Токсины морских актиний: структура и функция тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Козловская, Эмма Павловна
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Владивосток
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1990
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
ПРЕЗИДИУМ ОРДЕНА ТРУДОВОГО
КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ АКАДЕМИИ НАУК СССР
Зя правах рукописи.
КОЗЛОВСКАЯ Эмма Пявловпа
ТОКСИНЫ МОРСКИХ АКТИНИЙ : СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ
02.00.10 - Еяооргаютескзя химия, химия природных и физиологически актшзшх вецеств
АВТОРЕФЕРАТ
ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА ХИМИЧЕСКИХ НАУК
Владивосток - 1990
Работа выполнена в лаборатории химии пептидов Тихоокеанского Института биооргонической химии ДВО АН СССР
Официальные оппонента!
Доктор химических наук, профессор Л.А.ЕЛЯКОВА Доктор химических паук Л.И.ЫИТОШШКОВ Доктор химических наук В.А.ШБЖЕВ
Ведущая организация - Московский иноштуп тонкой хиличеокай
Защита состоится "__5_" ноября 1990 года в 14 часов на заседании
специализированного совета Д 002.06.06 по защите диссертаций на соискание ученой отепени доктора наук при Президиуме 'Дальневосточного отделения АН СССР по адресу!
690022 Владивосток, пр. 100 лет. Владивостоку, 159, ГИ50Х ДВО ¿В СССР.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО АН СССР (Влади-воспок-гг, пр. 100 лет. Владивостоку, 159)
Автореферат разослан -в- октября 1990 года
технологии ил. Х.В.Ломоносова
Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук
ОЩЛЯ ХЛРЛ1СГЕГПСТ1Ш РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из важных проблем физико-химической биологии является изучение нейротоксиноп, специфично взаимодействующих с натриевыми каналами электровозбудимых мембран. Быстрые натриевые каналы обладают способностью изменять ионную проницаемость в ответ на изменение трансмсмбранного электрического поля, в силу чего они играют ключевую роль в процессе генерации потенциала действия в нерве, сердце и скелетной ммшцо.
В основе механизма- возникновения трансмембранного натриевого тока лежит структурная перестройка ионного канала, которая выражается в работе так называемых "инактивпционннх порот". Химическая структура этой части канала и детальный механизм ее функционирования в настоящее время неизвестны. Инактивационные ворота являются мишенью полипептидннх нойротоксиноп морских актиний и скорпионов, замедляющих и делающих неполным процесс инактивации натриевых каналов. Аналогичное увеличение времени жизни канала и изменение кинетических параметров натриевого тока вызывают также химические агенты и градиент осмотического давления, создаваемый нарушением иэотонииносги омывающих мембрану нейронов растворов. При этом остается неясным, каким образом принципиально различные физико-химические агенты, воздействуя на различные участки канала, вызывают сходные изменения процессов активации н инактивации натриевого тока,и как эти участки связаны с воротным устройством натриевого канала.
В связи с втеиэложенным,большой интерес представляет исследование струнтурно-Зункцнональных взаимосвязей пнеконотоксинов и изучение кх взаимодействия с натр..евнмн каналах'.«.
Большув помощь в исследовании механизмов ионного транспорта оказывают эксперименты на биологических и простых модельных сие-
темах с использованием мембраноактивных белков, которые действуют непосредственно на липвдный остов мембран, увеличивая их проницаемость. Такие цитотоксические, каналобразующие белки отличаются от собственно мембранных белков только тем, что их адресатом являются мембраны чужих клеток. В связи с этим возникает необходимость глубокого исследования всей совокупности аспектов липид-белковых взаимодействий, что позволит приблизиться к истинной картине структурной организации биологических мембран. В этом ппане большой интерес представляет исследование цитотоксинов морских актиний, которые специфично взаимодействуют с липидами.
Цель работы. Основной цель» диссертационной работы явилась разработка общих подходов к использовании токсинов морских акти- • ний в качестве инструментов исследования структурной организации биологических мембран и механизмов ({унмзонирования ионных каналов.
Проведенные исследования были связаны с решением ряда конкретных задач:
- разработка.общих методов наделения индивидуальных нейро-и цитотоксинов из морских актиний;
- структурный анализ анемонотоксинов и определение особенности их-строения;
- получение модифицированных производных анемонотоксинов и определение их биологической активности;
- изучение взаимодействия нейротоксиков с натриевыми каналами;
- исследование взаимодействия цитотоксинов актиний с модельными системами;
- детальное исследование параметров ионных каналов, индуцировании* в бислойных липидных мембранах;
- изучение влияния циютоксинов актиний на эритроцит арную мембрану.
Научная новизна и практическая значимость работы. В процессе исследования впервые было осуществлено комплексное исследование полипептидных ТОКСИНОВ морской актинии Ва<НагиЬиа тасг011ас1.у1из и предложены новые подходы к их использованию в качестве инструментов изучения принципов функционирования ионных каналов.
Предложены принципиально новые методы выделения биологически активных полипептидов, продуцируемых актиниями, которые позволили вьаделить и охарактеризовать 28 индивидуальных соединений, 20 из которых выделены впервые. Установлена структура 6 из них; открыт новый структурный тип "длинных" анемонотоксинов; установлены особенности строения новых токсинов.
Впервые проведено систематическое исследование функциональной важности различных аминокислотных остатков токсина, принадлежащего к второму типу. Предложен механизм многоточечного взаимодействия анемонотоксинов с рецептором. Показано, что в случае анемонотоксинов не применимы как классическая концепция "активного центра", так и предложенная ранее (Баросанин, 1981 ) модель организации реакционного участка с остатком аргинина в качестве центра связывания с натриевым каналом.
Впервые установлено, что модификация "воротного устройства" анемонотоксинами осуществляется посредством аллостерического механизма и приводит к изменению фармакологических свойств натриевого канала. Рецептор анемонотоксинов, расположенный на наружной стороне мембраны, не является составной частью воротного устройства натриевого канала.
Впервые доказано существование общего механизма литического действия цитотоксинов морских анемон для биологических и модель-
них мембран, заключающегося в образовании в них пор с диаметром
«
6-10 Л, в результате чего на мембране исчезает градиент ионов.
Практическая значимость работы определяется прежде всего тем, что полученные- данные расширили наши знания о механизмах действия полипепгидных токсинов морских анемон и дают возможность осуществлять направленный поиск нош« химических соединений, модифицирующих свойства ионных каналов, и разработать общие подходы к испольэолпнию цитотоксипов актиний в качестве инструментов ис-слсдоиания структурной организации эритроцитарных мембран. Существенным предс является и тот факт, что некоторые ввделенние индивидуальные токсины и способ количественного определения ефинго-миелииа в биологических жидкостях уже используются в ряде учреждений Советского Союза.
Структур диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава посвящена литературному обзору по наделению, структурному анализу и изучению механизма действия пептидно-белковых токсинов морских беспозвоночных. Во второй главе излагаются результаты исследования "длинных" нойротоксинов морской актинии П. шас-гойаогу1ио ! выделение, установление структуры, исследование структурно-функциональных взаимосвязей и механизма действия. В третьей главе рассматриваются свойства ингибиторов протеиназ из Н. macrodactyl.ua . Четвертая глава посвящена исследованию свойств и механизма действия цитотоксинов морских актиний К. шаогойаогу-1ия и Ме1г1й1им веп11е. В пятой главе представлены использованные материалы и методы исследования. Диссертационная работа изложена на 310 страницах машинописного текста. Список цитируемой б диссертации литературы включает 506 наименований.
I. ВА01ЛЯТШТЗ НЕЙРОТОКСИНЫ: ЕВДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЙ
Выделение и характеристика нейротоксинов актиний
Скрининг 35 видов морских актиний показал, что наиболее перспективными для дальнейших исследований видами являются широко распространенные в Индийском океане КаНа^Ьив тасгобас^уХив , Карибском море - зг1оЬойаогу1а ЬеИав^чв и Японском море - Мв*-г141ит овп11в . Первяй продуцирует высокоактивные для млекопитающих нейротоксины и цитотоксины; второй - цитотоксины и токсины, высокоактивные для ракообразиьге; третий - высокоактивные цитотоксины.
Для ввделения нейротоксинов из морских актиний мы предложили оригинальную схему (табл. II, отличающуюся от всех ранее известных (Берея, 1975, 1975; Швейтц, 1981, 1985). В основу этой схемы положена способность политетрафторэтилена (полихрома 1} сорбировать биологически активные полипептиды актиний и не задерживать различные ионогенные приг-эси (табл. I).
Известно, что около 8035 веса актиний составляет морская вода, поэтому неудивительно, что экстракты этих животных содержат большое количество различных солей, от которых необходимо избавиться уже на первой стадии выделения. Использование хроматографии на полихроме I позволяет решить эту проблему, не прибегая дополнительно к гель-фильтрации или диализу. Этот метод обессоливя-ния мы использовали на всех стадиях ввделения биологически активных полипептидов из актиний и в дальнейшем при химической модификации нейротоксинов и ингибиторов протеиназ.
Другим важным преимуществом хроматографии на полихроме I является 'возможность концентрирования растворов полипептидов на различных стадиях очистки одновременно с обессоливанием". Этот ме-
~од концентрирования и сбессолиряния полипептидов позволяет работать с десятками и даже с сотнями литров разбавленных и концентрированных белком,пс растворов с высокой ионной силой.
Таблица I
Очистка нейротоксинов из П. тасго<1«^у1иа
К-л-го Летальная доза
Стадия очистки белке*, мг для Выход,' %
мышей крабов (J%)\ (Щ00\ мкг/хг
I. Исходим?! зкетракт 20000 30000 100
П. Хроматография на
полихроме I 1000 500 5
II!. Хроматография ип биороксе 70:
фрпкция А 200 163 I
(¡рЗКЦИЯ В СО 3400 0,3
1У.Хроматография фракции А
на sr-софацсксс C-2S3:
lim-lll е: 25 82 0,34
Rm-IV 32 40 9 0,16
У. Хроматография фракции В
нп зР-сеЛздексе С-25:
Rm-V 22 350 12 0,11
У1.Высокоэффективная
хр-.птогрпфия на С0:
Btn-I 27 3000 3,5 0,14
Ru-ll 16 ' 1650 4,0 0,08
* Белок определяли методом Лоури.
