что гены, кодирующие актинопорины Or-G и Or-А, не содержат интронов, что согласуется с литературными данными об их отсутствии в генах, кодирующие актинопорины.

Для установления полной аминокислотной последовательности актинопоринов О. orientalis проведена быстрая амплификация 3'-концов кДНК с использованием в качестве затравок стандартных «сар»-праймеров и специфичных праймеров Dirl и Dir2, а также Dir3, кодирующего центральные части аминокислотных последовательностей Or-А и Or-G (табл. 3). Полученные фрагменты имели длину чуть меньше 500 п.о. и состояли из нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент актинопоринов в 98 а.о., и 3'-нетранслируемой области, содержащей ро1у(А)-область. ПЦР-фрагменты были клонированы в pTZ19R и секвенированы. На основании полученных нуклеотидных последовательностей были выведены аминокислотные последовательности С-концевых фрагментов актинопоринов. Таким образом, полная аминокислотная последовательность Or-А состоит из 165 а.о., а Or-G - из 173 а.о. (рис. 41).

Сравнение последовательностей Or-А и Or-G показало, что гомология между ними составляет 81,2%, а с учетом консервативных замен 92,1%. Гомология между исследуемыми актинопоринами и эквинатоксинами II—V из А. equina и тенеброзином С из А. tenebrosa (данные виды также относятся к семейству Actiniidae) составляет 7779%, в то время как со стихолизинами I и II из S. helianlhus и магнификализином III из Н. magnifica (оба вида принадлежат к семейству Stichodactylidae) - 68-70% (рис. 41).

Для установления полной аминокислотной последовательности RTX-A использованы прямой (Dirl) и обратный (Rev) праймеры, синтезированные для определения последовательности Or-А и Or-G (табл. 3).

Из щупалец актинии R. macrodactylus выделена тотальная РНК, и с использованием Smart Kit синтезирована кДНК. При проведении ПЦР с праймерами Dirl и Rev в качестве матрицы применена полноразмерная кДНК-библиотека R. macrodactylus. ПЦР-фрагмент, содержащий около 430 п.о., был клонирован в вектор pBlueScript SK+ и секвенирован. На основании полученной нуклеотидной последовательности выведена частичная аминокислотная последовательность RTX-A (144 а.о.). Для установления полной последовательности RTX-A проведена быстрая амплификация З'-концов кДНК R. macrodactylus со специфичными праймерами Dirl, Dir3 (табл. 3) и стандартными «сар»-праймерами. Полученные ПЦР-фрагменты клонированы в pTZ19R и секвенированы. На основании полученной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность С-концевого фрагмента актинопорина. Таким образом, установлено, что полипептидная цепь RTX-A состоит из 175 а.о. (рис. 41).

Различия в аминокислотных последовательностях jV-концевых фрагментов RTX-A, установленных методами молекулярной биологии и автоматическим методом Эдмана, указывают на наличие нескольких генов, кодирующих последовательности

GVDNESGGTWTAbNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGQKDTGPVATGAVGVL

шги вэ

saalagaiIaGAsltFqvlqkVLgeLGk.vsRKIAvGvDNESGgtVn:AlNaYFRSGTtI)viLPefVPnqKAbLYnGqKdtGPVATGaVgvl

Dirl

Dir2

Dir3

AYyMSdGnTLgvmFSvPfDYNwYSNWWdV^vYsGkRRADQgMyEdiyyglnPyrGDNGWhqrnLgYGLkmrGfMtSageailelhiska

Rev

U)

Рис. 41. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов актиний: Or-G, Or-А из О. orientalis; Eqtll (код Genbank, Р17723), EqtIV (код Genbank, Q9Y1U9), EqtV (код Genbank, Q93109) из A. equina-, ТепС (код Genbank, Р17723) из А. tenebrosa-, RTX-A, RTX-SII из R. macrodactylus; HmglII (код Genbank, Q9U6X1), НМТ из Н. magnifica; Stl (код Genbank, Р81662), StlI (код Genbank, Р07845) из S. helianthus. Внизу представлен консенсус последовательностей. Идентичные аминокислотные остатки во всех последовательностях отмечены черным цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW. Стрелками отмечены последовательности, используемые для синтеза праймеров.

высокогомологичных изоформ Radianthus актинопоринов. Ранее существование мультигенного семейства у эквинатоксинов было обнаружено Андерлу с соавт. (1999).

При анализе высокогомологичных Л'-концсвых фрагментов последовательностей актинопоринов было установлено наличие в положениях 9 и 10 последовательности RTX-S II (SAALAGTITLGASLG-) аминокислотных остатков Thr и Leu, отсутствующих в аминокислотных последовательностях других актинопоринов (рис. 40). С учетом этого уникального факта, а также других отличий ¿V-концевого фрагмента последовательности RTX-S II, к нему был сконструирован вырожденный прямой праймер RMS-F. Для установления полной аминокислотной последовательности RTX-S II были синтезированы прямые праймеры C33-39F, C80-85F, C143-148F и на основании анализа высокогомологичных участков последовательностей актинопоринов A. equina, Н. magnifica и S. helianthus - обратный праймер C143-148R.

В результате полимеразной цепной реакции с праймерами RMS-F и C143-148R и использования в качестве матрицы геномной ДНК, выделенной из щупалец актинии, а также полноразмерной кДНК-библиотеки, были получены фрагменты длиной около 450 пар нуклеотидных оснований (п.о.). ПЦР-фрагменты были клонированы по тупым концам в плазмиду pTZ19R, обработанную эндонуклеазой рестрикции HindII. Рекомбинантные клоны Е. coli штамма DH5a были отобраны при помощи сине-голубой селекции. После щелочного лизиса плазмиды (10 штук) были секвенированы как с прямым, так и с обратным стандартными праймерами M13F и M13R соответственно. В результате были получены нуклеотидные последовательности (423 п.о.) участка гена, кодирующего актинопорин. Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных клонированием кДНК RTX-S II и фрагмента rtx-s II гена, показал их полную идентичность, а также отсутствие некодирующих нуклеотидных фрагментов. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность актинопорина (141 а.о.).

Применение техники быстрой амплификации З'-концов кДНК (З'-RACE) позволило установить нуклеотидную последовательность участка гена, кодирующего С-концевую аминокислотную последовательность RTX-S II. Для проведения ПЦР были использованы специфичные C33-39F, C80-85F, C143-148F и стандартные «сар»-праймеры. ПЦР-фрагменты, полученные с C143-148F и C80-85F праймерами и имевшие длину около 300 и 500 п.о. соответственно, были клонированы в pTZ19R и секвенированы. Кроме нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевой фрагмент актинопорина, они содержали З'-нетранслируемую область, имеющую сигнал полиаденилирования ААТААА, а также саму poly (А)-область. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена аминокислотная последовательность С-концевого фрагмента актинопорина. Таким образом, полная аминокислотная последовательность актинопорина RTX-S II содержит 177 а.о. (рис. 41)

Идентичность аминокислотных последовательностей актинопоринов RTX-S II и RTX-A составляет 89%, а с учетом консервативных замен - 95%. Такая же высокая степень гомологии была обнаружена между последовательностями актинопоринов актиний R. macrodactylus, Н. magnifica и S. helianthus, что может быть объяснено их принадлежностью к одному семейству Stichodactylidae.

Поиск гомологичных последовательностей для цитолизина Rmll показал, что его .У-концевой фрагмент (15 а.о.) имеет удивительно высокую гомологию (83%) с аналогичным фрагментом ингибитора протеиназ JnlV из R. macrodactylus, которая была определена ранее:

Rmll GGI CLEP-WGPf РА

JnlV GSIС LEP KWGP С TA

6. Изучение пространственной организации актинопорина ЮГХ-Б II и влияния различных факторов среды на его конформацнонную стабильность и активность

Пространственная организация молекулы ЯТХ-Б II в водном растворе исследована с помощью УФ-, КД-спектроскопии и собственной белковой флуоресценции. Наличие достаточно выраженной тонкой структуры спектра КД ЯТХ-8 II в ближней УФ-области свидетельствует о жесткой фиксации боковых групп остатков ароматических аминокислот, характерной для высокоорганизованной третичной структуры молекулы актинопорина.

Согласно результатам расчета элементов вторичной структуры ЯТХ-8 II по спектрам КД методом Провенчера, доля а-спирали составляет 5%, антипараллельных складчатых Р-слоев - 48%, (З-изгибов - 26% и неупорядоченной структуры - 22%. Ранее с использованием методов КД-спектроскопии спектральным и рентгеноструктурного анализа было установлено, что молекулы эквинатоксинов и стихолизинов содержат до 70% р-структуры (44-50% р-складчатых структур и 18-20% Р-изгибов), 12-15% а-спирали и 19-22% неупорядоченной структуры. Таким образом для вторичной структуры всех актинопоринов характерно преобладание Р-структуры.

При изучении влияния температуры на конформационное состояние ИТХ-З II (рис. 42, а) обнаружено, что в области поглощения ароматических аминокислотных остатков для исследованного актинопорина наблюдалось уменьшение эллиптичности полос спектра КД на 5-7%. Повышение температуры раствора ЯТХ-8 II до 50°С приводит к резкому уменьшению эллиптичности полос в области 250-270 нм, что

Рис. 42. Спектры КД актинопорина ЯТХ-Б II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2. (а) и (б) - Концентрация полипептида 0,37 и 0,222 мг/мл соответственно, (1-4) - температура = 25, 50, 55, 60°С соответственно; (в) — зависимость изменения эллиптичности полосы при 222 нм от температуры.

свидетельствует о возможном конформационном переходе в третичной структуре актинопорина. Дальнейшее нагревание раствора (до 60°С) не приводит к значительным изменениям спектра КД КТХ-8 II. Вероятно, в интервале температур 50-60°С молекула актинопорина находится в стабильном, частично денатурированном состоянии, что указывает на частичную обратимость наблюдаемых конформационных изменений. Охлаждение раствора ЯТХ-З II до 25°С приводит к восстановлению эллиптичности полос в спектре КД до 25-30% исходной величины.

Наряду с «плавлением» третичной структуры актинопорина ЯТХ-Б II при повышении температуры до 50°С происходит разрушение его вторичной структуры, на что указывает незначительное уменьшение эллиптичности отрицательной и положительной полос в спектре в области поглощения пептидных связей (рис. 42, б). Повышение температуры раствора до 60°С приводит к резким изменениям в спектре КД: сначала к уменьшению эллиптичности положительной и отрицательной полос, сопровождаемому сдвигом (по длине волны) максимума, минимума и точки пересечения нулевой линии (рис. 42, б), а затем и к исчезновению максимума в положительной области спектра.

Меру упорядоченности вторичной структуры ЯТХ-в II отражает график зависимости эллиптичности (при 222 нм) от температуры (рис. 42, в), из которого определена точка конформационного перехода в его вторичной структуре (53°С). До этого значения температуры конформационные изменения, как на уровне третичной, так и вторичной структуры, полностью обратимы. После точки конформационного перехода изменения в третичной структуре становятся частично обратимыми, в то время как во вторичной - полностью необратимыми.

Спектры КД ЯТХ-З И, измеренные при 25-60°С (рис. 43, а), не имеют изодихроичной точки.

Рис. 43. Спектры КД ИТХ-БП в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе при 25°С. (а) — Концентрация полипептида (0,37 мг/мл), (1-3) - рН 7,2, 11,4, 12,6 соответственно; (б) - концентрация полипептида (0,222 мг/мл), (1-4)-рН 7,2, 5,0, 1,7, 12,3 соответственно.

Этот факт позволяет предположить, что переход актинопорина из нативного в денатурированное состояние не является одностадийным процессом, а происходит через образование интермедиата. Литературные данные указывают на отсутствие изодихроичной точки и в спектрах КД эквинатоксина II из актинии A. equina. Их анализ подтверждает, что равновесный рефолдинг молекулы, индуцируемый снижением значения рН или увеличением температуры, сопровождается образованием интермедиата, называемого «расплавленной глобулой», который характеризуется термодинамически стабильной вторичной, но не третичной структурой.

Анализ спектра КД показывает, что третичная структура актинопорина RTX-S И стабильна как в кислой, так и в щелочной области значений рН, однако в области спектра 240-260 нм при повышении значений рН раствора появляется широкая положительная полоса (рис. 43, а), характерная для ионизированных остатков тирозина. При рН среды 12,3 в спектре актинопорина образуется полоса с высокой эллиптичностью при 242 нм (рис. 43, а), что свидетельствует о полной ионизации остатков тирозина в молекуле RTX-S II.

Спектры КД актинопорина RTX-S II в пептидной области, измеренные при различных значениях рН (рис. 43, б) указывают на то, что вторичная структура молекулы также устойчива к изменению значений рН, как и третичная, и лишь при рН среды 12,3 происходит значительное уменьшение эллиптичности отрицательной полосы и полное исчезновение положительной.

Для расчета элементов вторичной структуры RTX-S II, находящегося под влиянием таких факторов, как температура и величина рН среды, нами применена программа CONTIN и пакет программ CDPro (табл. 4). В отличие от CONTIN (метод Провенчера и Глокнера) пакет программ CDPro (метод Срирама и Вуди) имеет расширенные наборы различных реперных спектров, включая спектры КД

Таблица 4. Результаты расчета вторичной структуры актинопорина RTX-S II, %

т, °с рН а-спираль* р-структура* Р- изгиб Неупорядоченная форма

I II III I II III

Метод Провенчера и Глокнера

25 7,2 - - 5,0 - - 48,0 26,0 22,0

50 7,2 - - 1,0 - - 52,0 23,0 25,0

55 7,2 - - 0,0 - - 60,0 29,0 10,0

60 7,2 - - 0,0 - - 66,0 33,0 1,0

25 2,0, - - 0,0 - - 53,0 27,0 21,0

25 12,3 - - 2,0 - - 56,0 28,0 14,0

Me тод Срир 1ма и Byj 1И

25 7,2 0,5 3,5 4,0 24,4 12,5 36,9 22,2 36,8

50 7,2 0,2 2,9 3,1 20,4 16,5 36,9 18,3 41,8

55 7,2 0,1 2,7 2,8 12,3 23,2 35,5 18,0 43,7

60 7,2 0,1 2,3 2,4 10,0 28,5 38,5 8,0 51,1

25 5,0 0,2 4,0 4,2 26,8 14,0 40,8 21,8 33,2

25 2,0 0,1 3,6 3,7 24,4 12,5 36,9 19,4 40,0

25 12,3 0,1 2,8 2,9 11,5 21,4 32,9 17,8 46,2

* I—III — регулярная, искаженная и общая соответственно.

денатурированных белков. Это позволяет определять два вида а-спирали и р-етруктуры (регулярную и искаженную), что повышает достоверность получаемых результатов и дополнительно свидетельствует о конформационных изменениях молекулы, происходящих при изменении температуры и рН среды.

Вторичная структура нативной молекулы КТХ-Б II (рН 7,2, 25°С), рассчитанная по программе СОЫТШ, отличается большей долей р-структуры, чем рассчитанная по программе СЭРго. Согласно результатам расчета методом Провенчера и Глокнера, во вторичной структуре полипептида при увеличении степени денатурации под действием температуры происходит повышение содержания Р-структуры (до 66%) и уменьшение содержания неупорядоченной формы (до 1%) (табл. 4). Такое явление нетипично для подвергающихся денатурации водорастворимых мембраноактивных белков, в частности эквинатоксина II и стихолизина II, денатурация которых сопровождается увеличением содержания а-спирали и уменьшением содержания р-структуры. Поэтому для расчета элементов вторичной структуры ЯТХ-8 II нами была использована также программа СОРго. Результаты расчетов показали, что тепловая денатурация приводит к незначительному уменьшению доли а-спирали и более существенному увеличению доли неупорядоченной формы (7-15%). При этом общая доля р-структуры почти не меняется, однако, происходит перераспределение Р-структуры в регулярном и искаженном видах, в частности увеличивается доля искаженной р-структуры, что свидетельствует о частичном развертывании молекулы актинопорина.

Изучение конформационных изменений бактериальных а-ПФТ, таких как колищшы А и N и дифтерийный токсин, инициируемых высокими температурами или низкими значениями рН среды, показывает, что белки претерпевают конформационные переходы через различные состояния интермедиатов, определяемые исходной нативной структурой белка. Так, например, установлено, что включение в мембраны пороформирующего домена колицина при 25°С и значений рН ниже 4,0 сопровождается переходом в состояние «расплавленной глобулы», характеризующееся компактной и хорошо разрешимой вторичной структурой и «разрыхленной» третичной структурой.

На рисунке 44 показано влияние температуры на гемолитическую активность ЯТХ-Б II. Видно, что с ростом температуры гемолитическая активность

20 30 40 50 60 Температура ,°С

pH

Рис. 44. Зависимость гемолитической активности RTX-S II от времени выдерживания (а), температуры (б) и значения pH (в). (1-3) - 40, 50, 60°С соответственно. Время выдерживания 1 мин. Стандартное отклонение (± s.d.) вычислено на основании результатов трех независимых экспериментов и не превышает 0,5.

актинопорима уменьшается, а при 60°С полипептид полностью инактивируется в течение 3 мин (рис. 44, а, кривая 3).

Значительное уменьшение гемолитической активности ЯТХ-Б II, происходящее после точки конформационного перехода (53°С) (рис. 44, б), определяется, очевидно, коиформационным состоянием молекулы, зависящим от изменений в ее вторичной и третичной структуре. Резкое увеличение активности в диапазоне значений рН 6,7 - 7,6 и незначительное - в диапазоне 8,0 — 10,2 (рис. 44, в) может быть связано с изменениями в третичной структуре актинопорина, вызываемыми изменением заряда молекулы.

Анализ температурной зависимости собственной белковой флуоресценции ИТХ-Б II (рис. 45, а) свидетельствует о том, что с ростом температуры остатки тирозина и триптофана становятся более доступными полярному растворителю из-за возможного разворачивания молекулы актинопорина при нагревании.

а

Рис. 45. Зависимости интенсивности флуоресценции актинопорина ЯТХ-Б II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, от температуры (а) и ионной силы (б). (1) - суммарная флуоресценция (левая шкала), (2) — триптофановая флуоресценция (правая шкала).

№СГ. М

Изучение влияния ионной силы раствора на конформацию Г1ТХ-8 II показало, что титрование 5 М раствором №С1 влияет как на суммарную, так и на триптофановую флуоресценцию полипептида (рис. 45, б). При относительно малых изменениях в интенсивности триптофановой флуоресценции происходит голубой сдвиг максимума спектра к 335 нм, что свидетельствует об изменении третичной структуры белкового кора вследствие перехода остатков триптофана, экспонированных в нативной молекуле КТХ-8 II в растворитель, в менее полярное окружение.

