Изучение структуры и механизма действия актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах

Клышко Елена Владимировна

Изучение структуры и механизма действия актинопорина КТХ-в II из актинии КскИаМкт тасгойаМуЫз

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2005 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Козловская Э.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Костецкий Э.Я. кандидат химических наук, старший научный сотрудник Новикова О.Д.

Ведущая организация:

ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится 21 апреля 2005 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.m

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан «/?» марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

3

Л /3

I Актуальность проблемы. Поиск высокоспецифичных биологически активных соединений (потенциальных компонентов для создания фармакологических препаратов или биодобавок), исследование механизма их действия, изучение структурно-функциональных отношений, являются важнейшими задачами биоорганической химии. Особый интерес представляют цитолитические токсины белковой природы - уникальный по химической структуре и физиологическому действию класс биологически активных соединений, продуцируемых ядовитым аппаратом некоторых насекомых, рептилий, морских беспозвоночных, а также микроорганизмами.

Благодаря своему мембранотропному действию, цитолизины выступают в качестве цитоплазматических маркеров, являются незаменимым инструментом исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Знание первичной структуры и пространственной организации этих соединений позволяет делать выводы о центрах связывания с мембранными рецепторами и приводит к пониманию ряда процессов, происходящих на клеточном уровне. Несмотря на большой интерес к цитолитическим полипептидам различных микро- и макроорганизмов, структурная организация и механизм их действия остаются недостаточно изученными.

В настоящее время широко исследуются актинопорины - цитолитические полипептиды актиний, обладающие способностью образовывать поры в мембранах клеток эукариот, что лежит в основе проявляемых ими различных фармакологических эффектов. При исследовании механизма действия актинопоринов и их биологической активности были выявлены процессы, происходящие без разрушения клеточной мембраны и, соответственно, гибели клетки. Предполагается, что существуют определенные рецепторы или какие-то иные специфические трансдуктивные пути, которые также могли бы быть причиной наблюдаемых фармакологических эффектов.

Цель работы. Основной целью диссертационной работы являлось выделение, изучение физико-химических характеристик, установление первичной структуры и анализ пространственной организации актинопорина тропической актинии ЯасИапЖия тасгос1ас{у1из, а также изучение механизма действия актинопорина на биологические и модельные мембраны и исследование его взаимодействия с актином. Настоящая работа представляет собой часть исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структурно-функциональных взаимосвязей биологически активных полипептидов морских беспозвоночных. Задачи исследования:

1. Выделить и охарактеризовать цитолитические полипептиды из актинии К. тасгойасфЫз.

2. Исследовать механизм действия цитолизина на модельные и биологические мембраны.

3. Установить первичную структуру актинопорина.

4. Изучить пространственную организацию полипептида и исследовать его

конформационную стабильность.

5. Исследовать взаимодействие актинопорина с актином. Положения, выносимые на защиту:

1. Новый цитолитический полипептид, RTX-S II, выделенный из актинии R. macrodactylus, по физико-химическим свойствам и механизму действия на бислойные липидные мембраны относится к классу сфингомиелинингибируемых цитолизинов актиний - актинопоринам.

2. Первичная структура RTX-S II имеет высокую степень гомологии с аминокислотными последовательностями актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству Stichodactylidae.

3. RTX-S II имеет достаточно жесткую третичную структуру и упорядоченную вторичную структуру с высоким содержанием (3-структуры.

4. Актинопорины, помимо взаимодействия с липидными компонентами мембраны, взаимодействуют также и со структурным белком цитоскелета актином и могут быть отнесены к группе актинсвязывающих белков.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Установлена первичная структура нового актинопорина R. macrodactylus, исследован механизм его действия. Впервые показано влияние актинопоринов на процессы пролиферации клеток.

Настоящая работа представляет первое исследование взаимодействия актинопорина с белковыми компонентами цитоскелета. Показано, что актинопорины, помимо взаимодействий с липидами мембраны, взаимодействуют также и со структурным белком актином, и, таким образом, могут быть отнесены к группе актинсвязывающих белков. Впервые были определены кинетические и термодинамические характеристики комплекса актинопорин-актин. На основании полученных результатов сделан вывод о влиянии актинопорина на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, лежащие в основе клеточной пролиферации. Предполагается, что взаимодействия между актинопоринами и актином лежат в основе проявляемых ими различных фармакологических эффектов.

Выяснение механизма действия актинопоринов необходимо для более глубокого понимания целого ряда процессов, протекающих при действии этих полипептидов in vivo. Результаты структурно-функциональных исследований актинопоринов могут быть основой для создания эффективных рекомбинантных иммуно- и митотоксинов, специфически действующих на внутриклеточные мембраны опухолевых клеток или паразитов.

Апробация результатов. Материалы работы были представлены на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, Москва, 2003; Объединённой международной научной конференции "Новая геометрия природы", Казань, 2003; International Symposium on the Chemistry and Biology of Marine Organisms, Kolympari, Crete, Greece, 2003; Международном симпозиуме "Химия и химическое образование", Владивосток, 2003; XI International Symposium on Marine Natural Products, Sorrento, Italy, 2004; Региональной

научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 7 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 10 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 186 цитируемых работ.

Автор выражает искреннюю признательность за помощь в проведении отдельных разделов работы сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Монастырной М.М., к.х.н. Зыковой Т.А., к.х.н. Вакориной Т.И., н.с. Лихацкой Г.Н., к.м.н. Исаевой М.П., н.с. Гузеву К.В., н.с. Киселевой М.И., зав. ЛИРМА Дмитренку П.С., вед. инженеру Тищенко Л.Я., а также сотрудникам Института биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича, г. Москва м.н.с. Константиновой Н.И. и д.б.н. Иванову Ю.Д.

Содержание работы

Выделение и некоторые физико-химические характеристики Radianthus цитолизинов

Ранее из актинии Radianthus macrodactylus было выделено и охарактеризовано три актинопорина, RTX-A, RTX-S и RTX-G, и два низкомолекулярных цитолизина Rrnl и Rmll. Для RTX-A была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность (28 аминокислотных остатков) и исследовано его мембранотропное действие на биологические и модельные мембраны. В настоящей работе были продолжены структурно-функциональные исследования актинопоринов R. macrodactylus.

Схема выделения цитолизинов из актинии R. macrodactylus включала несколько стадий: осаждение гемолитически активных полипептидов из водных экстрактов ацетоном (80%), гель-фильтрационная хроматография на колонке с Акрилексом П-4, ионообменная хроматография и рехроматография на колонке с КМ-32 целлюлозой, обессоливание на колонке с Акрилексом П-4, катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой сорбента. На каждой стадии выделения цитолизинов определялась удельная гемолитическая активность.

В результате ацетонового осаждения была получена белковая фракция, водный раствор которой был использован для дальнейшего хроматографического разделения. С помощью гель-фильтрационной хроматографии этой фракции на колонке с Акрилексом П-4 были выделены три фракции, соответствующие пикам I, II и III (рис. 1), проявляющие гемолитическую активность. Фракция, соответствующая пику II, обладающая наибольшей гемолитической активностью, была собрана и лиофилизирована. По данным электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-электрофорез) она содержала, главным образом, полипептиды с молекулярной массой около 20 кДа. Далее полученный препарат был растворен в рабочем буферном растворе (0,01 М аммонийно-ацетатный буфер, pH 6,0) и хроматографирован на колонке с КМ-32 целлюлозой.

В результате ионообменной хроматографии были получены пять фракций, обладающих гемолитической активностью (рис. 2). Фракции, соответствующие пикам 1 и 3, обладали высокой гемолитической активностью, содержали, преимущественно, полипептиды с молекулярной массой 20 кДа и представляли интерес для дальнейшего исследования. Фракции, соответствующие пикам 2, 4 и 5, в данной работе не исследовались. После обессоливания и рехроматографии фракции, соответствующие пикам 1 и 3, лиофилизировали и хроматографировали на колонке Шгорас ТБК СМ-ЗЗ1^

Рис. 1 Рис. 2

Рис. 1. Гель-фильтрационная хроматография 2 г белка, полученного осаждением ацетоном водного экстракта актинии, на колонке с Акрилексом П-4. Элюция 0,01 М аммонийно-ацетатным буфером, рН 6,0. Скорость элюции 36 мл/ч. Объем фракций б мл.