Использование предложенной схемы позволило нам выделить из трех видов актиний 15 кеКротсксиков: 4 - из CondyXactia gigantea ; 5 - из К. nacrodactylua; 6 - из Stychodactyla helianthua . Го>'огснн.чсть вьщеленных токсинов доказана ВЭУХ, электрофорезом и анплдасм аминокислотного состава.
Все выделенные нами токсины относятся к группе длинных анемонотоксинов, Их молекулярная масса 5200+200, как показано гель-фил ьт рацией на пластинке в тонком слое сефадекса. Подобна другим длинныманемонотоксин&м,эта группа токсинов имеет в споем составе 6 остатков циотеина. Характерной особенностью токсинов ни Н. moo-rodaotylua, отличающей их от ранее известных инсмонот'ксинон из Anthopleure xaAthogrammioa и Anemonie sulcata,ннлнетен присутствия остатков тирозина и более высокое содержание основных аминокислот .
Биологическая активность rfaiianthuu токсинов оценивалась летальной дозой для мышей (ДДэд)и крабов (ЛД|0ц). Результаты, приведенные в табл. I, показывают, что,хотя все выделенный нейро-токсины высокотоксичны для крабов, токсичность Пго-i и II для мышей невелика: ДЦ^ ■> 3000 и 1650 мкг/кг соответственно. Самый токсичный для мышей полипептид Кт-И^ДЦзд = 25 мкг/кг) - наименее активен для крабов C.JWjqq ■ 82 мкг/кг). (Ьдобкая корреляция имеет место и для нейрогоксинов из других видов актиний (Шоейтц, 1981, 19У5). Для Hadlanthua токсинов также сохраняется закономерность ; токсичность для крябов варьирует значительно меньше (в 20 раз), чем для мшей (в 150 раз).
Первичная структура Radianthun токсинов
К моменту начала настоящего исследования были известки аминокислотные последовательности четырех длинных анемонотоксинов: АР-А из Anthopleura :xAntiiogrammio& , АР-С ИЗ A. elegantianima и ATX-I и II из Anemonia sulcata. Нейротоксины, выделенные нами из актинии К. macrodactylua, отличались По аминокислотному составу от всех ранее известных анемонотоксинов, поэтому определение их первичной структуры представляло большой интерес с точки зрения установления взаимосвязи между структурой и функцией полипептидов, модифицирую-
щих воротный механизм натриевого канала.
Установление аминокислотной последовательности 1гаа1а21№иа токсинов осуществлялось с применением современных методов белковой химии. Восстановление дисульфидных связей токсинов 2 -мер-каптоэтанолом и карбоксиметилирование образовавшихся еульфгид-рильных групп моноиодуксусной кислотой проводилось непосредственно перед структурным анализом. Фрагментацию модифицированных токсинов проводили ферментативньм гидролизом. Для выделения пептидов использовали ВЭЖХ. Определение аминокислотной последовательности осуществляли с помощью метода Эдмана в ручном или автоматическом варианте, для установления С-концевой последовательности использовали карбоксипептидазу У. На рис. I представлены результаты структурного анализа токсинов на примере Лт-Ш.
10 20 30
ь-Т-1—» I-Т-2-I >' ■ --1-3 ''
<т »
I-Т-Х-2-1 --Т- 3-1-
-С-А-З-У-Х-З-Р-Г-А-Е-С-С-К-К-К-К "
I-Т-4 -
-Т-3-1-•
-8р-4-Г н-Зр-5 ■
Рис. I..Аминокислотная последовательность 11т-Х11
- последовательность, определенная дансильным методом Эдмана; ♦ - гзследовательность, определенная автоматическим твердофазным методом Эдмана.
В результате были установлены аминокислотные последовательности для пяти нейротокс'инов из в. macrodaotylus(рис. 2),
ITI I A« II 1TÏ » »ГГ-I AFT-II С U-l »M U-C
С » f » t
с i e
0 I, с С l с
С l с
» f С l с 1 t С l с
С L С
с t с
1(1
M Р и г
î D G Р S »
пег S t О Р
its;
6S&GP
S 9 G
ПН(
« *
i в I S II I
I С 11 I С I 1С»
ten
ICI
I - • 4 I - -1 I - -1 lies tin t - -1
act - - -tin
l)C P - - -10«
ecr ■ ■ ■sen
а с p - • -set
s С P - - -toi
g с P - - -s с »
j с р - - -so*
s с p - - -se»
H с
II с
II с
Я » с
8 0 14-1
e и с р т
р
I I I I С Î I I I С Р т I A H С Р т I А « О Р Г
1 « в о Р и
I Л > S P J »
С С I С С К С С I С С I С С I С С I С С Ï С С !
tl-I »•-II
li-III G I ti-lV G I
I ! С 1С К и J i P С t S I I T S T V ! P S
1 U 20
A ,FITTED S P Oïft S A î f M S T A S P I Y
b)
Ip-Il
0 )
i s
IHII СI Sk-I t t
С I С С D
0 T С I С i I о
С I С D D
С I С II
С t С D
С I С t I
С I С II I
С I с и
i I И V
Г 1 D Г - - t Г
11 i г - - m
I » D I - - С Г Т » D L - - S I
r G Г 1 D i - ■
T » 11 - • i II I » i l - - 61
t» 11- • es
с * с и с > с к I с » с к с к
СИ
« » » • » • > » »
С I С О D S S » S I С » Т - ! 1 I 1 А Ь С С И fc I ¡9 «О
A G »|elsc]l 1 V L к V
I. s t
A S ( A S r f A f
A S I A S
t P 1 I Y P
S P I S P S p I Г P V I S P I 111
: с E 111
С С * I I I
С С t [ I (.
С С И ( [ I
С С î t t
С С I I ( I
8 С С t I I I
D С С t I I I
Рис.2 Аминокислотные последовательности нейротсксинов морских анемон: ATX-I, И И V - Anenonia sulcata (ВаПДОрер, 1976'. 1978; Ше$флер, 1982); AFT-!, AFT-!! - Anthopleura fuEcoviridis ( Cynaxapa, 1987); АР-A, AP-B - Anthopleura xanthogrammica (Танака, 1977; Реймер, 1985); AP-C - Anthopleura elesantissima (Танака, 1977); cP - caiiiacti- parasitica (Кариэлдо, 1985); Rnt-I - Rn-V - Radianthus riiacrodactylus (ЗЫКОВа, 19S5» 1988{ 1989 J; Rp-II, Rp-IXT - Radianthus paumoten3is (ШВСЙТЦ, 19S5i MerpHCHD, 1987); sh-l - Stichodactvln helianthun (Ком, 1У89I■
Radlanthua токсина - новый структурный класс "длинных" анемонотоксинов
В зависимости от длины аминокислотной цепи различают "короткие" (27-30 аминокислотных остатков) и "длинные" (47-50 аминокислотных остатков) нейротоксины морских анемон. Из актинии R. юео-rodactylus ввделены пять длинных нейротоксинов; короткие нейро-токсины не были обнаружены. Сравнение аминокислотных последовательностей длинных анемонотоксинов (рис. 2) показало, что среди них можно вьщелить два структурных типа. Критерием для отнесения полицентiyia к 1 или 2 типу является степень гомологии аминокислотной последовательности между ним и уже известными нейротокси-нами.
Исторически первыми анемонотоксинами, для которых была установлена первичная структура, являются полипептиды из А. sulcata, поэтому они вместе с гомологами отнесены к токсинам I типа. Аминокислотные последовательности этих токсинов высоко консервативны (ps-c. 2).
Аминокислотные последовательности токсинов из R. macrodacty-lua отличались от ранее исследованных анемонотоксинов, поэтому Rodianthus токсины и их гомологи, обнаруженные впоследствии в актиниях R. paumoter.els (ШвеЙтц, 1985) и S. helianthus(KeM, 1989) отнесены к 2 тицу (рис. 1, внизу). Если между токсинами одного типа степень гомологии достигает 9с$, то между по л и пептида».'и разных типов она не превшает 40%.
Кроме шести остатков цистеина имеются следующие консервативные остатки в последовательностях обоих типов токсинов (нумерация остатков приведена для токсинов I типа): Asp-7, Asp/Glu-9, Gly-10, Pro-11, Axg-14, Ser/Thr-17, Gly-20, Gly-30, Trp-31, Ile/Val-41. Многие из этих остатков являются вахными для правильного сверты-
вания полипептидной цепи, особенно Pro и Gly, которые почти всегда обнаруживаются в шпильках-поворотах, локализованных на поверхности молекулы.
Особое место среди длинных токсинов занимает токсин Ср из Calliactls paraaitica (Кариэлло, 1989), так как его трудно отнести к полипептидам как I, так и 2 типа. Для него xat кторна несколько более высокая гомология с токсинами 2 типа, чем I типа. Возможно, что Ср является представителем нового типа длинных ток-, синов. Уникальность структуры Ср делает его чрезвычайно полезным для анализа структурно-функциональных взаимосвязей анемонотокси-ноа. К сожалению, этот токсин пока недостаточно охарактеризован.
Характерной особенностью токсинов 2 типа является: I) отсутствие 1-2 аминокислотных остатков на Н-конце; 2) наличие остатка лизина между двумя остатками цистеина в положении 4; 3) наличие последовательности из трех кислых остатков в положениях 6-8; 4) наличие последовательности из 3-4 основных аминокислот на С-конце молекулы; 5) инвариабельность только одного остатка триптофана (в положении 30); 6) наховдение остатка тирозина в положении 37. В целом в последовательностях токсинов 2 типа содержится гораздо больше заряженных и ароматических аминокислотных остатков (рис. 2).
Определение положения дисульфидных связей в нейротоксинв Rm-Ill
■ Структура анемонотоксиноа стабилизирована тремя внутримолекулярными дисульфидными связями, положение которых определено только для токсинов I типа (Вандерер, 1978; Нортон, 1981; Суна-хара, 1987).