Увеличение гемолитической активности ЯТХ-Б II при увеличении концентрации КаС1 в растворе до 0,8 М (рис. 46) связано, по-видимому, с некоторыми изменениями в третичной структуре полипептида, о чем свидетельствуют спектры суммарной и триптофановой флуоресценции (рис. 45, б). Увеличение интенсивности собственной флуоресценции связано, очевидно, с изменением заряда, как самой молекулы, так и аминокислотных остатков, непосредственно окружающих остатки тирозина и триптофана. Подобный эффект, наблюдавшийся для актинопоринов ЕдШ и авторы объясняют облегчением

частичного разворачивания молекулы полипептида при повышении концентрации соли в растворе, т.е. ускорением ее перехода из нативного состояния в состояние «расплавленной глобулыл, необходимое для взаимодействия с мембраной. Это состояние характеризуется увеличением гибкости боковых цепей молекулы

лвозб., 280 нм 90 1

70 6030

А. возб., 296 >

г 60

л

20 30 40 50 60 70 Температура, ° С б

40 20 0

£ я'

0,0 0,2 0,4 0.6 0,8

Рис. 46. Зависимость гемолитической активности RTX-S II от ионной силы раствора. Стандартное отклонение (± s.d.) вычислено на основании результатов трех независимых экспериментов.

актинопорина при сохранении ее нативной вторичной структуры. Ранее установлено, что переход ПФТ бактерий в состояние «расплавленной глобулы» при их включении в мембрану сопровождается уменьшением энергетического барьера и выходом наружу трансмембранных гидрофобных фрагментов пороформирующих доменов, скрытых до того внутри белковой глобулы.

По мнению Альвареса (1998) высокая концентрация морской соли играет важную роль в контролировании биологической активности актинопоринов и регулирует их секрецию животными в морскую среду.

Исследование конформационной стабильности актинопорина RTX-S II в водном растворе и влияние на нее различных факторов (температуры, величины рН среды, ионной силы) позволило установить ключевую роль конформационных переходов в его функциональной активности.

7. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей Radianthus и Oulactis актинопоринов

Согласно современным представлениям механизм действия актинопоринов включает две стадии - связывание молекулы с мембранным интерфейсом с помощью сайта связывания, участка, обогащенного триптофаном, и последующее включение в липидный бислой jV-концевого фрагмента (10-28 а.о.). Ввиду отсутствия кристаллографических данных для структур Radianthus и Oulactis актинопоринов определение локализации функционально важных участков было проведено методами компьютерного моделирования. В качестве прототипов использованы эквинатоксин II (PDB, код 1IAZ) и стихолизин II (PDB, код 1GWY), кристаллические структуры которых установлены Атанасиадисом и Маичено с разрешением 1,9 А и 1,7 А соответственно (2001, 2003). Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей исследованных актинопоринов с Eqtll и Stnll (рис. 41) позволяет предположить, что они также относятся к семейству пороформирующих эквинатоксинов 1.С.38, и к ним применим метод сравнительного моделирования. Построение и анализ пространственных структур Oidactis и Radianthus актинопоринов проведены с помощью автоматического сервера SWISS-MODEL (http://expasy.org/swiss-model) и программы SPDBV (http://expasy.org/spdbv/) по аминокислотным последовательностям полипептидов.

На рисунках 47 (а, б, в) и 48 (а, б) представлены ленточные диаграммы пространственных структур актинопоринов Or-А и Or-G, RTX-A и RTX-S II с элементами вторичной структуры, свидетельствующие о высоком подобии полипептидов, что подтверждает суперпозиция Са атомов полученной теоретической модели RTX-S II и структуры сгихолизина II, показанная на рисунке 48 (в). Идентичность аминокислотных последовательностей RTX-S II и Stnll, согласно расчетам, выполненным с помощью программы МОЕ, составила 88,6%.

NaCI, М

/Г»-- TiHl'^

Tlf.<1

Рис. 47. Ленточные диаграммы актинопоринов Or-A (a), Or-G (б) и RTX-А (в), полученные с помощью сервера SWISS-MODEL и программы Rasmol. Показаны локализация а.о. триптофана и элементы вторичной структуры, полученные с помощью программы Molmol; а-спирали (/V- и С-концевая) окрашены лиловым, p-стренды - желтым, неупорядоченная структура — серо-белым, р-изгибы — синим цветом.

Рис. 48. Ленточная диаграмма актинопорина RTX-S II, полученная с помощью сервера SWISS-MODEL и программы Rasmol: вид сбоку (а), вид сверху (б), а-спирали (N- и С-концевая) окрашены красно-желтым цветом; суперпозиция Са атомов актинопоринов RTX-S II и Stnll (в).

Точность полученных теоретических моделей Radianthus и Oulactis актинопоринов высока (rmsd<0,5 А) и практически соответствует точности экспериментальных моделей, использованных нами в качестве прототипов. Величина параметров rmsd для Са атомов актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству, составляет менее 0,3 А, а тех же параметров для Са атомов актинопоринов актиний, принадлежащих к разным семействам, не более 0,8 А (табл. 5).

Таблица 5. Величины параметра rmsd (среднеквадратичное отклонение, А) ДЛЯ атомов актинопоринов RTX-A, RTX-SII, Or-A, Or-G, Stnll (1GWY) и EqtH (1IAZ), рассчитанные с помощью программы SPDBV

Актинопорин

1GWY

1IAZ

RTX-A RTX-SII Ог-А Or-G

0,06 0,25 0,57 0,58

0,76 0,79 0,28 0,29

Согласно теоретическим моделям Ои1асШ и Radianthus актинопорины являются Р-структурированными полипептидами с высоким содержанием неупорядоченной структуры (табл. 6).

Таблица 6. Содержание элементов вторичной структуры актинопоринов Or-A, Or-G, RTX-A, Eqtll (1IAZ) и Stnll (1GWY)

Актинопорин Р-Структура (%) a-Спираль (%) Неупорядоченная структура (%)

Ог-А 48,2 10,0(0) 40,8

Or-G 47,7 9,9(1,7) 39,5

RTX-A 48,0 10,3 (1,7) 38,9

HAZ 47,5 9,5(1,7) 47,5

1GWY 47,4 10,3 (1,7) 40,1

Таким образом, молекула актинопорина представляет собой жестко сформированный Р-кор, образованный двенадцатью антипараллельными (З-стрендами и двумя короткими а-спиралями, расположенными на противоположных сторонах р-кора (рис. 47, 48). На петле, соединяющей рб и Р7 стренды и на С-концевой а-спирали расположен участок, обогащенный остатками триптофана и тирозина, входящими в сайт связывания актинопорина с мембраной. Основные различия в визуализированных пространственных структурах исследованных актинопоринов наблюдаются в частично спирализованных Д'-концсвых фрагментах молекул. Согласно данным кристаллографических и ЯМР исследований, проведенных Атанасиадисом, Манчено и Хиндсом (2002), первые несколько остатков этого фрагмента в молекулах и 8(п11 не спирализованы.

Расчет контактов между аминокислотными остатками А-концевых фрагментов аминокислотных последовательностей исследованных актинопоринов показал, что они имеют от 7 до 12 гидрофобных связей, до трех ионных (в молекуле ЯТХ-8 11) и по одной водородной, играющей, как известно, ключевую роль в конформационной стабильности и сохранении нативной структуры молекулы белка. Наличие лишь одной водородной связи в А-концевом фрагменте актинопоринов свидетельствует о том, что этот участок молекулы может обладать высокой конформационной подвижностью.

Ранее Андерлу с соавт. показал, что удаление первых 5 или 10 А-концевых а.о. уменьшает гемолитическую активность EqtlI на 31 и 89% соответственно, а; рекомбинантный полипептид, лишенный тридцати трех а.о., теряет активность полностью. Актинопорины Ог-А и Ог-О из дальневосточной актинии О. оп'еМаПя являются первыми природными актинопоринами с укороченными А-концевыми фрагментами: отсутствие 5 и 13 а.о. отражается на величине их гемолитической активности, которая на два порядка ниже активности актинопоринов тропических актиний (табл. 2). Подтверждением такого вывода могут служить результаты электронной микроскопии, БТЖ и 3|Р ЯМР спектроскопии, полученные рядом исследователей, которые установили способность А-концевого фрагмента эквинатоксина II увеличивать длину а-спирали в мембранном интерфейсе за счет неспирализованного с 1 по 13 а.о. фрагмента до величины, сопоставимой с толщиной мембраны. На основании этих данных можно предположить, что длина аналогичного фрагмента в молекулах ОиШс^ актинопоринов (рис. 47) недостаточна для формирования полноценной тороидальной поры.

В аминокислотных последовательностях А-концевых фрагментов высокогомологичных актинопоринов КТХ-А. Я'ГХ-Я II, 81п11 и НтеШ актиний семейства 5НсЬоёас1уНс1ае имеется лишь незначительное количество консервативных замен а.о., что объясняет близкие величины гемолитической активности этих токсинов (табл. 2). Наличие двенадцати неконсервативных замен в аналогичных Л'-концевых фрагментах молекул Ец111 и ТпС, актинопоринов другого семейства, Ас1тнс1ае, объясняет на порядок большую величину их активности.

Показано, что местоположение полярных и гидрофобных а.о. в амфифильных а-спирализованных Д'-концевых фрагментах Oulactis актинопоринов, установленное с помощью вращательной проекции Шиффера и Эдмундсона, а также суммарный заряд остатков, экспонированных во внутреннюю полость поры, имеют важное значение для их функциональной активности. Суммарный заряд положительно заряженных а.о. Ог-А и Or-G, равный 9,01 и 10,0 соответственно, значительно выше суммарного заряда остатков аналогичных фрагментов Stnl и Stnll (4,01 и 4,56 соответственно), что обуславливает более низкую, индуцируемую ими проницаемость эритроцитарной мембраны для ионов калия.

Как известно, общей закономерностью для ряда ПФТ, включая бактериальные ХЗЦ и сфингомиелинингибируемые актинопорины, является наличие ароматического кластера, выполняющего функцию сайта связывания с мембраной клетки-мишени. Амфифильный характер индольного кольца триптофана способствует его «заякориванию» в мембране, благодаря электростатическому взаимодействию триптофана с фосфорилхолиновыми группировками диацилглицеринов и фосфосфинголипидов и образованию водородных связей с жирнокислотными цепями липидов. На происходящую при этом стабилизацию молекулы актинопорина относительно мембранного окружения указывает необратимый характер связывания RTX-A с БЛМ.

Молекулярные модели и результаты УФ-спектроскопии показывают, что часть а.о. триптофана и тирозина в молекулах Oulactis и Radianthus актинопоринов экспонирована в раствор, их локализация и ориентация аналогична таковой этих остатков в молекуле Eqtll, в сайт связывания которого с мембраной, согласно литературным данным, включены остатки Тгр112, Тгр116, Тгр117 и Туг133, Туг137, Туг138. Андерлу с соавт. установил, что замена трех остатков триптофана на Phe, осуществленная сайт-направленным мутагенезом, приводит к уменьшению (в случае Trpll2Phe или ТгрПбРЬе) или полной потере (в случае Trpl 12,116Phe) способности мутантной формы актинопорина взаимодействовать с мембраной, и наиболее критичным для проявления активности является положение остатка Trpl 12.

При сравнении аминокислотных последовательностей исследованных Oulactis и Radianthus актинопоринов и других представителей семейства актинопоринов (рис. 41) видно, что в положениях 103, 104 в молекуле Or-A, 111, 112 в молекуле Or-G, 114, 115 в молекуле RTX-A и 116. 117 в молекуле RTX-S II находятся а.о. триптофана, соответствующие положению Trpl 16 и Trpl 17 в молекуле Eqtll. В то же время остатку Trpl 12 в молекуле Eqtll соответствуют а.о. Leu99, Leul07 и Leul 10 в молекулах Ог-А, Or-G и RTX-A, Leul 12 в молекулах RTX-S II и EqtV и Phell2 в молекулах Hmglll и НМТ. Несмотря на это все вышеперечисленные актинопорины, за исключением Or-А и Or-G, проявляют высокую гемолитическую активность (табл. 2), что противоречит результатам сайт-направленного мутагенеза Eqtll. По-видимому, наличие Тгр в положении 112 аминокислотной последовательности нативной молекулы актинопорина не имеет принципиальной важности для ее связывания с мембраной. Этот факт свидетельствует либо о различных механизмах действия нативных и мутантных форм актинопоринов, либо о существовании функционально значимых фрагментов помимо фосфохолинового сайта связывания и Л'-концевой а-спирали.

Следует заметить, что в аминокислотных последовательностях актинопоринов имеется RGD-мотив (за исключением Oulactis актинопоринов), играющий, как известно, существенную роль в связывании ряда адгезивных и внеклеточных белков с их мембранными рецепторами, интегринами. Этот так называемый «трипептид узнавания» расположен в молекуле актинопорина рядом с фосфохолиновым сайтом связывания, экспонирован в раствор и, по-видимому, выполняет, как и у внеклеточных адгезивных белков, функцию сайта связывания. Экспериментальная проверка данного предположения не проведена, но ее косвенно подтверждает более низкая

пороформирующая активность Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G, у которых остаток аргинина в RGD-мотиве замещен на глицин, вследствие чего их электростатическое взаимодействие и скорость связывания с белковыми мембранными рецепторами значительно ниже, чем у актинопоринов с RGD-мотивом.

Изучение фармакологического действия эквинагоксина II показало, что он вызывает в клетках-мишенях морфологические и функциональные изменения, не связанные с порообразованием. На взаимодействие актинопоринов с белковыми компонентами мембран указывают также обнаруженные нами эффекты - нарушение структурной организации цитоскелета, приводящее к разрыву связи G-актина с эритроцитарной мембраной, и торможение развития ооцитов морского ежа, свидетельствующее о влиянии актинопорина на механизмы полимеризации и деполимеризации актина. По-видимому, модуляция изменений в молекулярной организации цитоскелета обусловлена нарушением путей внутриклеточной сигнальной трансдукции, вызываемым взаимодействием актинопоринов с мембранными рецепторами (подобное действие оказывают некоторые бактериальные токсины), а также латеральной диффузией липидов. Согласно существующим представлениям цитоскелет является интегрирующим звеном, объединяющим клеточные компартменты и обеспечивающим передачу сигналов как внутри одной клетки, так и между разными клетками. То есть, мембранотропное действие актинопоринов — сложный кооперативный процесс, в котором принимают участие помимо липидов другие соединения, включая интегральные мембранные белки и белки цитоскелета.

Таким образом, комбинация классических белковых структурных элементов -JV-концевая мелиттинподобная амфифильная а-спираль и фолд Р-сэндвича, снабженный ароматическим кластером, обуславливает уникальный механизм действия актинопоринов - эффективных природных инструментов, созданных природой для разрушения мембран клеток-мишеней. Данная структурная комбинация может служить моделью для конструирования новых специфичных полипептидных соединений направленного действия.

Взаимосвязь между структурой и активностью цитолитических токсинов и местом обитания продуцирующих их актиний косвенно указывает на алломональную и экологическую роль цитолизинов в морских биоценозах, которая осуществляется на уровне структурных особенностей функционально значимых фрагментов или аминокислотных остатков молекул. Однако до сих пор неясно, какие фрагменты молекулы токсина включены в процесс олигомеризации, являются ли липидные рафты местом включения актинопоринов в мембраны, какова роль RGD-мотива в молекуле. Не выяснен также молекулярный механизм мембранолитического действия низкомолекулярных цитолизинов и высокомолекулярного метридиолизина. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение структурно-функциональных взаимосвязей как известных, так и новых представителей цитолизинов актиний, а также их мутантных форм позволит ответить на многие из этих вопросов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из тропической актинии Radianthus macrodactylus и дальневосточной Oulactis orientalis выделено восемь новых цитолитических токсинов. Согласно физико-химическим характеристикам и липидной специфичности шесть из них отнесены к группе высокомолекулярных цитолизинов актиний, ингибируемых сфингомиелином (актинопоринам), а два — к группе низкомолекулярных цитолизинов, проявляющих антигистаминную активность. Показано, что метридиолизин из дальневосточной актинии Metridium senile, отнесенный ранее к группе цитолизинов, ингибируемых холестерином, не проявляет к этому липиду высокой специфичности.

2. Установлено, что в основе мембранолитнческого действия цитолизинов на биологические и модельные мембраны лежит специфическое связывание с липидным матриксом мембран и последующее формирование в них потенциалозависимых ионных каналов (пор). Показано, что в отличие от ингибируемых сфингомиелином Radianthus и Oidactis цитолизинов - типичных каналоформеров, Metridium цитолизин в низких концентрациях формирует в мембранах короткоживущие ионные каналы, а в высоких действует подобно поверхностноактивным соединениям. Обнаружено, что взаимодействие низкомолекулярных цитолизинов с мембраной обратимо, их пороформирующая активность проявляется в концентрациях, на два порядка превосходящих действующие концентрации актинопоринов.

3. Установлены полные аминокислотные последовательности Radianthus актинопоринов RTX-A и RTX-S II и Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G. Обнаружена высокая степень гомологии (90% и выше) в первичной структуре актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству. Установлена частичная аминокислотная последовательность Л'-коипевого фрагмента молекулы низкомолекулярного Radianthus цитолизина Rmll, которая имеет 83% гомологии с аналогичной последовательностью ингибитора протеиназ JnlV из R. macrodactylus. Впервые показано, что дальневосточная актиния О. orientalis продуцирует актинопорины, имеющие укороченные Л'-концевыс фрагменты.

4. Показано, что Radianthus актинопорины принадлежат к мультигенному семейству, а гены, кодирующие их последовательности, не содержат интронов.

5. Исследована пространственная организация актинопорина RTX-S II на уровне его вторичной и третичной структуры. Показано, что молекула имеет достаточно жесткую третичную структуру и вторичную, отличающуюся высоким содержанием (5-структуры.

6. Показано, что различные денатурирующие факторы (температура, рН среды, ионная сила раствора) влияют на конформационную стабильность и гемолитическую активность RTX-S II. Обнаружено, что в его третичной структуре при увеличении ионной силы раствора, а также при повышении значения рН выше 4,0 происходят конформационные изменения, характерные для состояния интермедиата молекулы, называемого «расплавленной глобулой». Данное конформационное состояние благоприятствует увеличению мембранолитической активности актинопорина. Показано, что вторичная структура полипептида достаточно стабильна, она сохраняется практически неизменной в широком диапазоне значений рН (от 2,0 до 11,7). Наблюдаемое в щелочной среде резкое увеличение гемолитической активности связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Происходящая при температуре выше 53°С необратимая денатурация полипептида приводит к полной потере его активности.

7. Методами сравнительного моделирования по аминокислотным последовательностям Radianthus и Oulactis актинопоринов и кристаллографическим данным их прототипов, эквинатоксина II из A. equina и стихолизина II из S. helianthus, предсказаны пространственные структуры Or-A, Or-G, RTX-A и RTX-S II, которые имеют высокую степень подобия со структурами актинопоринов-прототипов, за исключением Л-концевого фрагмента молекул.

8. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов показал, что значительные различия в величине гемолитической активности обусловлены различиями в аминокислотной последовательности функционально важных участков молекул, фосфохолинового сайта связывания и jV-концевого спирализованного фрагмента, в частности его длины, амфифильности и заряда а.о., экспонированных во внутреннюю полость формируемой поры. Противоречия в интерпретации структурно-

функциональных взаимосвязей нативных и мутантных форм актинопоринов, касающиеся значимости положения определенных а.о. в сайте связывания, показывают, что в мембранолитическом действии нативных и мутантных форм актинопоринов имеются существенные отличия.