Рис. 2. Ионообменная хроматография фракции, соответствующей пику II (рис. 1), на колонке с целлюлозой КМ-32. Элюция 0,01 М аммонийно-ацетагным буфером, рН 6,0, в градиенте концентрации ЫаС1 от 0 до 0,5 М. Скорость элюции 24 мл/ч. Объем фракций 4,5 мл.

В результате ионообменной ВЭЖХ фракции, соответствующей пику 1 (рис. 3), был получен в гомогенном состоянии (по данным ДСН-электрофореза, Ы-концевого аминокислотного анализа и капиллярного электрофореза) цитолизин с Ы-концевой аминокислотой аланином и молекулярной массой 20 кДа. Аминокислотный состав полученного полипептида полностью совпадал с аминокислотным составом выделенного ранее из этой актинии актинопорина ЯТХ-А. Поскольку физико-химические свойства 11ТХ-А и механизм его действия на биологические и модельные мембраны достаточно хорошо изучены, дальнейшее исследование этого полипептида в данной работе не проводилось.

С помощью ионообменной ВЭЖХ фракции, соответствующей пику 3 (рис. 4А), был выделен цитолизин с Ы-концевым аминокислотным остатком серином. Его гомогенность была доказана комбинацией различных методов: ДСН-электрофореза, 1\[-концевого аминокислотного анализа, капиллярного электрофореза, маес-спектрометрического анализа и ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой (рис. 4Б).

о

—|-,--,-,-,-л

О 30 270 320 370 420 470

0 20 40 60 Номер фракции

80

Номер фракции

RTX-A

50 100 Время, мин.

■100 %В

60 -40 -20

150

Рис. 3. Катионообменная ВЭЖХ фракции пика 1 (рис. 2) на колонке Шгорас ТБК СМ-ЗЭАУ, уравновешенной 0,1 М аммонийно-ацетатным буфером, рН 6,0, в ступенчатом градиенте от 0 до 100% раствора В (1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0) в растворе А (0,1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0), как указано пунктирной линией. Скорость элюции 1 мл/мин.

RTX-S II

50 100 150 Время, мин.

Б 0,5-

I Iм" I.....

5 10 15 Время, мин.

■100

-50

20

Рис. 4. Высокоэффективная жидкостная хроматография. (А) Катионообменная ВЭЖХ фракции, соответствующей пику 3 (рис. 2), на колонке Шгорас TSK CM-3SW, уравновешенной 0,1 М аммонийно-ацетатным буфером, рН 6,0, в ступенчатом градиенте от 0 до 100% раствора В (1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0) в растворе А (0,1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0), как указано пунктирной линией. Скорость элюции 1 мл/мин. (Б) ВЭЖХ RTX-S II на носителе с обращенной фазой сорбента на колонке 242 Nucleosil Cie в ступенчатом градиенте от 10 до 65% раствора В (ацетонитрил) в растворе А (0,1% раствор ТФУ в воде), как указано пунктирной линией. Скорость элюции 200 мкл/мин.

Было установлено, что полипептид имеет отличный от выделенного ранее из этой актинии цитолизина RTX-S аминокислотный состав (табл. 1). При одинаковых условиях проведения ВЭЖХ на колонке Ultropac TSK CM-3SW время удерживания этого полипептида отличалось от времени удерживания RTX-S. Таким образом, выделенный полипептид, названный нами RTX-S II, является новым цитолизином. Наличие ещё одного представителя цитолизинов R. macrodactylns не вызывает удивления, так как известно, что эти полипептиды существуют в виде изоформ с очень близкими физико-химическими характеристиками.

Полипептидная цепь RTX-S II, согласно аминокислотному анализу, состоит из 177 аминокислотных остатков - это, преимущественно, основные и гидрофобные аминокислоты.

Отсутствие цистеина в аминокислотном составе ЛТХ-З II позволяет предположить, что он относится к группе актинопоринов, так как это является их отличительной характеристикой. Согласно масс-спектрометрическим данным КТХ-Б II имеет молекулярную массу 19,28 кДа. Изоэлектрическая точка полипептида равна 10,0. Его гемолитическая активность, определяемая как количество гемолитических единиц в одном миллиграмме белка, составляет 3,6 х 104 ГЕ/мг, а токсичность, оцениваемая летальной дозой для мышей (ЛД50), равна 70 мкг/кг. Исследуемый цитолизин не проявляет фосфолипазной активности.

Таблица 1.

Аминокислотный (АК) состав цитолизинов актинии Я тасгойаОуЫя

Число АК остатков в полипептиде АК -

RTX-S II RTX-A RTX-G RTX-S

Asx 18 16 16 17

Thr 9 8 11 6

Ser 13 10 10 10

Glx 10 10 10 10

Pro 5 5 4 5

Cys 0 0 0 0

Gly 22 21 20 20

Ala 18 14 14 17

Val 12 9 8 9

Met б 5 б 6

lie 8 7 7 8

Leu 14 12 12 11

Tyr 13 10 10 10

Phe 7 6 6 6

Trp 3 4 4 4

Lys 10 11 12 8

His 1 2 2 2

Arg 8 7 6 7

Кол-во АК остатков 177 157 158 156

тУ-коицевая АК Ser Ala Gly Ser

Взаимодействие ЯТХ-Б II с липидами и бислойньши липидными мембранами

Ранее было показано, что сфингомиелин (СМ) и сыворотка крови ингибируют гемолитическую активность ЯасИапОшз цитолизинов. Установлено, что гемолитическая активность Р-ТХ-Б II также полностью ингибируется дисперсией экзогенного СМ.

Так как ЛТХ-Б II не проявляет фосфолипазной активности и по физико-химическим свойствам близок к актинопоринам, было высказано предположение, что он является представителем этой группы. Для того чтобы отнести изучаемый цитолизин к группе актинопоринов, необходимо было исследовать его мембранолитическое действие.

Изучение характеристик формируемых цитолизином проводящих структур проводилось методом регистрации электрической проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ) в режиме фиксации потенциала. Обнаружено, что RTX-S II вызывает дискретные флуктуации тока при добавлении его в водную фазу с одной стороны мембраны. Показано, что действие RTX-S II на ионную проницаемость мембран зависит от липидного состава мембраны и рН среды. Так, проводимость мембран в присутствии RTX-S II увеличивается, если они содержат сфингомиелин. При рН 7,2 активность RTX-S II максимальна. Мембранотропная активность RTX-S II проявляется при концентрациях 2-100 нг/мл, что сравнимо с действующими концентрациями актинопоринов из других тропических видов актиний. При анализе проводимости, индуцированной RTX-S II в моноолеиновых БЛМ, содержащих 10% сфингомиелина, установлено, что наиболее вероятная проводимость каналов составляет 72±8 пСм в 0,1 М NaCl, рН 7,2. При изменении концентрации цитолизина в 10 раз проводимость мембраны увеличивается в 10000 раз, что указывает на участие четырех молекул RTX-S II в образовании олигомерного ионпроводящего комплекса в мембране.

Полученные результаты указывают, что механизм действия на мембраны цитолизина RTX-S II актинии R. macrodactylus состоит в формировании олигомерных ионпроводящих структур (пор) в липидном бислое. Таким образом, согласно физико-химическим свойствам RTX-S II, а также характеру его действия на мембраны, исследуемый полипептид был отнесен ко II группе каналообразующих сфингомиелинзависимых цитолизинов актиний -актинопоринам.

Установление первичной структуры актинопорина RTX-S II

N-концевая аминокислотная последовательность RTX-S II (15 АК: SAALAGTITLGASLG-) была установлена автоматическим методом Эдмана на твердофазном аминокислотном секвенаторе. При сравнении этого фрагмента последовательности с аналогичными фрагментами аминокислотных последовательностей других актинопоринов, а также с последовательностью RTX-A, была обнаружена высокая степень их гомологии (от 70 до 90%). При анализе N-концевых фрагментов последовательностей было установлено, что аминокислотные остатки RTX-S II Thr-9 и Leu-10 не встречаются в этих положениях ни в одной из известных последовательностей актинопоринов.