Локализацию дисульфедньк связей в токсинах 2 типа проводили на молекуле Rm-III, который наиболее токсичен для млекопитающих (рис. 3).
I. Гидролиз Rb-III стафилококковой глутаминовой протеиназой и трипсином:
а) фрагмент H-I <J5-D-E-E-G-P-Ï-V-Ii13
. c33-a-s-y-y-s-p-i-a-e42
б) фрагмент Н-3 G1-H-C3-K (возможные структуры) q43_c44_r_k
tu-a-p-l-t-c-y-v-d-l-g-y-c26-u-e2s
П. Деградация по Эдману пептида Н-3: Pto
а) пептид H-3-I ц_с3-к
'43
• sc-c -nph
б) пептид Н-3-2 f
a -p-l-t-g-y-v-d-ir-g-y-c -n-e
sc-c-NPh - фенилтиогидантоиновое производное цистеина; Ptc-K - фенилтиокарбомоильное производное лизина.
Рис. 3. Локализация дисульфидных связей в Rm-III.
Итак, положение дисульфидных связей в молекуле Km-iii (рис.4) идентично их положению в токсинах I типа. Из этого факта следует, что, по-видимому, все токсины 2 типа имеют такое же положение дисульфидных свяеей, как у Rm-iii, поскольку степень их гомологии с последним значительно вше, чем у токсинов I типа.
,—;-Суа3-Суа*3 -•
1 I 5 10 15 20 25 30 35 40 I45
gnckcmegpyvhtapxtgîtolgyckegwekcasyïspiaeccrkkk
I_ 5 зэ Г I , I
Рис. 4. Аминокислотная последовательность Еш-111 с учетом дисульфидных связей
Консервативность положения дисульфидных связей для обоих типов токсинов является подтверждением важной роли остатков цис-
или т14
G1-N-C3-K
I.
С*3-С44-Н-К
...-y-c26-e20 •
Pto
теина в формировании пространственной структуры анемонотоксинов.
И хотя существуют большие различия в структуре токсинов, идентичное расположение дисульфидных связей, а также наличие консервативных остатков в положениях 7, 9, 10, И, 14, 17 , 20 , 30, 31 и 41 у обоих типов анемонотоксинов позволяют предположить, что они являются эволюционными потомками одного анцестрального гена.
Вторичная структура Над1апШ1з нейротоксинов
Разделение длинных анемонотоксинов на два структурных типа не позволяет объяснить различия в их фармакологических свойствах. Для понимания механизма взаимодействия токсинов с рецептором необходимо знание их пространственной структуры.
Нами было установлено, что в области оптической активности пептидных групп в спектрах КД водных растворов токсинов (рис. 5) присутствуют положительная (186 нм) и отрицательная (200 нм) полосы, отражающие # переход амидного хромофора. Плечо, расположенное около 217 нм на отрицательной полосе, обусловлено п переходом пептидных групп, тогда как слабую положительную полосу в области 230-240 км можно отнести к переходам остатков ароматических аминокислот. В целом для токсинов обоих структурных типов характерны сходные вид и амплитуда полос КД.
Расчет процентного содержания канонических элементов вторичной структуры по методу Провинчера (1981) покалывает преобладание /^-структуры и -изгибов. Такой же вывод следует из анализа полосы амид I в ИК-спектре Нш-Ш. Но, как следует из данных ЯМР, процентное содержание у? -структуры явно переоценено (Видмер, 1988; Маббут, 1990). Предсказательные методы в общих чертах правильно передают организацию вторичной структуры анемонотоксинов (рис. 15). Наибольший процент предсказания приходится мэ-метод Дафтона и Хай.дера (1977). Для токсинов I типа (АР-А, АТХ-1) этим
методом предсказываются концевые и средний (17-24)участки уЗ -структуры и £ -изгиб (27-30), обнаруженные методом двумерной ЯМР спектроскопии (Ь'аббут, 1990). Для токсинов 2 типа ( Нр-П ) процент предсказания вторичной структуры снижается, особенно на
и - и С-концевых участках полипепгадной цепи, где находится больше, чем для токсинов I типа, легко ионизируемых аминокислотных остатков, способных образовывать солевые мостики.
л ч о
г
0
S
а,
и
со
1
о
-5
-10
-10
190 210 230 НМ
190 210 230 НМ
Рис. 5.
ATX-I
АР-Л
Bp-II
Спек'.-ры КЦ водных растворов токсинов
I типа: ATX-II и АР-А (слева) и
токсинов 2 типа:Еш-1, III,Sh-I (справа).
GAACTiCKSBQFIITRGRSMSGTIWVFGCPSG'.fintCEGRAIIGYCCKq ювеявя ' • < вааигзвсгз crzsesss» г~п
Z2ZZZ _
1'^ЛуЛ ."1 I—1 акйаги рэ i . ...i езжя
GVTCICDSDGPSVRGgTLSGTLWLYPSGCPSCWHNCKAHGPTIGWCL'iCQ кха «зга пгтгаав» «sassui
взгг;
UffiSFSiSSSiSJ
явакаа
ASCKCDDDGPEmATFTGTVDFVWOTECr.liKCTAVYTPV'ASCCnEK e^sa емеи гттиида cssa
I 1 >?!-!•>*•■'(■;•,». Ii
C=3
eBHsssBrareasBai '
ЯМР
D & H С & F D fe R
ЯМР
D & В С & F D & R
да
D & Ii С & F D & R
Рис. 6. Сравнение данных ЯМР-спектроскопии и методов предсказания вторичной структуры для трех внет.'.онотоксинов: уттл -спираль, шзз уб-структура, Г I 6-поворот.
Методом КД мы исследовали влияние температуры и рН среды на конформационные изменения Дш-III. Данные по его тепловой денатурат свидетельствуют о полностью обратимом конформационном переходе молекулы при нагревании раствора от 20° до 85°С. Причем величина энтальпии этого перехода (65-75 ккал-моль), рассчитанная по температурным изменениям спектров, вьие энтальпии т..шюпой денатурации большинства глобулярных белков (40-60 ккал/моль). Сим-батные изменения спектров КД как в пептидной области, так и в об- ■ ласти переходов ароматических остатков показывают, что наблюдаемый конформационный переход затрагивает в одинаковой мере как вторичную, так и третичную структуры Rm-III.Токсин выдерживал температуру инкубации до 80°С в течение часа без потери активности. Методом ЯМР показано (Нортон, 1989), что молекула токсина 3h-I , который ,как и Rrn-III , принадлежит к второму структурному типу, разворачивается при повышенных -температурах с температурой основного перехода 55°С при рН 5,25. Инкубация токсинов из Anemonis
sulcata при 90°С в течение 15 мин приводила к их инактивации (Новак, 1973).
Длительная инкубация при высоких рН приводила к потере активности АР-А (Нортон, 1979), возможно, вследствие химических изменений отдельных аминокислотных остатков. Отсутствие изменения токсичности кш-Ш , выдержанного в течение суток при рН в диапазоне от 1,4 до 13, показывает, что если в молекуле токсина и происходят конформационные переходы, то они являотся полностью обратимыми.
На основании результатов, полученных математическими методами, а также экспериментальных данных можно сделать вывод, что на уровне элементов вторичной структуры длинные токсины I и 2 типа являются в высокой степени подобными. Несмотря на это, между по-
липепг идами разных типов наблюдаются различия в ионизационном поведении, внутримолекулярных ионных взаимодействиях и термической стабильности.
Известно, что такие физические свойства, как гидрофобность и гкдрофильность, наличие зарядов и свободных донорно-акцетор-ных групп, определяют поверхностную активность белков и пептидов.
Мы рассчитали по методу Кайта и Дулиттла (1982) индексы гидрофобдости аминокислотных последовательностей, представленных на рис. 2 токсинов I и 2 типов. Для токсинов как I, так и 2 типов, характерно наличие двух гидрофобных участков в последовательностях: 16-28 и 41-46 (I тип), 15-24 и 33-43 (2 тип). Профиль гидро-фобности первого среднего участка различен для токсинов I и 2 типов, но слабо меняется в ряду токсинов одного типа. В отличие от первого участка второй (С-концевой) участок варьирует как по протяженности, так и по гидрофобности среди токсинов каждого типа.
Сравнение суммарной гидрофобности "С-концевогои участка с токсичностью (летальная доза на мышах после внутрибрюшинной инъекции) показывает, что они хорошо коррелируют между собой (рис. 7).
^(ДД^
АТХ-Х^Лг
®Ах-п
гидрофобность
Рис. 7. Сравнение гидрофобности
С-концевого участка анемо-нотоксинов и токсичности для мьшей.
10 20 30 40 50 60 70
4
По-видимому, гидрофобные взаимодействия играют ппжную роль в связывании анемснотоксинов П типа с рецептором.
Структурно-функциональные взаимосвязи анемонотоксинон
В таблице 2 суммированы результаты по влиянию химической модификации на токсичность Шп-Ш. Совокупность всех представленных данных позволяет сделать вывод об отсутствии в аминокислотной последовательности йш-111 остатка, абсолютно необходимого для токсичности. Не считая эффекта от разрушения дисульфидных связей, максимальное падение токсичности происходило в результате модификации н-концевой аминогруппы (в 12 раз). Модификация других функциональных групп влияла на токсичность в значительно меньшей степени. Очевидно, что в данной ситуации не применимы как классическая концепция "активного центра", так и предложенная ранее модель организации реакционного участка анемонотоксинов (Бархинин, 1981) с остатком аргинина в качестве центра связывания с натриевым каналом. Полученные результаты показывают, что ответственность за токсические свойства распределена между многими функциональными группами, среди которых выделяются аминогруппы и гуанидиногрулпа остатка аргинина, способные в протонированном состоянии "нести" положительный заряд.
Наличие эффекта от модификации ряда заряженных аминокислотных остатков, с одной стороны, указывает на то, что взаимодействие йт-Ш с натриевым каналом, по крайней мере, на одной из стадий является электростатическим, а с другой - позволяет предположить, что оно является многоточечным. Концепция многоточечного связывания позволяет объяснить основные различия, наблюдаемые при модификации токсинов разных типов. Модификация отдельных функциональных групп па-т в меньшей степени влияет на токсичность по сравни нию с токсинами, принадлежащими к I тиЛу. Зта, по-видимому.
