Исследование структуры актинопоринов актиний Oulactis orientalis и Radianthus macrodactylus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Ильина Анна Павловна

Исследование структуры актинопоринов актиний Ои1ас№ опеШаШ и ЛаШаМИт тасгойасХуЫъ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток-2005

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Козловская Э.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Эпштейн Л.М. кандидат химических наук старший научный сотрудник Сова В.В.

Ведущая организация: Институт биомедицинской химии

РАМН им. В.Н. Ореховича, г. Москва

Защита состоится 21 апреля 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, электронная почта: 5иепсе(й)р1Ьос dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан " марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., с.н.с.

у / Прокопенко Г.И.

гоог-4

409AS*

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных задач физико-химической биологии является выяснение молекулярных основ функционирования биологических мембран, выполняющих ряд важнейших для клеток функций. Мембрана является границей раздела при клеточной компартментализации, через нее осуществляются контакты клеток друг с другом и с окружающей средой, мембрана также защищает клетку от действия агрессивных факторов окружающей среды Важнейшее направление в современных исследованиях составляет изучение механизмов транспорта ионов и метаболитов через мембраны, липид-белковых и белок-белковых взаимодействий в мембране, играющих ключевую роль в ряде биологических процессов. Многие из этих процессов жизненно важны для клеток, а некоторые из них ответственны за их гибель. Общепризнанными и универсальными инструментами в этих исследованиях являются а- и ß-пороформирующие токсины (ПФТ), группа цитолитических полипептидов и белков, продуцируемая как прокариотическими, так и эукариотическими клетками ПФТ многих бактерий являются инвазивными факторами ряда опасных заболеваний, что и предопределяет необходимость всестороннего изучения их структуры и механизма действия.

Наиболее изученными представителями ПФТ, наряду с холестеринингибируемыми цитолизинами грамположительных бактерий, являются сфингомиелинингибируемые цитолизины актиний - актинопорины. Уникальная пространственная организация и способность формировать в мембранах поры лежат в основе антиопухолевой, кардиостимулирующей, антипаразитарной и других видов биологической активности актинопоринов, т.е. ПФТ являются перспективными соединениями для создания новых лекарственных препаратов.

В данной работе изучены физико-химические свойства двух актинопоринов Or-А и Or-G из актинии Oulactis Orientalin (Японское море), установлена полная аминокислотная последовательность этих полипептидов, а также актинопорина RTX-A актинии Radianthus macrodactylus (Индийский океан).

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью диссертационной работы явились поиск, исследование физико-химических свойств актинопоринов актинии О. orientalis, установление структуры и анализ структурно-функциональных взаимосвязей Oulactis и Radianthus актинопоринов.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА Петербург

ДО

Положения, выносимые на защиту.

1. Дальневосточные актинии являются перспективным источником биологически активных полипептидов, в частности, цитолизинов.

2. Цитолитические полипептиды Or-А и Or-G, выделенные из дальневосточной актинии О. orientalis, по физико-химическим свойствам, первичной структуре и механизму действия относятся к группе сфингомиелинингибируемых актинопоринов.

3. В основе различий гемолитической активности Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G и Radianthus актинопорина RTX-A лежат различия в аминокислотной последовательности функционально важных участков молекул, в частности Л'-концевого фрагмента.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов, одной из групп пороформирующих токсинов, широко исследуемых в настоящее время. Впервые в гомогенном состоянии выделены два цитолизина Or-А и Or-G из дальневосточной актинии О. orientalis. Установлено, что по механизму действия Oulactis цитолизины относятся к группе сфингомиелинингибируемых актинопоринов. Определены полные аминокислотные последовательности Or-А, Or-G и RTX-A из актинии R. macrodactylus. Методами сравнительного моделирования предсказана пространственная структура Radianthus и Oulactis актинопоринов. Показано, что М-концевые фрагменты аминокислотных последовательностей актинопоринов дальневосточной актинии короче на несколько аминокислотных остатков, что может объяснить различия в величине их гемолитической активности. Таким образом, Oulactis актинопорины являются уникальными природными моделями для изучения структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Всестороннее изучение структуры и функции пороформирующих токсинов является не только важной задачей фундаментальных исследований, но и необходимо с прикладной точки зрения, так как позволяет создать предпосылки к получению новых высокоспецифичных лекарственных препаратов на их основе.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 3rd European Conference on Marine Natural Products, Elmau Castle, Bavaria, Germany, 2002; Объединенной международной научной конференции «Новая геометрия природы», Казань, Россия, 2003; International Symposium Chemistry & Biology of Marine Organisms, Kolympari, Crete, Greece, 2003; XI International Symposium on Marine Natural Products, Sorrento, Italy, 2004.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 5 статей и 4 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов, изложена на 118

страницах машинописного текста и включает 40 рисунков, 10 таблиц и список цитируемой литературы, состоящий из 247 наименований.

Автор выражает искреннюю признательность и глубочайшую благодарность всем сотрудникам лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН, оказавшим помощь в проведении исследования, за содействие в проведении отдельных разделов работы сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН: к.м.н. Исаевой М.П., н.с. Лихацкой Г.Н., м.н.с. Гузеву К.В., вед. инженеру Тищенко Л.Я., сотрудникам Института биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Москва): проф. Егорову Ц.А., к.б.н. Липкину A.B. и к.б.н. Барсовой Е.В., сотруднику Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток) к.б.н. Костиной Е.Е. за помощь при определении видовой принадлежности актиний.

Содержание работы Скрининг актиний Японского и Охотского морей

Исследование было направлено на поиск новых источников актинопоринов среди актиний Японского и Охотского морей. С этой целью был проведен скрининг актиний, собранных в 27 экспедиционном рейсе НИС «Академик Опарин» в прибрежных районах южного Сахалина и в заливе Посьета (табл. 1).

Как известно, наряду с цитолизинами актинии продуцируют нейротоксины и ингибиторы протеиназ Содержание цитолизинов, нейротоксинов и ингибиторов трипсина определялось в водных и этанольных экстрактах актиний. Самую высокую токсичность проявили этанольные экстракты Cribrinopsis similis и Stomphia sp. (ЛД50 = 36.55 и 53.36 мг/кг, соответственно). Этанольные экстракты остальных видов имели слабовыраженную токсичность (ЛД50 « 200-400 мг/кг) (табл. 1). Обычно токсичность этанольных экстрактов актиний связывают, в основном, с действием нейротоксинов, вызывающих нарушение сердечной деятельности и остановку сердца экспериментальных животных, и, в меньшей степени, с действием цитолизинов Поскольку в этанольных экстрактах исследуемых видов актиний Охотского и Японского морей гемолитическая активность не была обнаружена, можно предположить, что токсическое действие на экспериментальных животных оказывают нейротоксины Токсичность водных экстрактов актиний Actinostola sp., Metridium senile fîmbriatum, О. orientalis (залив Посьета) оказалась в два раза выше, чем соответствующих этанольных (табл 1) Невысокую, в целом, токсичность водных экстрактов актиний можно объяснить, по-видимому, действием цитолизинов. Таким образом, было установлено, что токсичность этанольных и водных экстрактов актиний бореальных вод на 2-3 порядка ниже, чем токсичность экстрактов тропических видов актиний.

Таблица 1

Сравнительная характеристика биологической активности водных и этанольных экстрактов актиний

Японского и Охотского морей

№ Источник Место сбора, глубина Гемолитическая активность, ГЕ/мг Фосфоли-пазная А2 активность* Токсичность, ЛД50, мг/кг мыши Трипсин-ингибирукяцая активность, ИЕ/мг

Н20 н2о н2о ЕЮН Н20 ЕЮН

1 Actinosíola callosa Охотское море, 46°19'7" с.ш., 143°45'11" в.д., 143 м 1.15 + - 203.70 5.08 0.82

2 Stomphia sp. Охотское море, 46°19'8" с.ш., 143°51'2" в.д., 188-200 м 1.54 + - 53.36 2.80 0.84

3 Stomphia coccínea Охотское море, 46° 19 "6" с.ш., 143°45'15" в.д., 142 м 1.39 + - 302.62 3.81 1.61

4 Cribrinopsis similis Охотское море, 46°19'6" с.ш., 143°45'15" в.д., 142 м 64.93 + 126.4 36.55 55.43 8.74

5 Actinosíola sp. Охотское море, 46°07' 11" с.ш., 143°30'54" в.д„ 59-71 м 3.33 + 123.4 213.60 3.72 1.93

6 Metridium senile fimbriatum Охотское море, 46° 18'2" с.ш., 142°21'7" в.д., 22-26 м 2.92 + 118.7 253.16 2.34 0.67

7 Oulactis orientalis (^Aníhopleura orientalis) Охотское море, залив Анива, мыс Анастасии, литораль 2.65 + - 428.60 4.39 5.68

8 Oulactis orientalis {=Anthopleura orientalis) Японское море, залив Посьета, 0.5-1 м 5.68 + 100.0 299.34 5.29 1.16

"-" - активность не обнаружена; * - количество не определено.

Показано, что все водные экстракты актиний бореальных вод обладают гемолитической активностью (табл. 1). Но даже самый высокий уровень активности, проявляемой актиниями С. similis и О. orientalis (залив Посьета) (64.93 и 5.68 ГЕ/мг, соответственно), был в несколько раз ниже, чем водных экстрактах актиний, распространенных в тропических водах.

Значительные различия в величинах токсической и гемолитической активности экстрактов бореальных и тропических видов актиний связаны, вероятно, со средой обитания этих животных. Предполагается, что биологическая роль нейро- и цитотоксинов состоит в умерщвлении жертв при добыче актиниями пищи, отпугивании хищников и конкурентов в борьбе за место обитания. Как известно, биота холодных морей гораздо беднее, чем теплых тропических, и количество, как потенциальных жертв актиний, так и их врагов, по-видимому, уменьшается. Поэтому низкие значения гемолитической и токсической активностей для видов, собранных в бореальных водах, могут быть обусловлены тем, что актиниям нет необходимости вырабатывать токсины против хищников, таких, например, как крупные голожаберные моллюски. По наблюдениям гидробиологов, они не обитают в заливе Посьета и на литорали юга Сахалина.

Помимо так называемых "прямых" гемолитических факторов, актинии бореальных вод, подобно наземным ядовитым насекомым и пресмыкающимся, продуцируют и "непрямые" - фосфолипазы Аг- Наличие фосфолипазной Аг активности у всех анализируемых видов актиний было установлено по появлению на хроматограмме пятен, соответствующих жирным кислотам и лизолецитину, продуктам гидролиза лецитина

Выделение и физико-химические свойства актинопоринов из О. orientalis

В результате проведенного скрининга актиний северных умеренных вод был выбран для дальнейших исследований широко распространенный в заливе Посьета вид О orientalis (семейство Actiniidae), водные экстракты которого показали значительную гемолитическую и А2-фосфолипазную, а спиртовые - токсическую и трипсинингибирующую активности Для выделения цитолизинов применили схему, включающую гидрофобную хроматографию на полихроме-1 (политетрафторэтилене), обессоливание и гель-фильтрационную хроматографию на Акрилексе П-4, ионообменную хроматографию на целлюлозе СМ-32 и обращенно-фазовую ВЭЖХ на колонке Nucleosil Cis (табл. 2). На всех стадиях выделения во фракциях определяли гемолитическую активность, а на первых стадиях и трипсинингибирующую активность. На первой стадии выделения водный экстракт после центрифугирования и удаления осадка хроматографировали на гидрофобном сорбенте полихроме-1 (рис. 1), при этом отделялись липиды, пигменты, соли, а также балластные белки, такие как нейротоксины и ингибиторы протеиназ. Ранее было установлено, что

цитолизины элюируются с полихрома вслед за свободным объемом колонки, а ингибиторы трипсина и нейротоксины, хорошо сорбирующиеся на этом носителе, - 40%-ным водным этанолом. Полипептиды с гемолитической активностью были обнаружены в водной фракции (пик 1), а с трипсинингибирующей активностью - в водно-этанольной фракции (пик 2).