Учитывая уникальность АК остатков в 9 и 10 положениях, а также другие различия в N-концевых фрагментах последовательностей актинопоринов, был сконструирован вырожденный прямой праймер (RMS-F) к N-концевому участку последовательности RTX-S II. На основании результатов анализа известных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей актинопоринов из Actinio, equina, Heteractis magnifica и Stihodactyla helianthus были сконструированы прямые праймеры C33-39F, C80-85F, C143-148F и обратный праймер C143-148R к высокогомологичным участкам последовательностей актинопоринов (АК остатки для EQT2, Swiss-prot, Р17723). Синтез всех праймеров, используемых в работе, был осуществлен в НПО «Евроген» (г. Москва).

В результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами RMS-F и С143 -148R с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, выделенной из щупалец актинии, и полноразмерной кДНК-библиотеки были получены фрагменты длиной около 450 пар нуклеотидных оснований (п.о.). ПЦР-фрагменты были выделены из агарозного геля (препаративный электрофорез), очищены и клонированы по тупым концам в плазмиду pTZ19R, обработанную эндонуклеазой рестрикции HindII. Рекомбинантные клоны Escherichia coli штамма DH5a были отобраны при помощи сине-голубой селекции.

Выделенные методом щелочного лизиса плазмиды (10 штук) были секвенированы как с прямым, так и с обратным стандартными праймерами M13F и M13R, соответственно. В результате были получены нуклеотидные последовательности (423 п.о.) участка гена, кодирующего данный актинопорин. Эти последовательности, полученные как клонированием кДНК RTX-S II, так и фрагмента rtx-s II гена, были полностью идентичны. При анализе нуклеотидных последовательностей не было обнаружено никаких некодирующих нуклеотидных фрагментов на этом участке гена. Таким образом, было показано, что гены, кодирующие актинопорины R. macrodactylus, не содержат интронов. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность актинопорина (141 АК).

Для установления нуклеотидной последовательности участка гена, кодирующего С-концевую аминокислотную последовательность актинопорина, была применена техника быстрой амплификации 3'-концов кДНК (З'-RACE). Для проведения ПЦР были использованы специфичные C33-39F, C80-85F, C143-148F и стандартные "cap" праймеры. Полученные фрагменты имели длину около 300 и 500 п.о. при проведении ПЦР с C143-148F и C80-85F праймерами, соответственно. ПЦР-фрагменты были клонированы в pTZ19R и секвенированы. Они содержали нуклеотидную последовательность, кодирующую С-концевой фрагмент актинопорина, и З'-нетранслируемую область, имеющую сигнал полиаденилирования ААТААА, а также саму poly (А)-область. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена аминокислотная последовательность С-концевого фрагмента актинопорина. Таким образом, была установлена первичная структура RTX-S II, полипептидная цепь которого содержит 177 АК остатков (рис. 5.)

При сравнении аминокислотных последовательностей RTX-S II и RTX-A было обнаружено, что идентичность аминокислотных остатков актинопоринов R. macrodactylus составляет 89%, а с учетом консервативных замен - 95%. Высокая степень гомологии обнаружена также между последовательностями RTX-S II и НЕТЗ, магиификализином Н. magnifica (96%), CYT1 и CYT2, стихолизинами S. helianíhus (88 и 90%, соответственно). Такая высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей RTX-S II с магнификализииом и стихолизинами может быть объяснена принадлежностью этих видов актиний, R. macrodactylus, Н. magnifica и S. helianíhus, к одному семейству Stichodactylidae.

RTXSI1 8 А А L А G Т ) т L

RTX-A - - А L А G А 1 1, А

НЕТЗ щ А А L А в: Т I Js Е

CYT1 - - А L ■Af © т i i А

CYT2 - - А L А &. т I Г А

EQT2 $ А D V А G А V Г" D

EQT4 в V А' V А & А 1 г К

EQT5 S V А V & G А V jj Е

ConsensusllijalaTT

ГГПТ

шо S И о щ Q 1 12 D

S У т ш Q 1 1ч D

т S Щ е и Q 1 й D

т S Ü т я Q V tí; D

шш S 1 т т Q V li- D

т S i S Я D 1 li К

шш А Щ т Я N V ti Q

тш Т а т й N V fi Q

ВЁ^ВЕЗВШ s

НПВПВЯЕШ V s.

Q^LEOilfelE V 5

¡sm. ВСЗШЁВ V a

ESÍEQIIBE V s

bqlbdbisb] Y к

□□ЕЕПШЕЕ 1

ОНРИПИНЕШ 51

01

Ш

ЕОШ T A ЕЕ m V D" !N

sis x Ш i Ш 1 в К

[Г.ГЧ ж M w s V к

Ш i. A V w Ш 1 в м

ss t A V, 1 & В

mm 1: A VI Ш Ш V E> щ

ш 1- A V V D N

[S3Í5 I 4 V № 1 ü

твввшаи

ЭШЭШШНЕ! т-ШУШи

вённшвв

шшввшшш 32.ЕПШШ

50

L N А

М ы А

L N А

L N А

L N А

L Н Т

SB

т т т т hit

ЗВВШВЕЗВЗПВ

ЩНВ^ИШВШаВЩг^ЕШВН

R7XSII fc п Е F W р N Q £ я

RTX-A L р Е F V р N Q к а:

НЕТЗ L р Е F V р N Q к А

CYT1 L р Е F V р N Т к А

CYT2 С р Е F V р N т к А

EQT2 L р Н К V р Н G к А

EQT4 L р Н К V р Н е к А

EQT5 L Е Н Т V р. Н G к Aj

С С Y s R £ D Т &

L L Y s G" R К N R G'

L L Y s G R fí D Т G

И L Y s &. R К D Т &

L L Y s e R к D Т G;

L L Y N G. Q к D R G

L L Y N G Q к D R G

и и. Yj N g: Q к D R

RTKSII I Y S G К R R А D а

RTX-A V Y S G К R R А D d

НЕТЗ V Y s G К R R А D Q

CYT1 1 Y s G К R R А D т

CYT2 1 Y s G к R R А D Q

EQT2 1 Y к G к R R А Q Q

EQT4 1 F к G¡ R R R А D Q

EQT5 V Y. к Н а В. А ñ <3

А М Y E D Q3E3SI

А М Y E D НИК

G М Y В D 111

G М Y E D mm

G М Y В D 1Г1Р

R М Y Щ E тш

R М Y В Q шж

R ü M, Я E ЯШ

р V А Т Í3" А А А F

р D т т G А V; G А L

р V А т G А ^ А А F

р V А т G А V. А А F

р V А т G А V А А F

р V А т G А V G V L

р V А т G А Y G V L

р. V А т Я V « G V L

ConsensusifLlBJeI f IfflBIn 1 |KlA3 ШВа \Ш r |gdI 1Ш НуЦ

% t Y M s N Ш H T is

А Y Y M s N G N T й

А Y Y M s N G H T в

Á Y Y M s S G N T й

А Y Y M s S G N T Ü

А Y L M s D G N T и

А Y A M s D G N T 13

Á Y A M s D G N ж tí

G 9 м F В У р F D Y;

G %Г м F S V р F D Y!

G V м F S V р F D Yi

G V м F S V р F D Y

G V м F S V р F D Y

А v¿ L F S V р Y D Y,

А V L F S V В Y D Y,

А Ч L Е е i P F D Y

M L Y S N H D ■if К

N L Y s N A? w D V к

NE F Y 8 N W D V к

N i/V Y S N M D V к

N W Y S N N w D V к

N W Y S N M w N V R

N W Y s N N w N V: R

fcí. L Y s N H N V К

ВШЕШЗШШШШ нниэаэиая!!