объясняется тем, что его последовательность содержит значительно больше как основных, так и кислых аминокислотных остатков: при блокировании одной-двух функциональных групп оставшиеся свободными группы продолжают выполнять свою роль в процессе реализации биологического оффента.
Таблица 2
Влияние химической модификации на токсичность Ет-Ш для мыпей
Модификация ЛДе^ (модифицир.) Реагент ——- ДД^ (нативного)
o£-NH2-Gly-1 1 I.ys-4 С-концевые LfjS [%] улусный ангидрид 12 2 2
Arg-13 Малоновый альдегид £енилглиоксаль I,2-циклогександион 4-5
COOK Метиловый эфир глицина . Тетрафгорборат г С^ триметил-оксония 1-2
тгр-:;о 2-гидрокси-5-нитробензилбромид I
Дисульфидные связи 2-меркапт оэтанол/иодацетамид 100
Нельзя не отметить общие черты в механизме действия Кга-Ш и постсинаптических токсинов яда змей. В настоящее время доказано, что действие последних является многоточечным, причем важную роль в ном играют положительно заряженные аминокислотные остатки (Цстлин, 1957).
На особую важность конформационного фактора указывает почти иолно.я потеря токсичности в результате разрушения дисульфидных
связей, стабилизирующих активную конформацию молекулы с определенным расположением гидрофильных и гидрофобных участков. Весьма вероятно, что гидрофобные взаимодействия играют в рецепции токсина важную роль.
Ближайшими фармакологическими аналогами анемонотоксииов являются оС-токсины из яда скорпионов (Катгералл, 19Ь0). Термодинамические исследования показали, что между скорпионотоксинами и рецептором существуют гидрофобные взаимодействия (Дарбон, 1983). По данным химической модификации, во взаимодействии с возбудимой мембраной участвуют положительно заряженные остатки токсинов скорпионов, находящиеся на гидрофобной поверхности (Эйб, 1986). В этом отношении очевидно значительное сходство между функционально важными основными остатками нейротоксинов скорпионов и анемон.
Фармакологические свойства На<11ап-ЬЬиз токсинов
Полипептидные токсины морских анемон, подобно ТТХ и йТХ , имеют несложный спектр действия: они селективно изменяют функцию натриевых каналов, присутствующих в электровозбудимых тканях, и этим, по-видимому, можно объяснить все их фармакологические эффекты.
Классический подход к анализу электровозбудимых мембран связан с использованием электрофизиологических методов, при помощи которых удается регистрировать быстрые изменения мембранного потенциала и тока, составляющих потенциал действия. Вследствие того, что зависимость ионной проницаемости от мембранного потенциала является нелинейной, мембранные токи обычно измеряют при постоянном потенциале на мембране (метод фиксации потенциала). Такой подход позволяет проводить прямое измерение ионной проницаемости как функции времени и мембранного потенциала (Каттералл, 1980). Элект-рофизнологические эксперименты были выполнены совместно с сотруд-
пиками Института физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР д.б.н. Сорокиной З.С. и к.б.н. Чижмаковым И.В.
Действие Щц-ш на нейроны качественно сходно с влиянием на них нойротоксинов, выделенных из других видов актиний: начиная с концентрации 10"^ моль/л,Ит-Ш замедляет процесс инактивации быстрых натриевых каналов, а часть каналов переводит в неинакти-вирувдцую форму.
Модифицирующее действие Ят-ИХ не затрагивает ни процесс активации, ни амплитуду натриевого тока при любом мембранном потенциале (рис. 8 а, 9). Однако при увеличении деполяризации постоянная времени инактивации полностью модифицированного натриевого тока проявляет максимальное возрастание, в то время как постоянная времени нормального ^модифицированного тока уменьшается (рис. Й б). Таким образом, действие йта-Ш проявляется не только в замедлении кинетики инактивации и ее частичном отсутствии, но и в инвертировании потенциалзависимости постоянной инактивации. Сходным действием на стационарный уровень инактивации обладает токсин из яда скорпиона ВиИтв еиреив (Можаева, 1980). мс
Г 2,0 1,0
б
МС
Ь
h 20
O-I
•"2
10
-40
-20
0 МВ
-I ЧпшН1
-40
-20
О мВ
Рис. 8. Зависимость постоянных времени активации (а) и инактивации (б) натриевого входящего тока от потенциала до (I) и после (2) приложения токсина.
а
-20 0 20
мс
х_1_I
+в
мВ
о- I
0,75
0,5
а
0,25
5нА
-120 -80 -40 0 мВ
Рис. 9. ГЬтенциалэависимые характеристики натриевого входящего тока до и после приложения токсина, а - вольт-амперная характеристика пиковых значений входящего тока; б - зависимость стационарного уровня инактивации натриевого тока от потенциала: I - до, 2 - после приложения токсина в концентрации М.
Действие нейротоксинов морских анемон, как и их наиболее близких фармакологических аналогов о^-скорпионотоксинов, является в высокой степени готенциалзависимым: если мембрана деполяризована, сродство токсинов к рецепторному участку натриевого канала понижается. Максимальная натриевая проницаемость при насыщающих концентрациях токсинов оставалась неизменной, следовательно деполяризация изменяет Кд, но не оказывает влияния на число участков связывания.
Зависимость доли модифицированных натриевых каналов от концентрации токсина в наружном растворе представляет в координатах Скетчарда прямую линию. Эти данные указывают на присутствие в мембране нейронов млекопитающих одного типа рецепторов Нта-Ш и позволяют считать, что связь между концентрацией введенного в
раствор токсина и вызываемым изменением кинетики натриевого тока (доза-эффект) описывается адсорбционной изотермой Ленгмюра, справедливой для мономолекулярного процесса на однородной поверхности.
Итак, для модификации одного натриевого канала необходима одна молекула токсина. С другой стороны, такое взаимодействие приводит к двухкомпонентному эффекту: замедлению кинетики инактивации и ее частичному отсутствию. В этой связи возникает вопрос, каким образом одна молекула токсина может обусловливать двухком-понентную модификацию натриевого тока.
Ленгмюровский характер взаимодействия токсин-канал свидетельствует против гипотезы о двух популяциях натриевых каналов, отличающихся сродством к токсину, и указывает на то, что все ток-синсвязивашие участки обладают равным соодством к молекулам токсина. Таким образом, замедление инактивации и ее отсутствие, вызванные модифицирующим действием токсина, определяются двумя различили состоя-МЯМИ канала. Однакс. при этом остается неясным, является ли участок, связывающий Rm-III , составной частью структуры инактивационных ворот натриевого канала, либо модификация этой структуры происходит за счет конформационных перестроек натриевого канала.
Молекулярные компоненты, входящие в воротную систему, по-видимому, прошивают мембрану насквозь, .так как они доступны для полипептидных токсинов с наружной стороны мембраны и,в то же время, могут Сыть разрушены проназой при ее обработке ферментом с внутренней стороны (РомеЙ, 1980).
Известно, что при внутриклеточной аппликации ионы цинка подавляют поротный ток (Кевес, 1976). Предполагают, что они специфически взаимодействуют со структура!.™, участвующими в реализации
воротного процесса. Ионы цинка значительно изменяют характер действия Кт-Ш на натриевые каналы: по мере увеличения концентрации медленно инактивирующий компонент модифицированного нейротоксином тока уменьшается и практически исчезает при концентрации, равной 6 мМ (рис. 10).
Аналогичным свойством обладают более специфические реагенты на ЗН-группы белка: п - хлормеркурибензоат и Н -этилмалеиыид. Напротив, катионы Ав+, Со2+ и Н1?+ не кодифицируют действие Кш-Щ, хотя и подавляют амплитуду натриевого тока. Эти данные позволяют предположить, что в состав участка внутриклеточной поверхности, аллостерически связанного с рецептором токсина, входят ЭН-группы.
I/ 4мМ б мМ
1нА [_,
2мс
Йт-Ш - 1,2-10"7М
Рис. 10. Модификация входящего натриевого тока йт-Ш и после введения во внутриклеточный . .
раствор 2пс12 в различных концентрациях, указанных под кривыми (Е^ = -20 мВ, V = -100 мВ).
Таким образом, структурные изменения макромолекулы натриевого канала, иццуцируемые Ит-т, охватывают участки и внутриклеточной поверхности, воздействуя на которые можно модифицировать действие ::а(ИРп1;!гиа токсина на натриевый канал.
Блокирование ТГХ натриевых каналов нейронов спиральных ганглиев крысы не препятствовало модификации инактивационных ворот
каналов Rn-III. Отсюда следует, что рецепторы обоих токсинов находятся на наружной стороне мембраны, но пространственно разобщены. Связывание ТТХ с натриевыми каналами, ранее модифицированными Em-III, обнаруживало характер положительной кооперативности с коэффициентом Хилла 1,5, т.е. для блокирования одного натриевого канала, модифицированного токсином, необходимо две молекулы ТТХ. Эти данные указывают на то, что модифицирующее действие Rm-III распространяется на участок наружной поверхности мембраны, с кр-торым взаимодействует ТТХ.
Таким образом, модификация Radianthus токсином инактивации натриевого тока сопровождается существенным изменением информации канала, охватывающим значительную его часть. Это проявляется не только в изменении функциональных свойств собственно натриевого канала (замедление инактивации и ее отсутствие, аномальная зависимость постоянной времени инактивации от мембранного потенциала), но также и в изменении фармакологических свойств макромолекулы натриевого канала. Полученные данные позволяют считать, что участок наружной поверхности натриевого канала, взаимодействующий с Лга-III, не входит в состав воротного устройства канала, а модификация последнего осуществляется посредством аллостерических взаимодействий. Ери этом участок макромолекулы натриевого канала, ответственный за связывание анемонотоксина, вероятно, играет важную роль в подцержании определенной конформации канала, нарушение которой приводит к значительной перестройке всей молекулы.