9. Установлено, что актинопорины оказывают тормозящее действие на развитие ооцитов морского ежа, что свидетельствует об их влиянии на процессы пролиферации клеток, а действие на эритроцитарные мембраны модулирует разрыв связи основного структурного белка цитоскелета, актина, с липидным матриксом. Данные эффекты указывают на то, что фармакологическое действие актинопоринов может быть обусловлено как липид-белковым, так и белок-белковым взаимодействием этих токсинов с компонентами биологических мембран и Цитоскелета.

Список статей по теме диссертации:

1. A.c. 942763 СССР, М. Кл. А 61 К 37/02. Способ получения гемолизина / Монастырная М.М., Вожжова Е.И., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. (СССР). - № 2981676/28-13; заявл. 20.08.80; опубл. 15.07.82, Бюлл. № 26.

2. A.c. 1242826 СССР, МКИ4 G 01 N 33/48, 33/50, 33/68, 33/92. Способ определения сфингомиелина / Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Еляков Г.Б. (СССР). - № 3808934/28-14; заявл. 08.10.84; опубл. 07.07.86, Бюлл. № 25.

3. Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б.. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus // Докл. АН СССР. 1984. Т. 277, № 6. С. 1491-1493.

4. Руднев B.C., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проницаемость липидных мембран //Биол. мембраны. 1984. Т. 1, № 10. С. 1019-1023.

5. Иванов A.C., Мольнар A.A., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 1987. Т. 4, № 3. С. 243-248.

6. Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Действие метридиолизина из морской актинии Metridium senile на биологические и модельные мембраны // Биол. мембраны. 1988. Т. 5, № 8. С. 830-835.

7. Иванов A.C., Мольнар A.A., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость мембран. Зависимость от pH, поверхностного потенциала и двухвалентных катионов // Биол. мембраны. 1988. Т. 5, № 1. С. 33-37.

8. Брежестовский П.Д., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Действие гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на мембрану эритроцитов // Докл. АН СССР. 1988. Т. 299, № 3. С. 748-750.

9. Monastyrnaya М.М., Kozlovskaya Е.Р., Elyakov G.B. Hemolysins from sea anemones: investigation of mechanism of action // J. Toxicol. -Toxin Reviews. 1990. Vol. 9, N. 1. P. 82.

10. Чантурия A.H., Шатурский О.Я., Лишко B.K., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Взаимодействие токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами // Биол. мембраны. 1990. Т. 7, № 7. С. 763-769.

11. Shnyrov V.L., Monastyrnaya М.М., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Intern. 1992. Vol. 26, No. 2. P. 219-229.

12. Zhadan G., Kuznetsova S., Apalikova O., Monastyrnaya M., Zykova Т., Emelyanenko V., Villar E., Shnyrov V. Stability of a low molecular mass cytolysin from the sea anemone Radianthus macrodactylus and membrane-toxin interactions // Biochemistry Mol. Biology Intern. 1994. Vol. 32, No. 2. P. 331-340.

13. Зыкова Т.А., Монастырная М.М., Апаликова О.В., Швец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из морской актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 1998. Т. 24, №7. С. 509-516.

14. Kuznetsova S., Emelyanenko V., Monastyrnaya М., Zhadan G., Shnyrov V. Fluorescence study of structural properties of cytolysin from the sea anemone Radianthus macrodactylus II Spectroscopy of biological molecules: modern trends / Eds. Carmona P., Navarro R., Hernanz A.; Boston-London: Kluwer Acad. Publ., 1997. P. 49-50.

15. Монастырная M.M., Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1998. Т. 25, № 10. С. 733-741.

16. Monastyrnaya М.М., Zykova Т.A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya Е.Р. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2002. Vol. 40, No. 8. P. 1197-1217.

17. Клышко E.B., Ильина А.П., Монастырная M.M., Бурцева Ю.В., Костина Е.Е., Зыкова Т.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П. Биологически активные полипептиды и гидролитические ферменты в актиниях низкобореальных вод // Биология моря. 2003. Т. 29, №3. С. 189-194.

18. Козловская Э.П., Клышко Е.В., Ильина А.П., Исаева М.П., Гузев КВ., Зыкова Т.А., Монастырная М.М. Цитолизины актиний // В тр. Объед. междунар. научн. конф. «Новая геометрия природы», Казань, 25 авг. — 5 сент. 2003. Казань, 2003. Т. 2. С. 179183.

19. Клышко Е.В., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.И., Крыжко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. 2004. № 3. С. 45-53.

20. Klyshko E.V., Issaeva М.Р., Monastyrnaya М.М., Il'ina A.P., Gusev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actinoporin from the sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2004. Vol. 44, No. 3. P. 315-324.

21. Ильина А.П., Монастырная М.М, Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика//Биоорган, химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39-48.

22. Вакорина Т.И., Клышко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Конформационная стабильность и гемолитическая активность актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus II Биохимия. 2005. Т. 70, № 7. С. 957-966.

23. Ильина А.П., Монастырная М.М., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis II Биоорган, химия. 2005. Т. 31, № 4. С. 357-362.

24. Il'ina A., Lipkin A., Barsova Е., Issaeva М., Leychenko Е., Gusev К., Monastyrnaya М., Lukyanov S., Kozlovskaya Е. Amino acid sequence of RTX-A's isoform actinoporin from the sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2006. Vol. 47, No. 5. P. 517-520.

25. Сокотун И.Н., Гнеденко O.B., Лейченко E.B., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Мольнар А.А., Иванов А.С. Исследование взаимодействия ингибитора трипсина из актинии Radianthus macrodactylus с различными протеиназами // Биомед. химия. 2006. Т. 52, вып. 6. С. 595-600.

Соискатель

М.М. Монастырная

Монастырная Маргарита Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И МЕМБРАПОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ АКТИНИЙ

Автореферат

Зак. №1п. Формат 60x84 Vis. Усл. п. л. 2,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 12.01.2007 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО "ДАЛЬПРИБОР" 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ.

2.1. Мишени действия мембраноактивных белков и пептидов.

2.2. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ).

2.3. Основные ступени порообразования.

2.4. а-Пороформирующие токсины.

2.4.1. Колицины бактерии Escherichia coli.

2.4.2. Апоптотические белки Вах и Bcl-xL семейства Вс1-2 белков, ключевых регуляторов апоптоза.:.

2.4.3. Дифтерийный токсин (ДТ) из Corynebacterium diphtheriae.

2.4.3.1. Некоторые биохимические аспекты действия ДТ.

2.4.3.2. Основа структурно-функциональных взаимосвязей ДТ.

2.4.4. Актинопорины - высокомолекулярные цитолизины актиний П-й группы.

2.4.4.1. Классификация цитолизинов актиний.

2.4.4.2. Первичная структура актинопоринов.

2.4.4.3. Вторичная и третичная структуры актинопоринов.

2.4.4.4. Исследование конформационного состояния актинопоринов.

2.4.4.5. Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами мембран.

2.4.4.6. Исследование механизма олигомеризации актинопоринов.

2.4.4.7. Исследование взаимодействия актинопоринов с мембранным интерфейсом, фосфохолиновый сайт связывания.

2.4.4.8. Молекулярный механизм порообразования.

2.5. p-Пороформирующие токсины.

2.5.1. Стафилококковый а-гемолизин из Staphylococcus aureus.

2.5.2. Холестеринзависимые цитолизины (ХЗЦ) грамположительных бактерий.

2.5.2.1. Перфринголизин О из Clostridium perfringens и родственные ХЗЦ.

2.5.2.2. Сайт связывания ХЗЦ с мембранным холестерином.

2.5.2.3. Механизм мембранолитического действия ХЗЦ.

2.5.2.4. Влияние холестерина на олигомеризацию и литическую активность ХЗЦ.

2.5.2.5. Биохимические эффекты ХЗЦ.

2.5.3. Гидрализины - новая группа р-ПФТ гидр семейства Cnidaria.

2.6. Пороформирующие антимикробные пептиды.

2.6.1. Биологическая роль и классификация.

2.6.2. Механизм мембранотропного действия.

2.6.3. Дермасептины.

2.6.4. Мелиттин.

2.6.5. Аламетицин.

2.7. Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов.

2.7.1. Структурная организация бислоя и функциональная роль липидных микродоменов.

2.7.2. Модуляция изменений цитоскелета клеток-мишеней бактериальными патогенами.

2.7.3. Сравнительная характеристика структурных особенностей водорастворимых мембраноактивных белков и пептидов и мембранных белков цитоплазматических мембран.

2.7.4. Локализация и роль остатков ароматических аминокислот в связывании с мембранным интерфейсом.

2.7.5. Движущие силы фолдинга мембраноактивных пептидов и белков, взаимодействующих с мембраной.

2.8. Перспективы исследования ПФТ и антимикробных пептидов.

3.2. Поиск цитолизинов в актиниях тропических и дальневосточных морей.73

3.3. Выделение и очистка цитолизинов актиний.76

3.3.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины (II группа).76

3.3.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины (I группа).81

3.3.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины (II группа).90

3.3.4. Высокомолекулярный Metridium цитолизин (IV группа).94

3.4. Физико-химические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний.95

3.4.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины.95

3.4.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины Rml и Rmll.103

3.4.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины.106

3.4.4. Высокомолекулярный Metridium цитолизин.108

3.5. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на модельные мембраны.111

3.5.1. Влияние Radianthus цитолизина RTX-A и Metridium цитолизина на проницаемость липосом.111

3.5.2. Порообразующее действие Radianthus, Oulactis, Metridium цитолизинов на бислойные липидные мембраны (БЛМ).123

3.5.2.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины.123

3.5.2.2. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины.138

3.5.2.3. Низкомолекулярный Radianthus цитолизин Rmll.140

3.5.2.4. Метридиолизин из Metridium senile.142

3.6. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на биологические мембраны.147

3.6.1. Действие цитолизинов П-й, 1-й и IV-й групп на эритроциты млекопитающих.147

3.6.2. Действие Radianthus цитолизина RTX-A на яйцеклетки морского ежа

Strongylocentrotus intermedins.152

3.6.3. Изучение проводимости изолированного фрагмента эритроцитарной мембраны, индуцированной цитолизином RTX-A.153

3.6.4. Влияние цитолизина RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedius.157

3.7. Исследование липидной специфичности и липид-белкового взаимодействия Radianthus цитолизинов методом дифференциальной сканирующей калориметрии.158

3.8. Установление первичной структуры Radianthus и Oulactis цитолизинов.171

3.8.1. Определение частичной аминокислотной последовательности Oulactis цитолизинов Or-А и Or-G и Radianthus цитолизинов RTX-A, RTX-S II и Rmll методами структурной химии белка.171

3.8.2. Установление полной аминокислотной последовательности Or-А и Or-G. 174

3.8.3. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-A.181

3.8.4. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-S II.185

3.9. Исследование вторичной структуры и конформационной стабильности актинопорина RTX-S II.189

3.9.1. Пространственная организация нативного актинопорина RTX-S II.189

3.9.2. Влияние различных факторов на конформацию актинопорина RTX-S И.191

3.9.3. Влияние температуры, величины рН и ионной силы раствора на гемолитическую активность RTX-S II.200

3.10. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей Radianthus и Oulactis актинопоринов.203

3.11. Radianthus актинопорины как инструмент количественного определения сфингомиелина в биологических жидкостях и тканях.213

3.12. Заключение.214

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. .215

5. ВЫВОДЫ.233

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.236

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одним из важнейших направлений биоорганической химии и ряда смежных наук является установление молекулярной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Изучение защитной и коммуникативной функций биомембран, осуществляемых на уровне клетки и внутриклеточных компартментов, а также ряда процессов, происходящих при их участии - биосинтеза и секреции белков, функционирования систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетических процессов, требует применения широкого набора биохимических инструментов. Общепризнанными и универсальными инструментами исследования цитоплазматических мембран являются высокоспецифичные соединения белковой природы, продуцируемые как прокариотами, так и эукариотами, которые относят к группам а- и р-пороформирующих токсинов (ПФТ), а также антимикробных пептидов. Созданные природой для разрушения мембран клеток-мишеней эти цитолитические токсины представляют собой удивительные структуры, способные существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии, в котором они осуществляют свое мембранолитическое действие. Благодаря установлению первичной структуры и пространственной организации многих ПФТ и мембраноактивных пептидов определена ключевая роль конформационных изменений, претерпеваемых их молекулами при переходе из водорастворимого в мембраносвязанное состояние. Предполагают, что состояние так называемой «расплавленной глобулы», характеризующееся переходом гидрофобных трансмембранных областей молекул из белкового кора в мембрану, ответственно за функциональную активность ПФТ. Очевидно, выяснение природы рецепторного взаимодействия мембраноактивных белков и полипептидов с мембранными белками, впрямую связанное с установлением структуры обеих групп белков, а также молекулярной организации мембран клеток-мишеней, должно способствовать пониманию механизма действия ПФТ.

Одной из широко исследуемых в последние годы моделей ПФТ являются актинопорины - цитолитические токсины, продуцируемые актиниями, морскими ядовитыми кишечнополостными (тип Coelenterata). Совместно с фосфолипазами, нейротоксинами, протеолитическими ферментами и ингибиторами протеиназ они входят в состав ядовитого секрета актиний. Известно, что цито- и нейротоксины выполняют в организме-продуценте алломональную роль, тогда как роль протеаз и их ингибиторов изучена еще недостаточно. Ее выяснение, очевидно, поможет понять механизмы экспрессии полипептидов актиний, в частности пре- и пропептидов цитолизинов, имеющих гомологичные фрагменты аминокислотной последовательности с рядом полипептидов актиний (класс Anthozoa) и других организмов типа Cnidaria, таких как гидры и кораллы (класс Hydrozoa).

Огромный интерес к цитолизинам актиний обусловлен не только возможностью их применения в качестве инструментов исследования биомембран, но и проявляемой ими биологической активностью (например, кардиостимулирующей, антиопухолевой, антипаразитарной), что позволяет использовать цитолизины как модели для дизайна современных высокоспецифичных фармакологических и биотехнологических препаратов направленного действия.

ПФТ актиний являются незаменимыми инструментами и уникальными модельными системами для исследования липид-белковых, белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий: их включение в мембрану не требует участия других соединений (например, шаперонов) или транслокона, поскольку вся необходимая для этого информация заключена в их собственной структуре. Кроме того, структурное и функциональное подобие ПФТ некоторым мембранным белкам, таким как порины грамотрицательных бактерий, позволяет использовать их в качестве моделей для изучения механизма действия поринов, поскольку получение последних в кристаллическом виде представляет значительную трудность. В то же время топология исследованных к настоящему времени мембранных белков вносит вклад в понимание механизмов взаимодействия с мембраной мембраноактивных водорастворимых белков. Этот факт, а также наличие ряда противоречий между литературными данными по исследованию структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов и результатами наших исследований диктуют необходимость расширения поиска и установления структуры новых ПФТ актиний.

Заманчивой целью в изучении цитолизинов актиний является установление их экологической и алломональной роли в морском биоценозе, установление структуры анцестрального гена для гомологов и ортологов этих полипептидов, а также выяснение правомерности гипотезы, представляющей актинопорины видовыми или родовыми хемотаксономическими маркерами.

Целью данного исследования являлся поиск новых источников цитолитических токсинов среди актиний низкобореальных и тропических вод, выделение цитолизинов, изучение их свойств, липидной специфичности и механизма действия, а также установление структуры и выяснение структурно-функциональных взаимосвязей цитолизинов (актинопоринов), ингибируемых сфингомиелином.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в гомогенном состоянии выделено четыре высокомолекулярных сфингомиелинингибируемых цитолизина, отнесенных к группе актинопоринов: два из дальневосточной актинии Oulactis orientalis и два из тропической актинии Radianthus macrodactylus. Из R. macrodactylus выделено также два низкомолекулярных гистаминолитических Radianthus цитолизина, подобных цитолизину из актинии Tealiafelina.

Впервые исследовано мембранолитическое действие высокомолекулярных Radianthus актинопоринов на изолированном фрагменте эритроцита кролика и доказан общий для модельных и биологических мембран механизм литического действия этих полипептидов. Также впервые исследовано действие метридиолизина на модельные мембраны и установлено отсутствие высокой липидной специфичности к мембранному холестерину. Установлено, что в отличие от Radianthus актинопоринов, типичных каналоформеров, метридиолизин в низких концентрациях проявляет канальные свойства, а в высоких - действует подобно поверхностноактивным соединениям.

Установлена первичная структура новых Oulactis и Radianthus актинопоринов, причем впервые - для двух представителей, продуцируемых актинией холодных низкобореальных вод. Установлена аминокислотная последовательность /V-концевого фрагмента одного из низкомолекулярных Radianthus цитолизинов, отличающаяся от аналогичного фрагмента актинопоринов и имеющая 83% подобия с /V-концевым фрагментом ингибитора протеиназ из R. macrodactylus.

Методами сравнительного моделирования предсказана пространственная структура Radianthus и Oulactis актинопоринов. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Показано, что //-концевые фрагменты аминокислотных последовательностей актинопоринов дальневосточной актинии короче на несколько аминокислотных остатков, что объясняет различия в величине их гемолитической активности.

Полученные результаты позволяют заключить, что Oulactis актинопорины являются уникальными природными моделями для изучения структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов.

Настоящая работа представляет собой первое исследование взаимодействия Radianthus актинопоринов с белковыми компонентами цитоплазматических мембран, в частности с основным структурным белком цитоскелета актином. Согласно результатам, полученным при изучении действия Radianthus актанопорина на яйцеклетки морского ежа, полипептид влияет на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, лежащие в основе клеточной пролиферации. Результаты изучения мембранотропного действия актинопоринов на биологические мембраны и анализ их структурно-функциональных взаимосвязей позволяют предположить, что фармакологические эффекты, проявляемые актипопоринами, обусловлены как их пороформирующим действием, так и рецепторным взаимодействием с белковыми компонентами биологических мембран.

Установление структуры и функции ПФТ важно для решения многих задач и проблем в таких областях научных знаний, как мембранология, клеточная биология и биохимия и др., оно необходимо и для прикладных исследований, так как создает предпосылки к дизайну новых высокоспецифичных фармакологических средств, избирательно действующих на клетки-мишени.

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые из тропической актинии Radianthus macrodactylus и дальневосточной Oulactis orientalis выделено восемь новых цитолитических токсинов. Согласно физико-химическим характеристикам и липидной специфичности шесть из них отнесены к группе высокомолекулярных цитолизинов актиний, ингибируемых сфингомиелином (актинопоринам), а два - к группе низкомолекулярных цитолизинов, проявляющих антигистаминную активность. Показано, что метридиолизин из дальневосточной актинии Metridium senile, отнесенный ранее к группе цитолизинов, ингибируемых холестерином, не проявляет к этому липиду высокой специфичности.

2. Установлено, что в основе мембранолитического действия цитолизинов на биологические и модельные мембраны лежит специфическое связывание с липидным матриксом мембран и последующее формирование в них потенциалозависимых ионных каналов (пор). Показано, что в отличие от ингибируемых сфингомиелином Radianthus и Oulactis цитолизинов, типичных каналоформеров, Metridium цитолизин в низких концентрациях формирует в мембранах короткоживущие ионные каналы, а в высоких действует подобно поверхностно активным соединениям. Обнаружено, что взаимодействие низкомолекулярных цитолизинов с мембраной обратимо, их пороформирующая активность проявляется в концентрациях на два порядка превосходящих действующие концентрации актинопоринов.