ВВПааВЕКЗПЕ ВШВЕШЁЗБШ^ЕГ

ВВИИШШШЖ ашганэиша^ш шввнвбшнэшб:

ШП ИИЯуШЯ \<ШШ |g|V3mlF,lSjv|pJTlD]Yi |n! lv|slNlw№1\ik1

Q К N L G Y G V к M

Q К N L G Y G L к М

Q К N L © Y G В R м

Е К N L G Y G Й R м

Е К N L G Y t? a R м

Т R N L G Y G с К S

Е R Н С © Y G tí К S

N R D h ш Ш и К G

К G 1 М т S А V Е А

К G, 1 М т S А G Е А

к & 1 М т S А G Е А

к &¡ 1 М т а А G Е А

к Й 1 № т 8 А G Е А

R & F т N S S G Н П

R Й F Ы N Ц G G- Q А

R м F Щ N S ^ Q S

1 L Е г! R 1 S R -

1 М Е И R 1 S R -

1 L Q ш R 1 S R -

к М Q •1 К 1 S R -

к М Q ц К 1 S R -

1 L Е в Н V S К п

I L Е (1 Н V т К я

А- L Е N0 Н V т К щ

Consensus 11 i I у 1 s IM к |В,|ВЙ1Шё1 I |MlY,lE]d 11 ¡YM~Iñ"l 1МДуЩШВШШШ | 0-9% 1 10-19% ¡ 20-29% 30 - 39% 40 - 49% j 50 - 59%

|к|п|Щ|У,|0.111кН iKiaiMtlflaliTiTil

К 60 - 69% 2 Л-79% 3 80-89* Д 90-99% Щ 100%

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей актинопоринов. RTX-SII и RTX-A - актинопорины из R. macrodactylus. НЕТЗ - магнификализин из Н. magnifica (Swiss-prot, Q9U6X1), CYT1 и CYT2 - стихолизины из S. helianthus (Swiss-prot, Р81662, Р07845, соответственно). EQT2, EQT4 и EQT5 - эквинатоксины из A. equina (Swiss-prot, Р17723, Q9Y1U9, Q93109, соответственно). Идентичность аминокислотных остатков во всех последовательностях отмечена цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW.

Сравнение последовательностей актинопоринов показало высокую консервативность фрагмента, содержащего большое количество ароматических аминокислотных остатков: 108-FDYNLYSNWWDVKIY-122 (для RTX-S II). Как было установлено экспериментально, именно этот фрагмент молекулы участвует в связывании с поверхностью мембраны. Основные различия в аминокислотных последовательностях актинопоринов находятся на N-и С-концевых участках молекулы, тогда как средний участок последовательности этих полипептидов очень консервативен. Экспериментально показано, что именно N-концевой, а-спиральный участок полипептидной цепи участвует в формировании поры в цитоплазматической мембране и отвечает, таким образом, за мембранолитическую активность актинопоринов.

Интересно заметить, что в аминокислотных последовательностях актинопоринов R. macrodactylus RTX-S II и RTX-A нет неконсервативных замен, по крайней мере, на N-концевых участках последовательностей. Этим, возможно, объясняется практически одинаковый уровень их гемолитической активности: 3,6x104 и 3,5x104 ГЕ/мг для RTX-S II и RTX-A, соответственно. Таким образом, очевидна связь между структурой и пороформирующей активностью актинопоринов.

Исследование пространственной организации актинопорина RTX-S II

Пространственная организация RTX-S II в водном растворе была исследована с помощью УФ- и КД-спектроскопии и собственной белковой флуоресценции.

УФ-спектр RTX-S II в ближней УФ-области (230-350 нм) является типичным спектром белка с максимумом при 275 нм и впадиной около 250 нм.

1%

Значения А |см, определенные из УФ-спектров поглощения растворов RTX-S II в 0,01

М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, и в 6 М гуанидингидрохлориде, рН 4,0, при длине волны 275 нм с учетом вклада светорассеяния (3-5% в максимуме поглощения), равны соответственно 15,5 и 16,3. Соответствующие молярные коэффициенты поглощения равны 29890 и 31430 М"'-см"'. Число остатков тирозина и триптофана, оцененное по 2-ой производной УФ-спектра поглощения, составляет 11 и 3, соответственно. Рассчитанный по этим данным молярный коэффициент экстинкции хорошо согласуется с измеренным по УФ-спектру раствора RTX-S II.Спектр КД RTX-S II в ближней УФ-области (230-310 нм), области поглощения ароматических хромофоров и диеульфидных связей (рис. 6, а), имеет положительные полосы при 284 и 290 нм, относящиеся к остаткам тирозина и/или триптофана. Наличие достаточно выраженной тонкой структуры спектра КД RTX-S II в ближней УФ-области свидетельствует о существенной асимметрии окружения боковых групп остатков ароматических аминокислот, то есть об их жесткой фиксации и о высокоорганизованной третичной структуре исследуемого полипептида. Спектр КД RTX-S II в далекой УФ-области (190-240 нм), области поглощения пептидных связей (рис. 6, б), характеризуется минимумом при 217 нм и максимумом при 198 нм, кривая пересекает

нулевую линию дважды, при 195 и 203 нм. Расчет элементов вторичной структуры RTX-S II по программе Провенчера дает следующее содержание канонических структур: 5% а-спирали, 48% антипараллельных складчатых Р-слоев, 26% Р-изгибов и 22% неупорядоченной структуры. Таким образом, характерным признаком структурной организации RTX-S II является преобладание (З-структуры, что было также установлено для актинопоринов из других видов актиний.

Рис. 6. Спектры КД актинопорина RTX-S II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2. а: концентрация RTX-S II - 0,37 мг/мл, 1 - 25°С; 2 - 50°С; 3 - 60°С. б: концентрация RTX-S II - 0,222 мг/мл, 1 - 25°С; 2 - 50°С; 3 - 55°С; 4 - 60°С. в: изменение эллиптичности полосы при 222 нм от температуры.

Исследование конформационных изменений в структуре актинопорина при действии различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора)

При исследовании влияния температуры на конформационное состояние RTX-S II было показано, что при увеличении температуры от 25 до 40°С эллиптичность полос в спектре КД актинопорина в области поглощения ароматических аминокислотных остатков понижается на 5-7% (рис. 6, а). Повышение температуры раствора RTX-S II до 50°С приводит к резкому уменьшению эллиптичности полос в спектре КД в области 250-270 нм. Очевидно, в области температур 40-50°С происходит конформационный переход в третичной структуре актинопорина. Дальнейшее нагревание раствора (до 60°С) не приводит к значительным изменениям спектра КД RTX-S II. Вероятно, молекула актинопорина находится в частично денатурированном, но стабильном состоянии. Охлаждение раствора

RTX-S II, прогретого 10 минут при 60°С, до 25°С и выдерживание его в течение двух суток при этой температуре приводит к частичному восстановлению эллиптичности полос в спектре КД (25-30% от исходной).

Наряду с «плавлением» третичной структуры актинопорина RTX-S II при повышении температуры происходит разрушение его вторичной структуры, о чем свидетельствуют спектры КД в области поглощения пептидных связей (рис. 6, б): при 50°С наблюдается незначительное уменьшение эллиптичности отрицательной и положительной полос в спектре. Повышение температуры раствора всего на 5°С приводит к резким изменениям в спектре КД; наблюдается 60%-ное уменьшение эллиптичности положительной и отрицательной полос, со сдвигом (по длине волны) максимума, минимума и точки пересечения нулевой линии (рис. 6, б). Нагревание раствора актинопорина до 60°С приводит к еще большему уменьшению эллиптичности отрицательной полосы и исчезновению максимума в положительной области спектра. На основании зависимости эллиптичности при 222 нм от температуры (рис. 6, в) определена точка конформационного перехода во вторичной структуре RTX-S II. Эллиптичность актинопорина не зависит от температуры в пределах 20 - 45°С, а затем в узком интервале температур резко уменьшается. Середина этого перехода находится при 53°С. До этой температуры конформационные'изменения как в третичной, так и во вторичной структуре, являются полностью обратимыми. Следует отметить, что после точки конформационного перехода изменения в третичной структуре являются частично обратимыми, в то время как во вторичной они полностью необратимы.

Спектры КД актинопорина RTX-S II, измеренные в диапазоне температур от 25 до 60°С (рис. 6, а), не имеют изодихроичной точки (пересечение всех кривых в одной точке при определенной длине волны). Это обстоятельство позволяет предположить, что денатурация актинопорина не является одностадийным процессом (присутствие только нативного и денатурированного состояний), а происходит через образование промежуточного продукта -интермедиата.