Таблица 2

Схема выделения цитолизинов из О. опеШаИя

Стадия очистки Суммарный белок, мг Выход, %

1. Исходный экстракт 20000 100

Хроматография на полихроме-1:

фракции пика 1 6500 32,5

2. Гель-фильтрация на Акрилексе П-4

фракций пика 1:

фракции пика 1 2500 12,5

фракции пика 2 1400 7

3. Ионообменная хроматография на

СМ-32 целлюлозе фракций пика 1:

фракции пика 3 90 0.45

4. ВЭЖХ на ЫисЬозП С]8 фракций

пика 3:

фракции пика 1 (Ог-А) 5 0.025

фракции пика 2 (Ог-в) 2.8 0.014

2.5

1280

1.5

0.5

1

0 50 100 150 200 Номер фракции

Рис. 1. Гидрофобная хроматография водного экстракта актинии О. опепшШ на колонке (2.6x15 см) с полихромом-1. Элюция гемолизинов водой (1500 мл), ингибиторов трипсина - 40%-ным этанолом (1200 мл). Скорость элюции 3 мл/мин. Объем фракций 9 мл. Сплошной линией отмечены границы фракций, проявивших гемолитическую активность. Пунктиром отмечены границы фракций, _ проявивших трипсинингиби-

250 300 рующую активность. Стрелкой отмечен момент смены элюента.

Водные фракции, содержащие значительное количество морской соли, после хроматографии на полихроме-1 лиофилизировали и затем обессоливали на Акрилексе П-4 (рис 2). При этом удалось разделить небольшого размера полипептиды по молекулярной массе В результате гель-фильтрации получено три пика, фракции первых двух обладали значительной гемолитической активностью. В исследуемых фракциях трипсинингибирующая активность не обнаружена

О.!)/™) 0.8 0.70.60.50.4 0.3 0.2. 0.1 0

10 20 30 40 50 60 Номер фракции

70 80

Рис. 2. Гель-фильтрация и обессоливание водной фракции цитолизинов после полихрома-1 (пик 1, рис. 1) на колонке (3><90 см) с Акрилексом П-4. Элюция 0.01 М аммоний-ацетатным буфером, рН 6.0 Скорость элюции 18 мл/ч. Объем фракций 4.5 мл. Сплошной линией отмечены границы фракций, проявляющих гемолитическую

активность.

Для дальнейшей очистки цитолитических полипептидов, содержащихся во фракциях 1-го пика (рис. 2), была использована ионообменная хроматография на целлюлозе СМ-32 (рис. 3). Кроме гемолитической активности, фракции 1-го пика проявили также Аг-фосфолипазную, в то время как во фракциях правого склона пика 3 идентифицированы только прямые гемолитики, цитолизины. Эти фракции после объединения и диализа были лиофилизированы. На завершающей стадии очистки цитолизинов использована ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Мис^ояН С]я (рис 4) По данным ЯОв-электрофореза в 14% ПААГ, а также масс-спектрометрического и А'-коицевого аминокислотного анализов, полученные в результате ВЭЖХ полипептиды (рис 4, пики 1 и 2), проявляющие гемолитическую активность, были гомогенными. Л'-Концевые аминокислотные остатки цитолизинов - аланин (пик 1) и глицин (пик 2). Согласно принятой классификации цитолизинов актиний они были названы Ои!ас/и цитолизинами Ог-А и Ог-в.

По данным SDS-электрофореза в 14% ПААГ, молекулярная масса обоих цитолизинов составляет 18 кДа, согласно данным MALDI-TOF-MS, она равна 15353.7 и 16035.9 Да для Or-А и Or-G, соответственно. Близкие значения молекулярной массы имеют актинопорины, выделенные из тропических видов Stichodactyla helianthus, R macrodactylus и Actinia equina.

Рис. 3. Рис. 4.

1,A750

0.9' 0.8' 0.70.6 0.50.4' 0.3' 0.20.10

[NaCl], M

>214

у

у

У

К

у

у

У

2.5

40 80. 120 160 2Ö0 Номер фракции

0.51-5 0.4

1

0.3 0.2

0.5

0.1

0 о

[CHjCN], %

1А1а

2Gly

60

0 10 20 30 40 50 60

мин

Рис. 3. Ионообменная хроматография полипептидов фракций пика 1 (рис. 2), обладающих гемолитической активностью, на колонке (2.6x50 см) с целлюлозой СМ-32 в градиенте концентрации NaCl (0-0.5 М) в 0.01 М аммоний-ацетатном буфере, pH 6.0. Скорость элюции 24 мл/ч. Объем фракций 10 мл. Пунктиром отмечены границы фракций, проявляющих Аг-фосфолипазную активность. Сплошной линией отмечены границы фракций, проявляющих гемолитическую активность.

Рис. 4. ВЭЖХ цитолизинов 3 пика (рис 3) на колонке (4.6x250 мм) с обращенной фазой Nucleosil Ci8 в градиенте концентрации ацетонитрила (5-60%) в 0.1% трифторуксусной кислоте за 60 мин. Скорость элюции 1 мл/мин. Отмечены границы фракций, проявляющих гемолитическую активность.

Для аминокислотного состава Oulactis цитолизинов (табл. 3) характерно высокое содержание неполярных аминокислот, наличие четырех остатков триптофана, отсутствие остатков цистеина. Таким образом, наблюдается высокая степень гомологии с

аминокислотным составом сфингомиелинингибируемых цитолизинов второй группы, причем наибольшее подобие - с эквинатоксинами II и V из актинии A equina, представителя семейства Actiniidae, к которому принадлежит также О. orientalis.

Таблица 3

Аминокислотный состав цитолизинов (число остатков на 1 моль белка)

Аминокислота Oulactis цитолизины Or-A Or-G Equina цитолизины II V Stihodactyla цитолизины I II III IV Radianthus цитолизины AGS

Азх 14 13 18 21 18 14 15 19 16 16 17

Thr 11 9 9 11 9 9 9 9 8 11 6

Ser S 9 И 12 13 И 10 12 10 10 10

Glx 10 11 9 9 9 10 9 12 10 10 10

Pro 5 5 5 5 5 5 5 7 5 4 5

Й Cys 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Gly 18 24 20 20 21 20 18 23 21 20 20

Ala 24 21 17 14 12 14 13 15 14 14 17

Val 9 11 15 16 9 10 10 10 9 8 9

Met 4 5 3 5 5 5 5 5 5 6 6

lie 6 7 8 8 6 6 7 8 7 7 8

Leu 14 14 16 16 10 10 12 13 12 12 11

Tyr 10 11 11 10 12 9 10 10 10 10 10

Phe 6 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6

Trp 4 4 5 4 4 4 4 3 4 4 4

Lys 12 10 10 8 10 10 10 11 11 12 8

His 3 5 5 5 0 1 1 1 2 2 2

Arg g 9 11 9 8 8 7 8 7 6 7

Число a.o. 166 173 179 179 201 151 150 171 157 158 156

N-

концевая амино- Ala Gly Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ser

кислота

M (Да)* 18000 18000 20000 20000 17600 17600 17600 17500 20000 20000 20000

Приведены средние значения, полученные из двух экспериментов при гидролизе в течение 24 ч (результаты 48- и 72-часовых гидролизов аналогичны);

* Молекулярная масса по данным вОв-электрофореза.

Индивидуальные Ои1асНя цитолизины, подобно цитолизинам тропических видов актиний, не проявляют Аг-фосфолипазную активность. В процессе выделения цитолизинов

полипептиды с А2-фосфолипазной активностью отделяются на стадии ионообменной хроматографии (рис. 3, пик 1).

Гемолитическая активность Ог-А и Ог-О, определенная на эритроцитах мышей, составляет 295.86 и 322.58 ГЕ/мг белка, соответственно, что на два порядка ниже активности цитолизинов тропических видов актиний. Прединкубация Ои1асН$ цитолизинов с экзогенным сфингомиелином приводит к полной потере их гемолитической активности. Таким образом, они, подобно цитолизинам тропических видов актиний, относятся к группе сфингомиелинингибируемых цитолизинов, которые являются каналоформерами.

Исследование мембранотропного действия Ом/ас(/'л- цитолизинов проведено на бислойных липидных мембранах (БЛМ), содержащих сфингомиелин, с использованием суммы Ог-А и Ог-О. При добавлении цитолизинов в водную фазу наблюдались дискретные флуктуации тока (рис. 5), характерные для действия актинопоринов, образующих в мембранах ионные каналы Было показано, что интегральная проводимость БЛМ, индуцированная Ои1асНх цитолизинами, возрастает с увеличением содержания сфингомиелина в мембранах. Также было обнаружено, что при рН среды 8.0 проводимость каналов выше, чем при рН 7.2, ранее подобная зависимость была отмечена для актинопоринов тропических видов актиний. Мембранотропная активность Ог-А и Ог-в проявляется при концентрациях (300-1000 нг/мл), сравнимых с действующими концентрациями актинопоринов тропических видов актиний, с увеличением мембранного потенциала действующие концентрации полипептидов уменьшаются (рис. 5).

Размер пор, формируемых в БЛМ Ои1ас11я цитолизинами, значительно меньше, чем пор, образуемых в мембранах актинопоринами тропических видов актиний. Как показал

анализ флуктуаций тока, наиболее вероятная проводимость каналов составляет 16, 32 и 40 пСм в 0.1 М №С1 и 168, 240 и 320 пСм в 1 М ЫаС1 при рН 7.2 (рис. 6).

Рис. 5. Проводимость каналов, формируемых Ом/а«« актинопоринами (при двустороннем введении в водную фазу) в моноолеиновых БЛМ, содержащих сфингомиелин. Весовое отношение моноолеин:сфингомиелин равно 10:1, рН среды 7.2. Концентрации ОиШсНь актинопоринов и мембранный потенциал указаны на рисунке.

А

Б

Рис. 6. Гистограммы проводимости каналов, образуемых Oulactis актинопоринами: (А) - в 0.1 М NaCl; (Б) - в 1 М NaCl.

Таким образом, характер действия Oulactis цитолизинов на модельные липидные мембраны подтвердил, что они относятся к группе пороформирующих сфингомиелинзависимых цитолизинов - актинопоринам.