3. Установлены полные аминокислотные последовательности Radianthus актинопоринов RTX-A и RTX-S II и Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G. Обнаружена высокая степень гомологии (90% и выше) в первичной структуре актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству. Установлена частичная аминокислотная последовательность //-концевого фрагмента молекулы низкомолекулярного Radianthus цитолизина Rmll, которая имеет 83% гомологии с аналогичной последовательностью ингибитора протеиназ JnlV из R. macrodactylus.

Впервые показано, что дальневосточная актиния О. orientalis продуцирует актинопорины, имеющие укороченные //-концевые фрагменты.

4. Показано, что Radianthus актинопорины принадлежат к мультигенному семейству, а гены, кодирующие их последовательности, не содержат интронов.

5. Исследована пространственная организация актинопорина RTX-S II на уровне его вторичной и третичной структуры. Показано, что молекула имеет достаточно жесткую третичную структуру и вторичную, отличающуюся высоким содержанием Р-структуры.

6. Показано, что различные денатурирующие факторы (температура, рН среды, ионная сила раствора) влияют на конформационную стабильность и гемолитическую активность полипептида. Обнаружено, что в третичной структуре RTX-S II при увеличении ионной силы раствора, а также при увеличении рН выше 4,0 происходят конформационные изменения, характерные для состояния интермедиата молекулы, называемого «расплавленной глобулой». Данное конформационное состояние благоприятствует увеличению мембранолитической активности актинопорина. Показано, что вторичная структура полипептида достаточно стабильна - сохраняется практически неизменной в широком диапазоне рН (от 2,0 до 11,7). Наблюдаемое в щелочной среде резкое увеличение активности связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Происходящая при температуре выше 53°С необратимая денатурация полипептида приводит к полной потере его активности.

7. Методами сравнительного моделирования по аминокислотным последовательностям Radianthus и Oulactis актинопоринов и кристаллографическим данным их прототипов, эквинатоксина II из A. equina и стихолизина II из S. helianthus, предсказаны пространственные структуры Or-А, Ог-G, RTX-A и RTX-S II, которые имеют высокую степень подобия со структурами актинопоринов-прототипов, за исключением N-концевого фрагмента молекул.

8. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов показал, что значительные различия в величине гемолитической активности обусловлены различиями в аминокислотной последовательности функционально важных участков молекул, фосфохолинового сайта связывания и //-концевого спирализованного фрагмента, в частности его длины, амфифильности и заряда а.о., экспонированных во внутреннюю полость формируемой поры. Противоречия в интерпретации структурно-функциональных взаимосвязей нативных и мутантных форм актинопоринов, касающиеся значимости положения определенных а.о. в сайте связывания, показывают, что в мембранолитическом действии нативных и мутантных форм актинопоринов имеются существенные отличия.

9. Установлено, что актинопорины оказывают тормозящее действие на развитие ооцитов морского ежа, что свидетельствует об их влиянии на процессы пролиферации клеток, а действие на эритроцитарные мембраны модулирует разрыв связи основного структурного белка цитоскелета, актина, с липидным матриксом. Данные эффекты указывают на то, что фармакологическое действие актинопоринов может быть обусловлено как липид-белковым, так и белок-белковым взаимодействием этих токсинов с компонентами биологических мембран и цитоскелета.

3.12. Заключение

Проведенный анализ структуры и функции актинопоринов тропических и дальневосточной актиний подтвердил экспериментально полученные данные, свидетельствующие о функциональной важности //-концевого фрагмента (его длины, амфифильности и заряда а.о., экспонированных внутрь поры) и фосфохолинового сайта связывания. Вместе с тем появившиеся в результате анализа противоречия в интерпретации структурно-функциональных взаимосвязей этой группы ПФТ требуют проведения дальнейших исследований как с помощью мутантных, так и нативных форм. Помимо этого до сих пор неясно, какие фрагменты молекулы актинопорина включены в процесс олигомеризации, являются ли липидные рафты местом включения актинопоринов в мембраны, какова роль RGD-мотива в молекуле. Не выяснен также молекулярный механизм мембранолитического действия низкомолекулярных цитолизинов и высокомолекулярного метридиолизина. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение структурно-функциональных взаимосвязей как известных, так и новых представителей цитолизинов актиний, а также их мутантных форм позволит ответить на многие из этих вопросов. Этому будет способствовать также детальное изучение белок-белковых взаимодействий цитолизинов in vitro, а также in vivo на молекулярном уровне с учетом их влияния на клеточные компоненты.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы

В работе были использованы полихром-1 (Олайне, Латвия); Акрилекс П-4, целлюлоза КМ-23 (Reanal, Венгрия), бычий сывороточный альбумин (Reanal, Венгрия); сефадекс G-15 и сефароза 4В (Pharmacia, Швеция); целлюлоза КМ-32 (Whatman, Англия и Serva, ФРГ); ацетонитрил 1 сорта (Криохром, Санкт-Петербур); трихлоруксусная кислота (Merck, ФРГ); реактивы для капиллярного ДНК секвенатора, реактивы для автоматического метода Эдмана (Applied Biosystems, США); трипсин (СПОФА, Чехословакия и Worthington, США); N-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновая кислота (HEPES), фосфолипаза К2 из пчелиного яда, фосфолипаза А и фосфолипаза С из С. welcbii (Calbiochem, США); сфингомиелиназа (Boehringer Mannheim, ФРГ); набор стандартов для определения молекулярных масс (Pharmacia, Fine Chemicals АВ, США и Serva, ФРГ); реактивы для электрофореза в ПААГ, 5-диметиламинонафталин-1-сульфохлорид (дансихлорид), наборы стандартных DNS-аминокислот, дицетилфосфат, цетилтриметиламмонийбромид (Serva, ФРГ); реактивы для автоматического анализатора Д-500 (Durum, Pierce, США), триптон, глицерин, гуанидинизотиоцианат, саркозил (ICN Biochemicals, США); агар (Ferak Berlin, Германия); дрожжевой экстракт, глюкоза, тригидроксиметиламинометан (Трис), этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (EDTA), N-6eH30Wi-D,L-аргииина л-нитроанилид (BAPNA), Р-меркаптоэтанол, холестерин, сфингомиелин из мозга быка, L-a-фосфатидилэтаноламин, L-a-фосфатидилхолин из соевых бобов и яичный отечественного производства, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, L-a-димиристоилфосфатидилхолин, a-моноолеин, а-моноэруцин, 1-а-дифосфатидил-£^глицерин, стеариламин (Sigma, США); фосфолипиды из яйцеклеток морского ежа S. intermedius; сыворотка крови (Hyland Division Traveno, Laboratories S.A., Бельгия); родамид В (Wako Pure Chemical Industries, Япония); IPTG, X-Gal (Fermentas, Литва); агароза (BioRad, США); силикагель марки КСК с размером частиц 5-7 мк (Россия); дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты, [a-33P]dATP, эндонуклеазы рестрикции, Т4-ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза, Т4полинуклеотидкиназа, Гяд-ДНК-полимераза, олигонуклеотидные праймеры M13F и M13R (Сибэнзим, Новосибирск); олигонуклеотидные Dirl, Dir2, Dir3, Rev праймеры (EuroGene, Москва); RMS-F, C33-39F, C80-85F, C143-148F и C143-148R (синтезированы Н.Н. Мудриком, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Все остальные использованные реактивы имели квалификацию "ос. ч".

4.2. Приборы и оборудование

Для ВЭЖХ использовали колонки с обращенной фазой Nucleosil С)8, Silasorb С18 (Sigma Aldrich, США или 10x250 мм, Элсико, НПО Диагностикум), Microsil Cis (Macherey-Nadel, Германия) и колонку с ионообменной смолой Ultropac TSK CM-3SW (21,5x150 мм, LKB, Швеция), а также жидкостной хроматограф Altex 114М Solvent Delivery Module (Beckman, США), детектор 2151 (LKB, Швеция).

Детектирование белков осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord 8300 (LKB, Швеция) при длине волны 280 нм и 214 нм.

Аминокислотный анализ проводили на аминокислотном анализаторе D-500 (Durum, США) и Pharmacia-LKB 4151 (Alpha Plus, Швеция).

Для определения молекулярной массы актинопорина RTX-SII использовали время-пролетные масс-спекгрометры (MALDI-TOF MS) Vision 2000 (Termo, Англия) и BIFLEX III (Bruker, Германия).

Капиллярный электрофорез проводили на 270А Capillary Electrophoresis System (Applied Biosystem).

Исследование проницаемости эритроцитов, липосом и яйцеклеток ежа при действии цитолизинов проводили с помощью валиномицинового К+-селективного электрода типа ОР-К-0711Р и ионографа ОР-267 (Radelkis, Венгрия). В качестве электрода сравнения был использован каломельный электрод типа К-701 (Radiometer, Дания), заполненный насыщенным раствором NaCl.

Степень гемолиза эритроцитов цитолизинами рассчитывали по поглощению супернатанта, полученного после центрифугирования суспензии эритроцитов, на фотометре Spectromom-410 (MOM, Венгрия) при 540 нм.

Измерение электрических характеристик БЛМ осуществляли иа высокоомном вольтметр-электрометре ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране e помощью хлор-серебряных электродов, ток на выходе регистрировали усилителем потенциометром КПС-4.

Калориметрические измерения проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (СССР).

Анализ белковых компонентов теней эритроцитов проводили с помощью горизонтального SDS-электрофореза в градиенте плотности ПААГ (5-20%). Гели сканировали на денситометре ДСА-1 (СССР).

Токи через изолированные фрагменты эритроцитарной мембраны в конфигурации «inside-out» регистрировали с помощью усилителя ЕРС-5 (List-electronik, ФРГ). Данные записывали на магнитограф для последующей обработки.

Секвестрование //-концевых фрагментов актинопоринов проводили на секвенаторе модели 477А и Procise модели 492 (Applied Biosystems, США) по программе производителя, для чего осуществляли очистку полипептидов на системе 270А Capillary Electrophoresis System (Applied Biosystem).

УФ-спектры полипепидов снимали на спектрофотометре CECIL СЕ 7250 (Англия).

Спектры КД полипепидов регистрировали на спектрополяриметре (Jasco-500А, Япония).

Спектры флуоресценции актинопорина измеряли на спектрофлуориметре (Hitachi 850, Япония).

Количество остатков тирозина и триптофана в полипептидах оценивали спектрофотометрически по 2-ой производной УФ-спектров поглощения полипептидов иа приборе Сагу 219 (Varian, Англия) и на CECIL СЕ 7250 спектрофотометре (Англия).

Величину рН растворов измеряли на рН-метре (InoLab, ФРГ).

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе (Eppendorf, Германия).

Секвенирование плазмидных ДНК осуществляли с прямым и обратным М13-праймерами на капиллярном ДНК-секвенаторе (ABI, PRISM™ 310, США).

Рекомбинантные клоны секвенировали с прямым и обратным М13-праймерами с [33Р] dATP на ДНК-секвенаторе версии 2.0 (Amersham, США).

4.3. Сведения о биологическом материале

Актинию R. macrodactylus собирали на литорали Сейшельских островов во время научных экспедиций НИС «Академик Опарин» в 1984-2000 г.г. Образцы актинии замораживали и хранили при -20°С. Актинии О. orientalis и М. senile собирали на глубине до 1 м в заливе Посьета Японского моря (Хасанский район Приморского края) в начале сентября 2002 г. в ходе экспедиции НИС «Академик Опарин» и хранили при температуре -20°С. Вид, определенный как О. orientalis, ранее был описан как A. orientalis [257]. Видовая принадлежность актиний определена к.б.н. С.Д. Гребельным (ЗИН РАН, Санкт-Петербург) и к.б.н. Е.Е. Костиной (ИБМ ДВО РАН, Владивосток). Все выделительные операции проводили при 4°С.

Несколько актиний вида О. orientalis хранили в аквариуме с природной морской водой для последующего выделения из них генетического материала. Щупальца актинии R. macrodactylus для выделения генетического материала, собранные в Желтом море на глубине до 1 м и любезно предоставленные к.б.н. Д.А. Жадан (подводный клуб МГУ «Босфор»), хранили в лизирующем буферном растворе D (4 М гуанидинизотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% лаурилсаркозил натрия, 0,1 М (З-меркаптоэтанол) до использования.

4.4. Выделение цитолизинов актиний

Приготовление экстракта. Цельные актинии (0,5 кг) гомогенизировали с тремя объемами соответствующего растворителя (вода или этанол), выдерживали на холоде (+4°С) в течение 12 часов, экстракт фильтровали через несколько слоев ткани, а затем центрифугировали при 4000xg (К-23, ГДР) в течение 1 часа. Осадок отбрасывали, супернатант повторно центрифугировали при 10000xg (К-24, ГДР) в течение 2 часов. Липидный слой отбрасывали, прозрачный супернатант диализовали против воды и использовали для определения биологической активности. В случае экстракции этанолом супернатант предварительно упаривали на роторном испарителе при 40°С.

Осаждение ацетоном суммарных водорастворимых фракций полипептидов. 1 кг перемолотых актиний заливали 4 л воды, экстрагировали 12 ч при 4°С, затем центрифугировали 2 ч при 3000 об/мин. Осаждение 50%-ным ацетоном выполняли путем добавления 300 мл охлажденного до -20°С ацетона к 300 мл холодного супернатанта. При добавлении ацетона экстракт медленно перемешивали, а затем 15 мин выдерживали на холоду. Осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин (10 мин). Осаждение 80%-ным ацетоном выполняли добавлением к 540 мл полученного супернатанта 180 мл охлажденного ацетона. После центрифугирования осадок сушили 8-12 ч в вакууме над хлоридом кальция.

Гидрофобную хроматографию водных экстрактов актиний проводили на колонках (4,5x120 см либо 2,6x15 см) с полихромом-1, уравновешенным водой. Элюцию цитолизинов осуществляли водой (1500 мл) со скоростью 120 мл/ч, объем фракций составлял 20 мл, элюцию ингибиторов протеиназ - 40%-ным этиловым спиртом (1200 мл) со скоростью 3 мл/мин, объем фракций составлял 9 мл. Детектирование осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord 8300 (LKB, Швеция) при длине волны 280 или 214 нм.

Хроматографию в статическом варианте проводили на воронке Шотта № 4 (объем 300 см3) с целлюлозой КМ-23 (Reanal, Венгрия), уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0. Элюцию осуществляли 0,5 М NaCl в том же буферном растворе.

Обессоливание и гель-фильтрацию проводили на колонках (2,5x30 см) или (3x90 см) с Акрилексом П-4, уравновешенных 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0 при скорости элюции 18 мл/ч. Объем фракций 4,5 мл.

Ионообменную хроматографию цитолизинов проводили на колонке (2,6x50 см) с целлюлозой КМ-32, уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0,5 М, общий объем 2 л) в рабочем буферном растворе. Скорость элюции составляла 24 мл/ч, объем фракций - 4,5 мл.

Ионообменную ВЭЖХ цитолизинов проводили на колонке Ultropac TSK CM-3SW (21,5x150 мм), уравновешенной 0,1 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в ступенчатом градиенте от 0,1 до 1 М аммоний-ацетатного буферного раствора, рН 6,0 при скорости элюции 1 мл/мин.

ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой сорбента цитолизинов проводили либо на колонке с обращенной фазой Nucleosil Cj8 (4,6x250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (5-60%) в 0,1%-ном водном растворе ТФУ, рН 2,2 при скорости 1 мл/мин, либо на Nucleosil С|8 (2,0x75 мм) на хроматографе МилиХром А-02 в ступенчатом градиенте от 10 до 65% ацетонитрила в 0,1%-ном водном растворе ТФУ при скорости элюции 200 мкл/мин.

Аффинную хроматографию проводили на колонке (1x10 см) с активированной трипсином сефарозой согласно [348]. Лиофильно высушенные фракции А и Б обессоливали на колонках с Акрилексом П-4 и Полихромом-1 соответственно. Цитолизины фракции А элюировали водой, а ингибиторы фракции Б - 40%-ным этанолом.

Гель-фильтрацию ингибиторов протеиназ проводили на колонке с сефадексом G-15 (1,5x95 см), элюируя активные фракции водой со скоростью 18 мл/ч. Объем фракций составлял 5 мл.

4.5. Общие методы исследования физико-химических характеристик и структуры цитолизинов

Количество белка определяли по методу Лоури [349], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

SDS-электрофорез проводили в вертикальных пластинах (9x12x1 мм) 14%-ого полиакриламидного геля в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) или в градиенте плотности ПААГ по методу Лэммли [350].

Молекулярную массу цитолизинов определяли на времяпролетпом масс-спектрометре (MALDI-TOF MS) Vision 2000 (Termo, Англия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в прямом пролете и режиме рефлектора.

Изоэлектрическую точку цитолизинов определяли методом изоэлектрофокусирования [351] на стандартных пластинках (11x15 см) в полиакриламидном геле, содержащем 2%-ный раствор амфолинов с рН 3,5-11,0 (LKB, Швеция).

Капиллярный электрофорез проводили на 270А Capillary Electrophoresis System, (Applied Biosystem); капилляр 75 мкмхЮО нм, Т=39,8°С, U=10 кВ, в 20 мМ натрий-цитратном буферном растворе, рН 2,5.

N-концевые аминокислоты цитолизинов определяли по методу Грея [352]. Дансильные производные аминокислот идентифицировали с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках (5x5 см) с закрепленным слоем силикагеля по методу [353].

Карбоксиметилирование белков осуществляли по методу [264]. Обессоливание полученных препаратов проводили на затемненной колонке с биогелем П-2.

Аминокислотный анализ. Образцы полипептидов (2,5-3 нМ) гидролизовали в запаянных ампулах 24, 48 и 72 ч 5,7 н НС1 (50 мкл) при 110°С. После гидролиза образцы анализировали на аминокислотном анализаторе D-500 (Durum, США) или аминокислотном анализаторе (Pharmacia-LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) на колонке Ultropac 8 мкм (0,46x20,0 см) согласно методу [354]. Количество остатков тирозина и триптофана в полипептидах оценивали спектрофотометрически по 2-ой производной УФ-спектров поглощения полипептидов на приборе Сагу 219 (Varian, Англия) или CECIL СЕ 7250 спектрофотометре (Англия) согласно методу [355]. Содержание триптофана определяли также после гидролиза образцов 4 н метансульфокислотой (50 мкл), содержащей 0,2% 3-(2-аминоэтил) индола в течение 24 ч при 110°С.

N-концевую аминокислотную последовательность цитолизинов RTX-S II и RTX-A (10 нмоль) определяли по методу [356] на секвенаторе модели 477А (Applied Biosystems, США). Фенилтиогидантоины аминокислот идентифицировали ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой сорбента Microsil Cig (Macherey-Nadel, Германия). Аминокислотную последовательность цитолизинов Or-А и Or-G определяли па автоматическом секвенаторе белков Procise модели 492 (Applied Biosystems, США) по программе производителя.