Наряду с изучением конформационной термостабильности RTX-S II проведено исследование влияния рН на пространственную структуру актинопорина. Из спектров КД растворов RTX-S II (рис. 7, а) видно, что третичная структура исследуемого актинопорина чрезвычайно устойчива к действию рН как в кислой, так и в щелочной области. При титровании раствора RTX-S II в кислую область спектр КД в ближней УФ-области сохраняет свою форму и эллиптичность полос. При рН 2,2 приблизительно на 10% уменьшается эллиптичность полос при 284 и 290 нм, но при этом спектр сохраняет свою тонкую структуру. При титровании в щелочную область спектр КД актинопорина не меняется до рН 10,6, за исключением области 240-260 нм. В этом интервале длин волн появляется широкая положительная полоса, которая характерна для ионизированных остатков тирозина. При рН 12,6 образуется полоса высокой эллиптичности при 242 нм (рис. 7, а), что свидетельствует о полной ионизации остатков тирозина в молекуле RTX-S II.

Рис. 7. Спектры КД актинопорина КТХ-Б II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе при 25°С. а: концентрация ШХ-Б II - 0,37 мг/мл, рН 7,2 (1); 10,6 (2); 12,6 (3). б: концентрация КТХ-Б II - 0,222 мг/мл, рН 7,2 (1); 5,0 (2); 2,0 (3); 12,3 (4).

Вторичная структура актинопорина ЯТХ-Б II так же устойчива к воздействию рН, как и третичная, о чем свидетельствуют спектры КД в пептидной области, измеренные при различных значениях рН (рис. 7, б). При титровании в кислую область (рН 5,0) наблюдается незначительное уменьшение эллиптичности (по абсолютной величине) отрицательной полосы при 217 нм. Дальнейшее уменьшение рН раствора (до 2,0) приводит к 10%-ному уменьшению эллиптичности положительной и отрицательной полос в спектре КД полипептида по сравнению с исходным спектром (рН 7,2). Повышение рН раствора от 7,2 до 10,4 не вызывает изменений в пептидной области спектров КД ИТХ-Э II. При рН 11,4 наблюдается резкое уменьшение эллиптичности положительной полосы при 198 нм, с сохранением эллиптичности при 217 нм. Дальнейшее титрование раствора в щелочную область (рН 12,3) приводит к уменьшению эллиптичности отрицательной полосы при 217 нм на 30% и полному исчезновению положительной полосы (рис. 7, б).

Для расчета элементов вторичной структуры образцов актинопорина ЯТХ-Б II, подверженных как воздействию температуры, так и рН, были применены программа СопСт и пакет программ СБРго, которые используются для анализа вторичной структуры глобулярных белков по спектрам КД в дальней УФ-области. В отличие от Соп^п (метод Провенчера и Глокнера), СБРго (метод Срирама и Вуди) имеет более обширный набор

спектров реперных белков, содержащий также КД-спектры денатурированных белков. Кроме этого, пакет программ СОТ го позволяет определить содержание а-спирали и /3-структуры в двух видах: регулярном и искаженном. Содержание элементов вторичной структуры ЯТХ-Э II приведено в табл. 2.

Таблица 2.

Содержание элементов вторичной структуры актинопорина ЯТХ-Э II, %

т, °с pH а-спираль (^-структура /3-изгиб Неупоряд. форма

Н(г)" H(d)6 1(Н)" В(г)г В(с1)д ту

25* 7,2 - - 5,0 - - 48,0 26,0 22,0

50* 7,2 - - 1,0 - - 52,0 23,0 25,0

55ж 7,2 - - 0,0 - - 60,0 29,0 10,0

60ж 7,2 - - 0,0 - - 66,0 33,0 1,0

25ж 2,0 - - 0,0 - - 53,0 27,0 21,0

25* 12,3 - - 2,0 - - 56,0 28,0 14,0

25' 7,2 0,5 3,5 4,0 24,4 12,5 36,9 22,2 36,8

5 О3 7,2 0,2 2,9 3,1 20,4 16,5 36.9 18,3 41,8

553 7,2 0.1 2.7 2,8 12,3 23,2 35,5 18,0 43,7

603 7,2 0,1 2,3 2,4 10,0 28,5 38,5 8,0 51,1

253 5,0 0,2 4,0 4,2 26,8 14,0 40,8 21,8 33,2

253 2,0 0,1 3,6 3,7 24,4 12,5 36,9 19,4 40,0

253 12,3 0,1 2,8 2,9 11,5 21,4 32,9 17,8 46,2

Примечание: а - регулярная а-спираль, 6 - искаженная а-спираль, 8 - сумма а-спирали, г -регулярная /3-структура, д - искаженная /3-структура, е - сумма /3-структуры, ж - метод Провенчера и Глокнера,3 - метод Срирама и Вуди.

При анализе экспериментальных данных обнаружено, что вторичная структура актинопорина RTX-S II, находящегося в нативном состоянии (pH 7,2, 25°С), рассчитанная по программе Contin, отличается большим содержанием /3-структуры, чем рассчитанная по программе CDPro. Нагревание раствора RTX-S II до 55°С и 60°С приводит к денатурации нативного полипептида: спектры КД при этих температурах значительно отличаются от исходного (рис. 6, б). Вторичная структура полипептида в денатурированном состоянии, согласно расчетам, проведенным по методу Провенчера и Глокнера, характеризуется повышением содержания /3-структуры до 66% и уменьшением содержания неупорядоченной формы до 1%. Такое явление при денатурации белков нетипично, поэтому для расчетов вторичной структуры RTX-S II была также использована программа CDPro.

Согласно расчетам элементов вторичной структуры RTX-S II по программе CDPro установлено, что денатурация при нагревании приводит к незначительному понижению содержания а-спирали и более существенному увеличению содержания неупорядоченной формы (7-15%), при этом общее содержание /3-структуры почти не меняется. Однако при этом происходит перераспределение /3-структуры между регулярным и искаженным видами: увеличивается содержание искаженной /3-структуры (табл. 2).

Собственная белковая флуоресценция актинопорина обусловлена остатками триптофана и тирозина. Спектры флуоресценции ЯТХ-Б И при возбуждении светом с длиной волны 280 и 296 нм приведены на рис. 8. Как известно, при ЛеХ = 280 нм происходит эмиссия как остатков тирозина, так и остатков триптофана, т.е. суммарная флуоресценция, а возбуждение при = 296 нм приводит к эмиссии только остатков триптофана. Спектр суммарной флуоресценции ЯТХ-Б II характеризуется максимумом при 333 нм (рис. 8, кривая 1) , максимум спектра триптофановой флуоресценции сдвинут в красную область на 6 нм (рис. 8, кривая 2). Соотношение квантовых выходов суммарной и триптофановой флуоресценций составляет 3,5. Это указывает на то, что в исследуемом полипептиде, не имеющем дисульфидных связей, остатки тирозина вносят значительный вклад в эмиссию при возбуждении его светом с длиной волны 280 нм.

При анализе температурной зависимости собственной белковой флуоресценции ЛТХ-8 II показано, что нагревание раствора актинопорина от 25 до 70°С приводит к уменьшению интенсивности в спектрах как суммарной, так и триптофановой флуоресценции (рис. 9), при этом изменение интенсивности суммарной флуоресценции происходит более резко, чем триптофановой. Уменьшение интенсивности спектров флуоресценции ЯТХ-Б II при повышении температуры сопровождается сдвигом максимума спектров на 8-11 нм в красную область ультрафиолета. Это свидетельствует о том, что остатки тирозина и триптофана становятся более доступными полярному растворителю, что, в свою очередь, указывает на разворачивание молекулы актинопорина при нагревании.

Установлено, что повышение ионной силы раствора влияет как на суммарную, так и триптофановую флуоресценцию ЯТХ-Б II (рис. 10). Интенсивность спектра суммарной флуоресценции актинопорина возрастает при концентрации №С1 0,025 М; второй скачок в увеличении интенсивности наблюдается в 0,4 М растворе №С1. При дальнейшем увеличении ионной силы раствора ЯТХ-Б II изменение интенсивности спектра флуоресценции не происходит (рис. 10, кривая 1).

0,8

Этот факт свидетельствует о существенном отличии ЛТХ-З II от актинопоринов ЕчШ и ЭтН и большинства нативных глобулярных белков, в которых при возбуждении светом с длиной волны 280 нм преобладает флуоресценция остатков триптофана вследствие тушения эмиссии тирозиновых остатков различного вида тушителями.