Установление полной аминокислотной последовательности

Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G

Установление аминокислотной последовательности выделенных полипептидов

проведено с использованием современных методов структурной белковой химии и

молекулярной биологии. Автоматическим методом Эдмана установлена аминокислотная

последовательность ЛЛконцевых фрагментов Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G,

ATFRVLAK- и GAIIAGAA-, соответственно. С помощью программы CLUSTALW было

проведено их сравнение с аналогичными фрагментами аминокислотных

последовательностей актинопоринов тропических видов (рис. 7).

Ог-А Or-G RTX-A RTX-SII Hmgl Hmgll StlII Eqtll TnC

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей АЛконцевых фрагментов актинопоринов: Oulactis актинопорины Ог-А, Or-G из О orientalis; Radianthus актинопорины RTX-A, RTX-SII из R macrodactylus; магнификализины I и II (Hmgl, Hmgll) из H magnifica; Stichodactyla цитолизин III (StlII) из S helianthus; эквинатоксин II (Eqtll) из A. equina и тенебросин-С (Тп С) из A. tenebrosa. Идентичные аминокислотные остатки во всех последовательностях отмечены черным цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW.

slkSJIEJJJGJ^ESEV1

Для установления полной аминокислотной последовательности Oulactis актинопоринов были использованы прямые специфичные праймеры к Л^-концевым участкам последовательностей Or-G (Dirl) и Ог-А (Dir2) и обратный праймер (Rev) к высокогомологичному для всех известных последовательностей актинопоринов С-концевому участку (табл. 4).

Таблица 4

Олигонуклеотидные праймеры«, использованные для ПЦР-амплификации

Праймер Структура (5'—>3')

Dirl GCT-ATT-ATT/C/A-GCN-GGN-G

Dir2 ACN-TTC-C/AGN-GTN-CTT/G-GCN-AA

Dir3 ССАЯ-GGT-GCG/A-ACT/G-GGC-G

Rev ATG-CCA-TCC-A/GTT-A/GTC-NCC

♦Синтез всех праймеров, используемых в работе, был осуществлен в НПО "ЕипЮепе" (Москва)

При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами Dirl, Dir2 и Rev в качестве матрицы использована полноразмерная кДНК-библиотека и геномная ДНК актинии О. orientalis. Для выбора оптимальных температурных параметров реакции проведено несколько ПЦР с последовательным повышением температуры отжига праймеров от 40 до 65°С. При электрофоретическом анализе продуктов этих реакций было обнаружено, что наиболее эффективная амплификация фрагментов ожидаемой длины (около 430 п.о. для Or-G и 400 п.о. для Or-А) наблюдается при температуре отжига 60°С, причем неспецифической амплификации при этой температуре не происходит. Полученные в результате амплификации фрагменты клонированы по тупым концам в плазмидный вектор pTZ19R, обработанный эндонуклеазой рестрикции Hindll. Рекомбинантные клоны Escherichia coli штамма DH5<x отобраны при помощи сине-голубой селекции на среде, содержащей X-Gal и IPTG.

Для подтверждения наличия в отобранных клонах рекомбинантной вставки определенной длины применен метод ПЦР "на колониях" с использованием универсальных праймеров. Отобранные этим методом клоны далее секвенировали. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность Or-G (143 а.о.) и Ог-А (135 а.о.) (рис. 8). Ранее Андерлу с соавторами установил, что гены, кодирующие актинопорины, не содержат интроны. Идентичность нуклеотидных последовательностей фрагментов Ог-А и Or-G, полученных амплификацией кДНК и геномной ДНК, показала, что гены, кодирующие актинопорины О. orientalis, также не содержат интроны.

Для установления полной аминокислотной последовательности актинопоринов О. orientalis проведена быстрая амплификация 3'-концов кДНК. В качестве затравок были

использованы стандартные "сар"-праймеры, специфичные праймеры Dirl, Dir2, а также Dir3, кодирующий центральные части аминокислотных последовательностей актинопоринов Or-А и Or-G (табл. 4). Полученные фрагменты имели длину чуть меньше 500 п.о. и состояли из нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент актинопоринов в 98 а.о. и З'-нетранслируемой области, содержащей ро1у(А)-область. ПЦР-фрагменты были клонированы в pTZ19R и секвенированы. На основании полученных нуклеотидных последовательностей были выведены аминокислотные последовательности С-концевых фрагментов актинопоринов. Таким образом, было установлено, что полная аминокислотная последовательность Or-А составляет 165 а.о., a Or-G - 173 а.о. (рис. 8).

Сравнение последовательностей Ог-А и Or-G показало, что процент гомологии между ними составляет 81.2%, а с учетом консервативных замен - 92.1%. Гомология между исследуемыми актинопоринами и эквинатоксинами II-V из A. equina и тенебросином С из А. tenebrosa (данные виды также относятся к семейству Actiniidae) составляет 77-79%, в то время как со стихолизинами I и II из S. helianthus и магнификализином III из Н. magnifica (оба вида принадлежат к семейству Stichodactylidae) гомология составляет 68-70% (рис. 8).

Установление полной аминокислотной последовательности Radianthus актинопорина RTX-A Сравнение ^-концевых фрагментов RTX-A из R. macrodactylus и Oulactis актинопоринов показало, что наиболее высокая степень гомологии наблюдается для RTX-A и Or-G (рис. 7). Для установления полной аминокислотной последовательности RTX-A использованы прямой (Dirl) и обратный (Rev) праймеры, синтезированные для определения последовательности Oulactis актинопоринов (табл. 4).

Из щупалец актинии R macrodactylus выделена тотальная РНК и, с использованием Smart Kit, синтезирована кДНК. При проведении ПЦР с праймерами Dirl и Rev в качестве матрицы использована полноразмерная кДНК-библиотека R. macrodactylus. ПЦР-фрагмент, содержащий около 430 п.о, был клонирован в вектор pBlueScnpt SK+ и секвенирован. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность RTX-A (144 а о.). Для установления полной последовательности RTX-A была проведена быстрая амплификация 3'-концов кДНК R. macrodactylus со специфичными Dirl, Dir3 (табл. 4) и стандартными "сар"-праймерами. Полученные ПЦР-фрагменты клонированы в pTZ19R и секвенированы. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена аминокислотная последовательность С-концевого фрагмента актинопорина. Было установлено, что полипептидная цепь RTX-A состоит из 175 а.о. (рис. 8).

Or-G

Or-A

EqtV

EqtIV

Eqtll

TenC

RTXA

RTXSII

HmglII

HMT

StlI

Stl

Консенсус

Or-G

Or-A

EqtV

EqtIV

Eqtll

TenC

RTXA

RTXSII

HmglII

HMT

StlI

Stl

Консенсус

yfrsgttdvil yfrsgttdvil yfrsgt0dvil yfrsgt: сщь yfrsgt: D№L yfrsgtBdiHl yfrsgttdvil yfrsgttdvil yfrsgttdvil yfrsgttdvil yfrsgttdvil

h* Hi

RjgSSj

vaj :gavgvl

va1 :g®vgvl

va1 [•ggvgvl

va1 rGAVGVL

va1 rGAVGVL

va1 fgavgvl

:gavSal

SF

VF ^AAF

85 77 90 90 90 90 88 90 90 90 88 89

saalagailaGAsltFqvlqkVLgeLGkvsRKIAvGvDNESGgtWTAlNaYFRSGTtDviLPefVPnqKALLYnGqKdtGPVATGaVgvl --»■ -►

AYyMSdGnTLgvmFSvPfDYNwYSNWWdVkvysGkRRADQgMyEdLyYglnPyrGDNGWhqrnLgYGLkmrGfMtSageailelhiska

Rev

Рис. 8. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов актиний. Or-G, Or-A из О. orientalis; Eqtll (код Genbank, Р17723), EqtIV (код Genbank, Q9Y1U9), EqtV (код Genbank, Q93109) из Л. equina; TenC (код Genbank, P17723) из A. tenebrosa; RTX-A, RTX-SII из R. macrodactylus-, HmglII (код Genbank, Q9U6X1), HMT из H. magnifica; Stl (код Genbank, P81662), StlI (код Genbank, P07845) из S. helianthus. Консенсус последовательностей представлен внизу. Идентичные аминокислотные остатки во всех последовательностях отмечены черным цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW. Стрелками отмечены последовательности, используемые для синтеза олигонуклеотидных праймеров.

На наличие нескольких генов, кодирующих последовательности высокогомологичных изоформ Radianthus актинопоринов, указывают различия в аминокислотных последовательностях JV-концевых фрагментов RTX-A, установленных методами молекулярной биологии и автоматическим методом Эдмана (рис. 7, 8). Ранее существование мультигенного семейства у эквинатоксинов было обнаружено Андерлу с соавторами.

При множественном выравнивании аминокислотных последовательностей методом CLUSTLW была обнаружена высокая степень гомологии RTX-A с HmgUI из Н. magmfica (87%) и с StI, StII из S. helianthus (84 и 87%, соответственно). Такая высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей актинопоринов R. macrodactylus с магнификализином и стихолизинами может быть объяснена принадлежностью этих видов актиний, R macrodactylus, Н. magmfica и 5. helianthus, к одному семейству Stichodactylidae (рис. 8).

Исследование структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов

Согласно существующей гипотезе, основанной на экспериментальных данных, механизм действия актинопоринов включает две стадии, первая из которых - связывание молекулы с мембраной с помощью сайта связывания (триптофанобогащенный участок), а вторая - проникновение в липидный бислой iV-концевого фрагмента (10-28 а.о.). Определение локализации функционально важных участков Oulactis и Radianthus актинопоринов было проведено методами компьютерного моделирования. С помощью автоматического сервера Swiss-model (http://expasy.org/swiss-model) и программы SPDBV (http://expasy.org/spdbv/) по аминокислотным последовательностям полипептидов предсказаны пространственные структуры Radianthus актинопорина RTX-A и Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G с элементами вторичной структуры, полученными с помощью программы Molmol (рис. 9). В качестве прототипов использованы эквинатоксин II (1IAZ) и стихолизин II (1GWY), кристаллические структуры которых определены Атанасиадисом и Манчено с разрешением 1.9 А и 1.7 А, соответственно. Точность полученных теоретических моделей высока (RSMD<0.5 А) и практически соответствует точности экспериментальных моделей, использованных нами в качестве прототипов. Величина параметров RSMD для Са атомов актинопоринов, принадлежащих одному семейству, составляет менее 0.3 А и не более 0.8 А - у актинопоринов, принадлежащих к разным семействам (табл. 5).

Таблица 5

Величины параметров RSMD (среднеквадратичное отклонение, А) для С„ атомов Oulactis актинопоринов Or-G, Or-A, Radianthus актинопоринов RTX-A, RTX-SII, эквинатоксина II (IIAZ) и стихолизина II (1GWY), рассчитанные с помощью программы SPDBV

Актинопорин 1GWY IIAZ

RTX-A 0,06 0,76

RTX-SII 0,25 0,79

Ог-А 0,57 0,28

Or-G 0,58 0,29

Согласно теоретическим моделям Ои1ас11з и Radianthus актинопорины являются Р-структурированными полипептидами с высоким содержанием неупорядоченной структуры (табл. 6). Молекулы состоят из жестко сформированного кора, образованного 12 антипараллельными Р-стрэндами и двумя короткими а-спиралями, расположенными на противоположных сторонах Р-кора (рис. 9). Две р-петли (р-шпильки) расположены вне Р-кора молекулы (нижняя часть молекул на рис. 9) Вблизи одной из петель расположен участок, обогащенный остатками триптофана ТгрЮЗ, Тгр104 (Ог-А), Тф 111, Тгр112 (Ог-в) и Тгр114, Тф115 (ЯТХ-А), которые экспонированы наружу Р-кора молекулы. Остальные петли и С-концевой участок формируют плоскую поверхность на вершине молекулы (рис. 9) Основные различия в визуализированных пространственных структурах Ог-О, Ог-А и ИТХ-А наблюдаются в а-спирапьных А'-концевых фрагментах молекул.