Выделение тотальной РНК. Щупальца актинии О. orientalis и R. macrodactylus суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (4 М гуанидинизотиоцианат; 30 мМ ацетат натрия, рН 7,0, 0,5% саркозил, 1%-ный (по объему) p-меркаптоэтанол). После интенсивного встряхивания на вортексе добавляли 160 мкл уравновешенного дистиллированной водой фенола и 160 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). После интенсивного встряхивания смесь центрифугировали 10 мин при 12000xg, водную фазу переносили в новую пробирку. Экстракцию РНК из водной фазы смесью фенола с хлороформом (1:1) проводили трижды до исчезновения интерфазы. К водной фазе добавляли 2,5 объема этанола. После выдерживания в течение 2 ч при -20°С смесь центрифугировали 20 мин при 12000xg. Осадок, содержащий РНК, промывали, растворяли в 200 мкл воды и использовали для синтеза кДНК. Степень очистки и концентрацию выделенной РНК определяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле.

Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом Smart™ Kit (Clontech, США). Для реакции отбирали по 3 мкг тотальной РНК.

Геномную ДНК из щупалец актинии выделяли по методу [357]. К растертым в порошок в ступке с жидким азотом щупальцам актинии (~1 мг) добавили десять объемов буферного раствора для экстракции: 0,5% SDS, 0,1 М EDTA и 5 мкл (0,5 мг/мл) РНК-азы (Fermentas, Литва) в 10 мМ Трис-HCl буферном растворе, рН 8,0 в случае R. macrodactylus и 4 М гуанидинизотиоцианат, 25мМ цитрат натрия, 0,5% лаурилсаркозил натрия, 0,1 М |3-меркаптоэтаиол в случае О. orientalis и R. macrodactylus). Смесь инкубировали 1 ч при 37°С. Затем к ней добавляли протеиназу К (до конечной концентрации 100 мкг/мл) и инкубировали 3 ч при 50°С. ДНК дважды экстрагировали фенолом, уравновешенным 10 мМ Трис-HCl буферным раствором, рН 8,0, затем смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). На всех стадиях экстракции органическую и водную фазы осторожно перемешивали в течение 10 мин. ДНК осаждали 95%-ным этанолом и растворяли в 100 мкл воды.

Концентрацию ДНК определяли с помощью горизонтального электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле, используя буферный раствор, содержащий 40 мМ Трис-ОН, 20 мМ СН3СООН, 1мМ EDTA (рН 8,0). В качестве стандарта использовали ДНК фага X различной концентрации (Сибэнзим, Новосибирск).

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием 50 пМ каждого ген-специфичного праймера (EuroGene, Москва), 2,5 единицы TagSE-полимеразы, буферного раствора для TagSE-полимеразы, раствора дезоксирибонуклеотидов (0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеотида) (SibEnzyme, Новосибирск) и 0,05 мкг ДНК, выделенной из О. orientalis и R. macrodactylus. Реакцию проводили на амлификаторе (Eppendorf, Германия): для ДНК R. macrodactylus при следующих условиях: денатурация - 20 с при 94°С, отжиг - 20 с при 55°С, синтез - 1 мин при 72°С; количество циклов 25; для ДНК О. orientalis (с использованием «hot-start») при следующих условиях: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг - 30 с при 60°С, синтез - 1 мин при 72°С; количество циклов 28.

ПЦР для R. macrodactylus проводили при следующих условиях: денатурация - 4 мин при 95°С; 25 циклов: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг - 20 с при 55°С, синтез - 1 мин при 72°С; затем 5 мин при 72°С. Условия при проведении ПЦР 3'-RACE кДНК подбирали экспериментально для каждой пары праймеров.

Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, в качестве стандартов использовали набор нуклеотидов с длинами фрагментов от 100 до 1500 п.о. (Сибэнзим, Новосибирск).

Лигирование. Для лигирования использовали лигазный буфер, лигазу, вектор pTZ19R (Сибэнзим, Новосибирск), обработанный нуклеазой рестрикции Hindll, ПЦР-фрагмент.

Трансформация. К компетентным клеткам, размороженным при 4°С, добавляли 5 мкл лигазиой смеси и инкубировали при той же температуре в течение 30 мин. Затем, после нагревания на водяной бане при 42°С в течение 90 с, добавляли 1 мл нагретой до 37°С среды LB, инкубировали при 37°С 45 мин. Полученные клетки рассевали шпателем на чашки Петри с селективной средой. Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи.

Полимеразная цепная реакция колоний. Для ПЦР использовали реакционную смесь, содержащую: TagSE-полимеразный буферный раствор, раствор дезоксирибонуклеотидов, прямой и обратный праймеры M13Dir и M13Rev соответственно, TaqSE-полимеразу. В качестве матрицы использовали супернатант, полученный после лизиса отобранных колоний. Реакцию проводили на амлификаторе (Eppendorf, Германия) при следующих условиях: 10 мин при 95°С; затем 24 цикла: 15 с при 94°С, 15 с при 55°С, 30 с при 72°С; затем 10 мин при 72°С. Концентрацию и длину полученного ПЦР-фрагмента определяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, в качестве стандартов использовали набор нуклеотидов с длинами фрагментов от 100 до 1500 пар оснований.

Выделение плазмид проводили методом щелочного лизиса. В пробирку помещали 2 мл ночной культуры. Клетки осаждали центрифугированием при 14000xg в течение 1 мин, затем тщательно ресуспендировали их в 100 мкл раствора, состоящего из 10 мМ раствора EDTA, 50 мкг/мл РНКазы А, 25 мМ Трис-HCI буфера, рН 8,0, пипетированием. К клеткам добавляли 200 мкл раствора 0,4 М NaOH и 2% ДСН, мягко перемешивали, помещали на 5 мин в лед, добавляли 150 мкл раствора 3 М ацетата калия, рН 5,5, перемешивали мягким переворачиванием пробирки и затем инкубировали во льду 5 мин. После 20 мин центрифугирования смеси при 10000xg супернатант отбирали, добавляли 5 мкл РНКазы (100 мкг/мл) и раствор инкубировали 15 мин при 37°С. Затем к супернатанту добавляли равный объем смеси фенолгхлороформ (1:1), перемешивали, центрифугировали в течение 5 мин при 10000xg. Отбирали водную фазу, добавляли равный объем хлороформа, перемешивали, центрифугировали в течение 5 мин при 10000xg. Для осаждения ДНК к водной фазе добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Полученную смесь инкубировали в течение 20 мин при -20°С, затем центрифугировали в течение 10 мин при 10000xg. Супернатант удаляли, осадок промывали 70%-ным этанолом и растворяли в 30 мкл воды.

Секвенирование. Полученные плазмидные ДНК секвенировали с прямым и обратным М13 праймерами по методу [358] на капиллярном ДНК-секвенаторе (ABI, PRISM1"' 310, США). ПЦР продукт актинии R. macrodactylus очищали также с помощью Wizard DNA Clean-up Purification System (Promega, США), его концы наполняли dNTP и ATP с использованием фрагмента Klenow и Т4 полинуклеотидной киназы. Полученный продукт лигировали в pBlueScript SK+ вектор (Stratagene, США), гидролизованного эндонуклеазной рестриктазой Smal. Аликвоты из лигазного раствора трансформировали в Е. coli XL-1 Blue клетки. Рекомбинантные клоны анализировали, используя стандартные техники, и секвенировали с прямым и обратным М13-праймерами по методу [358] с [33Р] dATP на ДНК-секвенаторе версии 2.0 (Amersham, США).

Компьютерный анализ. Поиск гомологичных последовательностей проводили, используя белковые базы данных, при помощи программы BLASTX

359]. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили, используя программу CLASTALW [94,108].

4.6. Спектроскопические методы исследования вторичной структуры и конформационного состояния полипептидов УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре (Cecil СЕ 7200, Англия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при ширине щели 1 нм. Поправку на светорассеяние раствора актинопорина RTX-S II проводили, как описано Виндером

1% и Гентом [360]. Удельный коэффициент поглощения (^jCM) определяли по навеске актинопорина, доведённой до постоянного веса. Количество остатков тирозина и триптофана в молекуле RTX-S II рассчитывали из второй производной УФ-спектра поглощения, как описано [323].

Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре (Jasco-500A, Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 мм для пептидной области спектра и 1 см для ароматической. Кювету с раствором термостатировали при заданной температуре 25-30 мин до снятия спектра КД. Повторная регистрация спектра при этой же температуре показывала его полное совпадение с зарегистрированным первоначально. Точность температуры составляла ±0,5°С. Во избежание испарения растворителя при высоких температурах в кювету поверх исследуемого раствора наслаивали слой вазелинового масла. рН-Титрование раствора RTX-S II проводили концентрированными растворами NaOH и НС1. Значение рН раствора измеряли на рН-метре (inoLab, Германия). Точность измерения составляла ±0,02. В пептидной области спектра эллиптичность считали как эллиптичность среднего остатка, принимая среднюю молекулярную массу аминокислотного остатка равной 110 Да, в единицах град-см2/дмоль по формуле: [9] = 9Iia6jl-S-110/10-C-l, где S -чувствительность шкалы прибора, С - концентрация белка, мг/мл, 1 -длина оптического пути, мм. В ароматической области эллиптичность считали как молярную эллиптичность [9]м с молекулярной массой актинопорина RTX-S II, равной 19,28 кДа. Калибровку спектрополяриметра проводили по 0,06%-ному водному раствору d-камфора-Ю-сульфоната аммония. Отношение эллиптичности полос при 191 и 290 нм составляло 2,05.

Спектры флуоресценции RTX-S II измеряли на спектрофлуориметре (Hitachi 850, Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Влияние ионной силы на спектры флуоресценции проводили, добавляя рассчитанное количество концентрированного раствора NaCl в кювету с раствором актинопорина. Возбуждение флуоресценции проводили светом с длиной волны 280 и 296 нм. Спектры флуоресценции, корректированные по родамиду В (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буферного раствора. Значение интенсивности флуоресценции корректировали на увеличение объема при нагревании и при добавлении концентрированного раствора NaCl. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм.

Влияние ионной силы и величины рН на гемолитическую активность RTX-S II исследовали, выдерживая актинопорин (27,6 нг) в течение 30 мин при температуре 37°С в первом случае в растворах с концентрацией NaCl от 0 до 0,8 М, а во втором - в 0,01 М натрий-фосфатных буферных растворах со значением рН от 3,88 до 10,25. Конечный объем смеси составлял 20 мкл. Затем в пробы добавляли по 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов (3 параллели). Степень гемолиза (в %) определяли, как описано выше относительно контрольных проб, не содержащих актинопорин.

Влияние температуры па гемолитическую активность RTX-S II исследовали, выдерживая RTX-SII (27,6 нг) в 0,01 М натрий-фосфатпом буферном растворе, рН 7,2, в объеме 20 мкл при температурах 25,40, 50 и 60°. Затем в пробы добавляли по 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов (3 параллели). Степень гемолиза (в %) определяли, как описано выше относительно контрольных проб, не содержащих актинопорин.

Достоверность различий между полученными независимыми значениями оценивали при помощи критерия Стьюдента с использованием программы для статической обработки данных Statistica for Windows r.5.1 b (StatSoft Inc.). Значение S.D. не превышало 0,5%.

4.7. Биофизические и электрофизиологические методы исследования мембранолитического действия цитолизинов Влияние цитолизинов на проницаемость липосом. Липосомы формировали в два этапа. Вначале готовили многослойные липосомы по методу Бэнгхэма [292], используя раствор липидов в смеси хлороформ-метанол (1:1 по объему). Растворители упаривали до полного удаления, затем добавляли 1 мМ HEPES-Трис буферный раствор, рН 7,4, содержащий 100 мМ КС1. Колбу периодически встряхивали (через каждые 15 мин) в течение 1,5-2 ч. Суспензию оставляли для стабилизации при комнатной температуре на 1 час. Перед работой проводили второй этап подготовки липосом - увеличение степени гомогенности суспензии [284] и создание градиента ионов К+ на мембране [283]. Для этого суспензию липосом «продавливали» через ядерный фильтр с размерами пор 0,6 мкм (Nucleopore, Inc., США), а затем пропускали через колонку 1,5x25 см с грубой фракцией сефадекса G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). Содержание ионов К+ в липосомах определяли по выходу К+ при действии тритерпенового гликозида голотурина А [286].

Влияние цитолизинов на ионную проницаемость биологических мембран. Транспорт ионов К+ в суспензии эритроцитов, яйцеклеток морского ежа и липосом измеряли с помощью К+-селективного электрода типа ОР-К-0711Р и ионографа ОР-267 (Radelkis, Венгрия). В качестве электрода сравнения был использован каломельный электрод типа К-701 (Radiometer, Дания), заполненный насыщенным раствором NaCl.

Измерение электрических характеристик БЛМ, модифицированных цитолизинами. БЛМ формировали на отверстии тефлонового стаканчика диаметром 0,25 мм по методу [294]. Ток через БЛМ измеряли высокоомным вольтметр-электрометром ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране с помощью хлорсеребряных электродов (потенциал асимметрии 2-3 мВ). Регистрацию тока на выходе усилителя осуществляли потенциометром КПС-4. Цитолизины добавляли в водную фазу до формирования БЛМ. Температуру в измерительной ячейке поддерживали с помощью термостата с точностью ±0,5°С.

Измерение электрических характеристик эритроцитарной мембраны, модифицированной цитолизином. Действие цитолизина изучали на изолированных мембранных фрагментах эритроцита кролика (размер 6-8 мкм) в конфигурации «inside-out» [304, 305] методом точечной фиксации потенциала [361]. Пипетки заполняли раствором следующего состава: 140 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1,1 мМ EGTA, 0,55 мМ СаС12 (рСа 7), 10 мМ HEPES-KOH буферный раствор, рН 7,4. Сопротивление пипеток составляло 20-30 МОм. Эритроциты находились в растворе следующего состава: 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12, Ю мМ HEPES-NaOH буферный раствор, рН 7,4. Для регистрации токов использовали усилитель ЕРС-5 (List-electronik, ФРГ). Данные записывали на магнитограф для последующей обработки. Опыты проводили при температуре 20-22°С.

Исследование термодинамических характеристик цитолизинов и их липид-белковых и белок-белковых взаимодействий дифференциальной сканирующей калориметрией. Калориметрические измерения проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (СССР). Для измерения базовой линии обе калориметрические ячейки заполняли растворителем. Для измерения теплоемкости одну из ячеек заполняли раствором исследуемого цитолизина. Ошибка измерения составляла не более 5%. Все измерения проводились со скоростью нагревания 1 К/мин. Точность определения температуры соответствовала 0,1 °С. Температура, при которой наблюдалось максимальное теплопоглощение, регистрировалась как температура фазового перехода (Ттах). Энтальпию денатурации (AHd) определяли как отношение площади под эндотермическим пиком перехода образца к площади под калибровочной кривой. Площадь под пиком кривой теплопоглощения определяется как область, ограниченная калориметрической кривой и прямыми линиями, полученными экстраполяцией температурной зависимости теплоемкости до и после термоперехода к Td. Разницу между энергией Гиббса для денатурированного и нативного состояния полипептида, AGd, определяли по уравнению [310]: aGd = AHd ' дСР (Td " Т) + дСР Т (lnTd" lnT) где дСр - изменение теплоемкости денатурации.

Определение кооперативности термообусловленных процессов денатурации проводили по корреляционным тестам [311], основанным на том факте, что для перехода единой кооперативной системы измеряемая AHd должна равняться изменению энтальпии, рассчитанной из параметров калориметрически измеренной теплоемкости (величины эффективной энтальпии денатурации AHV-h или энтальпии Вант-Гоффа) в соответствии с уравнением [310]: дНу-Н =4RTd1'AT где ДТ - полуширина пика теплопоглощения.

Тени эритроцитов получали из консервированной крови человека и свежей крови собаки. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в концентрации 50 тыс. ед./мл. Кровь центрифугировали 5 мин при lOOOxg и при 0-4°С, осадок трижды промывали 5 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 8,0, содержащим 150 мМ NaCl. Эритроциты доводили этим же раствором до 10% гематокрита и разделяли на две части. К одной добавляли цитолизин в количестве 100 мкг/мл эритроцитов. Затем обе суспензии эритроцитов инкубировали 30 мин при 37°С. Контрольный образец эритроцитов центрифугировали в условиях, описанных выше, модифицированные цитолизином эритроциты - при 30000xg в течение 20 мин. Эритроциты в контрольном образце гемолизировали 20-25-кратпым объемом 5 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, рН 8,0, и центрифугировали в условиях, описанных выше для модифицированных цитолизином эритроцитов. В обоих случаях осадки промывали 3-4 раза средой, используемой для гемолиза, и дважды - буферным раствором, используемым в дальнейших измерениях.

Для анализа белковых компонентов теней эритроцитов использовали горизонтальный SDS-электрофорез в градиенте плотности ПААГ (5-20%). Гели сканировали на ДСА-1 денситометре (СССР).

4.8. Биологическая активность цитолизинов актиний

Острую токсичность определяли на белых беспородных мышах весом 2022 г внутрибрюшинной инъекцией исследуемой пробы, а также на прибрежных морских крабах Hemigrapsus penicillatus весом 14-18 г инъекцией между телом и ногой. Для количественного определения токсической активности полипептидов использовали величину летальной дозы ЛД50, мг/кг (количество белка, при введении которого у 50% экспериментальных животных наступает летальный исход).

Цитотоксическую дозу определяли модифицированным методом Шрека [362] окрашиванием опухолевых клеток эозином.

Гемолитическую активность цитолизинов определяли на эритроцитах мыши в среде, содержащей 0,9 % NaCl, 1 мМ КС1, 10 мМ глюкозы, 5 мМ трис-НС1 буферный раствор, рН 7,4. Уровень гемоглобина в супернатанте измеряли спектрофотометрически при 540 нм после предварительного охлаждения реакционной смеси и ее центрифугирования для осаждения эритроцитов и их теней на фотометре Spectromom-410 (MOM, Венгрия). За 100%-ный гемолиз (0,9 ОЕ540) принимали лизис 0,7% суспензии эритроцитов (1,2 ОЕ72о) Ю мкл 1% водного раствора голотурина А из морской кукумарии Н. leucospilota (любезно предоставленный лабораторией химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН). За одну гемолитическую единицу (ГЕ) принимали количество (мг) белка, вызывающее 50%-ный гемолиз в 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов за 30 мин при 37°С.

Определение рН-зависимости гемолитической активности RTX-A.

Цитолизин (2,5 мкг) инкубировали в течение 30 мин при 37°С в 1 мл буферного раствора с заданным значением рН, после чего быстро отбирали 5 мкл раствора и вводили в 0,5%-нуго суспензию (3 мл) эритроцитов кролика. Так как среда для суспендирования эритроцитов имела большую буферную емкость (100 мМ NaCl, 1 мМ КС1, 50 мМ HEPES-трис, рН 7,4), значение рН после добавления цитолизина изменялось не более чем на 0,05. Индуцируемый выход ионов К+ измеряли, как описагго выше.

Ингибирующее действие сфингомиелина определяли по методу [126]. Цитолизины предварительно инкубировали дисперсией сфингомиелина в молярном соотношении 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:50, 1:100 в течение 60 мин. Степень гемолиза эритроцитов, добавленных к липид-белковой смеси, определяли спектрофотометрически при 540 нм по поглощению супернатанта, полученного после центрифугирования суспензии эритроцитов.