320 340 360 380 400 Х,нм

Рис. 8. Спектры флуоресценции актинопорина ЮГХ-З II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, концентрация КТХ-Б II - 5-10"8 М, 1 -суммарная флуоресценция (ХеХ = 280 нм), 2 -триптофановая флуоресценция (АеХ = 296 нм).

Увеличение интенсивности спектра суммарной флуоресценции в зависимости от ионной силы раствора происходит при постоянном максимуме спектра (333 нм). Интенсивность спектров триптофановой флуоресценции при повышении ионной силы раствора меняется незначительно. В растворе с концентрацией ИаС1 до 0,1 М эмиссия плавно увеличивается, а при дальнейшем увеличении ионной силы раствора не меняется (рис. 10, кривая 2). Однако при достаточно малых изменениях в интенсивности спектра триптофановой флуоресценции происходит сдвиг максимума спектра к 335 нм (голубой сдвиг), что свидетельствует о том, что при высоких концентрациях ЫаС1 в растворе индольная группа триптофана находится в окружении неполярных аминокислотных остатков молекулы.

Рис. 9 Рис. 10

Рис. 9. Зависимость интенсивности флуоресценции актинопорина ЯТХ-Б II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, от температуры. 1 - суммарная флуоресценция (ХеХ = 280 нм), 2 - триптофановая флуоресценция (\.х = 296 нм).

Рис. 10. Зависимость интенсивности флуоресценции актинопорина ШХ-Б II в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,2, от ионной силы. 1- - суммарная флуоресценция (Хех = 280 нм), 2 - триптофановая флуоресценция (ХеХ = 296 нм).

Исследование влияния различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) на гемолитическую активность ИТХ-в II

При исследовании влияния температуры на активность ЯТХ-Б II было показано, что с ростом температуры гемолитическая активность актинопорина уменьшается, а при 60°С в течение 3 минут ЯТХ-Б II полностью инактивируется. Обнаружено, что после точки конформационного перехода (53°С) актинопорина происходит резкое уменьшение гемолитической активности полипептида. Очевидно, что гемолитическая активность ЯТХ-Б II зависит от конформационного состояния молекулы и связана с изменениями в его вторичной и третичной структуре.

Установлено, что гемолитическая активность ЯТХ-Б II зависит от рН раствора. В области рН от 4,0 до 6,5 уровень гемолитической активности полипептида не меняется. Резкое увеличение активности наблюдается в диапазоне рН от 6,7 до 7,6 и несколько

замедленное увеличение наблюдается при повышении рН от 8,0 до 10,2. По-видимому, изменения в третичной структуре, происходящие при высоких значения рН, а также изменение заряда молекулы актинопорина RTX-S II (pi 10,0) способствуют увеличению его мембранолитического действия.

На основании результатов исследования зависимости гемолитической активности RTX-S II от ионной силы раствора было установлено, что увеличение концентрации NaCl до 0,8 М приводит к заметному увеличению активности актинопорина. Вероятно, это связано с некоторыми изменениями в третичной структуре полипептида, о чем свидетельствуют спектры суммарной и триптофановой флуоресценции (рис. 10). Увеличение интенсивности собственной флуоресценции, очевидно, связано с изменением заряда как самой молекулы в целом, так и аминокислотных остатков, непосредственно окружающих остатки тирозина и триптофана. Подобный эффект наблюдался для EqtH и Stnll и был объяснен облегчением частичного развертывания полипептида в растворах с повышенной концентрацией солей.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что RTX-S II, подобно другим актинопоринам, имеет достаточно жесткую третичную структуру и упорядоченную вторичную структуру с высоким содержанием |3-структуры. Вторичная и третичная структура полипептида сохраняется практически неизменной в широком диапазоне рН (от 2,0 до 11,7), при этом в щелочной среде наблюдается резкое увеличение активности, что связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Необратимая денатурация полипептида, приводящая к полной потере его активности, происходит при температуре выше 53°С. Увеличение ионной силы раствора приводит к изменениям в его третичной структуре и увеличению гемолитической активности актинопорина. Остатки тирозина в молекуле RTX-S II вносят существенный вклад в эмиссию полипептида, и их флуоресценция более зависима от температуры и ионной силы раствора, чем триптофановая.

Влияние RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedins

При исследовании действия RTX-S II на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа S. intermedins было обнаружено, что обработанные актииопорином ооциты на первых стадиях развития (через 1,5 часа от начала оплодотворения) независимо от концентрации RTX-S II практически не отличались от контрольных (ооциты в морской воде). Однако через 20 часов обработанные ооциты находились на 13 стадии "ранней гаструлы", в то время как контрольные - на 15 стадии "средней гаструлы". Было установлено, что актинопорин вызывает торможение дробления яйцеклеток в концентрации 10 мкг/мл (280 ГЕ/мл), не вызывая лизиса клеток. Таким образом, было установлено, что RTX-S II влияет на процессы пролиферации клеток. Отсутствие сфингомиелина в мембранах ооцитов позволяет высказать предположение о связывании RTX-S II со структурными и/или мембранными белками.

Ранее при изучении взаимодействия RTX-A с эритроцитами крови человека и собаки методом дифференциальной сканирующей калориметрии, помимо специфического липид-белкового связывания со сфингомиелином, было обнаружено взаимодействие актинопорина

со структурным белком G-актином. Известно, что в основе процессов клеточной пролиферации лежат реакции полимеризации и деполимеризации актина, регулируемые сложным кооперативным механизмом, ключевую роль в котором выполняют актинсвязывающие белки. Было сделано предположение, что влияние актинопорина на процессы пролиферации связано с его взаимодействием с актином. В связи с этим представляло интерес исследовать теоретически возможные комплексы актинопорина с актином и сравнить их с комплексами актинсвязывающих белков, непосредственно влияющих на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина.

Сравнительное изучение структуры комплексов актинопорина с G-актином и гельзолина с G-актином методами компьютерного моделирования

Модель пространственной структуры актинопорина была получена с помощью сервера SWISS-MODEL методом сравнительного моделирования. В качестве прототипа была использована пространственная структура Stn II (PDB, код 1GWY), установленная на основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,7 А. Идентичность аминокислотных последовательностей RTX-S II и Stnll была определена с помощью программы МОЕ и составила 88,6%. Полученная модель была использована для предсказания структуры комплексов актинопорина с актином.

Теоретическое изучение комплексообразования RTX-S II и гельзолина, пептидного регулятора деполимеризации актина, с актином было проведено с помощью программы GRAMM с параметрами докинга низкого и высокого разрешения. Параметры программы GRAMM были подобраны таким образом, чтобы программа предсказывала место связывания гельзолина с актином как в комплексе домена S1 человеческого гельзолина с актином кролика, установленное методом рентгеноструктурного анализа (PDB, код 1ESV). Были рассчитаны структуры 100 комплексов для каждого белка и проанализированы структуры с наиболее низкой энергией комплекса. Программой было предсказано наличие нескольких сайтов связывания актинопорина с G-актином. Интересно, что в комплексах с наиболее низкой энергией сайты связывания актина с доменом S1 гельзолина и актинопорииом расположены близко друг к другу.

Таким образом, была показана принципиальная возможность образования комплекса актинопорина с актином. Можно предположить, что актинопорины влияют на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, подобно гельзолину и ряду других актинсвязывающих белков.

Исследование межмолекулярного взаимодействия RTX-S II и G-актина

Определение кинетических и термодинамических характеристик реакции образования комплекса RTX-S II с G-актином было проведено с помощью оптического биосенсорного анализа на IAsys двухканальном биосенсоре в Институте биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича, г. Москва, в лаборатории бионаиотехиологий (зав. лаб., д.б.и. Иванов Ю.Д.).