Таблица 6

Содержание элементов вторичной структуры Oulactis актинопоринов Ог-G, Ог-А, Radianthus актинопорина RTX-A, эквинатоксина II (1IAZ) и стихолизина II (1GWY)

Актинопорин Р-структура, % a-спираль (Зю a-спираль), % неупорядоченная структура, %

1IAZ 47.5 9.5(1.7) 47.5

1GWY 47.4 10.3(1.7) 40.1

Ог-А 48.2 10.0 (0) 40.8

Or-G 47.7 9.9(1.7) 39.5

RTX-A 48.0 10.3(1.7) 38.9

Рис. 9. Ленточные диаграммы структур актинопоринов Or-G (А), Ог-А (Б) и RTX-A (В), полученные с помощью сервера SWISS-MODEL, показывающие элементы вторичной структуры и локализацию аминокислотных остатков триптофана.

Таким образом, анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур Or-G, Ог-А и RTX-A подтверждает, что вариабельными участками молекул актинопоринов являются N- и С-концевые фрагменты, тогда как центральная часть молекул наиболее консервативна (рис. 8, 9). В аминокислотных последовательностях JV-концевых участков RTX-A, RTX-SII, Stil и Hmglll присутствуют только консервативные замены и их количество незначительно, что позволяет объяснить близкие значения гемолитической активности: 3.5х104, З.бхЮ4, 3.14х104 и З.ЗхЮ4 ГЕ/мг для RTX-A, RTX-SII, Stil и Hmglll, соответственно. Вместе с тем процент гомологии аминокислотной последовательности RTX-A с последовательностями актинопоринов актиний, принадлежащих к другому

семейству (Actiniidae), значительно меньше (64-67%). В их jV-концевых участках присутствует 12 неконсервативных замен и величина активности RTX-A и ТпС отличается на порядок (1.7х 105 ГЕ/мг для ТпС).

ЛМСонцевые фрагменты аминокислотных последовательностей Oulactis актинопоринов не только высоко вариабельны, но и значительно усечены, От-А укорочен на 13 а.о., a Or-G - на 5 а.о. по сравнению с последовательностями актинопоринов тропических видов (рис. 8). По-видимому, низкую гемолитическую активность Oulactis актинопоринов (295.86 ГЕ/мг для Ог-А и 322.58 ГЕ/мг для Or-G) можно объяснить отсутствием у молекул нескольких Л'-концевых аминокислотных остатков. Данное предположение подтверждается результатами исследований мутантных форм эквинатоксина II, проведенных Андерлу с соавторами. Ими было установлено, что отсутствие первых 5 или 10 аминокислотных остатков в мутантных формах актинопорина уменьшает их гемолитическую активность на 31 и 89 %, соответственно, а эквинатоксин II без 33 JV-концевых остатков теряет ее полностью. Можно предположить, что длина а-спирального фрагмента молекулы актинопорина играет важную роль в формировании в липидном бислое поры, проницаемой для ионов калия.

Общей закономерностью для некоторых групп пороформирующих токсинов, включая сфингомиелинингибируемые актинопорины, является наличие ароматического кластера (триптофанобогащенного участка), выполняющего функцию сайта связывания с мембраной клетки-мишени. Предполагается, что эти остатки участвуют в связывании молекулы не только с липидными головками, но и жирнокислотными цепями. Амфифильный характер индольного кольца триптофана способствует «заякориванию» молекулы актинопорина в мембране в результате электростатических взаимодействий и образования водородных связей. Рядом авторов показано, что в связывании молекул Eqtll с липидной мембраной участвуют Тгр112, ТгрПб, Тгр117 и наиболее критичным для сайта связывания является Trpl 12, так как замена этого остатка на фенилаланин почти полностью предотвращает связывание молекулы с мембраной, вследствие чего происходит потеря актинопорином гемолитической активности. При сравнении аминокислотных последовательностей Oulactis и Radianthus актинопоринов и Eqtn видно, что в положениях 103, 104 в Or-A, 111, 112 в Or-G и 114, 115 в RTX-A находятся остатки Тгр (соответствуют остаткам ТгрПб, Trpl 17 в Eqtll) Эти остатки экспонированы наружу и могут входить в сайт связывания молекул с мембраной (рис 8, 9). Положению Trpl 12 в Eqtll соответствуют

Ьеи99 в Ог-А, Ьеи107 в Ог-в, Ьеи110 в ШХ-А, Ьеи112 в ЯТХ-вН и а также РЬе 112 в Нгг^Ш и НМТ (рис. 8). Несмотря на это все актинопорины, кроме Ои/лс/и актинопоринов, проявляют высокую гемолитическую активность. По-видимому, аминокислотный остаток в данном положении не имеет принципиальной важности для связывания этих актинопоринов с мембраной, что не согласуется с данными, полученными в результате сайт-направленного мутагенеза этого остатка ЕцШ (Тгр112РЬе) Наличие таких противоречий свидетельствует о необходимости продолжения исследований структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Однозначного мнения о механизме действия этих пороформирующих токсинов до сих пор не существует и в настоящее время гипотеза двухступенчатого механизма подвергается проверке Для выяснения молекулярных основ механизма действия актинопоринов необходимо уточнить роль не только Л'-концевого и триптофанобогащенного участков молекул, но и определить, участвуют ли в его реализации С-концевой спирализованный участок и {^-шпильки.

Выводы

1. Проведен скрининг актиний Японского и Охотского морей с целью поиска биологически активных полипептидов, обладающих цитолитической активностью, в результате которого определен перспективный для дальнейших исследований вид О опемаШ, широко распространенный в бореальных водах.

2. Из актинии О опемаИь выделены два полипептида (Ог-А и Ог-О), которые, согласно их физико-химическим характеристикам, липидной специфичности и механизму действия, отнесены к группе сфингомиелинингибируемых цитолитических полипептидов актиний -актинопоринам.

3. Методами молекулярной биологии установлены полные аминокислотные последовательности Ои1асИз актинопоринов Ог-А (165 а.о.) и Ог-С (173 а о.) и ¡{асИамНш актинопорина ЯТХ-А (175 а.о.).

4. Методом сравнительного моделирования по аминокислотной последовательности полипептидов предсказаны пространственные структуры Ог-А, Ог-й и №ГХ-А, которые, за исключением Л'-концевых фрагментов молекул, имеют высокую степень подобия со структурами актинопоринов, установленными экспериментально.

5. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей ОиЬсИя актинопоринов Ог-А и Ог-в и ИасНапЛи^ актинопорина ЯТХ-А подтвердил важность Л'-концевых а-спирапьных фрагментов молекул актинопоринов для проявления ими гемолитической активности.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Il'ina А.Р., Monastymaya М.М., Zykova Т.А., Kozlovskaya E.P. The biologically active polypeptides from the sea anemone Anthopleura orientalis II 3rd European Conference on Marine Natural Products' book of abstr. - Elmau Castle, Bavaria, Germany 2002. P 59.

2. Клышко E.B., Ильина А.П., Монастырная M.M., Бурцева Ю.В., Костина Е.Е., Зыкова Т.А, Мензорова Н.И, Козловская Э П. Биологически активные полипептиды и гидролитические ферменты в актиниях низкобореальных вод // Биология моря. 2003. Т. 29, №З.С. 189-194.

3. Козловская Э.П., Клышко Е.В., Ильина А.П., Исаева М.П., Гузев К.В., Зыкова Т.А., Монастырная М.М. Цитолизины актиний // Объединенная международная научная конференция «Новая геометрия природы»: сб. расш. тез. докл. - Казань. 2003. Т.Н. Биология. Медицина. С. 179-183.

4. Il'ina A., Lipkin A., Barsova Е., Monastymaya М., Likhatskaya G., Kozlovskaya Е., Luk'yanov S. cDNA Cloning Actinoporin from Sea Anemone Radianthus macrodactylus II International Symposium Chemistry & Biology of Marine Organisms: book of abstr - Kolympari, Crete, Greece. 2003. P. 107.

5. Клышко E.B., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.В., Крыжко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. 2004. Т. 115, № 3. С. 45-53.

6. Klyshko E.V., Isaeva М.Р., Monastymaya М.М., Il'ina A.P., Guzev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actiniporins from the sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2004. Vol. 44. P. 315-324.

7. Ильина А.П., Монастырная M.M., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39-

8 Il'ina A., Monastymaya М, Isaeva М., Guzev К, Likhatskaya G., Kozlovskaya Е cDNA Cloning Actinoporins from Sea Anemone Oulactis orientalis II XI International Symposium on Marine Natural Products: proceed. - Sorrento, Italy. 2004. P. 43.

9. Ильина А.П., Монастырная M.M., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis II Биоорган, химия. 2005. Т. 31, №4.

48.

Соискатель

Ильина А.П

ЗАО «Фартроп» г Владивосток. > л Алеутская. 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 15.03.2005

02.00 РНБ Русский фонд

2005-4 40945

( ¡Í h \J : I /

12 MAP 20054

Список сокращений.

Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ).

2.2. Структура и механизм действия а-пороформирующих токсинов.

2.2.1. Колицин.

2.2.2. Актинопорины.

2.2.2.1. Первичная структура актинопоринов.

2.2.2.2. Вторичная и третичная структура актинопоринов.

2.2.2.3. Механизм действия актинопоринов.

2.3. (З-Пороформирующие токсины.

2.3.1. Холестеринзависимые цитолизины.

2.3.2. Стафилококковый а-гемолизин.

2.3.3. Антиген сибирской язвы.

2.4. Пороформирующие антимикробные пептиды.

2.4.1. Механизм трансмембранного действия антимикробных пептидов.

2.4.2. Секропины.

2.4.3. Магаинины.

2.4.4. Дермасептины.

2.4.5. Мелиттин.

2.4.6. Аламетицин.

2.4.7. Пардаксин.

Одной из фундаментальных задач физико-химической биологии является выяснение молекулярных основ функционирования биологических мембран, выполняющих ряд важнейших для клеток функций. Мембрана является границей раздела в клеточной компартментализации, через нее осуществляются контакты клеток друг с другом и с окружающей средой, она также защищает клетку от действия агрессивных факторов окружающей среды. Важное направление в современных исследованиях составляет изучение механизмов транспорта ионов и метаболитов через мембраны, липид-белковых и белок-белковых взаимодействий в мембране, играющих ключевую роль в ряде биологических процессов. Многие из этих процессов жизненно важны для клеток, а некоторые из них ответственны за их гибель. Общепризнанными и универсальными инструментами в этих исследованиях являются а- и (3-пороформирующие токсины (ПФТ), группа цитолитических полипептидов и белков, продуцируемая как прокариотическими, так и эукариотическими клетками. ПФТ многих бактерий являются инвазивными факторами ряда опасных заболеваний, что и предопределяет необходимость всестороннего изучения их структуры и механизма действия.