Трипсинингибирующую активность полипептидов определяли по методу [263], используя субстрат К-бензоил-0,Ь-аргинина л-нитроанилид (BAPNA), приготовленный как описано ранее [264]. К 50 мкл водного раствора ингибитора добавляли 50 мкл раствора трипсина (100 мкг/мл 0.001 М HCI) и 250 мкл 0,1 М Трис-HCI буферного раствора, рН 8,1. После прединкубации в течение 5 мин при 37°С добавляли 250 мкл раствора субстрата (4 мг BAPNA в 0,3 мл диметилформамида, разбавленного в 10 раз 0,1 М Трис-HCI буферным раствором, рН 8,1). Количество образовавшегося в результате гидролиза п-нитроанилина определяли спектрофотометрически при 410 нм. Измерение проводили относительно контрольного образца, который содержал субстрат, денатурированный фермент и ингибитор в соответствующем разбавлении. За единицу трипсинингибирующей активности (ИЕ) принимали количество белка, необходимое для 50%-ного ингибирования 1 мг трипсина.

Фосфолипазную активность в полипептидных фракциях определяли тонкослойной хроматографией на пластинках с закреплённым слоем SiC>2 по появлению продуктов гидролиза лецитина (sn-фосфатидилхолина) согласно методу [273]. В качестве стандартов использовали лецитин и сфингомиелин (для определения сфингомиелиназной активности). Гидролиз лецитина осуществляли коммерческой фосфолипазой А2 из пчелиного яда и фосфолипазой С из С. welcbii (Calbiochem, США), сфингомиелин гидролизовали стафилококковой сфингомиелиназой (Boeringer Manheim, ФРГ).

Цитотоксическое действие RTX-S II на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа S. intermedins определяли по методу [363]. Действие цитолизина испытывали путем добавления RTX-S II в различных концентрациях (10, 25, 50, 100 мкг/мл) в инкубационную смесь к уже развивающимся зародышам, на стадии «поздняя бластула». За стадиями развития наблюдали в бинокуляр и фиксировали их несколько раз в течение инкубационного периода, сравнивая с контролем (эмбрионы в морской воде).

Антигистаминную активность определяли по методу [281] на белых беспородных крысах-самцах весом 52±2 г (по 5 животных в группе), используя 0,1%-ный раствор дигидрохлорида гистамина в физиологическом растворе. Контрольная группа животных получала гистамин, вызывающий микрошок в течение 2 мин. Состояние микрошока характеризовалось первоначально усилением дыхательных движений брюшной стенки животного с последующим участием в дыхательном процессе всех мышц тела, сопровождающимся быстрым движением головы вперед-назад. Раствор смеси Rml и Rmll (в соотношении 1:1) вводили животным внутривенно в дозах от 0,1 до 1 мл.

Аналитические данные. Полученные данные анализировали с помощью /теста Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ±S.D. из трех независимых измерений.

4.9. Компьютерный анализ.

Получение теоретических моделей актинопоринов. Для получения компьютерных моделей методом сравнительного моделирования [364, 365] использовали аминокислотные последовательности актинопоринов RTX-A [321], RTX-S II [265], Ог-А и Or-G [319] (коды Genbank AAW48528, AAW47579, AAW47930 соответственно). Поиск прототипа для исследуемых актинопоринов проводили по базе установленных пространственных структур PDB [366] с помощью автоматического сервера SWISS-MODEL [335, 367, 368]. Выравнивание аминокислотных последовательностей исследуемых акгииопоринов и их прототипов выполняли с помощью модуля CLUSTALW с параметрами BLOSUM62 в составе программы МОЕ [337] и вручную программой SPDBV [333, 335]. Выровненные последовательности исследуемых актинопоринов и их прототипов посылались программой SPDBV [333, 335] на сервер SWISS-MODEL [367, 368], где строились и оптимизировались теоретические модели. Качество полученных теоретических моделей было проверено на сервере программой WhatCheck [369] и с помощью программ МОЕ [337] и Molmol [334]. Элементы вторичной структуры актинопоринов были определены с помощью программы Molmol [334]. Анализ контактов в молекулах актинопоринов проведен с помощью программ МОЕ [337] и SPDBV [333]. Визуализацию молекул актинопоринов проводили с помощью программы Rasmol [336].

1. Alouf J.E. Pore-forming bacterial toxins: an overview // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 1-14.

2. Gouaux E. Channel-forming toxins: tales of transformation // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 4. P. 566-573.

3. Parker M.W., Pattus F., Tucker A.D., Tsemoglou D. Structure of the membrane-pore-forming fragment of colicin A // Nature. 1989. Vol. 337, N 6202. P. 93-96.

4. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa 3.0 A at resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. Vol. 83, N5. P. 1310-1324.

5. Li J.D. Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution // Nature. 1991. Vol. 353, N 6347. P. 815-821.

6. Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M., Kantardjieff K.A., Collier R.J., Eisenberg D. The crystal structure of diphtheria toxin // Nature. 1992. Vol. 357, N 6375. P. 216-222.

7. Adams J.M., Cory S. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family // Trends Biochem. Sci. 2001. Vol. 26, N 1. P. 61-66.

8. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40, N 2. P. 111-124.

9. Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. Vol. 88, N 1. P. 91-142.

10. Wiener M., Frcymann D., Ghosh P., Stroud R.M. Crystal structure of colicin la // Nature. 1997. Vol. 385, N 6615. P. 461-464.

11. Athanasiadis A., Anderluh G., Macek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II Structure. 2001. Vol. 9, N 4. P. 341-346.

12. Kraulis P. MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures // J. Appl. Cryst. 1991. Vol. 24, Pt. 5. P. 946-950.

13. Parker M.W., Buckley J.T., Postma J.P., Tucker A.D., Leonard K, Pattus F., Tsernoglou D. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin and the membrane-channcl states // Nature. 1994. Vol. 367, N 6460. P. 292-295.

14. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux, J.E. Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. Vol. 274, N5294. P. 1859-1866.

15. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen // Nature. 1997. Vol. 385, N 6619. P. 833— 838.

16. Li J., Koni P.A., Ellar D.J. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation //J. Mol. Biol. 1996. Vol. 257, N 1. P. 129-152.

17. Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. The cholesterol-dependent cytolysins // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 114.

18. Rossjohn J., Feil S.C., McKinstry W.J., Tweten R.K., Parker M.W. Structure of a cholesterol-binding, thiolactivated cytolysin and a model of its membrane form // Cell. 1997. Vol. 89, N 5. P. 685-692.

19. Gilbert R.J.C. Pore-forming toxins // Cell Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59, N 5. P.832.844.

20. Palmer M. The family of thiol-activated cholesterol-binding cytolysins // Toxicon. 2001. Vol 39, N11. P. 1681-1689.

21. Howard S.P., Meiklejohn H.G., Shivak D., Jahagirdar R. A TonB-like protein and a novel membrane protein encoding an ATP-binding cassette function together in exotoxin secretion // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 22, N 4. P. 595-604.

22. Lakey J.H., Slatin S.L. Pore-forming colicins and their relatives // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001, P. 131-161.

23. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nature Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

24. Pommier S., Gavioli M., Cascales E., Lloubes R. Tol-Dependent Macromolecule Import through the Escherichia coli Cell Envelope Requires the Presence of an Exposed TolA Binding Motif//J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, N 21. P. 7526-7534.

25. Bullock J.O., Kolen E.R. Ion selectivity of colicin El. III. Anion permeability // J. Membr. Biol. 1995. Vol. 144, N 2. P. 131-145.

26. Collarini M., Amblard G., Lazdunski C., Pattus F. Gating processes of channels induced by colicin A, its C-terminal fragment and colicin El in planar lipid bilayers // Eur. Biophys. J. 1987. Vol. 14, N 3. P. 147-153.

27. Slatin S.L., Nardi A., Jakes K.S., Baty D., Duche D. Translocation of a functional protein by a voltagedependent ion channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. Vol. 99, N 3. P. 1286-1291.

28. Parker M.W., Tucker A.D., Tsernoglou D., Pattus F. Insights into membrane insertion based on studies of colicins // Trends Biochem. Sci. 1990. Vol. 15, N 4. P. 126— 129.

29. Vetter I.R., Parker M.W., Tucker A.D., Lakey J.H., Pattus F., Tsernoglou D. Crystal structure of a colicin N fragment suggests a model for toxicity // Structure. 1998. Vol. 6, N 7. P. 863-874.

30. Duche D., Parker M.W., Gonzalez-Manas J.M., Pattus F., Baty D. Uncoupled steps of the colicin A pore formation demonstrated by disulfide bond engineering // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, N 9. P. 6332-6339.

31. Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. Brominated phospholipids as a tool for monitoring the membrane insertion of colicin A // Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 32. P.7294-7300.

32. Lindeberg M., Zakharov S.D., Cramer W.A. Unfolding pathway of the colicin El channel protein on a membrane surface // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 295, N 3. P. 679-692.

33. Lakey J.H., Parker M.W., Gonzalez-Manas J.M., Duche D. Vriend G., Baty D., Pattus F. The role of electrostatic charge in the membrane insertion of colicin A. Calculation and mutation //Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 220, N 1. P. 155-163.

34. Muga A., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F.P., Surewicz W.K. pH-dependent stability and membrane interaction of the pore-forming domain of colicin A // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, N 3. P. 1553-1557.

35. Baty D., Lakey J., Pattus F., Lazdunski C. A 136-amino-acid residue COOH-terminal fragment of colicin A is endowed with ionophoric activity // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 189, N2. P. 409-413.

36. Ghosh P., Mel S.F., Stroud R.M. The domain structure of the ion channel-forming protein colicin la// Nature Struct. Biol. 1994. Vol. 1, N 9. P. 597-604.

37. Garcfa-Saez A.J., Coraiola M., Serra M.D., Mingarro I., Menestrina G., Salgado J. Peptides derived from apoptotic В ax and Bid reproduce the poration activity of the parent full-length proteins // Biophys. J. 2005. Vol. 88, N 6. P. 3976-3990.

38. Antonsson В., Montessuit S., Lauper S., Eskes R., Martinou J.C. Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome с release from mitochondria // Biochem. J. 2000. Vol. 345 (Part 2). P. 271— 278.

39. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis // Science. 1998. Vol. 281, N 5381. P. 1309-1312.

40. Epand R.F., Martinou J.C., Montessuit S., Epand R.M., Yip C.M. Direct evidence for membrane pore formation by the apoptotic protein Bax // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 298, N 5. P. 744-749.

41. Suzuki M., Youle R.J., Tjandra N. Structure of Bax: Coregulation of Dimer Formation and Intracellular Localization // Cell. 2000. Vol. 103, N 4. P. 645-654.

42. McDonnell J.M., Fushman D., Milliman C.L., Korsmeyer S.J., Cowburn D. Solution structure of the proapoptotic molecule BID: a structural basis for apoptotic agonists and antagonists // Cell. 1999. Vol. 96, N 5. P. 625-634.

43. Barbato G., Ikura M., Kay L.E., Pastor R.W. Backbone dynamics of calmodulin studied by 15N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the centralhelix is flexible //Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 23. P. 5269-5278.

44. Grzesiek S., Bax A. Amino-acid type determination in the sequential assignment procedure of uniformly 13C/15N-enriched proteins // J. Biomol. NMR. 1993. Vol. 3, N 2. P. 185-204.

45. Nechushtan A., Smith C.L., Hsu Y.T., Youle R.J. Conformation of the Вах C-terminus regulates subcellular location and cell death // EMBO J. 1999. Vol. 18, N 9. P. 2330-2341.

46. Strauss N., Hendee E.D. The effect of diphtheria toxin on the metabolism of HeLa cells //J. Exp. Med. 1959. Vol. 109, N 2. P. 145-163.

47. Lennox E.S., Kaplan A.S. Action of diphtheria toxin on cells cultivated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. Vol. 95, N 4. P. 700-702.

48. Collier R.J. Effect of diphtheria toxin on protein synthesis: inactivation of one of the transfer factors // J. Mol. Biol. 1967. Vol. 25, N 1. P. 83-98.

49. Honjo Т., Nishizuka Y., Hayaishi O. Diphtheria toxin-dependent adenosine diphosphate ribosylation of aminoacyl transferase II and inhibition of protein synthesis // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 13. P. 3553-3555.

50. Van Ness B.G., Howard J.B., Bodley J.W. ADP-ribosylation of elongation factor 2 by diphtheria toxin. Isolation and properties of the novel ribosyl-amino acid and its hydrolysis products // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N 22. P. 10717-10720.

51. Drazin R., Kandel J., Collier R.J. Structure and activity of diphtheria toxin-II: attack by trypsin at a specific site within the intact toxin molecule // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246, N 5. P. 1504-1510.

52. Weiss M.S., Blanke S.R., Collier R.J., Eisenberg D. Structure of the isolated catalytic domain of diphtheria toxin // Biochemistry. 1995. Vol. 34, N 3. P. 773-781.

53. Barbieri J.T., Collier R.J. Expression of a mutant, full-length form of diphtheria toxin in Escherichia coli II Infect. Immun. 1987. Vol. 55, N 7. P. 1647-1651.

54. Madshus I.H., Wiedlocha A., Sandvig K. Intermediates in translocation of diphtheria toxin cross the plasma membrane // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, N 6. P. 2628-2652.

55. Stenmark H., Olsnes S., Madshus I.H. Elimination of the disulphide bridge in fragment В of diphtheria toxin: Effect on membrane insertion, channel formation, and ATP binding // Mol. Microbiol. 1991. Vol. 5, N 3. P. 595-606.

56. Oh K.J., Zhan H., Cui C., Altenbach C., Hubbell W.L., Collier R.J. Conformation of the diphtheria toxin T domain in membranes: a site-directed spin-labeling study of the TH8 helix and TL5 loop II Biochemistry. 1999.Vol. 38, N 32. P. 10336-10343.

57. Silverman J.A., Mindell J.A., Zhan H., Finkelstein A., Collier R.J. Structure-function relationships in diphtheria toxin channels: I. Determining a minimal channel-forming domain//J. Membr. Biol. 1994. Vol. 137, N 1. P. 17-28.

58. Naglich J.G., Metherall J.E., Russell D.W, Eidels L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor // Cell. 1992. Vol. 69, N 6. P. 1051-1061.

59. Lotan A., Fishman L., Zlotkin E. Toxin compartmentation and delivery in the Cnidaria: The nematocyst's tubule as a multiheaded poisonous arrow // J. Exp. Zool. 1996. Vol. 275, N6. P. 444-451.

60. Meinardi E., Florin-Christensen M., Paratcha G., Azcurra J.M., Florin-Christensen J. The molecular basis of self/nonself selectivity of a coelenterate toxin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 216, N 1. P. 348-354.

61. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

62. Elliot R.C., Konya R.S., Vickneshwara K. Isolation of a toxin from the dahlia sea anemone, Tealiafelina L. //Toxicon. 1986. Vol. 24, N 2. P. 117-122.

63. Grotendorst G.R., Hessinger D.A. Enzymatic characterization of the major phospholipase A2 component of sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom // Toxicon. 2000. Vol. 38, N 7. P. 931-943.

64. Bernheimer A.W., Avigad L.S., Kim K.S. Comparison of metridiolysin from the sea anemone with thiol-activated cytolysins from bacteria // Toxicon. 1979. Vol. 17, N 1. P. 69-75.

65. Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus II ДАН СССР. 1984. Т. 277, N 6. С. 1491-1493.

66. Иванов А.С., Мольнар А.А., Козловская Э.П., Монастырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 1987. Т. 4, N 3. С. 243-248.

67. Брежестовский П.Д., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Действие гемолизина из морской анемоны Radianthus macrodactylus на эритроцитарную мембрану //ДАН СССР. 1988. Т. 299, N 3. С. 748-750.

68. Belmonte G., Pederzolli С., Macek P., Menestrina G. Pore formation by the sea anemone cytolysin equinatoxin II in red blood cells and model lipid membranes // J. Membrane Biol. 1993. Vol. 131, N 1. P. 11-22.

69. Michaels D.W. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus I. Formation of transmembrane channels in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555, N 1. P. 67-78.

70. Varanda W., Finkelstein A. Ion and nonelectrolyte permeability properties of channels formed in planar lipid bilayer membranes by the cytolytic toxin from the sea anemone, Stoichactis helianthus II J. Membr. Biol. 1980. Vol. 55, N 3. P. 203-211.

71. Руднев B.C., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная M.M., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1, N 10. С. 1019-1024.

72. Saier M.H. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. Vol. 64, N 2. P. 354-411.

73. Tejuca M., Dalla Serra M., Ferreras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilization by sticholysin I, a cytolysin isolated from venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus II Biochemistry. 1996. Vol. 35, N 47. P. 14947-14957.

74. Blumenthal K.M., Kem W.R. Primary structure of Stoichactis helianthus cytolysin III IIJ. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 9. P. 5574-5581.

75. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family // Toxicon. 1999. Vol. 37, N 10. P. 1391-1401.

76. Pungercar J., Anderluh G., Gubensek F., Strukelj B. Sequence analysis of the cDNA encoding the precursor of equinatoxin V, a newly discovered hemolysin from the sea anemone Actinia equina II Biochem. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1341, N 2. P. 105-107.

77. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. Cloning, sequencing and expression of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. Vol. 220, N 2. P. 437-442.

78. Wang Y., Chua K.L., Khoo H.E. A new cytolysin from the sea anemone, Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning and functional expression // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1478, T 1. P. 8-18.

79. Jiang X.Y., Yang W.L., Chen H.P., Tu H.B., Wu W.Y., Wei J.W., Wang J., Liu W.H, Xu A.L. Cloning and characterization of an acidic cytolysin cDNA from sea anemone Sagartia rosea //Toxicon. 2002. Vol. 40, N 11. P. 1563-1569.

80. Simpson R.J., Reid G.E., Moritz R.L., Morton C., Norton R.S. Complete amino acid sequence of tenebrosin-C, a cardiac stimulatory and haemolytic protein from sea anemone Actinia tenebrosa II Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 190, N 2. P. 319-328.

81. Shai Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides // Biopolymers. 2002. Vol. 66, N 4. P. 236-248.

82. Takagi J. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Transactions. 2004. Vol. 32 (Pt 3). P. 403-406.

83. Anderluh G., Podlesek Z., Macek P. A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1476, N 2. P. 372-376.

84. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. The coding region of the equinatoxin II gene lacks introns // Croat. Chem. Acta. 1995. Vol. 68, N 3. P. 533542.

85. Spagnuolo A., Zanetti L., Cariello L., Piccoli R. Isolation and characterization of two genes encoding calitoxins, neurotoxic peptides from Calliactis parasitica (Cnidaria) // Gene. 1994 Vol. 138, N 1-2. P. 187-191.

86. Weber J., Klug M., Tardent P. Chemistry of hydra nematocysts // The Biology of Nematocysts / Eds. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. San Diego, CA: Acad. Press, 1988. P. 427-444.

87. Zhang M., Fishman Y., Sher D., Zlotkin E. Hydralysin, a novel animal group-selective paralytic and cytolytic protein from a noncnidocystic origin in hydra // Biochemistry. 2003. Vol. 42, N 30. P. 8939-8944.