Каждый из белков-партнеров был по очереди иммобилизован на карбоксиметилдекстрановой подложке кюветы оптического биосенсора. Формирование

комплексов ЯТХ-8 II с в-актином проводилось в 20 мМ натрий-ацетатном буферном растворе в диапазоне рН от 6,0 до 4,0 и диапазоне температур от 15 до 40°С. Образование комплексов ЯТХ-Э П^ЛЗ-актин наблюдалось при рН 4,5. Показано, что комплекс 0-актин;ш /КТХ-Б II при данных условиях не образуется (рис. 11). Так как в процессе иммобилизации белка на карбоксиметилдекстрановой поверхности кюветы принимают участие в-аминогруппы лизина, то зависимость формирования комплексов от порядка иммобилизации (отсутствие взаимодействия ЯТХ-Б II с иммобилизованным О-актином) указывает на важную роль аминогрупп в-актина в процессе комплексообразования.

20 мМ натрий-ацдташьш буферный раствор, рН 4,5

Рис. 11. Сенсограммы белок-белковых взаимодействий. Температурная зависимость взаимодействий в системе КТХ-Э ИщУ й-актин. Среда инкубации содержала 20 мМ натрий-ацетатный буфер, рН 4,5. Стрелками показаны добавки 11,5 нМ й-актина и 1,7 мкМ ЯТХ-Э II в инкубационном буферном растворе.

При повышении температуры от 15 до 40°С происходит рост амплитуды сигнала связывания и увеличение тангенса начального угла наклона кривой связывания, что указывает на рост константы скорости формирования комплексов Г^ТХ-Б НтДл-актин.

Были рассчитаны значения кинетических параметров реакции комплексообразования (табл. 3). Рост константы скорости формирования комплексов (коп) в диапазоне температур 15-40°С указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса ЫТХ-Б ПтУв-актин. Значение энергии активации реакции ассоциации АОапп составляет 6,2 ккал/моль. Порядок константы скорости диссоциации комплексов ЛТХ-Б ИипЛЗ-актин составляет -Ю"4 с"1. Значение энергии активации реакции диссоциации АСог/ составляет 22,2 ккал/моль. Константа равновесия Кр имеет величину порядка 108 М"1 и растет с повышением температуры. Температурная зависимость Дв реакции комплексообразования ЯТХ-Б Н^ЛЗ-актин удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка (рис. 12) и ее можно представить выражением: АО = ДН - Т-А8, где АН и ДБ - изменение энтальпии и энтропии реакции, соответственно, Значения АН и АЭ рассчитанные из этого уравнения составили 6,2 ± 0,1 ккал/моль и 60,1 ± 0,3 кал/(моль-К), соответственно. В

реакцию комплексообразования основной вклад вносит энтропийный фактор, так как значение Т-ДБ превышает по модулю положительную составляющую энтальпии. На основании анализа полученных данных был сделан вывод, что образование комплекса ЫТХ-Э 11,г11/0-актин происходит, в основном, за счет гидрофобного взаимодействия.

Таблица 3.

Кинетические и термодинамические параметры реакции комплексообразования

ЯТХ-Б ПшУО-актин

Температура 15°С 20°С 25°С зо°с 35°С 40°С

^„М-'с"1 (6,7 ± 0,3)-104 (1,2 ± 0,1)105 (1,3±0,1)'Ю5 (1,4 ± 0,1)'Ю5 (1,7 ± 0, !)• 105 (1,8 ± 0,1)-105

к*, с"' (2,8 ±0,1) 10"4

Кр, М-1 (2,4 ± 0,1)-108 (4,3 ±0,1)'10* (4,6 ± 0,1 И О8 (5,0 ± 0,1)-10 (6,1 ±0,1)-108 (6,4 ± 0,1)-108

Дв, ккал/моль -10,9 ±0,1 -11,5 ± 0,1 -11,7 ±0,1 -11,9 ± 0,1 -12,3 ±0,1 -12,6 ± 0,1

ДН, ккал/моль 6,2 ±0,1

ДБ, кал/мольК 60,1 ±0,3

Температура, К

Рис. 12. Температурная зависимость энергии Гиббса (Дв) реакции комплексообразования КТХ-Б Н^/О-актин.

При сравнении констант скорости образования комплекса актинопорин/О-актин с константами комплексов актина и актинсвязывающих белков, обнаружено, что они сравнимы с константой скорости ассоциации комплекса гельзолин-актин.

Результаты проведенных исследований подтверждают, что актинопорины, помимо взаимодействия с липидными компонентами мембраны, взаимодействуют также и со структурным белком цитоскелета актином, и, поэтому, могут быть отнесены к группе актинсвязывающих белков. Таким образом, различные фармакологические эффекты, проявляемые актинопоринами, могут быть обусловлены не только их порообразующей активностью, но и взаимодействием этих полипептидов с актином, т.е. непосредственным участием актинопоринов в процессах клеточной пролиферации.

23 Выводы

1. Из актинии ИасИапг1ги$ тасгойаОуЫз выделен и охарактеризован новый цитолитический полипептид ЯТХ-Б II. Изучено его действие на проницаемость модельных мембран. Установлено, что ЯТХ-Б II относится к классу сфингомиелинингибируемых цитолизинов актиний - актинопоринам.

2. Установлена первичная структура актинопорина К-ТХ-8 II, полипептидная цепь которого состоит из 177 аминокислотных остатков. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству БйсЬоёа^уНёае.

3. Исследована пространственная организация актинопорина на уровне его вторичной и третичной структур. Показано, что КТХ-Б И имеет достаточно жесткую третичную структуру и упорядоченную вторичную структуру с высоким содержанием Р-структуры.

4. Исследовано влияние различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) на конформационную стабильность и гемолитическую активность актинопорина. Установлено, что вторичная и третичная структуры ИТХ-Б II сохраняются практически неизменными в широком диапазоне рН (от 2,0 до 11,7), при этом в щелочной среде наблюдается резкое увеличение активности, что связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Показано, что необратимая денатурация полипептида, приводящая к полной потере его активности, происходит при температуре выше 53°С. Обнаружено, что увеличение - ионной силы раствора приводит к изменениям в его третичной структуре и увеличению гемолитической активности актинопорина. Установлено, что остатки тирозина в молекуле ЯТХ-Э II вносят существенный вклад в эмиссию полипептида, и их флуоресценция более зависима от температуры и ионной силы раствора, чем триптофановая.

5. Исследовано действие актинопорина на развитие ооцитов морского ежа 51гоп&>1осеп(го!ш ШегтесИш. Установлено, что ЯТХ-Э II оказывает влияние на процессы пролиферации клеток.

6. Рассчитаны кинетические и термодинамические характеристики комплекса актинопорин-актин. Установлено, что актинопорины, помимо взаимодействия с липидными компонентами мембраны, взаимодействуют также и со структурным белком цитоскелета актином, и, таким образом, могут быть отнесены к группе актинсвязывающих белков.

Основные публикации по теме диссертации

1. Клышко Е.В., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.И., Крыжко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. 2004. Т. 115, №3. С. 45-53.

2. Klyshko E.V., Isaeva M.P., Monastymaya M.M., Gusev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2004. Vol. 44, №3. p. 315-324.

3. Vakorina T.I., Klyshko E.V., Monastymaya M.M. and Kozlovskaya E.P. Conformational stability and hemolytic activity of actinoporin RTX-SII from the sea anemone Radianthus macrodactylus // http://protein.bio.msu.ru/biokhimiva/BiVf04-i64.pdf

4. Козловская Э.П., Клышко E.B., Ильина А.П., Исаева М.П., Гузев К.В., Зыкова Т.А. и Монастырная М.М. Цитолизины актиний // Объединённая международная научная конференция «Новая геометрия природы»: сб. расш. тез. докл. - Казань, 2003. Т. II. Биология. Медицина. С. 179-183.

5. Klyshko E.V., Monastymaya М.М., Vakorina T.I., Nasimov I.V., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. A new actinoporin, RTX-S II, from the sea anemone, Radianthus macrodactylus // International Symposium on the Chemistry and Biology of Marine Organisms: book of abstr. - Kolympari, Crete, Greece, 2003. PI08.

6. Клышко E.B., Полянская H.A., Сокотун И.Н., Монастырная, М.М., Козловская Э.П. Выделение и определение аминокислотной последовательности Radianthus-цитолизина RTX-S и Rm-II из актинии Radianthus macrodactylus И 3-ий Международный симпозиум "Химия и химическое образование": сб. тез. докл. -Владивосток, 2003. С. 53.