Наиболее изученными представителями ПФТ, наряду с холестеринингибируемыми цитолизинами грамположительных бактерий, являются сфингомиелинингибируемые цитолизины актиний — актинопорины. Уникальная пространственная организация и способность формировать в мембранах поры лежат в основе антиопухолевой, кардиостимулирующей, антипаразитарной и других видов биологической активности актинопоринов, т.е. ПФТ являются перспективными соединениями для создания новых лекарственных препаратов.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная работа посвящена поиску, изучению физико-химических свойств, установлению структурно-функциональных взаимоотношений актинопоринов тропической актинии Radianthus macrodactylus и актинии Японского моря Oulactis orientalis.

2. Литературный обзор

Цитолитические токсины белковой природы продуцируют бактерии, насекомые, ядовитые рептилии, жалящие морские беспозвоночные. К настоящему времени охарактеризовано более 300 белковых токсинов и, по крайней мере, треть из них действует, разрушая клеточные мембраны [1]. Многие из этих токсинов формируют поры в клеточных мембранах, что приводит к дезорганизации их структуры и, в конечном итоге, к потере морфологической и функциональной целостности клеток (рис. 1). Поэтому в настоящее время токсины, обладающие мембранолитическим действием, принято называть пороформирующими токсинами (ПФТ).

5. Выводы

1. Проведен скрининг актиний Японского и Охотского морей с целью поиска биологически активных полипептидов, обладающих цитолитической активностью, в результате которого определен перспективный для дальнейших исследований вид О. orientalis, широко распространенный в бореальных водах.

2. Из актинии О. orientalis выделены два полипептида (Or-А и Or-G), которые, согласно их физико-химическим характеристикам, липидной специфичности и механизму действия, отнесены к группе сфингомиелинингибируемых цитолитических полипептидов актиний - актинопоринам.

3. Методами молекулярной биологии установлены полные аминокислотные последовательности Oulactis актинопоринов Ог-А (165 а.о.) и Or-G (173 а.о.) и Radianthus актинопорина RTX-A (175 а.о.).

4. Методом сравнительного моделирования по аминокислотной последовательности полипептидов, предсказаны пространственные структуры Ог-А, Or-G и RTX-A, которые, за исключением //-концевых фрагментов молекул, имеют высокую степень подобия со структурами актинопоринов, установленными экспериментально.

5. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей Oulactis актинопоринов Ог-А и Or-G и Radianthus актинопорина RTX-A подтвердил важность //-концевых а-спиральных фрагментов молекул актинопоринов для проявления ими гемолитической активности.

2.5. Заключение

Уникальная способность ПФТ одновременно находиться в двух взаимно несовместимых состояниях определяет то, что в водорастворимом состоянии, токсин транспортируется от продуцирующей его клетки к клетке- мишени, а в мембраносвязанном - токсин проявляет свое лирическое действие на клетку-мишень [6|. В водорастворимом состоянии у а-ПФТ гидрофобный а-спирализованпый транс мембранный регион скрыт внутри глобулы молекулы. Его конформация адаптирована к внешнему окружению как в растворимом, гак и в мембраносвязанном состоянии молекулы. В противоположность а-ПФТ, трансмембранные регионы ПФТ находится в водной среде в различных крнформэцИРнНЫ* МР^'^КУЛ.

Для перехода молекулы токсина в связанное с мембраной состояние существует соответствующий «пусковой механизм» (например, протеолиз защитного антигена сибирской язвы), инициирующий перестройку гидрофобных трансмембранных регионов в Р-шпильки, которые способны включаться в мембрану. Эти шпильки образуют пары со шпильками соседних протомеров олигомера, внедряющегося в мембрану.

Ряд особенностей структуры молекулы, которые присущи представителям обоих семейств ПФТ, облегчают взаимодействие токсинов с мембраной:

1) способность изменять конформацию при низких значениях рН (колицин А, дифтерийный токсин, эквинатоксин, защитный антиген сибирской язвы);

2) наличие полостей внутри глобулы молекулы, которые ускоряют ее конформационные изменения (колицины, перфринголизин О);

3) локализация ароматических аминокислотных остатков на поверхности молекулы токсина (эквинатоксины, стафилококковый а-гемолизин, перфринголизин О), что способствует взаимодействию токсина с мембраной.

Токсины обоих структурных семейств могут формировать поры, как в биологических, так и в модельных мембранах различного состава, что указывает на незначительную роль рецепторного взаимодействия токсина с мембраной. Исключением являются холестеринзависимые цитолизины.

Всестороннее исследование структуры и функции всех групп пороформирующих токсинов является не только важной фундаментальной задачей, но и необходимо с прикладной точки зрения, так как позволяет создать предпосылки к получению методами молекулярной биологии новых высокоспецифичных лекарственных препаратов на их основе.

ПФТ в настоящее время широко используются в биологических, биотехнологических и биомедицинских исследованиях. Их химическое и функциональное разнообразие обеспечивает огромный ресурс фармакологических инструментов, которые могут быть применены для изучения ключевых клеточных процессов и физиологических явлений, липид-белковых и белок-белковых взаимодействий, идентификации определенных аминокислотных остатков или областей в белках, которые являются существенными для их функции. Например, с помощью а-гемолизина были построены УФ-светочувствительные поры, поры, чувствительные к протеазам, металл-чувствительные поры и поры, чувствительные к определенным органическим молекулам [6]. В некоторых случаях пороформирующие токсины могут быть использованы как антибактериальные, противовирусные, антиопухолевые препараты. Таким образом, все вышеперечисленное стимулирует всестороннее исследование структуры и функции этой группы пороформирующих токсинов.

3. Результаты и обсуждение

Пороформирующие токсины продуцируют не только наземные виды животных . (рептилии, насекомые, бактерии и др.), но и морские гидробионты, такие как актинии.

Актинии относят к простейшему уровню организации и вместе с медузами и кораллами образуют тип кишечнополостные (Coelenterata), который насчитывает около 9000 видов. Характерной особенностью кишечнополостных является наличие стрекательных клеток (книдобластов или нематоцистов), вырабатывающих ядовитый секрет, который защищает их от врагов, и с помощью которого они добывают пищу [189]. Секрет состоит из биологически активных полипептидов: нейротоксинов, модифицирующих воротный механизм натриевых каналов электровозбудимых мембран; цитотоксинов, вызывающих лизис цитоплазматических мембран клеток эукариот; протеолитических ферментов и высоко- и низкомолекулярных ингибиторов протеиназ, биологическая роль которых в актиниях во многих случаях пока не ясна [36, 76, 190].

Показано, что цитолизины являются перспективными противоопухолевыми ^ соединениями [30, 191]. Поиск продуцентов новых актинопоринов среди тропических актиний и актиний, обитающих в холодных водах Японского и Охотского морей, сравнительное изучение их структуры позволит получить новые инструменты исследования молекулярной организации биологических мембран, а также проверить гипотезу, согласно которой актинопорины являются родовыми хемотаксономическими маркерами актиний.

3.1. Поиск биологически активных полипептидов в актиниях Японского и Охотского морей

Наше внимание было направлено на поиск новых источников актинопоринов среди актиний Японского и Охотского морей. С этой целью нами был проведен скрининг нескольких видов актиний, собранных в 27 экспедиционном рейсе НИС щ

Академик Опарин» в Охотском море в районе южного Сахалина и в заливе Посьета Хасанского района (табл. 3). Видовая принадлежность актиний была определена сотрудником Института биологии моря ДВО РАН (г. Владивосток) к.б.н. Костиной Е.Е.

Как известно, наряду с цитолизинами актинии продуцируют нейротоксины и ингибиторы протеиназ. Содержание цитолизинов, нейротоксинов и ингибиторов трипсина было определено в водных и этанольных экстрактах актиний. Самую высокую токсичность проявили этанольные экстракты Cribrinopsis similis и Stomphia sp. (ЛД5о = 36.55 и 53.36 мг/кг, соответственно). Этанольные экстракты остальных видов имели слабовыраженную токсичность (ЛД50 ~ 200-400 мг/кг). Обычно токсичность этанольных экстрактов актиний связывают, в основном, с действием нейротоксинов [76], вызывающих нарушение сердечной деятельности и остановку сердца экспериментальных животных (так ЛД50 нейротоксина RmlH из тропической актинии R. macrodactylus составляет 20 мкг/кг) [192] и, в меньшей степени, с цитолизинами [193, 194]. Поскольку в этанольных экстрактах исследуемых видов актиний Охотского и Японского морей гемолитическая активность не была обнаружена, можно предположить, что токсическое действие на экспериментальных животных оказывают нейротоксины. Водные экстракты актиний Actinostola callosa, Stomphia sp., Stomphia coccinea, Oulactis orientalis (залив Анива) не были токсичны (табл. 3). Интересно, что токсичность водных экстрактов актиний Actinostola sp., Metridium senile Jimbriatum, О. orientalis (залив Посьета) оказалась в два раза выше, чем соответствующих этанольных. Невысокую, в целом, токсичность водных экстрактов актиний можно объяснить, по-видимому, действием цитолизинов.

Ранее был определен уровень нейро- и цитолизинов в этанольных и водных экстрактах 21 вида актиний Индийского океана (Сейшельские и Мальдивские острова, о-в Мадагаскар, о-в Маврикий) и Карибского моря [195]. Оказалось, что токсичность этанольных и водных экстрактов актиний бореальных вод на 2-3 порядка ниже, чем токсичность экстрактов тропических видов актиний.

Показано, что все водные экстракты актиний бореальных вод обладают гемолитической активностью (табл. 3). Но, как и в случае с нейротоксинами, даже самый высокий уровень активности, проявляемой актиниями С. similis и О. orientalis (залив Посьета) (64.93 и 5.68 ГЕ/мг, соответственно), был в несколько раз ниже, чем водных экстрактах актиний, распространенных в тропических водах (табл. 1).

1. Alouf J.E. Pore-forming bacterial toxins: an overview // Pore-Forming Toxins. Springer, Heidelberg, Germany: van der Goot F.G. 2001. P. 1-14.

2. Lakey J.H., Slatin S.L. Pore-forming colicins and their relatives // Pore-Forming Toxins. Springer, Heidelberg, Germany: van der Goot F.G. 2001. P. 131-161.

3. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa 3.0 A at resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 1310-1324.

4. Li J., Carrol J., Ellar D.J. Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution //Nature. 1991. Vol. 353. P. 815-821.

5. Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M., Kantardjieff K.A., Collier R.J., Eisenberg D. The crystal structure of diphtheria toxin // Nature. 1992. Vol. 357. P. 216-222.

6. Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. Vol. 88. P. 91-142.

7. Wiener M., Freymann D., Ghosh P., Stroud R.M. Crystal structure of colicin la. // Nature. 1997. Vol. 385. P. 461-464.

8. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. Vol. 274. P. 1859-1866.

9. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen //Nature. 1997. Vol. 385. P. 833-838.

10. Rossjohn J., Feil S.C., McKinstry W.J., Tweten R.K., Parker M.W. Structure of a cholesterol-binding, thiolactivated cytolysin and a model of its membrane form // Cell. 1997. Vol. 89. P. 685-692.

11. Parker M.W. Cryptic clues as to how water-soluble protein toxins form pores in membranes // Toxicon. 2003. Vol. 42. P. 1-6.

12. Parker M.W., Postma J.P., Pattus F., Tucker A.D., Tsernoglou D. Refined structure of the pore-forming domain of colicin A at 2.4 A resolution // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 224. P. 639-657.

13. Parker M.W., Tucker A.D., Tsernoglou D., Pattus F. Insights into membrane insertion based on studies of colicins // Trends Biochem. Sci. 1990. Vol. 15. P. 126-129.

14. Duche D., Parker M.W., Gonzalez-Manas J.M., Pattus F., Baty D. Uncoupled steps of the colicin A pore formation demonstrated by disulfide bond engineering // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 6332-6339.

15. Lakey J.H., Duche D., Gonzalez-Manas J.M., Baty D., Pattus F. Fluorescence energy transfer distance measurements. The hydrophobic helical hairpin of colicin A in the membrane bound state//J. Mol. Biol. 1993. Vol. 230. P. 1055-1067.

16. Zakharov S.D., Lindberg M., Griko Y., Salamamon Z., Tollin G., Prendergast F.G., Cramer W.A. Membrane-bound state of the colicin El channel domain as an extended two-dimensional array // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 4282-4287.

17. Lindberg M., Zakharov S.D., Cramer W.A. Unfolding pathway of the colicin El channel protein on a membrane surface // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 295. P. 679-692.

18. Muga A., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F.P., Surewicz W.K. pH-dependent stability and membrane interaction of the pore-forming domain of colicin A // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 1553-1557.

19. Evans L.J.A., Goble M.L., Hales K., Lakey J.H. Different sensitivities to acid denaturation within a family of proteins: implications for acid unfolding and membrane translocation//Biochemistry. 1996. Vol. 35 P. 13180-13185.

20. Baty D., Lakey J., Pattus F., Lazdunski C. A 136-amino-acid residue COOH-terminal fragment of colicin A is endowed with ionophoric activity // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 189. P. 409-413.

21. Levinthal F., Todd A.P., Hubbel W.L., Levinthal C. A single tryptic fragment of colicin El can form an ion channel: stoichiometry con.rms kinetics // Proteins. 1991. Vol. 11. P. 254-262.

22. Tory M.C., Merrill A.R. Adventures in membrane protein topology. A study of the membrane bound state of colicin El // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 24539-24549.

23. Kem W.R. Sea anemone toxins: structure and action // The Biology of Nematocysts. Academic Press, New York: Hessinger D. A., Lenhoff H. M. 1988. P. 375-405.

24. Calton G.J. Burnett J.W. Characterization of nematocyst venoms // The Biology of Nematocysts. Academic Press, Inc, San Diego: Hessinger D.A., Lenhoff H.M. 1988. P. 369374.

25. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 111-124.

26. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. 2002. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. Vol. 40. P. 1197-1217.

27. Turk T. Cytolytic toxins from sea anemones // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1991. Vol. 10. P. 223-262.

28. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea-anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 105. P. 121-130.

29. Kem W.R., Dunn B.M. Separation and characterization of four different amino acid sequence variants of a sea anemone (Stichodactyla helianthus) protein cytolysin // Toxicon. 1988. Vol. 26. P. 997-1008.

30. Norton R.S., Macek P., Reid G.E., Simpson R.J. Relationship between the cytolysins tenebrosin-C from Actinia tenebrosa and equinatoxin II from Actinia equina II Toxicon. 1992. Vol. 30. P. 13-23.

31. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo H.E., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica II Toxicon. 1993. Vol. 31. P. 1567-1579.

32. Jiang X.Y., Yang W.L., Chen H.P., Tu H.B., Wu W.Y., Wei J.W., Wang J., Liu W.H, Xu A.L. Cloning and characterization of an acidic cytolysin cDNA from sea anemone Sagartia rosea // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1563-1569.

33. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family //Toxicon. 1999. Vol. 37. P. 1391-1401.

34. Pungercar J., Anderluh G., GubenSek F., Strukelj B. Sequence analysis of the cDNA encoding the precursor of equinatoxin V, a newly discovered hemolysin from the sea anemone Actinia equina II Biochem. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1341. P. 105-107.

35. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., GubenSek F. Cloning, sequencing and expression of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. Vol. 220. P. 437442.

36. Lanio M.E., Morera V., Alvarez C., Tejuca M., Gomez Т., Pazos F., Basada V., Martinez D., Huerta V., Padron G., Chavez M.A. Purification and characterization of two hemolysins from Stichodactyla helianthus И Toxicon. 2001. Vol. 39. P. 187-194.

37. Wang Y., Chua K.L., Khoo H.E. A new cytolysin from the sea anemone, Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning and functional expression // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1478. P. 8-18.

38. Athanasiadis A., Anderluh G., Macek, P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II Structure. 2001. Vol. 9. P. 341-346.

39. Macek P., Belmonte G., Pederzolli C., Menestrina G. Mechanism of action of equinatoxin II, a cytolysin from the sea anemone Actinia equina L. belonging to the family of actinoporins // Toxicology. 1994. Vol. 87. P. 205-227.

40. Heuck A.P., Hotze E.M., Tweten R.K., Johnson A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric beta-barrel protein. Perfringolysin О creates a pore using ordered and coupled conformation changes // Mol. Cell. 2000. Vol. 6. P. 1233-1242.

41. Simpson R.J., Reid G.E., Moritz R.L., Morton C., Norton R.S. Complete amino acid sequence of tenebrosin-C, a cardiac stimulatory and haemolytic protein from sea anemone Actinia tenebrosa II Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 190. P. 319-328.

42. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTALW: improving the senitivity of progressive multiple sequence aligment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acid Res. 1994. Vol. 22. P. 4673-4680.

43. Menestrina G., Cabiaux V., Tejuca M. Secondary structure of sea anemone cytolysins in soluble and membrane bound form by infrared spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 254. P. 174-180.

44. Zhang W., Hinds M.G., Anderluh G., Hanse P.E., Norton R.S. Sequence-specific resonance assignments of the potent cytolysin equinatoxin II // J. Biomol. NMR. 2000. Vol. 18. P. 281-282.

45. Malavasic M., Poklar N., Macek P., Vesnaver G. Fluorescence studies of the effect of pH, guanidine hydrochloride and urea on equinatoxin II conformation // Biochim. Biophys. Acta: Bio-Membranes. 1996. Vol. 1280. P. 65-72.

46. Mancheno J.M., De los Rios V., Del Pozo A.M., Lanio M.E., Onaderra M., Gavilanes J.G. Partially folded states of the cytolytic protein sticholysin II // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1545. P. 122-1531.

47. Poklar N., Volker J., Anderluh G., Macek P., Chalikian T.V. Acid- and base-induced conformational transitions of equinatoxin II // Biophys. Chem. 2001. Vol. 90. P. 103-121.

48. Мабек P., Lebez D. Kinetics of hemolysis induced by equinatoxin, a cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina. Effect of some ions and pH H Toxicon. 1981. Vol. 19. P. 233-240.

49. Doyle J.W., Kem W.R. Binding of a radiolabeled sea anemone cytolysin to erythrocyte membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 987. P. 181-186.

50. Doyle J.W., Kem W.R., Vilallonga F.A. Interfacial activity of an ion channel-generating protein cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1989. Vol. 27. P. 465-471.

51. Michaels D.W. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, I. Formation of transmembrane channels in lipid bilayers // Biochem. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555. P. 67-78.

52. Shin M.L., Michaels D.W., Mayer M.M. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, II. Effect of membrane lipid composition in a liposome system // Biochem. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555. P. 79-88.

53. Руднев B.C., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная M.M., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проницаемость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1. С. 1019-1024.

54. Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus II Докл. АН СССР. 1984. Т. 277. С. 1491-1493.

55. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 467-471.

56. Meinardi E., Florin-Christensen M., Paratcha G., Azcurra J.M., Florin-Christensen J. The molecular basis of the self non self selectivity of a coelenterate toxin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 216. P. 348-354.

57. Caaveiro J.M., Echabe I., Gutierrez-Aguirre I., Nieva J.L., Arrondo J.L.R., Gonzales-Manas J.M. Differential interaction of equinatoxin II with model membranes in response to lipid composition // Biophys. J. 2001. Vol. 80. P. 1343-1353.

58. Macek P., Zecchini M., Stanek K., Menestrina G. Effect of membrane-partitioned n-alcohols and fatty acids on pore-forming activity of a sea anemone toxin // Eur. Biophys. J. 1997. Vol. 25. P. 155-162.

59. Tejuca M., Serra M.D., Ferraras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilisation by sticholysin I, a cytolysin isolated from the venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus И Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 14937-14957.

60. Poklar N., Fritz J., Macek P., Vesnaver G., Chalikian T.V. Interaction of the pore-forming protein equinatoxin II with model lipid membranes: A calometric and spectroscopic study // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 14999-15008.

61. Mouritsen O.G., Jorgensen K., Honger T. Permeability of lipid bilayers near the phase transition // Permeability and Stability of Lipid Bilayers. CRC Press, London: Disalvo E.A., SimonS.A. 1995. P. 137-160.

62. White S.H., Wimley W.C. Hydrofobic interaction of peptides with membrane interfaces II Biochem. Biophys. Acta: Rev. Biomembr. 1998. Vol. 1376. P. 339-352.

63. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Ядовитые кишечнополостные // Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды. Москва: Высшая школа. 1985. С. 36-54.

64. Anderluh G., Pungercar J., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P. TV-terminal truncation mutagenesis of equinatoxin II, a pore-forming protein from the sea anemone Actinia equina II Protein Eng. 1997. Vol. 10. P. 751-755.

65. Malovrh P., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Menestrina G., Anderluh G. Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. J. 2000. Vol. 346. P. 223-232.

66. Anderluh G., Barlic A., Krizaj I., Menestrina G., Gubensek F., Macek P. Avidin-FITC topological studies with three cysteine mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 242. P. 187-190.

67. Anderluh G., Barlic A., Portich C., Macek P. Lysine 77 is a key residue in aggregation of equinatoxin II pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II J. Membrane Biol. 2000. Vol. 173. P. 47-55.

68. Anderluh G., Dalla Serra M., Viero G., Guella G., Macek P., Menestrina G. Pore formation by equinatoxin II, a eukaryotic protein toxin, occurs by induction of nonlamellar lipid structures // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 45216-45223.

69. Turk Т., Macek P., GubenSek F. Chemical modification of equinatoxin II, a lethal and cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina L // Toxicon. 1989. Vol. 27. P. 375-384.

70. Turk Т., Macek P., Gubensek F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1119. P. 1-4.

71. Khoo H.E., Fong C.L., Yuen R., Chen D.C. Stimulation of haemolytic activity of sea anemone cytolysins by 8-anilino-l-naphthalenesulphonate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 232. P. 422-426.