88. Menestrina G., Cabiaux V., Tejuca M. Secondary structure of sea anemone cytolysins in soluble and membrane bound form by infrared spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 254, N 1. P. 174-180.

89. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALW windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, N 24.4876-4882.

90. Holm L., Sander C. Protein folds and families: sequence and structure alignments // Nucl. Acids Res. 1999. Vol. 27, N 1. P. 244-247.

91. Gibrat J.F., Madej Т., Spouge J.L., Bryant S.H. The VAST protein structure comparison method // Biophys. J. 1997. Vol. 72, N 2. P. MP298.

92. Hinds M.G., Zhang W., Anderluh G., Hansen P.E., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 315, N 5. P. 1219-1229.

93. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C. Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. 1995. Vol. 375, N6529. P. 291-298.

94. Malavasic M., Poklar N., Macek P., Vesnaver G. Fluorescence studies of the effect of pH, guanidine hydrochloride and urea on equinatoxin II conformation // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1280, N 1. P. 65-72.

95. Mancheno J.M., De los Rios V., Del Pozo A.M., Lanio M.E., Onaderra M., Gavilanes J.G. Partially folded states of the cytolytic protein sticholysin II // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1545, N 1-2. P. 122-1531.

96. Anderluh G., Dalla Serra M., Viero G., Guella G., Macek P., Menestrina G. Pore formation by equinatoxin II, a eukaryotic protein toxin, occurs by induction of nonlamellar lipid structures // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N 46. P. 45216-45223.

97. Anderluh G., Razpotnik A., Podlesek Z., Macek P., Separovic F., Norton R.S. Interaction of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II with model membranes: l9F NMR studies // J. Mol. Biol. 2005 Vol. 347, N 12. P. 27-39.

98. Poklar N. Volker J., Anderluh G., Macek P., Chalikian T.V. Acid- and base-induced conformational transitions of equinatoxin II // Biophys. Chem. 2001. Vol. 90, N 2. P. 103-121.

99. Macek P., Lebez D. Kinetics of hemolysis induced by equinatoxin, a cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina. Effect of some ions and рН II Toxicon. 1981. Vol. 19, N2. P. 233-240.

100. Doyle J.W., Kem W.R. Binding of a radiolabeled sea anemone cytolysin to erythrocyte membranes II Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 987, N 2. P. 181-186.

101. Doyle J.W., Kem W.R., Vilallonga F.A. Interfacial activity of an ion channel-generating protein cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1989. Vol. 27, N4. P. 465^71.

102. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating those near the membrane surface // Biochemistry. 1996. Vol. 35, N 19. P. 6058-6063.

103. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding // Adv. Protein Chem. 1995. Vol. 47, N 47. P. 83-229.

104. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73, N 2. P. 467-471.

105. Caaveiro J.M., Echabe I., Gutierrez-Aguierre I., Nieva J.L., Arrondo J.L.R., Gonzales-Manas J. Differential interaction of equinatoxin II with model membranes in response to lipid composition // Biophys. J. 2001. Vol. 80, N 3. P. 1343-1353.

106. Zorec R., Tester M., Macek P., Mason W.T. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and increase in intracellular calcium activity // J. Membrane Biol. 1990. Vol. 118, N 3. P. 243-249.

107. Bonev B.B., Lam Y.H., Anderluh G., Watts A., Norton R.S., Separovic F. Effects of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II on lipid membranes and the role of sphingomyelin II Biophys. J. 2003 Vol. 84, N 4. P. 2382-2392.

108. Shin M.L., Michaels D.W., Mayer M.M. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus. II. Effect of membrane lipid composition in a liposome system // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555, N 1. P. 79-88.

109. Macek P., Zecchini M., Stanek K„ Menestrina G. Effect of membrane-partitioned n-alcohols and fatty acids on pore-forming activity of a sea anemone toxin // Eur. Biophys. J. 1997. Vol. 25, N3. P. 155-162.

110. Turk Т., Macek P., Gubensek F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1119, N 1. P. 1-4.

111. Khoo H.E., Fong C.L., Yuen R., Chen D.S. Stimulation of hemolytic activity of sea anemone cytolysins by 8-anilino-l-naphtalenesulphonate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 232, N 2. P. 422-426.

112. Campos A.M., Lissi E.A., Vergara C., Lanio M.E., Alvarez C., Pazos I., Morera V., Garcia Y., Martinez D. Kinetics and mechanism of Stn I modification by peroxyl radicals //J. Protein Chem. 1999. Vol. 18, N 3. P. 297-306.

113. Malovrh P., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Menestrina G., Anderluh G. Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. J. 2000. Vol. 346 (Pt 1). P. 223-232.

114. Anderluh G., Macek P., Lakey J.H. Peeking into a secret world of pore-forming toxins: membrane binding processes studied by surface plasmon resonance // Toxicon. 2003. Vol. 42, N 3. P. 225-228.

115. Anderluh G., Pungercar J., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P. N-terminal truncation mutagenesis of equinatoxin II, a pore-forming polypeptide from the sea anemone Actinia equina II Protein Eng. 1997. Vol. 10, N 7. P. 751-755.

116. Anderluh G., Barlic A., Potrich C., Macek P., Menestrina G. Lysine 77 is a key residue in aggregation of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II J. Membrane Biol. 2000. Vol. 173, N 1. P. 47-55.

117. Nicholls A., Sharp K.A., Honig, B. Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons // Proteins. 1991. Vol. 11, N 4. P. 281-296.

118. Esnouf R.M. An extensively modified version of MolScript that includes greatly enhanced coloring capabilities //J. Mol. Graph. 1997. Vol. 15, N 2. P. 132-134.

119. Merritt E.A., Murphy M.E.P. Raster3D version 2. A program for photorealistic molecular graphics // Acta Crystallogr. 1994. Vol. 50 (Pt. 6). P. 869-873.

120. Gutierrez-Aguirre I., Barlic A., Podlesek Z., Мабек P., Anderluh G., Gonzalez-Manas J.M. Membrane insertion of the N-terminal a-helix of equinatoxin II, a sea anemone cytolytic toxin // Biochem J. 2004. Vol. 384 (Pt. 2). P. 421-428.

121. Schiffer M., Edmundson A.B. Use of helical wheels to represent the structures of protein and to identify segments with helical potential // Biophys. J. 1967. Vol. 7, N 2. P. 121-135.

122. Hildebrand A., Pohl M., Bhakdi S. Staphylococcus aureus a-toxin. Dual mechanism of binding to target cells // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, N 26. P. 1719517200.

123. Valeva A., Palmer M., Bhakdi S. Staphylococcal a-toxin: formation of the heptameric pore is partially cooperative and proceeds through multiple intermediate stages // Biochemistry. 1997. Vol. 36, N 43. P. 13298-13304.

124. Kawate Т., Gouaux E. Arresting and releasing Staphylococcal a-hemolysin at intermediate stages of pore formation by engineered disulfide bonds // Protein Sci. 2003. Vol. 12, N5. P. 997-1006.

125. Ward R.J., Leonard K. Staphyloccus aureus alpha-toxin channel complex and the effect of Ca2+ ions on its interactions with lipid bilayers // J. Struct. Biol. 1992. Vol. 109, N 2. P. 129-141.

126. Czajkowsky D.M., Sheng S.T., Shao Z.F. Stapyhlococcal a-hemolysin can form hexamers in phospholipids bilayers // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 276, N 2. P. 325-330.

127. Prevost G., Mourey L., Colin D.A., Menestrina G. Pore-forming bacterial toxins: an overview // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 53-83.

128. Watson K.C., Kerr E.J. Sterol structural requirements for inhibition of streptolysin О activity // Biochem. J. 1974. Vol. 140, N 1. P. 95-98.

129. Kehoe M.A., Miller, L., Walker J.A. Boulnois G.J. Nucleotide sequence of the streptolysin О (SLO) gene: structural homologies between SLO and other membrane-damaging, thiol-activated toxins // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, N 12. P. 3228-3232.

130. Polekhina G., Giddings K.S., Tweten R.K., Parker M.W. Insights into the action of the superfamily of cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102, N 3. P. 600-605.

131. Getzoff E.D., Tainer J.A., Olson A.J. Recognition and interactions controlling the assemblies of beta barrel domains//Biophys. J. 1986 Vol. 49, N l.P. 191-206.

132. Iwamoto M., Ohno-Iwashita Y., Ando S. Role of the essential thiol group in the thiol-activated cytolysin from Clostridium perfringens II Eur. J. Biochem 1987. Vol. 167, N 3. P. 425-430.

133. Boulnois G.J., Paton J.C., Mitchell T.J., Andrew P.W. Structure and function of pneumolysin, the multifunctional, thiol-activated toxin of Streptococcus pneumoniae II Mol. Microbiol. 1991. Vol.5, N 11. P.2611-2616.

134. Palmer M., Saweljew P., Vulicevic I., Valeva A., Kehoe M., Bhakdi S. Membrane-inserting domain of streptolysin О identified by cysteine scanning mutagenesis // J. Biol. Chem 1996. Vol. 271, N 43. P. 26664-26667.

135. Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. The mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel paradigm for pore-forming toxins // Cell. 1999. Vol. 99, N 3. P. 293-299.

136. Heuck A.P., Hotze E.M., Tweten R.K., Johnson A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric P-barrel protein: perfringolysin О creates a pore using ordered and coupled conformational changes // Mol. Cell. 2000. Vol. 6, N 5. P. 1233-1242.

137. Ramachandran R., Tweten R.K., Johnson A.E. Membrane-dependent conformational changes initiate cholesterol-dependent cytolysin oligomerization and intersubunit p-strand alignment//Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, N 8. P. 697-705.

138. Hotze E.M., Heuck A.P., Czajkowsky D.M., Shao Z., Johnson A.E., Tweten R.K. Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of a P-barrel-forming cholesteroldependent cytolysin // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, N 13. P. 11597-11605.

139. Bayley H., Jayasinghe L., Wallace M. Prepore for a breakthrough // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12, N 5. P. 385-386.

140. Alouf J.E., Geoffroy C. The family of the antigenically related, cholesterol-binding («sulphydryl-activated») cytolytic toxins // Sourcebook of Bacterial Protein Toxins / Eds. Alouf J.E., Freer J.J. London, UK: Acad. Press, 1991. P. 147-186.

141. Jacobs Т., Darji A., Frahm N. Rohde M., Wehland J„ Chakraborty Т., Weiss S. Listeriolysin O: cholesterol inhibits cytolysis but not binding to cellular membranes // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 28, N 6. P. 1081-1089.

142. Giddings K.S., Johnson A.E., Tweten R.K. Redefining cholesterol's role in the mechanism of the cholesteroldependent cytolysins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100, N20. P. 11315-11320.

143. Nishibori Т., Xiong H., Kawamura I., Arakawa M., Mitsuyama M. Induction of cytokine gene expression by listeriolysin О and roles of macrophages and NK cells // Infect. Immun. 1996. Vol. 64, N 8. P. 3188-3195.

144. Yoshikawa H., Kawamura I., Fujita M., Tsukada H., Arakawa M., Mitsuyama M. Membrane damage and interleukin-1 production in murine macrophages exposed to listeriolysin О // Infect. Immun. 1993. Vol. 61, N 4. P. 1334-1339.

145. Sher D., Fishman Y., Zhang M., Lebendiker M., Gaathon A., J.M. Mancheno, Zlotkin E. Hydralysins, a New Category of P-Pore-forming Toxins in Cnidaria // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, N 24. P. 22847-22855.

146. Sher D., Knebel A., Bsor Т., Nesher N. Tal Т., Morgenstern D., Cohen E., Fishman Y., Zlotkin E. Toxic polypeptides of the hydra a bioinformatic approach to cnidarian allomones // Toxicon. 2005. Vol. 45, N 7. P. 865-879.

147. Kawashima Y., Nagai H., Ishida M., Nagashima Y., Shiomi K. Primary structure of echotoxin 2, an actinoporin-like hemolytic toxin from the salivary gland of the marine gastropod Monoplex echo II Toxicon. 2003. Vol. 42, N 5. P. 491-497.

148. Papo N. Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? // Peptides. 2003. Vol. 24, N 11. P. 1693-1703.

149. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. 1995. Vol. 13. P. 61-92.

150. Lehrer R.I.* Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz Т., Selsted M.E. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity // J. Clin. Invest. 1989. Vol. P. 84, N 2. P. 553-561.

151. Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by H1 NMR // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 209, N 1. P. 163-169.

152. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84, N 15. P. 5449-5453.

153. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin// Biochemistry. 1991. Vol. 30, N 36. P. 8824-8830.

154. Terwilliger T.C., Eisenberg D. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, N 11. P. 6016-6022.

155. Fox R.O., Richards F.M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5 A resolution // Nature. 1982. Vol. 300, N 5890. P. 325-330.

156. Shai Y., Fox J., Caratsch C., Shih Y.L., Edwards C., Lazarovici P. Sequencing and synthesis of pardaxin, a polypeptide from the Red Sea Moses sole with ionophore activity // FEBS Lett. 1988. Vol. 242, N 1. P. 161-166.

157. Allende D., Mcintosh T.J. Lipopolysaccharides in bacterial membranes act like cholesterol in eukaryotic plasma membranes in providing protection against melittin-induced bilayer lysis // Biochemistry. 2003. Vol. 42, N 4. P. 1101-1108.

158. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride // Experientia. 1967. Vol. 23, N 2. P. 85-86.

159. Hancock R.E., Scott M.G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97, N 16. P. 8856-8861.

160. Seelig J. Thermodynamics of lipid-peptide interactions // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1666, N 1-2. P. 40-50.

161. Oren Z., Shai Y. Mode of action of linear amphipathic a-helical antimicrobial peptides // Biopolymers (Peptide Science). 1998. Vol. 47, N 6. P. 451-463.

162. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by a-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462, N 1-2. P. 55-70.

163. Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L., Huang H.W. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys. J. 2001. Vol. 81, N 3. P. 1475— 1485.

164. Ladokhin A.S., White S.H. Interfacial folding and membrane insertion of a designed helical peptide // Biochemistry. 2004. Vol. 43, N 19 . P. 5782-5791.

165. Pouny Y., Rapaport D., Мог A., Nicolas P., Shai Y. Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes // Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 49. P. 12416-12423.

166. Feder R., Dagan A., Мог A. Structure-activity relationship study of antimicrobial dermaseptin S4 showing the consequences of peptide oligomerization on selective cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 6. P. 4230-4238.

167. Habermann E. Bee and wasp venom: the biochemistry and pharmacology of their peptides and enzymes are reviewed // Science. 1972. Vol. 177, N 46. P. 314-322.

168. Dempsey C.E., Butler G.S. Helical structure and orientation of melittin in dispersed phospholipid membranes from amide exchange analysis in situ II Biochemistry. 1992. Vol. 31, N48. P. 11973-11977.

169. Terwilliger T.C., Weissman L., Eisenberg D. The structure of melittin in the form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities // Biophys. J. 1982. Vol. 37, N 1. P. 353-361.

170. Altenbac h C., Hubbell W.L. The aggregation state of spinlabeled melittin in solution and bound to phospholipid membranes: evidence that membrane-bound melittin is monomeric // Proteins. 1988. Vol. 3, N 4. P. 230-243.

171. Makhatadze G.I., Medvedkin V.N., Privalov P.L. Partial molar volumes of polypeptides and their constituent groups in aqueous solution over a broad temperature range//Biopolymers. 1990. Vol. 30, N 11-12. P. 1001-1010.

172. Lubke K., Matthes S„ Kloss G. Isolation and structure of N 1-formyl melittin // Experientia. 1971. Vol. 27, N 7. P. 765-767.

173. Dawson C.R., Drake A.F., Helliwell J., Hider R.C. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes // Biochim. Biophys. Acta 1978. Vol. 510, N 1. P. 75-86.

174. Skehel J.J., Wiley D.C. Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion // Cell. 1998. Vol. 95, N 7. P. 871-874.

175. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride II Experientia. 1967. Vol. 23, N 2. P. 85-86.

176. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. Vol. 175, N 23. P. 720-731.

177. Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes // Nature. 1997. Vol. 387,N 6633. P. 569-572.

178. Brown D.A., London E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 23. P. 17221-17224.

179. Alonso M.A., Millan J. The role of lipid rafts in signalling and membrane trafficking in T lymphocytes // J. Cell Sci. 2001 Vol. 114 (Pt. 2) P. 3957-3965.

180. Brown R.E. Sphingolipid organization in biomembranes: what physical studies of model membranes reveal // J. Cell Sci. 1998. Vol. 11 l(Pt. 1). P. 1-9.

181. Kabouridis P.S., Janzen J., Magee A.L., Ley S.C. Cholesterol depletion disrupts lipid rafts and modulates the activity of multiple signaling pathways in T lymphocytes // Eur. J. Immunol. 2000. Vol. 30, N 3. P. 954-963.

182. Pralle A., Keller P., Florin E.-L., Simons K., Horber J.K.H. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells // J. Cell Biol. 2000. Vol. 148, N 5. P. 997-1007.

183. Stefanova I., Horejsi V., Ansotegui I., Knapp W., Stockinger H. GPI-anchored cell-surface molecules complexed to protein tyrosine kinases // Science. 1991. Vol. 254, N 5034. P. 1016-1019.

184. Wulfing C., Davis M.M. A receptor/cytoskeletal movement triggered by costimulation during T cell activation // Science. 1999. Vol. 282, N 5397. P. 2266-2269.

185. Boyle E.C., Finlay B.B. Bacterial pathogenesis: exploiting cellular adherence // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol. 15, N 5. P. 633-639.

186. Galan J.E. Salmonella interactions with host cells: type III secretion at work // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. Vol. 17. P. 53-86.

187. Barbieri J.T., Riese M.J., Aktories K. Bacterial toxins that modify the actin cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2002.Vol. 18. P. 315-344.

188. Hayward R.D., Koronakis V. Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella // EMBO J. 1999. Vol. 18, N 18. P. 4926-4934.

189. McGhie E.J., Hayward R.D., Koronakis V. Cooperation between actin-binding proteins of invasive Salmonella: SipA potentiates SipC nucleation and bundling of actin // EMBO J. 2001. Vol. 20, N 9. P. 2131-2139.

190. Stebbins C.E. Structural insights into bacterial modulation of the host cytoskeleton // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. Vol. 14, N 6. P. 731-740.

191. Lilic M., Galkin V.E., Orlova A., VanLoock M.S., Egelman E.H., Stebbins C.E. Salmonella SipA polymerizes actin by stapling filaments with nonglobular protein arms // Science. 2003. Vol. 301, N 5641. P. 1918-1921.

192. White S.H., Wimley W.C. Membrane protein folding and stability: Physical Principles // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. Vol. 28. P. 319-365.

193. Koepke J., Ни X.C., Muenke C., Schulten K., Michel H. The crystal structure of the light-harvesting complex II (B800-850) from Rhodospirillum molischianum II Structure. 1996. Vol. 4, N 5. P. 581-597.

194. Meyer J.E.W., Hofnung M., Schulz G.E. Structure of maltoporin from Salmonella typhimurium ligated with a nitrophenyl-maltotrioside // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266, N 4. P. 761-775.