П.' ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ: ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА И СТРУКТУРА
В процессе ввделения нейротоксинов из R. macrodactylus было обнаружено, 4vo в водно-этанольных экстрактах актиний присутствует большое количество ингибиторов протеиназ. Ранее аналогичный факт отмечали для актиний A.sulcata (Фриц, 1972; baHVjxp, 197o)
И Б^ЮмеПа ар. (Мебс, 1980).
Биологическая роль ингибиторов протеиназ в морских актинилх пока неясна. Можно предположить, что они защищают животных от переваривания протеиназами жертв и саыопереваривания или блокируют расщепление гемолизинов и токсинов, в комплексе с которыми находятся в организме. Также возможно, что ингибиторы играют важную роль в регуляции процессинга белков. Активность йасищиьиа полипептидов оценивали по их способности ингибировать действие трипсина.
Вьщеление и некоторые свойства ингибиторов протеиназ из И. пасго(!а<^у1иа
При хроматографии на полихроме I ингибиторы трипсина из Н. тасго<1а(^у1и8 присутствуют в той же фракции, что и нейротокси-ны. Поскольку поведение ингибиторов трипсина при хроматографии аналогично поведению нейротоксинов, то для их выделения был использован тот же методический подход, что и в случае нейротоксинов (табл. 3).
Молекулярная масса выделенных ингибиторов 5500-7000 дальтон. Подобно ингибиторам протеиназ из других видов актиний, Па<11ап*;}пш ингибиторы имеют в своем составе шесть остатков цистеина и не содержат остатков метионина и триптофана. Как показано методом Элл-мана, в Ка<иап1;11иа ингибиторах отсутствуют свободные сульфгид-рильные группы. Это позволяет предположить, что шесть остатков цистеина образуют три внутримолекулярные дисульфидные связи. По-видимому, высокое содержанке основных аминокислот, присутствие трех д«сульфидных связей в молекуле ингибиторов и обусловливают их поведение при хроматографии, подобное нейротоксинам. В связи с этим,большой интерес представляет установление первичной структуры иш/битеров протеиназ, поскольку решение этой проблемы позволит
выяснить, существует ли филогенетическое родство между этими по-
лтептщаыи о различной функцией.
Таблица 3
Характеристика стадий очистки ингибиторов, трипсина из И. шасгойас1у1иа
Стадия очистки Количество белка, мг трипсина, М Выход, %
I. Исходный экстракт 5000 - 100
П. Хроматография на
полихромс I:
фракция I 250 - 5
111. Хроматография фракции I
на БР-сефадексе С-25:
I 10 1.М0"6 0,2
2 6 4-10"7 0,12
■3 3 8-Ю-8 0,06
4 2 2-Ю"5 0,04
5 24 1,3-Ю-5 0,48
6 0,67 1,5-Ю-6 0,0013
7 12 2-Ю"7 0,24
9 9 ' 7. Ю-6 0,12
1У. Рехроматография на .
БР-сефадексе С-25: 1-Ю"8
8 15 0,3
10 5 4-КГ8 0,1
Определение аминокислотной последовательности ингибитора трипсина ,?п-1У
При выделении Гш-Ш на стадии ионообменной хроматографии на зр-сефадексе С-25 был обнаружен полипептид ^п-ГУ , который блокировал действие бычьего трипсина с константой ингибирования 1.0Л0"8 М (табл. 3).
По данным аминокислотного анализа, в молекуле при-
сутствует 6 остатков КМ-цистеина. н -Концевая аминокислота - глицин, С-концевая - аланин. При секвенировании .1п-1У были использованы те же методические подходы, что и в случае нейротокси-нов (стр. 8).
I-Т-1-ц-Т-2-ч 1-1-3-1
. |-СЬ-1-1 -1 i-СЪ-З-
I-1-4-1 I-Т-5 -н
-1 ьСЬ-4—I I-СЬ-5-1 I-СЬ-8-
' "*" " ь-сь-б—I " " "" """ • ~ —~ ь-СЬ-7^_Зр_4_,
Рис. II. Аминокислотная последовательность ингибитора трипсина Jn-IV
Сравнение аминокислотных последовательностей ингибиторов протеиназ из актиний A. sulcata и R. macrodactylus, гадюки Vipère ammodytes и молозива коровы показало довольно высокую степень гомологии первичных структур между такими далекими типами, как кишечнополостные, пресмыкающиеся и млекопитающие. По-видимому, в процессе эволюции структурные участки, отвечающие за ингибитор-ную функцию данного класса соединений, практически не претерпели каких-либо существенных изменений. Процент совпадения положений аминокислотных остатков для ингибитора 5 П из A. sulcata и Jn-IV составляет 50%. Гомология последнего с ингибиторами высших классов животных такого же порядка. Размеры полипептидных звеньев между остатками цистеина одинаковы. Длина н - и С-кокцевых участков в ряду от ингибиторов кишечнополостных к ингибиторам млекопитающих увеличивается и процент идентичных аминокислот в этих участках невелик. Видимо, эти участки молекул наименее консерзагивны.
Сравнение аминокислотных последовательностей токсинов и ингибиторов, выделенных из одного вида актиний, показало, что наибольший процент гомологии аминокислотной последовательности имеют ингибитор 5 П и самый короткий токсин АТХ Ш, в котором положение II аминокислотных остатков из 27 совпадает с положением остатков в 5 И: _ „
Ингибитор 5 П АТХ Ш
ikfttcodggnaeyfeleecefev
pe mase
PWGQfi^jPEGCSaigV
cgvrs OH
Проведенное нами сравнение аминокислотных последовательностей не позволяет сделать однозначных выводов ни в пользу существования филогенетического родства между нейротоксинами и ингибиторами, ни для его отсутствия. Для того, чтобы однозначно ответить на этот вопрос, необходимо провести сравнение участков, ответственных за биологическую активность полипептидов, а также сравнить аминокислотные последовательности токсинов и ингибиторов, выделенных из различных видов актиний. В настоящее время информация о структуре ингибиторов и строении их активного центра практически отсутствует.
С;. ЦИТОЛИЗИНЫ МОРСКИХ АКТИНИЙ: ВВДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
Морские актинии продуцируют полйпептидные цитолитические токсины, которые обычно действуют на клеточные мишени, лизируя клеточные мембраны. По-видимому, эти токсины вырабатываются актиниями с цеяыо нападения, в основном, чтобы добывать пищу. Кроме того, цитотоксины могут также выполнять ограниченную защитную функцию. Полагают, что эта функция не является первичной, поскольку в не-матоцистах синтезируется значительно больше цитотоксинов, чем требуется для защиты.
Выделение и некоторые физико-химические свойства Radianthua цитолизинов
0 основном для выделения цитолизинов из морских актиний используют схемы, предложенные Девлином и Бернхеймером (1974, 1976), включающие осаждение активного белка ацетоном или лиофилизацию водных экстрактов, гель-фильтрацию на сефадексах и иэ(< /лектрофо-кусирование. Этих стадий оказалось явно недостаточно для получения индивидуальных токсинов. И только повторное изоэлектрофокуси-рование или дополнительное включение в схему выделения ионообменной хроматографии и рехрсматографии оказалось эффективным; с их помощью было получено по три гомогенных изогоксина A. cari (Ма~ чек, 19Ь2) И S. helianthua (Кем, 1982).
Для ввделения цитолизинов из R. macrodaotylua намя была предложена схема, включающая гидрофобную хроматографию на политетрафторэтилене (полихроме I), концентрирование на СМ-целлюлозе, обессоливание на акрилексе (Р-2 или Р-4) и ионообменную хроматографию на СМ-целлюлозе (табл. 4).
Гомогенность выделенных изотоксинов доказана 3DS -электрофорезом в градиенте плотности Г1ААГ и анализом N -концевых аминокислот .
Цитолизин из М. aenlle был выделен по методу Бернхеймера (1978).
Ингибирование липидами
Известно, что морские актинии продуцируют три группы полипептидных цитолизинов. Отнесение полипептнцов к определенной группе производится на основании их взаимодействия с липидами: сфингомие-лин- и холестерин-ингибируе!мым: цитолизинам и фосфолипазам,
Истодом тонкослойной хроматографии на SiOg (Васьковский, 1У72) доказано, что Matridium и Radianthua цитолизины фермента-
Таблица 4
Схема очистки гемолизинов из R. macrodactylus
Стадия очистки
Коли- Специ- ДЦсп ВД^О' чест- фкчес- для мкг/мд
белка, актив-мг ность мг/кг /мг белка
Выход
белка, %
I. Исходный водный экстракт 60000 . 400 100 100 100
2. Хроматография на полихроме I 2000 1000 60 12,5 3,3
3. Eatc.fi -хр матография
на СМ-23 целлюлозе 1420 - 25 12,5 2,4
4. Гельфильтрация и обес-соливание на акрилексе
фракция А 200 10000 20 5 0,33
фракция Б 250 5000 20 5 0,41
5. Ионообменная хроматография фракции А на СМ-32 целлюлозе:
фракция I 23 20000 10 1,25 0,04
фракция 2 17 33000 10 1*0 0,028
фракция 3 20 - 0,033
фракция 4 15 - 0,025
6. Ионообменная хроматография Фракции Б на СМ-32 целлюлоз е:
фракция '5 23 7500 15 0,65 0,04
фракция 6 8 - - 0,013
7. Рехроматография на СМ-32 целлюлозе фракций 1,2,5:
КТХ-А 5,2 35000 5 0,008
НТХ-Б 11,3 50000 5 . 0,02
кгх-а I / 10000 10 1,5-10"'
тивной активностью не обладают.
Гемолитическое действие rtx. блокируется дисперсией сфингомие-лина и сывороткой крови. Преинкубацяя токсинов с другими липвдами
не приводит к потере активности даже при тысячекратном избытке липида. После обработки эритроцитов кролика стафилококковой сфингомиелиназой действие на них ПаМап-Нша цитолизинов оказалось не эффективным. По-видимому, сфингомиелин является специфическим мембранным акцептором цитолизинов. Подобный цитолизин был выделен из актинии 3. ЬвИап-ИшаСШин, 1979).