72. Campos A.M., Lissi E.A., Vergara C., Lanio M.E., Alvarez C., Pazos I., Morera V., Garcia Y., Martinez D. Kinetics and mechanism of St I modification by peroxyl radicals // J. Protein Chem. 1999. Vol. 18. P. 297-306.

73. Schiffer M., Edmundson A.B. Use of helical wheels to represent the structures of protein and to identify segments with helical potential // Biophys. J. 1967. Vol.7. P. 121135.

74. Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. The cholesterol-dependent cytolysins // Pore-Forming Toxins. Springer, Heidelberg, Germany: van der Goot F.G. 2001. P. 1-14.

75. Giddings K.S., Johnson A.E., Tweten R.K. Rede.ning cholesterol's role in the mechanism of the cholesteroldependent cytolysins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 11315-11320.

76. Sekino-Suzuki N., Nakamura M., Mitsui K.I., Ohno-Iwashita Y. Contribution of individual tryptophan residues to the structure and activity of y-toxin (perfringolysin-O), a cholesterol-binding cytolysin // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 241. P. 941-947.

77. Jacobs Т., Daiji A., Frahm N., Rohde M., Wehland J., Chakraborty Т., Weiss S. Listeriolysin O: cholesterol inhibits cytolysis but not binding to cellular membranes // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 28. P. 1081-1089.

78. Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. The mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel paradigm for pore-forming toxins // Cell. 1999. Vol. 99. P. 293-299.

79. Petosa C., Liddington R.C. The anthrax toxin // Protein Toxin Structure. R. G. Landes Co., Austin, Texas: Parker, M.W. 1996. P. 97-121.

80. Pezard C., Berche P., Mock M. Contribution of individual toxin components to virulence of Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1991. Vol. 59. P. 3472-3477.

81. Gordan V.M., Klimpel K.R., Arora N., Henderson M.A., Leppla S.H. Proteolytic activation of bacterial toxins by eukaryotic cells is performed by furin and by additional cellular proteases // Infect. Immun. 1995. Vol. 63. P. 82-87.

82. Milne J.C., Furlong D., Hanna P.C., Wall J.S., Collier R.J. Anthrax protective antigen forms oligomers during intoxication of mammalian cells // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 20607-20612.

83. Blaustein R.O., Koehler T.M., Collier R.J., Finkelstein A. Anthrax toxin: channel-forming activity of protective antigen in planar phospholipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 2209-2213.

84. Milne J.C., Collier R.J. pH-dependent permeabilization of the plasma membrane of mammalian cells by anthrax protective antigen // Mol. Microbiol. 1993. Vol. 10. P. 647-653.

85. Benson E.L., Huynh P.D., Finkelstein A., Collier R.J. Identi.cation of residues lining the anthrax protective antigen channel // Biochemistry. 1998. Vol. 37. P. 3941-3948.

86. Papo N., Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? // Peptides. 2003 Vol. 24. P. 16931703.

87. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immun. 1995. Vol. 13. P. 61-92.

88. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. 1981. Vol.292. P. 246-248.

89. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides fromXenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 5449-5453.

90. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin

91. Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 8824-8830.

92. Papo N., Oren Z., Pag U., Sahl H.G., Shai Y. The consequence of sequence alteration of an amphipathic alpha-helical antimicrobial peptide and its diastereomers // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 33913-33921.

93. Habermann E., Jentsch J. Sequence analysis of melittin from tryptic and peptic degradation products Sequence analysis of melittin from tryptic and peptic degradation products Hoppe Seyler's Z // Physiol. Chem. 1967. Vol. 348. P. 37-50.

94. Shai Y., Fox J., Caratsch C., Shih Y.L., Edwards C., Lazarovici P. Sequencing and synthesis of pardaxin, a polypeptide from the Red Sea Moses sole with ionophore activity // FEBS Lett. 1988. Vol. 242. P. 161-166.

95. Mignogna G., Simmaco M., Kreil G., Barra D. Antibacterial and haemolytic peptides containing d-alloisoleucine from the skin of Bombina variegate I IEMBO J. 1993. Vol. 12. P. 4829-4832.

96. Barra D., Simmaco M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides//Trends Biotechnol. 1995. Vol. 13. P. 205-209.

97. Johansson J., Gudmundsson G.H., Rottenberg M.E., Berndt K.D., Agerberth B. Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally-occuring human peptide LL-37//J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 3718-3724.

98. Andreu D., Merrifield R.B., Steiner H., Boman H.G. N-terminal analogues of cecropin A: synthesis, antibacterial activity, and conformational properties // Biochemistry. 1985. Vol.24. P. 1683-1688.

99. Steiner H., Andreu D., Merrifield R.B. Binding and action of cecropin and cecropin analogues: antibacterial peptides from insects // Biochim. Biophys. Acta. 1988. Vol. 939. P. 260-266.

100. Chen H.C., Brown J.H., Morell J.L., Huang C.M. Synthetic magainin analogues with improved antimicrobial activity // FEBS Lett. 1988. Vol. 236. P. 462-466.

101. Zasloff M., Martin В., Chen H.C. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 910-913.

102. Segrest J.P., De L.H., Dohlman J.G., Brouillette C.G., Anantharamaiah G.M. Amphipathic helix motif: classes and properties // Proteins. 1990. Vol. 8. P. 103-117.

103. Мог A., Amiche M., Nicolas P. Structure, synthesis, and activity of dermaseptin b, a novel vertebrate defensive peptide from frog skin: relationship with adenoregulin // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 6642-6650.

104. Gazit E., Lee W.J., Brey P.T., Shai Y. Mode of action of the antibacterial cecropin B2: a spectrofluorometric study//Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 10681-10692.

105. Gazit E., Boman A., Boman H.G., Shai Y. Interaction of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI with phospholipid vesicles // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 1147911488.

106. Wade D., Boman A., Wahlin В., Drain C.M., Andreu D., Boman H.G., Merrifield R.B. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 4761-4765.

107. Bessalle R., Kapitkovsky A., Gorea A., Shalit I., Fridkin M. All-D-magainin: chirality, antimicrobial activity and proteolytic resistance // FEBS Lett. 1990. Vol. 274. P. 151-155.

108. Merrifield E.L., Mitchell S.A., Ubach J., Boman H.G., Andreu D., Merrifield R.B. D-enantiomers of 15-residue cecropin A-melittin hybrids // Int. J. Pept. Protein Res. 1995. Vol. 46. P. 214-220.

109. Shai Y., Oren Z. Diastereoisomers of cytolysins, a novel class of potent antibacterial peptides // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 7305-7308.

110. Oren Z., Hong J., Shai Y. A repertoire of novel antibacterial diastereomeric peptides with selective cytolytic activity//J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 14643-14649.

111. Oren Z., Shai Y. Selective lysis of bacteria but not mammalian cells by diastereomers of melittin: structure-function study // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 1826-1835.

112. Pouny Y., Rapaport D., Мог A., Nicolas P., Shai Y. Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 12416-12423.

113. Ehrenstein G., Lecar H. Electrically gated ionic channels in lipid bilayers // Quart Rev. Biophys. 1977. Vol. 10. P. 1-34.

114. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. //Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. P. 55-70.

115. Matsuzaki K., Murase O., Fujii N., Miyajima K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 6521-6526.

116. Ludtke S.J., He K., Heller W.T., Harroun T.A., Yang L., Huang H.W. Membrane pores induced by magainin // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 13723-13728.

117. Matsuzaki K., Murase O., Fujii N., Miyajima K. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation// Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 11361-11368.

118. Sawyer J.G., Martin N.L., Hancock R.E. Interaction of macrophage cationic proteins with the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa I I Infect. Immun. 1988. Vol. 56. P. 693-698.

119. Piers K.L., Brown M.H., Hancock R.E. Improvement of outer membrane-permeabilizing and Iipopolysaccharide-binding activities of an antimicrobial cationic peptide by C-terminal modification // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. Vol. 38. P. 2311-2316.

120. Piers K.L., Hancock R.E. The interaction of a recombinant cecropin/melittin hybrid peptide with the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12. P. 951-958.

121. Falla T.J., Karunaratne D.N., Hancock R.E.W. Mode of action of the antimicrobial peptide indolicidin // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 19298-19303.

122. Hultmark D., Steiner H., Rasmuson Т., Boman H.G. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia // Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 106. P. 7-16.

123. Boman H.G., Faye I., Gudmundsson G.H., Lee J.Y., Lidholm D.A. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins // Eur. J. Biochem. 1991. Vol. 201. P. 23-31.

124. Hultmark D. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity // Trends Genet. 1993. Vol. 9. P. 178-183.

125. Lee J.Y., Boman A., Sun C.X., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., Boman H.G. Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 9159-9162.

126. Lee W.J., Brey P.T. Isolation and identification of cecropin antibacterial peptides from the extracellular matrix of the insect integument // Anal. Biochem. 1994. Vol. 217. P. 231-235.

127. Lockey T.D., Ourth D.D. Formation of pores in Escherichia coli cell membranes by a cecropin isolated from hemolymph of Heliothis virescens larvae // Eur. J. Biochem. 1996. Vol.236. P. 263-271.

128. Iwai H., Nakajima Y., Natori S., Arata Y., Shimada I. Solution conformation of an antibacterial peptide, sarcotoxin I A, as determined by 1H-NMR // Eur. J. Biochem. 1993. Vol.217. P. 639-644.

129. Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by proton-NMR // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 209. P. 163-169.

130. Frohm M., Gunne H., Bergman A.C., Agerberth В., Bergman Т., Boman A., Liden S., Jornvall H., Boman H.G. Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blister fluid // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 237. P. 86-92.

131. Agerberth В., Gunne H., Odeberg J., Kogner P., Boman H.G., Gudmundsson G.H. FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 195-199.

132. Gudmundsson G.H., Agerberth В., Odeberg J., Bergman Т., Olsson В., Salcedo R. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 238. P. 325-332.

133. Giovannini M.G., Poulter L., Gibson B.W., Williams D.H. Biosynthesis and degradation of peptides derived from Xenopus laevis prohormones II Biochem. J. 1987. Vol. 243. P. 113-120.

134. Gibson B.W., Poulter L., Williams D.H., Maggio J.E. Novel peptide fragments originating from PGLa and the caerulein and xenopsin precursors from Xenopus laevis II J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 5341-5349.

135. Unger Т., Oren Z., Shai Y. The effect of cyclization of magainin 2 and melittin analogues on structure, function, and model membrane interactions: implication to their mode of action // Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 6388-6397.

136. Мог A., Nicolas P. Isolation and structure of novel defensive peptides from frog skin //Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 219. P. 145-154.

137. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 8824-8830.

138. Hernandez С., Мог A., Dagger F., Nicolas P., Hernandez A., Benedetti E.L., Dunia I. Functional and structural damage in Leishmania mexicana exposed to the cationic peptide dermaseptin // Eur. J. Cell Biol. 1992. Vol. 59. P. 414^24.

139. Feder R., Dagan A., Мог A. Structure-activity relationship study of antimicrobial dermaseptin S4 showing the consequences of peptide oligomerization on selective cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 4230^238.

140. Habermann E. Bee and wasp venom: the biochemistry and pharmacology of their peptides and enzymes are reviewed // Science. 1972. Vol. 177. P. 314-322.