195. McDonnell P.A., Shon К., Kim Y., Opella S.J. fd coat protein structure in membrane environments //J. Mol. Biol. 1993. Vol. 233, N 3. P. 447-463.

196. White S.H., von Heijne G. The machinery of membrane protein assembly // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. Vol. 14, N 4. P. 397-404.

197. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure // J. Biol. Chem. 2001 Vol. 276, N 35. P. 32395-32398.

198. Schiffer M., Chang C.H., Stevens F.J. The functions of tryptophan residues in membrane proteins // Protein Eng. 1992. Vol. 5, N 3. P. 213-214.

199. Wimley W.C., White S.H. Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces // Nat. Struct. Biol. 1996. Vol. 3, N 10. P. 842-848.

200. Yau W.-M., Wimley W.C., Gawrisch K., White S.H. The preference of tryptophan for membrane interfaces // Biochemistry. 1998. Vol. 37, N 42. P. 14713-14718.

201. Morrow M.R., Huschilt J.C., Davis J.H. Simultaneous modeling of phase and calorimetric behavior in an amphiphilic peptide/phospholipid model membrane // Biochemistry. 1985. Vol. 24, N 20. P.5396-406.

202. Potrich C., Tomazzolli R., Dalla Serra M., Anderluh G., Malovrh P., Macek P., Menestrina G., Tejuca M. Cytotoxic activity of a tumor protease-activated pore-forming toxin // Bioconjug. Chem. 2005. Vol. 6, N 2. P. 369-376.

203. Menestrina G., Serra M.D., Prevost G. Mode of action of p-barrel pore-forming toxins of the staphylococcal a-hemolysin family // Toxicon. 2001. Vol. 39, N 11. P. 16611672.

204. Burks R.L., Lodge D.M. Cued in: advances and opportunities in freshwater chemical ecology//J. Chem. Ecol. 2002. Vol. 28, N 10. P.1901-1917.

205. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea-anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 5, N 1-3. P. 121-130.

206. Halstead B.W. Poisonous and venomous marine animals of the world. Princeton, N.Y.: Darwin Press, 1978.1216 p.

207. Shiomi K., Ishikawa M., Yamanaka H., Kikuchi T. Isolation and properties of four serine protease inhibitors from water extracts of sea anemone Actinia equina II Nippon Suisan Gakkaishi. 1989. Vol. 55, N 7. P. 1235-1241.

208. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Ядовитые кишечнополостные // Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды; Москва: Высшая школа, 1985. С. 36-54.

209. Hessinger D.A., Lenhoff Н.М. Membrane structure and function. Mechanism of hemolysis induced by nematocyst venom: roles of phospholipase A and direct lytic factor // Arch. Biochem. Biophys. 1976. Vol. 173, N 2. P.603-613.

210. Norton R.S., Мабек P., Reid G.E., Simpson R.J. Relationship between the cytolysins tenebrosin-C from Actinia tenebrosa and equinatoxin II from Actinia equina И Toxicon. 1992. Vol. 30, N 1. P. 13-23.

211. Зыкова T.A., Винокуров JI.M., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus II Биорган. химия. 1984. Т.11, N 3. С. 302-310.

212. Kem W.R. Sea anemone toxins: Structure and action // The Biology of Nematocysts / Eds. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. San Diego: Acad. Press, 1988. P. 375— 405.

213. Монастырная M.M., Зыкова T.A., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus //Биоорган, химия. 1999. Т. 25, N 10. С. 733-741.

214. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo Н.Е., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica //Toxicon. 1993. Vol. 31, N 12. P. 1567-1579.

215. Козловская Э.П. Токсины морских актиний: структура и функция: автореф. дис. д-ра хим. наук. Владивосток, 1990. 50 с.

216. Аверинцев В.Г. Актинии залива Посьет Японского моря // Исслед. фауны морей. 1967. Т. 5. С. 62-77.

217. Клышко Е.В., Ильина А.П., Монастырная М.М., БурцеваЮ.В., Костина Е.Е., Зыкова Т.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П. Биологически активные полипептиды и гидролитические ферменты в актиниях низкобореальных вод // Биол. моря. 2003. Т. 29, N3. С. 189-194.

218. Mebs D., Liebrich М., Reul A., Samejima Y. Hemolysins and proteinase inhibitors from sea anemones of the Gulf of Aqaba // Toxicon. 1983. Vol. 21, N 2. P. 257-264.

219. Lenarci6 В., Ritonja A., Strukelj В., Turk В., Turk V. Equistatin, a new inhibitor of cysteine proteinases from Actinia equina, is structurally related to thyroglobulin type-1 domain //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, N 21. P. 13899-13903.

220. Monastyrnaya М.М., Zykova Т.А., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus //Toxicon. 2002. Vol. 40, N 8. P. 1197-1217.

221. Зыкова T.A., Винокуров JI.M., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора IV из Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1985. Т. 11, N 3. С. 293-301.

222. Bernheimer A.W., Avigad L.S. A cholesterol inhibitable cytolytic protein from the sea anemone Metridium senile II Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 541, N 1. P. 96-106.

223. Turk T. Cytolytic toxins from sea anemones // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1991. Vol. 10 N 3. P. 223-262.

224. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73, N 2. P. 467-471.

225. Kem W.R., Dunn B.M. Separation and characterization of four different amino acid sequence variants of a sea anemone (Stichodactyla helianthus) protein cytolysin // Toxicon. 1988. Vol. 26, N 11. P. 997-1008.

226. Санина Н.М., Костецкий ЭЛ. Термотропное поведение сфингофосфолипидов морских беспозвоночных // Ж. эволюц. биохим. физиол. 2000. Т. 36, №3. С. 192-197.

227. Gomes Т., Chaves М., Lanio М.Е., Romero L., Wong L. Purification and hemolytic properties of two isotoxins from the sea anemone Stoichactis helianthus (Coelenterata) //Toxicon. 1987. Vol. 25, N 4. P. 361.

228. Vascovsky V.E., Suppes Z.S. Phospholipases of marine invertebrates. I. Distribution of phospholipase A // Сотр. Biochem. Physiol. 1972. V. 43, N 3. P. 601-609.

229. Uechi G., Toma H., Arakava Т., Sato Y. Biochemical and physiological analysis of a hemolytic toxin isolated from a sea anemone Actineria villosa II Toxicon. 2005. Vol. 45, N 6. P. 761-766.

230. Mahnir V.M., Kozlovskaya E.P. Sea anemone Radianthus macrodactylus new source of palytoxin //Toxicon. 1992. Vol. 30, N 11. P. 1449-1456.

231. Giraldi Т., Ferlan I., Romeo D. Antitumor activity of equinatoxin // Chem. Biol. Interact. 1976. Vol. 13, N 3-4.13. P. 199-203.

232. Batista U., Macek P., Sedmak B. The cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina II Cell Biol. Int. Rep. 1990. Vol. 14, N 11. P. 1013-1024.

233. Batista U., Macek P., Sedmak B. The influence of equinatoxin II on V-79-379 a cell lines // Period. Biol. 1986. Vol. 88, N 2. P. 97-98.

234. Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A carcinoembryogenic antigen-directed immunotoxin built by linking a monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer 1989. Vol. 43, N5. P. 926-929.

235. Pederzolli C., Belmonte G., Serra M.D., Macek P., Menestrina G. Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin II, a cytolysin from a sea anemone // Bioconjugate Chem. 1995. Vol. 6, N 2. P. 166-173.

236. Гацура B.B. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных соединений. Москва: Медицина, 1979. 50 с.

237. Ильина А.П., Монастырная М.М., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 2005. Т. 31, N 1.С. 39-48.

238. Иванов А.С. Транспорт хлоридов в митохондриях и поверхностный потенциал мембран: автореф. дис. канд. биол. наук. Москва. 1978.18 с.

239. Olson F., Hunt С.А., Szoka F.C., Vail W.J., Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes // Biochim. Bophys. Acta. 1979. Vol. 557, N 1. P. 9-23.

240. Василенко И.А., Боровягин B.JI. Полиморфизм липидов в модельных и биологических мембранах// Биол. мембраны. 1990. Т. 7, N 7. С. 677-701.

241. Barenholz Y., Gatt S. Sphingomyelin: metabolism, chemical synthesis, chemical and physical properties // Phospholipids / Eds. Hawthorne J.N., Ansel G.B. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier Biomedical Press, 1982. P. 129-177.

242. Марголис Л.Б.б Бергельсон Г.Н. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Москва: Наука, 1986, 240 с.

243. Folch I., Less М., Standley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, N 1. P. 497-509.

244. Bangham A.D., Flemans R., Heard D.H., Seaman G.V.F. An apparatus for microelectrophoresis of small particles // Nature. 1958. Vol. 182, N 4636. P.642-644.

245. Mc Laughlin S.G.A., Szabo G., Eisenman G., Ciani S.M. Surface charge and the conductance of phospholipid membranes //Proc. Nat. Acad. Sci. 1970. Vol. 67, N 3. P. 1268-1275.

246. Muller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phis. Chem. 1963. Vol. 67, N 3. P. 534-535.

247. Красильников O.B., Сабиров P.3., Терновский В.И., Ташмухамедов Б.А. Влияние ионного состава среды на динамику образования стафилотоксиновых каналов в БЛМ // Биол. мембраны. 1981. Т. 3, N 10. С. 1057-1061.

248. Чантурия А.Н., Шатурский О.Я., Лишко В.К., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Взаимодействие токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами // Биол. мембраны. 1990. Т. 7, N 7. С. 763-769.

249. Соколов Ю.В., Чантурия А.Н., Лишко В.К. Исследование каналообразующих свойств яда паука Steatoda paykulliana II Биофизика. 1984. Т. 29, N 4. С.620-623.

250. Красильников О.В., Сабиров Р.З., Терновский В.И.,Ташмухамедов Б.А. Природа и приближенное математическое описание свойств латротоксинового канала // Биол. мембраны. 1986. Т. 3, N 9, С.936-943.

251. Vakorina T.I., Klyshko E.V., Monastyrnaya M.M. and Kozlovskaya E.P. Conformational stability and hemolytic activity of actinoporin RTX-S II from the sea anemone Radianthus macrodactylus И http://protein.bio.msu.ru/biokhimiva/BM04-164.pdf

252. Williamson P, Antia R, Schlegel RA. Maintenance of membrane phospholipid asymmetry. Lipid-cytoskeletal interactions or lipid pump? // FEBS Lett. 1987. Vol. 219, N 2. P. 316-320.

253. Сигворс Ф., Сакман Б., Heep Э. Регистрация одиночных каналов. Под ред. Сакмана Б., Неера Э. Москва: Мир, 1987. 448 с.

254. Hille В. Ionic channels of excitable membranes. Messachusetts: Sinauer Assoc. Inc., 1984, P. 185-186.

255. Melchior D.L. Lipid domains in fluid membranes: a quick-freeze differential Scanning calorimetry study // Science. 1986. Vol. 234, N 4783. P. 15771580.

256. Shnyrov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Intern. 1992. Vol. 26, N 2. P. 219-229.

257. Gomez-Fernandez J.C., Goni F.M., Bach D., Restall C.J., Chapman D. Protein-lipid interaction. Biophysical studies of (Ca2+ + Mg2+)-ATPase reconstituted systems // Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 598, N 3. P. 502-516.

258. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 86, N 3. P. 665-684.

259. Lumry R, Biltonen R. Validity of the «two-state» hypothesis for conformational transitions of proteins // Biopolymers. 1966. Vol. 4, N 8. P. 917-944.

260. Haest C.W.M. Interaction between membrane skeleton proteins and the erythrocyte membrane //Biochim. Biophys. Acta. 1982. Vol. 694, N 4. P. 331-352.

261. Liu S.-C., Derick L.H., Palek J. Visualization of the Hexagonal Lattice in the Eeythrocyte Membrane Skeleton//J.Cell Biol. 1987 Vol. 104, N 3. P. 527-536.

262. Zachowski A., Farve E., Cribier S., Herve P., Devaux H.F. Outside-inside translocation of aminophospholipids in the human erythrocyte membrane is mediated by a specific enzyme// Biochemistry. 1986. Vol. 25, N 9. P. 2585-2590.

263. Chanturiya A.N. Detection of transient capacitance increase associated with channel formation in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1026, N 2. P.248-250.

264. Клышко E.B., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.В., Крыжко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. 2004. N 3. С. 45-53.

265. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 12. P. 5463-5467.

266. Ильина А.П., Монастырная M.M., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis II Биоорган, химия. 2005. Т. 31, N 4. С. 357-362.

267. Козловская Э.П., Клышко Е.В., Ильина А.П., Исаева М.П., Гузев К.В., Зыкова Т.А., Монастырная М.М. Цитолизины актиний // В тр. Объед. междунар. научн. конф. «Новая геометрия природы», Казань, 25 авг.-5 сент. 2003. Казань, 2003. Т. 2. С. 179-183.

268. Вакорина Т.И., Клышко E.B., Монастырная M.M., Козловская Э.П. Конформационная стабильность и гемолитическая активность актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus II Биохимия. 2005. Т. 70, N 7. С. 957-966.

269. Ichikawa Т., Terada H. Determination of phenylalanine, tryptophan and tyrosine in a mixture of amino acid by 2nd derivative spectrophotometry // Chem. Pharm. Bull. 1981. Vol. 29, N 2. P. 438-444.

270. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochemistry. 1981. Vol. 20. N. 1. P. 33-37.

271. Poklar N., Fritz J., Macek P., Vesnaver G., Chalikian T.V. Interaction of the poreforming protein equinatoxin II with model lipid membranes: a calorimetric and spectroscopic study// Biochemistry. 1999. Vol. 38, N 45. 14999-15008.

272. Веньяминов С.Ю., Косых В.Г., Холодков O.A., Бурьянов Я.И. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы EcoRII и ДНК-метилазы EcoRII // Биоорган, химия. 1990. Т. 16, N 1. С. 47-51.

273. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. Москва: Мир, 1986. 351 с.

274. Эфтинг М.Р. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. 1998. Т. 63, N 3. С. 327-337.332. http://expasy.org/swiss-model333. http://expasy.org/spdbv

275. Koradi R., Billeter М., Wuthrich К. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, N 1. P. 51-55.

276. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis. 1997. Vol. 18, N 15. P. 2714-2723.

277. Sayle R.A., Milner-White E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20, № 9. P. 374-376.337. http://www.chemcomp.com/Corporate Information/MOE.html

278. Chattopadhyay A., Raghuraman H. Application of fluorescence spectroscopy to membrane protein structure and dynamics // Curr. Sci. 2004. Vol. 87, N 8. P. 175-180.

279. Takagi J. Molecular Environment of Integrins. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Trans. 2004. Vol. 32, N 3. P. 403-406.

280. Bunc M., Frangez R., Horvat I., Turk Т., Suput D. Effects of equinatoxins in vivo. Possible role of degranulation of thrombocytes and granulocytes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. Vol.710. P. 162-167.

281. Suput D., Frangez R., Bunc M. Cardiovascular effects of equinatoxin III from the sea anemone Actinia equina (L.) // Toxicon. 2001. Vol. 39, N 9. P. 1421-142.

282. Piehler J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro II Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. Vol. 15, N 1. P. 4-14.

283. Халилов Э.М., Иванова Л.И. Изменение микровязкости липидного бислоя мембран некоторых злокачественных клеток и перевиваемость опухолей // Биофизика. 1986. Т. 31, N 1. С. 156-157.

284. Халилов Э.М., Ли B.C., Азизова О.А., Саженин Г.И., Алимов Т.А., Арчаков А.И. Структурно-функциональный анализ мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина//Вопр. мед. химии. 1982. N 1. С. 81-86.

285. А.с. 942763 СССР, М. Кл. А 61 К 37/02. Способ получения гемолизина / Монастырная М.М., Вожжова Е.И., Козловская Э.П., Еляков Г.Б.; (СССР). № 2981676/28-13; заявл. 20.08.80; опубл. 15.07.82, Бюл. № 26.

286. А.с. 1242826 СССР, МКИ4 G 01 N 33/48, 33/50, 33/68, 33/92. Способ определения сфингомиелина / Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Еляков Г.Б. (СССР). № 3808934/28-14; заявл. 08.10.84; опубл. 07.07.86, Бюл. № 25.

287. Schriewer Н., Jabs H.U., Assmann G. The enzumatic analysis of sphingomyelin in HDL//J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1982. Vol. 20, N 5. P. 305-312.

288. Cuatrecasas P., Wilchek M., Anfinsen C.B. Selective enzyme purification by affinity chromatography// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1968. Vol. 61, N 2. P. 636-643.

289. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, N 1. P. 265-275.

290. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, N 5259. P. 680-685.

291. Awdeh Z.L., Williamson A.R., Askonas B.A. Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its application to immunoglobulins // Nature. 1968. V. 219, N 5149. P. 66-68.

292. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology / Eds. Hirs C.H.W., Timasheff S.N. N.Y., London: Acad. Pres, 1972. V. 25B. P. 121-139.

293. Беленький Б.Г., Ганкнна E.C., Нестеров B.B. Экспрессный ультрачувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // ДАН СССР. 1967. Т. 172. С. 91-93.

294. Allen G. Amino acid analyses // Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Sequencing of Proteins and Peptides / Eds. Burdon R.H., van Knippenberg P.H. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier, 1989. P. 40.

295. Ichikawa T, Terada H. Second derivative spectrophotometry as an effective tool for examining phenylalanine residues in proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 494, N 1. P. 267-270.

296. Hunkapiller M.W., Hood L.E. Direct microsequence analysis of polypeptides using an improved sequenator, a nonprotein carrier (polybrene), and high pressure liquid chromatography//Biochemistry. 1978. Vol. 17, N. 11. P. 2124-2133.

297. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1976. Vol. 3, N 9. P. 2303-2308.

298. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 12. P. 5463-5467.

299. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, N 3. P. 403-410.

300. Winder A.F., Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spectrophotometric protein determinations // Biopolymers. 1971. Vol. 10. N. 7. P. 12431251.

301. Hamill O.P., MartyA., Neher E., Sakman В., Sigworth F.J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch. 1981. Vol. 391, N 2. P. 85-100.

302. Богославская Е.Г., Коган В.Е.Глущенко Н.Н., Ерохин В.Н. Сравнительное изучение противоопухолевого действия полиненасыщенной жирной кислоты и продуктов ее автоокисления // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1976, № 5. С. 734-741.

303. Бузников Г.А., Подмарев В.К. Методы биологии развития. Москва: Наука, 1975. С. 188-222.

304. Sanchez R., Sali A. Advances in comparative protein-structure modelling // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 2. P. 206-214.

305. Baker D., Sali A. Protein structure prediction and structural genomics // Science. 2001. Vol. 294, N 5540. P. 93-96.

306. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, N 1. P. 235-242.

307. Schwede Т., Kopp J., Guex N. Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31, N 13. P. 3381-3385.

308. Peitsch M. C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling // Biochem. Soc. Trans. 1996. Vol. 24, N 1. P. 274-279.

309. Hooft R.W., Vriend G., Sander C., Abola E.E. Errors in protein structures // Nature. 1996. Vol. 381, N 6580. P. 272.