Используя способность наснашлиа цитолизинов взаимодействовать с эквимолярным количеством сфингомиелина, мы разработали способ определения этого липида в биологических жидкостях, который заключается в титровании липида гемолизином и определении точки эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов. Этот метод количественного определения сфингомиелина является более простым и дешевым, чем обычно используемый ферментативный.
ИнгибироЕание литической активности экзогенным холестерином ранее наблюдали для многих бактериальных цитолизинов (Ватсон, 1974; Коувелл, 1978). Подобное явление было обнаружено и для цитолизина из морской актинии м. аеа11е, что послужило поводом для его выделения в отдельную группу холестерин-ингибируемых цитолизинов (Бернхеймер, 1978). Однако в отличие от сфкнгомиелин-инги-бируемых цитолизинов актиний метридиолизин не обнаруживает высокой специфичности при взаимодействии с холестерином: для ингиби-рования 90^ гемолитической активности требовался тысячекратный молярный избыток как холестерина, так и лецитина.
Исследование действия цитолизинов на биологические мембраны
Исследование мембранотропных свойств гемолизинов проводили, используя две модели: яйцеклетки морского ежа Э1;гопЕу1осеп1;го1;из 1г^егт0<11иэ , в составе мембран которых сфингомиелин отсутствует или находится в видоизмененном состоянии, и эритроциты кролика, позволяющие быстро и количественно оценить активность т'оксинов по индуцируемому ими выходу ионов калия и гемоглобина.
ш?х не влияет на проницаемость мембран яйцеклеток даже в концентрации, в 1000 раз превосходящей концентрацию белка, вызываемого 10(# выход К4" из эритроцитов.
Кинетика выхода ионов К1" и гемоглобина из эритроцитов кролика при действии различных концентраций КТХ свидетельствует о значительном опережении выхода К*. Постоянные времени этих процессов различаются на порядок при концентрации цитолизина 25 нМ.
Действие мегридиолизина на эритроциты кролика характеризуется наличием большого латентного периода (3-4 мин), который отсутствует у Еа<11апгЬиз токсинов. Опережение выхода ионов К* наблюдается в значительно меньшей степени.
По-видимому, при действии цитолизинов актиний на эритроциты первоначально образуются небольшие, проницаемые для ионов К* структуры. Выход гемоглобина, индуцируемый нтх, начинается в результате осмотического лизиса мембран эритроцитов после выхода из них более 90/о ионов. Гемолиз, индуцируемый метредиолизином, начинается после выхода 60-70% К4", видимо, вследствие нарушения целостности липидного матрикса.
Мембранотропное действие гемолизинов актиний зависит от рН и акткЕируется ионами двухвалентных металлов.
Исследование гействия цитолизинов на модельные мембраны
Зависимость литическога действия йтх от присутствия в мембране сфингомиелина исследована с помощью липосом, приготовленных из общей фракции фосфолипидов морского ежа с добавлением холестерина в присутствии сфингомиелина и без него.
Как и предполагалось, даже высокие концентрации токсина не влияют на проницаемость липосом без сфингомиелина, в то же время лклосо'.ат, содержащие 5$ сфингомиелина, оказались высокочувстви-тельнн/к г действию йтх. Сравнение действующ®: концентрация На-<1хбгД.ьие тсксина на обе системы позволяет оценить селективность
его взаимодействия с различными фосфолипидами - не менее 10° в пользу сфингомиедина.
Вещества, вызывающие увеличение ионной проницаемости мембран, в зависимости от механизма их действия разделяют на три группы: ионофоры-переносчики, ханалоформеры и детергентоподобдае соединения. Изучение зависимости ивдуцируемого транспорта ионов от концентрации »доктора, кан правило, дает возможность различить первый и второй тип. Для ионофорного механизма транспорта характерна линейная зависимость, в то время как при действии каналоформеров наблюдается нелинейная зависимость от концентрации индуктора с областью насыщения. Зависимость индуцированной ионной проницаемости липосом от концентрации МХ наблюдается в узком диапазоне концентраций , нелинейна и имеет область насыщения, т.е. типична для каналоформеров (рис. 12).
Рис. 12. Зависимость выхода ионов К4" (за 10 мин) от концентрации 1Ш.
Состав липосом: Ъ% сфингомие-лина; 12,!$ холестерина; 82,5% фосфолипидов яйцеклеток морского ежа. Липосомы содержали: 100 мМ КС1, 1мМцЕРЕЗ -трис, рН 7.4; состав среды: 100 ыМ 1ГаС1, I мМ КС1, Ь.М НЕРЕЗ --трис, рН 7.4. Концентрация липосом в среде 3,5 мг липи--1к с,г/мл да/мл.
При увеличении содержания сфингомиелина в липосомах до 25% заметно увеличивается начальная скорость выхода ионов К* из липосом, хотя диапазон действующих концентраций цитотоксина не изменяется. Наблюдаемый эффект можно объяснить либо увеличением скорости связывания токсина с мембраной и уменьшением времени формирования
каналов, либо увеличением диаметра формируемых каналов,как у аламетицина.
Липосомы являются также удобной моделью для исследования влияния поверхностного потенциала но индуцированную ионную проницаемость мембран, так как их поверхностный потенциал можно задавать путем введения в липидный состав мембран веществ, несущих заряд, а также изменять поверхностный потенциал в ходе эксперимента с помощью различных ионных детергентов, добавляемых в концентрациях ниже критической концентрации мицеллообразования. Мы использовали обь варианта создания и изменения потенциала мембран. Положительный и отрицательней поверхностные потенциалы липосом задавались добавлением в липвдный состав стеариламина и дицетил-фосфата соответственно.
При добавлении додецилсульфата натрия (Ю-4 И), нейтрализующего положительный потенциал липосом, выход ионов К* из них заметно увеличивается, в то время как в присутствии цетилтриметиламмо-ний бромида (Ю-4 М), создающего значительный положительный потенциал на поверхности мембраны, выход К*" резко падает. Полученная зависимость может быть объяснена в рамках теории Гуи-Чепмена уменьшением скорости трансмембранного переноса ионов К*" вследст-, вие снижения примембранной концентрации катионов.
Резкое возрастание выхода К* из липосом при рН 5.5-6 связано, по-видимому, с депрогонированием карбоксильных групп и нейтрализацией положительно заряженных групп лизина и аргинина, располагающихся в устье канала (рис. 13). Различия в лилиднои составе липосом не влияют на величину ионной проницаемости и ее зависимость от рН среда.
Доказательство отсутствия высокой избирательности метридио-лизина по отношению к холестерину было получено в дальнейших исследованиях его действия на липосомы различного лишздного состава.
Рис. 13. Эффект pH среды на проницаемость модифицированных RTX липосом. Состпр липосом: "О- 5 вес. % сфин-гомиелина, 12,¡У/, холестерина, 82общей Фракции фосфолипидов яйцеклеток морского ежа; о - 5 пес.% сфингомиелиня. 12,% холестерина, 77,зд лецитина,
дицетилфосфата. Концентрация RTX 50 нг/мл. Липосомы содержали: 100 мМ KCl, Ь мМ PIKS -тгис, pH 7.4. Состав среды: 100 мМ ИаС1 , I мМ ICI, 5 мМ PIPES -трис, pH 7.4. Среду с липосомами титровали HCl
4 б 8 pH И ТРИС-
Высокая концентрация липида, необходимая для ингибировония действия токсина, а также лизис липосом, не содержащих холестерин, свидетельствуют о том, что липцд, очевидно, не участвует в литическом процессе, a необходим для связывания белка с мембраной.
Следует отметить, что связывание метридиолизина с мембраной является, видимо, кооперативным процессом, о чем свидетельствуют сигмоиднь'й вид кинетических кривых и зависимости скорости выхода ионов К4" из эритроцитов от концентрации белка.
Действие цитолизинов на бислойные липидные мембраны
Изучение электрических характеристик проводящих структур, формируемых Metridiua и Redlanthus цитолизинами, мы проводили совместно с В.И.Рудневым и Г.И.Лихацкой (Институт химии ДВО АН СССР), используя метод регистрации электрической проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ) в режиме фиксации потенциала.
Действующие концентрации Radlanthus токсина сильно зависят от наличия и количества сфингомиелина в мембране. Для достижения одинаковых изменений проводимости мембран из о( -моноолеина необходимы в 50 раз и более высокие концентрации ЯТХ, чем для мембран из смеси сС-моноолеина и сфингомиелина; причем оказалось, что в при-
сутствии сфингомиелина проводимость мембран зависит от длины углеводородного радикала фосфолипида: для ©¿-моноэруцина (С^) она в 2 раза выше, чем для оС-моноолеина (С^д). Добавление сфингомиелина в мембраны не изменяет эффект. Такая зависимость обусловлена, возможно, тем, что с ростом длины углеводородного радикала липида уменьшается плотность упаковки липидов в мембране, и поэтому для образования каналов необходима меньшая концентрация токсина на поверхности мембраны.
12 о,
Ом-1-см"2
-3 -4
-5
-б
Рис. 14. Зависимость проводимости БЛМ от концентрации RTX. Токсин введен с двух сторон мембраны. Каждая точка соответствует среднему значению проводимости 5 мембран через 15 мин после их Нормирования. Состав'мембран: 1-0,3%
01-моноолеин в н-гептане,
2-0,3% o^-моноолеин + С,3$ холестерин +0.3% сфингомиелин (1:1:1) в н-октане; 3 - 0,3$ о^-моно-олеин + 0,3% сфингомиелин (1:1) в н-гептане. Состав среды: 0.1 М KCl, 5 мМ триЫ1С1, pH 7.0.
1е с.нг/мл
Наклон прямых, характеризующих зависимость проводимости мембран от концентрации токсина в двойных логарифмических координатах, близок к четырем (рис. 14). Это означает, что элементарная проводящая структура образуется агрегацией в пределах бислоя четырех полипептидных молекул, независимо от состава БЛМ.
Небольшие концентрации ИТХ при одно- и двустороннем добавлении вызывают дискретные скачки тока через БЛМ, свидетельствующие о появлении элементарных проводящих структур - одиночных ионных каналов, время открытого состояния которых зависит от велнчи-нн потенциала на мембране.