141. Dempsey C.E. The actions of melittin on membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1031. P. 143-161.

142. Habermann E., Jentsch J. Sequenzanalyse des Melittins aus den tryptischen und peptischen Spaltstucken // Hope-Seylers Z. Physiol. Chem. 1967. Vol. 348. P. 37-50.

143. Terwilliger T.C., Weissman L., Eisenberg D. The structure of melittin in the form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities // Biophys. J. 1982. Vol. 37. P. 353-361.

144. Lubke K., Matthes S., Kloss G. Isolation and structure of N 1 -formyl melittin // Experientia. 1971. Vol. 27. P. 765-767.

145. Gauldie J., Hanson J.M., Rumjanek F.D., Shipolini R.A., Vernon C.A. The peptide components of bee venom // Eur. J. Biochem. 1976. Vol. 61, № 2. P. 369-76.

146. Dawson C.R., Drake A.F., Helliwell J., Hider R.C. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 510, № 1. P. 75-86

147. Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L., Huang H.W. Barrel-Stave Model or Toroidal Model? A Case Study on Melittin Pores // Biophys. J. 2001. Vol. 81 P. 1475-1485

148. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride // Experientia. 1967. Vol. 23. P. 85-86.

149. Pandery R.C., CookJ. C., Rinehart K.L. Structures of the peptide antibiotics. Emerimicins III and IV 1,2 // J. Am. Chem. Soc. 1977. Vol. 99. P. 8469-8483.

150. Fox R.O., Richards F.M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5 A resolution // Nature. 1982. Vol. 300. P. 325-330.

151. Jones L.R., Besch H.R. Jr., Watanabe A.M. Monovalent cation stimulation of Ca2+ uptake by cardiac membrane vesicles // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252, № 10. P. 3315-3323.

152. Mathew M.K., Balaram P. Alamethicin and related membrane channel forming polypeptides // Mol. Cell Biochem. 1983. Vol. 50, № 1. P.47-64.

153. Lazarovici P., Primor N., Loew L.M. Purification and pore-forming activity of two hydrophobic polypeptides from the secretion of the Red Sea Moses sole (Pardachirus marmoratus) // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 16704-16713.

154. Zagorski M.G., Norman D.G., Barrow C.J., Iwashita Т., Tachibana K, Patel D.J. Solution structure ofpardaxin P-2 // Biochemistry. 1991. Vol. 30.P. 8009-8017.

155. Porcelli F., Buck В., Lee D.K., Hallock K.J., Ramamoorthy A., Veglia G. Structure and orientation of pardaxin determined by NMR experiments in model membranes // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 44. P. 45815-45823.

156. Shai Y., Bach D., Yanovsky A. Channel formation properties of synthetic pardaxin and analogues // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 20202-20209.

157. Shai Y. Pardaxin: channel formation by a shark repellant peptide from fish // Toxicology. 1994. Vol. 87. P. 109-129.

158. Oren Z., Shai Y. A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus II Eur. J. Biochem .1996. Vol. 237. P. 303-310.

159. Halstead B.W. Poisonous and venomous marine animals of the world. Princeton, New York: Darwin Press. 1978. P. 1216.

160. Shiomi K., Ishikawa M., Yamanaka H., Kikuchi T. Isolation and properties of four serine protease inhibitors from water extracts of sea anemone Actinia equine II Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1989. Vol. 55. P. 1235-1241.

161. Pennington M.W., Zadenberg I. Byrnes M.E., Norton R.S., Kem W.R. Synthesis of the cardiac inotropic polypeptide anthopleurin-A // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. Vol. 43. P. 463-470.

162. Зыкова Т.А., Винокуров JT.M., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus И Биорг. химия. Т.11, № 3. С. 302-310.

163. Монастырная М.М., Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1999. Т. 25. С. 733-741.

164. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo H.E., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnified//Toxicon. 1993. Vol. 31. P. 1567-1579.

165. Козловская Э.П., 1990. Токсины морских актиний: структура и функция действия//Диссертация . д.х.н., Владивосток. 1990. 310 с.

166. Аверинцев В.Г. Актинии залива Посьет Японского моря // Исслед. фауны морей. 1967. Т. 5. С. 62-77.

167. Ottaway J.R. Predators of sea anemones // Tautara. 1977. Vol. 22. P. 213-221.

168. Ross D.M. Behavior patterns in associations and interactions with other animals // Coelenterate biology. Academic Press. New York, San Francisco: Muscatine L., Lenhoff H.M. 1974. P. 281-312.

169. Davenport D. Cnidarian symbioses and the experimental analysis of behavior // The Cnidaria an their evolution. Proceed. Symp. Zool. Soc. London. № 16. Academic Press. London: Rees W.J. 1966. P. 361-372.

170. Кусакин О.Г., Иванова М.Б., Цурпало А.П. Список видов животных, растений и грибов литорали дальневосточных морей России. Владивосток: Дальнаука. 1997. С.168.

171. Hessinger D.A., Lenhoff Н.М. Membrane structure and function. Mechanism of hemolysis induced by nematocyst venom: roles of phospholipase A and direct lytic factor // Arch. Biochem. Biophys. 1976. Vol. 173. P.603-613.

172. Mebs D., Gebauer E. Isolation of proteinase inhibitory, toxic and hemolytic polypeptides from a sea anemone, Stoichactis sp. Toxicon. 1980. Vol. 18. P. 97-106.

173. Lenarcic В., Ritonja A., Strukelj В., Turk В., Turk V. Equistatin, a new inhibitor of cysteine proteinases from Actinia equina, is structurally related to thyroglobulin type-1 domain // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 13899-13903.

174. Швец T.B., Монастырная M.M., Зыкова T.A., Козловская ,Э.П., Высокомолекулярные ингибиторы протеиназ из морской актинии Radianthus macrodactylus // Второй Межд. симп. "Химия и химическое образование": Сб. тез. докл. Владивосток. 2000.С. 233.

175. Shiomi К., Ishikawa M., Yamanaka H., Kikuchi Т. Isolation and properties of four serine protease inhibitors from water extracts of sea anemone Actinia equine II Nippon. Suisan. Gakkaishi. 1989. Vol. 55. P. 1235-1241.

176. Клышко E.B., Ильина А.П., Монастырная M.M., Бурцева Ю.В., Костина Е.Е., Зыкова Т.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.ГТ. Биологически активные полипептиды и гидролитические ферменты в актиниях низкобореальных вод // Биол. моря. 2003. Т. 29. С. 189-194.

177. Norton R.S. Structure and function of peptide and protein toxins from marine organisms // J. Toxicol.-Toxin reviews. 1998. Vol. 17. P. 99-130.

178. Зыкова T.A., Монастырная M.M., Апаликова O.B., Швец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из морской актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорг. химия 1998. Т. 24. С. 509-516.

179. Зыкова Т.А., Винокуров JI.M., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность ингибитора трипсина IV из Radianthus macrodactylus II Биорг. химия 1985. Т. 11. С. 293-301.

180. Blumenthal К.М., Kem W.R. Primary structure of Stoichactis helianthus II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 258.P. 5574-5581.

181. Ferlan I., Jackson K.W. Partial amino acid sequence of equinatoxin // Toxicon. 1983. Vol. 21, №3. P. 141-144.

182. Ильина А.П., Монастырная M.M., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика // Биоорг. химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39-48.

183. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. P. 5463-5467.

184. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. The coding region of the equinatoxin II gene lacks introns // Croat. Chem. Acta 1995. Vol. 68. P. 533-542.

185. Koradi R., Billeter М., Wtithrich К. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graphics. 1996. Vol.14. P. 51-55.

186. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis. 1997. Vol.18. P. 2714-2723.

187. Sayle R.A., Milner-White E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends in Biochemical Sciences. 1995. Vol. 20, № 9. P. 374-376.

188. Popot J.L., Engelman D.M. Membrane protein folding and oligomerization: the two-stage model // Biochemistry. 1990. Vol. 29, № 17. P. 4031-4037.

189. Yau W.M., Wimley W.C., Gawrisch K., White S.H. The preference of tryptophan for membrane interfaces // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 42. P. 14713-14718

190. Persson S., Killian J.A., Lindblom G. Molecular ordering of interfacially localized tryptophan analogs in ester- and ether-lipid bilayers studied by 2H-NMR // Biophys. J. 1998. Vol. 75, №3. P. 1365-1371.

191. Jacobs R.E., White S.H. The nature of the hydrophobic binding of small peptides at the bilayer interface: implications for the insertion of transbilayer helices // Biochemistry. 1989. Vol. 28, № 8. P. 3421-3437.

192. Brown J.W., Huestis W.H. Structure and orientation of a bilayer-bound model tripeptide: a proton NMR study // J. Phys. Chem. 1993. Vol. 97, № 12. P. 2967-2973.

193. Landolt-Marticorena С., Williams K.A., Deber C.M., Reithmeier R.A. Non-random distribution of amino acids in the transmembrane segments of human type I single span membrane proteins //J. Mol. Biol. 1993. Vol. 229, № 3. P. 602-608.

194. Yeagle P.L., Lee D.A. Membrane protein structure // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1565, № 2. P.I43.

195. Chattopadhyay A., Raghuraman H. Application of fluorescence spectroscopy to membrane protein structure and dynamics // Current Science. 2004. Vol. 87, № 8. P. 175180.

196. Anderluh G., Razpotnik A., Podlesek Z., Macek P., Separovic F., Norton R.S. Interaction of the Eukaryotic Pore-forming CytolysinEquinatoxin II with Model Membranes: 19F NMR Studies // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 347. P. 27-39

197. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 192. P. 265-275.

198. Vaskovsky V.E., Suppes Z.S. Phospholipases of marine invertebrates. I. Distribution of phospholipase A // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1972. Vol. 43, № 3. P. 601-609.

199. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

200. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology. Acad. Press, New York, London: Hirs C.H.W., Timasheff S.N. 1972. Vol. 25, part B. P. 121139.

201. Беленький Б.Г., Ганкина E.C., Нестеров B.B. Экспрессный ультрачувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // Докл. АН СССР. 1967. Т. 172. С. 91-93.

202. Muller P., Rudin D.O., Tien Н.Т., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phis. Chem. 1963. Vol. 67. P. 534535.

203. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1976. Vol. 3. P. 2303-2308.

204. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol.1990. V. 215. P. 403-410.

205. Ильина А.П., Монастырная М.М., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis II Биоорг. химия. 2005. Т. 31, № 4.

206. Sanchez R., Sali A. Advances in comparative protein-structure modelling // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7. P. 206-214

207. Baker D., Sali A. Protein structure prediction and structural genomics // Science. 2001. Vol. 294. P. 93-96

208. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Research. 2000. Vol. 28. P. 235-242

209. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server//Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31. P. 3381-3385

210. Peitsch M. C. Protein modeling by E-mail // BioTechnology. 1995. Vol. 13. P. 658660246. http://www.chemcomp.com/CorporateInformation/MOE.html

211. Hooft R.W., Vriend G., Sander C, Abola E.E. Errors in protein structures // Nature. 1996. Vol. 381, № 6580. P.272.