Одностороннее добавление итх ивдуцирует увеличение проводимости меморань1, зависящее от величины и полярности приложенного потенциала (рис. 15). Проводимость мембраны в три раза выше при
положительном потенциале со стороны добавки токсина. Вольт-амперная характеристика канала асимметрична относительно качала координат и полярности, что указывает на несимметричное распределение ВТХ в пределах бислоя. Различные значения проводимости канала при изменении полярности потенциала можно объяснить либо изменением конфигурации канала или его устья, либо перераспределением ионов электролита вблизи устья каналов. Образуемые гемолизином ионные каналы проницаемы преимущественно для катионов = 0.72,
tcj_ = 0.28).
Зависимость проводимости одиночного канала, образованного RTX от потен-
Ниала на мембране, остав мембран: 0,3у> «f-моноэруцин в н-гептане. Состав среды как на рис. 13. Концентрация RTX 100 нг/мл, токсин введен со стороны электрода, знак потенциала которого указан на рисунке.
Подобно Radianthua цитотоксинам метридиолизин вызывает увеличение проводимости БЛМ. Действующие концентрации токсина не зависят от липидного состава мембран, что соответствует результатам исследования липидной специфичности на липосомах.
В средах с высокой ионной силой (IM LiCl) действие метридио-лизина не проявляется вплоть до высоких его концентраций (1.5*10 мкЮ. При уменьшении ионной силы путем разведения среды методом отмывки на одной мембране удалось зарегистрировать отдельные скачки трансмембранного тока величиной 0.1-0.2 пА и временем жизни 10-20 с (рис. 16), которые можно расценить как появление в мембране проводящих структур типа ионных каналов. ■
Приблизительно через 1-1,5 минуты начинается резкое увеличение проводимости мембраны, связанное либо с появлением большого
Рис. 15.
Рис. 16. Дискретные изменения тока через БЛМ в присутствии метридиолизина. Состав мембран: 2% азолек-тин в н-декане. Состав среды: 0,1 М11С1 , 0,01 аммоний-ецетатный буфер, Н 6.0; Т - 250С. отенциал на мембране 10? мВ. Токсин добавлен с двух сторон БЛМ.
количества каналов, либо с пертурбациями липидного матрикса.
Вольт-амперная характеристика БЛМ, модифицированной токсином, симметрична. Сублинейность появляется при увеличении напряжения выше 40 мВ (рис. 17). Значительные изменения в действии токсина на БЛМ наблюдаются при добавлении ионов (I мМ): происходит уменьшение интегральной проводимости мембраны, изменяется вольт-амперная характеристика канала (рис. 17). Появление участка с отрицательным динамическим сопротивлением при v =-50 мВ указывает на значительный положительный заряд и наличие потенциального барьера в устье проводящих структур.
Рис. 17. Вольт-амперная характеристика модифицированных мет-ридиолизином БЛМ. Токсин введен по обе стороны мембраны, концентрация 1,3 мкг/мл. *
1 - без добавления La^ •,
2 - ионы 1а+ добавлены с одной стороны мембраны. Состав среды: 0,1 м HCl, 0,01 М аммоний-ацетатный буфер, pH 6.0, Т - 25°С.
Блокирование каналов ионами , преодолевающими потен-
циальный барьер, происходит благодаря высокому положительному потенциалу. Напряжение, противоположное по знаку и равное по величине блокирующему, деблокирует канал, в. результате чего проводи-
мость мембраны резко возрастает. Ионы р~ деблокируят модифицированное лантаном проводящие структуры даже при значительном запирающем напряжении, равном 107 мВ.
Исходя из блокирующего эффекта ионов лантана, размер гидра-
о
тированного иона которого около 5 А, и незначительного уменьшения
проводимости мембраны в присутствии сахарозы (размер молекулы ~ о
5 А) можно предположить, что диаметр первоначально образующихся пор, проницаемых для ионов электролита, близок этой величине.
Итак, в основе биологического действия метридиолизина лежит, по-вицимому, его способность формировать в небольших концентрациях короткоживущие проводящие структуры (ионные каналы).и действовать в высоких концентрациях подобно поверхностно-активным соединениям, нарушающим упаковну липидов в бислое.
Действие Radlanthua токсина на изолированный фрагмент эритроцктарной мембраны
Исследование канальных свойств Radianthua токсина методом точечной фиксации потенциала проведено на мембранном фрагменте эритроцита кролика (в конфигурации inside-out ) совместно с к.б.н. П.Д.Ережестовским (ИЭК ВКНЦ АМН СССР).
Скачкообразное увеличение амплитуды выходящего тока при добавлении RTX в экспериментальную камеру соответствует встраиванию полипептидннх молекул в мембрану.
Подобное дискретное изменение тока через мембрану с близкими величинами индуцированных скачков проводимости при близких действующих концентрациях цитотоксина имеет место и в случае БЛМ. И в БЛМ, и в зритроцитарной мембране иногда наблюдается закрывание пор (рис. 18).
Линейный характер вольт-амперных характеристик и четное увеличение проводимости мембранного фрагмента при действии RTX ст-иде-
Рис. 18. а - Примеры токов через одиночные ионные каналы в мембране эритроцитов, зарегистрированные в конфигурации ineide-out . Слева - мембранные потенциалы, при которых проводилась регистрация токов. Стрелки показывают закрытое состояние канала.
б - Вольт-амперные характеристики, соответствующие образованию одной С-о-о-), двух ( -А—), четырех (-о —элементарных пар проводимостью 290, 587 и 1175 пСм, соответственно.
тельствуют (рис. 18,6) о том, что элементарная проводящая структура имеет строго определенные размеры. Исходя из величины проводимости канала 300-400 пСм, можно рассчитать диаметр канала,
Формируемого rtxв эритроцитарном фрагменте, он равен приблизи-о
тельно 6-10 А. Подобнуе размеры имеют каналы, формируемые RTX в липооомах, как определено с использованием химических маркеров. Канал имеет близкую избирательность для ионов К* и На+.
Влияние rtx на физико-химические свойства эритроцитарной мембраны
Результаты исследования эффектов различных белков на термо-тропш 9 свойства синтетических фосфолипидов позволили выделить три группу белков. Белки первой группы уменьшают энтальпию денатурации Нд1 и температуру фазового перехода липидов (Тп). Белки второй группы увеличивают Гп. Белки третьей группы почти не гаменяэт Тп, но уменьшают д Нд.
Эта классификация может быть использована для характеристики механизма взаимодействия MX со сфингомиелином (СМ). Калориметрические исследования были выполнены совместно с д.б.н. Шныровым В.Л. (Институт биофизики АН СССР, г.Пущино).
На рис. 19 приведены кривые плавления СМ в присутствии нтх. Увеличение концентрации белка приводило к уширению пика плавления и его уменьшению. Изменение Тп практически отсутствовало, что свидетельствовало о принадлежности ВИС к белкам третьей группы. Уменьшение ДНд есть линейная функция зависимости от концентрации белка. Экстраполяцией Д Нд к 0 было определено, что из кооперативного перехода изъято шесть молекул СМ на молекулу rix. дСр
Рис. 19. Кривые плавления СМ из
мозга быка и смеси CM-rtx в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7.4. Величины молярного отношения липид:бвлок указаны на кривых.
»с
Зависимость избыточной теплоемкости теней человеческих эритроцитов от температуры характеризуется четырьмя четкими пиками (А,В,С,Д) (рис. 19). Кривая плавления теней модифицированных нтх . имеет дополнительный максимум при 36°С (рис. 20, кривая 2); кроме того, в последнем случав пик А уменьшается, а пик С сдвигает-, t
ся на 1,5 К в область более низких температур.
Взаимодействие с ÄTX приводит к значительному уменьшению на электрофореграмме модифицированных теней эритроцитов полосы, соответствующей актину, который вместе со спектрином и полосой белка 4.1 является одним из основных компонентов эритроцитарного
20. Кривые плавления интактных теней эритроцитов человека (I) и теней, модифицированных rtx(2).
-1__J_Ii_•_■
30 50 70 °С
цитоскелета. Проникновение RTX в мембрану человеческих эритроцитов связано с нарушением взаимодействия между мембраной и цито-скелетом. Это приводит к высвобождению актина, который выходит в цитоплазму и вымотается в процессе приготовления теней. Так как в интактных мембранах актин связан с белком полосы 3, то проникновение RTX в мембрану нарушает С-перекод,
Что касается появления на термограмме низкотемпературного перехода, то, по-видимому, он появляется вследствие денатурации одной из цепей комплекса спектрина. Неэквивалентное термическое поведение оС- и ß-цепей спектрина может быть также обусловлено потерей большей части актина из цитоскелета.
Подобно теням человеческих эритроцитов, тени эритроцитов собаки характеризуются четырьмя температурными переходами. Однако существуют различия в термоинактивации белков, которые вызывают эти переходы. Модификация теней эритроцитов собаки rtx не вызывает заметных изменений ни калориметрических, ни электрофоре-тических параметров мембранных белков. Мы можем только утверждать, что rix проникает в мембрану эритроцитов собаки, что отражается в появлении на электрофореграмые полосы, соответствующей белку с кажущейся мол,массой 20,кДа. Полученные результаты подтверждают
наличие существенных различий в структурной организации мембран эритроцитов человека и собаки.
ВЫВОДЫ
1. Проведено комплексное исследование токсинов морских анемон, на основе которого разработаны общие принципы их использования для изучения структурной организации биологических мембран и ионных каналов.
2. Впервые осуществлено систематическое исследование двух основных групп полипептидных токсинов морской актинии ПасИапШлэ тасго<1ас1у1ив. Предложены новге общие методы выделения биологически активных полипептццов из морских актиний. При помощи этих методов выделено 28 индивидуальных полипептидов, из которых 20 выделено впервые.
3. Установлена аминокислотная последовательность пяти нейро-токсинов и одного ингибитора трипсина. Открыто существование нового структурного типа анемонотоксинов. Установлены основные принципы строения нового типа анемонотоксинов. Исследованы структурные закономерности, характерные для анемонотоксинов.
4. Впервые проведено систематическое изучение структурно-функциональных взаимосвязей в ЯасИапЭДив токсинах методом химической модификации. Установлено, что в структуре нейротоксинов отсутствует остаток, абсолютно необходимый для токсичности, однако гуанидиногруппя Агб-13 , гтротонированные аминогруппы и отдельные карбоксильные группы важны для проявления токсином максимальной биологической активности. Предлог н механизм многоточечного связывания анемонотоксинов с натриевым каналом.
5. Впервые исследовано взаимодействие анемонотоксинов 2 типа с натриевыми каналами. Установлено, что модификация воротного устройства осуществляется посредством аллсстерического механизма
и определяется структурной перестройкой значительной части натриевого канала. Рецептор токсина расположен на наружной строне мембраны и, по-пидимому, не является составной частью воротного устройства натриевого канала.
6. Установлено, что в основе мембранолитического действия цитотоксинов актиний лежит их способность формировать в биологических и модельных мембранах ионные каналы, которые являются оли-гомерннми структурами и имеют близкую избирательность для ионов натрия и калия.
Показано, что в отличие от Radianthua токсинов, типичных канал оформеров, митрадиолизин в низких концентрациях проявляет кана-лоформерные свойства, а в высоких действует подобно поверхностно-активным соединениям.
Предложен принципиально новый способ количественного определения сфингомиелина в биологических жидкостях.
Основные результаты работы опубликованы в следующих статьях:
1. A.c. 953565 (СССР). Способ очистки низкомолекулярных белков // Возгжова Е.И., Зыкова Т.А., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Опубл. в Б.И. ¥ 31, 1982.
2. A.c. 957469 (СССР). Способ получения нейротоксинов // Зыкова Т.А., Кофанова H.H., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Опубл. в Б.И., 1982.
3. A.c. 942763 (СССР). Способ получения гемолизинов JJ Монастыр-ная М.М., Вожжова Е.И., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Опубл.
в Б.И., 1982.
4. A.c. 944192 (СССР). Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью // Козловская Э.П., Оводова Р.Г., Прокофьева Н.Г., Лоенко D.H.', Гарсия И. Опубл. в Б.И., 1982.
5. Байдан JI.B., Козловская Э.П., Тишшн С.М., Щуба М.Ф., Еляков Г.Б. Действие анемонотоксина на нервно-мышечную передачу в скелетных и гладких мышцах // Докл. АН СССР. 1981. Т.259. Г' 4. С.1000-1002.
6. Нршталь О,А., Оеипчун D, В,, Кляков Г,В,, Коаловскан У.11, Действие токсина из актинии ii.duerdemt на рупдшний тлк * нейронах млекопитающих // Нейрофизиологии, 1С.М2, Т, 14. У Л, С. 402-409,
7, Нор уллин А.А., Одиноков С.Е,, Вожжова Е.И,, Илялонекпя У.П., Ёяяков Г.Б, Исследование конформпционной стабильности тпнсн-ИП I из ОКТИНИИ rtadlnnthua maorodnetylus // Пноорган. химии. 1982. Т. 8. № 12. С, 1644Л64Д,
¡J, Nabiullin A,A,, Odlnikov С.В., Koslovnkaya K.I'., l;l><»Uov (J. И. Seooridary structure оf aea anemone toxins, (Juroular dlnliroj mn. infrared apeotroeeopy and Chou~Faem>m oaloulationa // l.ett,
1902. V. 141. N 1. P.124-127.
9. Koelovokaye В.Г., Voahova H.I., Klyekov О.В, atruoture-uotivity atudiee of neurotoxin from sea anemone R.Mttcrodaotylua// I/u Chemlutry of l'eptlde» and I'roteln» f Ede, VI. VoBltur, К.МшгшьИ, J.Ovohlrinlkov, V.Ivnnov. Uerlin-Hew Yorkui iYaltar de (Jruyten and Co., 1902. V.I, P.379-307.
Ю.ГСоялопскчя Э.П., Эикопа Т.Д., Винокура* Л.М. Пхрпичнпн струк» турП нойротокеинч из актинии liadlanthua inaorodaotylu»// Те-зиси 16 конферощии ФЬБО. Москва, I9H4, С,310,
11.Козловская Э.П,, Инпнов А.С,, Мольняр А, А,, Григорьеп П,А., Монаетырняя М.М., Хялилоп Э.М.; Елпков Г.Б, Ионные капали в мембранах, индуцированнме гемолизином ил актинии Uadinuthue maorodeotylus //Докл. АН СССР, 1984. Т, 277. У 6. С, 1491-1493.
12.Руднев B.C., Лихацкая Т.Н., 1(озловская 3,11., Монае-шриап М,М,, Еяяков Г,Б. Влияние гемолизина из морской актинии Jiadlenthue mnorodeotyluB на проницаемость липидтле м«мбран // Ей о л, мембраны, 1984. T.I. № Ю, C.I0I9-I023,
13. Сорокина З.Д,, Чижмакоя И, В., Е/шкоп Г,Р., Козлолскян З.П., Вожжова Ь'.И. Исследование механизма инактивации бнетрьте натрий вых конялоя с помощью нвйротоксина из актинии itadlanthuu плого-daotylue и различных химических реагентон // Фияиол. жу-ишл. 1904, Т. 30, № 5, С.571-579.
14. Зыкова Т.Д., ЕЬпюкуров Л.М,, Козловская Э.П,, Еяяков Г,Б. Аминокислотная последовательность нейротокеина III из актинии ¡1, macroduotyluo // Биооргон. химия. 1905, Т, И, № 3. С.302-310,
15.Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Марком Л.Ф., Козловская Э.П,, Кляков Г,<1. Аминокислотная последовательность трипеинойого ингибитора 1У из liadl.anthus maorodactyXufi // ЕиоорГШ!, ХИМИЯ, 19.':!'. Т. II. .»,* 3. С,293-301.
16. Сорокина З.А., Чижмаков И.В., Козловская Э.П., Вожжова Е.И., Еляков Г.Б. Положительная коолеративность связывания тегродо-токсина натриевыми каналами нейронов спинальных ганглиев крыс, индуцируемая анемонотоксином rtx-III // Докл. АН СССР. 1985. Т. 282. if 2. С.433-436.
17. Zykova Г.A., Vinokurov l.M., Markova Z.Ii., Kozlovskaya E.P. Primary structure of trypsin inhibitor XV from sea anemone R.macrodactylue // 3 Conf. PECS Biotechnol. Biol. Active Hat. Prod. Sofia. 1985. v. 4. p.44-48.
18. A.c. 1242826 (СССР). Способ определения сфингомиелина // Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Еляков Г.Б.,Опубл. в Б.И. * 25. 1986.
19. Козловская ?.П., Иванов A.C., Мольнар А.А..Монастырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 1987.
Т. 4. К' 3. С.243-248.
20. Брежестовский Б.Д., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Еляков
Г.Б. Действие гемолизина из морской актинии Radianthus macrodao-tylus на мембраны эритроцитов // Докл. АН СССР. 1988. Т. 299. № 3. С.748-750.
21. Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Действие метридиолизина из морской актинии Metridium senile на биологические и модельные мембраны // Биол. мембраны. 1988. Т. 5. № 8. С.830-835.
22. Иванов A.C., Мольнар A.A., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Действие токсина из Radianthus ma, . orodactylua на проницаемость мембран П Биол. мембраны. 1988.
Т. :. Щ I. С.243-248. .23, Зыкова Т. А., КозловскЬя Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина II из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. № 7. С.878-882.
24. Зыкова Т.А., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксинов 1У и У из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. № II. С.1489--1494.
25. Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Дисульфедные связи в нейротоксине III из актинии Radianthus macrodaotyluэ// Биоорган, химия. 1989. Т. 15. ¥ 7. С.904-907.
26. Oäinokov S.E., Kabiullin A.A., Kozlovskaya E.P., Klyakov G.B.
Structure-function relationship of polypeptide toxins, modifying gate mechanism of sodium channel Ц Pure Appl. Chora. 1989. V.61. H 3. P.497-500.
27. Махштрь B.M., Козловская Э.П. Необычный результат модификации анемонотонсина RTX-III малоновым альдегидом // Химия природных соединений. 1989. JP 3. С.383-337.
28. Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина
из актинии Radiaathua tnacrodactylua уксусным ангидридом // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. ff 4. С.465-470.
29. Machnir V.M., Kozlovskaya 2.P., Elyakov C.B. Modification of argin ine in sea anemone toxin RTX-III from Hadianthus гласго-daetylus // Toxicon, 1989. V.27. IÎ 10. Р.1075-Ю84.
30. Зыкова T.A., Козловская Э.П. Аминокислотная последовательность нейротоксина I из актинии Radianthua macrodactylua // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. ff 10. C.I30I-I306.
31. Zykova Т.А., Kozlorskaya Е.Р. Radienthua-toxins as new structural clasa of anemonotoxing, effecting Ha+ channel // 5 Conf. FECS Biotechnol. Biol. Active Hat. Prod. Sofia. 1989. V.1. P.401-406.
32. Махнырь B.M., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина
из морской актинии Eadlanthue maoxodactyluo // Биоорган, химия. 1990. T.I6. F 5. С.643-648.
Результаты диссертационной работы были представлены на: Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Баку, 1980; Рига, 1983; Таллинн, 1987; Тбилиси, 1990), III, 1У, УП СССР-ФРГ симпозиумах по химии белков (Махачкала, 1980; ТЬбенген, 1982; Дилижан, 1989), III Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси, 1981), Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983>, Конференции "Токсины-инструменты исследования в нейрохимии" (Западный Берлин, 1983), III и У Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функция" (Ташкент, 1983; Рига, 1988), 16 Конференции ФЕБО (Москва, 1984), УН Европейском симпозиуме по растительным, животным и микробным токсинам. (Лсщон,. 1985), 3 Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природ- . ных соединений (София, 1985), 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), I Азиатско-Тихоокеанском конгрессе по животным, растительным и микробным токсинам (Сингапур, 1987), 16 Симпозиуме
ШЛК по химии природных продуктов (Киото, 1900), Всесоюзном сим-погтумо "Одиночные ионнис кпналы в биологических мембранах (1Сара-Лаг, 1Ш9). .