7. Клышко Е.В., Ильина А.П., Монастырная М.М., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Козловская Э.П. Структурно-функциональные исследования актинопорина Radianthus macrodactylus II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов: сб. тез. стенд, сообщений. - Москва, 2003. С. 27.

8. Klyshko E.V., Isaeva М.Р., Monastymaya М.М., Gusev K.V., Kozlovskaya E. P. Primary structure of a new actinoporin from Radianthus macrodactylus // XI International Symposium on Marine Natural Products: proceed. - Sorrento, Italy, 2004. P54.

9. Клышко E.B., Константинова Н.И., Иванов Ю.Д., Монастырная М.М., Киселева М.И., Козловская Э.П. Исследование межмолекулярного взаимодействия G-актина и актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus И Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. - Владивосток, 2004. С. 57.

10. Лихацкая Г.Н., Клышко Е.В., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Бородина А.С., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Компьютерное моделирование структуры комплексов актинопоринов и домена S1 гельзолина с G-актином // Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. - Владивосток, 2004. С. 58.

Соискатель

Клышко Е.В.

ЗАО «Фартроп» г. Владивосток, ул. Алеутская. 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 15.03.2005

i %J

РНБ Русский фонд

2006-4 4331

1. Введение.

2. Литературный обзор. Цитолитические полипептиды актиний: структура, свойства, механизм действия.

2.1. Кишечнополостные - богатый источник биологически активных полипептидов. Цитолизины актиний.

2.2. Некоторые биологические аспекты в изучении цитолизинов актиний.

2.3. Биохимические и функциональные характеристики цитолизинов актиний I-IV групп.

2.3.1. Низкомолекулярные цитолизины актиний.

2.3.2. Цитолизины актиний II группы. Актинопорины.

2.3.2.1. Первичная структура актинопоринов.

2.3.2.2. Пространственная структура актинопоринов.

2.3.2.3. Взаимодействие актинопоринов с липидными мембранами.

2.3.2.4. Молекулярный механизм порообразования.

А 2.3.2.5. Фармакологические исследования актинопоринов.

2.3.3. Цитолизины актиний III группы.

2.3.4. Цитолизины актиний IV группы.

2.4. Перспективы исследования цитолизинов актиний.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Выделение и некоторые физико-химические характеристики цитолизинов R. ф macrodactylus.

3.2. Взаимодействие RTX-S II с липидами и бислойными липидными мембранами

3.3. Установление первичной структуры актинопорина RTX-S II.

3.3.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участка гена, кодирующего зрелый актинопорин.

3.4. Исследование конформационной стабильности и гемолитической активности актинопорина RTX-S II.

3.4.1. Исследование пространственной организации актинопорина RTX-S II.

3.4.2. Исследование конформационных изменений в структуре актинопорина при действии различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора)

3.4.3. Исследование влияния различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) на гемолитическую активность RTX-S II.

3.5. Влияние RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedius.

3.6. Сравнительное изучение структуры комплексов актинопорина с G-актином и гельзолина с G-актином методами компьютерного моделирования.

3.6.1. Построение модели пространственной структуры RTX-S II.

3.6.2. Теоретическое предсказание структур комплексов актинопорин-актин в сравнении с комплексом актин-S 1 гельзолин.

3.7. Исследование межмолекулярного взаимодействия RTX-S II и G-актина.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

5. Выводы.

Поиск высокоспецифичных биологически активных соединений (потенциальных компонентов для создания фармакологических препаратов или биодобавок), исследование механизма их действия, изучение структурно-функциональных отношений, являются важнейшими задачами биоорганической химии. Особый интерес представляют цитолитические токсины белковой природы -уникальный по химической структуре и физиологическому действию класс биологически активных соединений, продуцируемых ядовитым аппаратом некоторых насекомых, рептилий, морских беспозвоночных, а также микроорганизмами.

Благодаря своему мембранотропному действию, цитолизины выступают в качестве цитоплазматических маркеров, являются незаменимым инструментом исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Знание первичной структуры и пространственной организации этих соединений позволяет делать выводы о центрах связывания с мембранными рецепторами и приводит к пониманию ряда процессов, происходящих на клеточном уровне. Несмотря на большой интерес к цитолитическим полипептидам различных микро- и макроорганизмов, структурная организация и механизм их действия остаются недостаточно изученными.

Бурное развитие как физических, биохимических, молекулярнобиологических методов исследования, так и методов компьютерного моделирования, позволяет в настоящее время успешно определять структуры первичных и вторичных метаболитов, изучать свойства и механизмы действия этих соединений in vitro, in vivo и in silica.

Настоящая работа представляет собой часть исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структурно-функциональных взаимодействий биологически активных полипептидов морских беспозвоночных. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств актинопорина, выделенного из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению его первичной структуры, исследованию его пространственной организации, а также изучению механизма действия этого полипептида.

102 5. Выводы

1. Из актинии Radianthus macrodactylus выделен и охарактеризован новый цитолитический полипептид RTX-S II. Изучено его действие на проницаемость модельных мембран. Установлено, что RTX-S II относится к классу сфингомиелинингибируемых цитолизинов актиний - актинопоринам.

2. Установлена первичная структура актинопорина RTX-S II, полипептидная цепь которого состоит из 177 аминокислотных остатков. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству Stichodactylidae.

3. Исследована пространственная организация актинопорина на уровне его вторичной и третичной структур. Показано, что RTX-S II имеет достаточно жесткую третичную структуру и упорядоченную вторичную структуру с высоким содержанием Р-структуры.

4. Исследовано влияние различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) на конформационную стабильность и гемолитическую активность актинопорина. Установлено, что вторичная и третичная структуры RTX-S II сохраняются практически неизменными в широком диапазоне рН (от 2,0 до 11,7), при этом в щелочной среде наблюдается резкое увеличение активности, что связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Показано, что необратимая денатурация полипептида, приводящая к полной потере его активности, происходит при температуре выше 53°С. Обнаружено, что увеличение ионной силы раствора приводит к изменениям в его третичной структуре и увеличению гемолитической активности актинопорина. Установлено, что остатки тирозина в молекуле RTX-S II вносят существенный вклад в эмиссию полипептида, и их флуоресценция более зависима от температуры и ионной силы раствора, чем триптофановая.

5. Исследовано действие актинопорина на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Установлено, что RTX-S II оказывает влияние на процессы пролиферации клеток.

6. Рассчитаны кинетические и термодинамические характеристики комплекса актинопорин-актин. Установлено, что актинопорины, помимо взаимодействия с липидными компонентами мембраны, взаимодействуют также и со структурным белком цитоскелета актином, и, таким образом, могут быть отнесены к группе актинсвязывающих белков.

1. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды // М.: Высшая школа. 1985. 280 с.

2. Hessinger D.A., Lenhoff Н.М. The Biology of Nematocysts // Academic Press. Inc. San Diego. 1988. 764 p.

3. Calton G.J., Burnett J.W. Characterization of nematocyst venoms // In: Hessinger D.A., Lenhoff H.M. (Eds.). The Biology of Nematocysts. Academic Press. Inc. San Diego. 1988. P. 369-374.

4. Nagai H., Takuwa K., Nakao M., Ito E., Miyake M., Noda M., Nakajima T. Novel proteinaceous toxins from the box jellyfish (sea wasp) Carybdea rastoni II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 28. P. 582-588.

5. Nagai H., Takuwa K., Nakao M., Sakamoto В., Crow G.L., Nakajima T. Isolation and characterization of a novel protein toxin from Hawaiian box jellyfish (sea wasp) Carybdea alata И Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 28. P. 589-594.

6. Norton R.S. Structure and structure-function relationships of sea anemone proteins that interact with the sodium channel //Toxicon. 1991. V. 29. P. 1051-1084.

7. Norton R.S. Structure and function of peptide and protein toxins from marine organisms // J. Toxicol. Toxin Rev. 1998. V. 17. P. 99-130.

8. Mahnir V.M., Shumilov U.N., Kovalevskaya A.M., Romanenko L.A., Grebelny S.D. Evidence of several types of biologically active substances in North Pacific sea anemones//Сотр. Biochem. Physiol. 1993. V. 106C. P. 661-665.

9. Bernheimer A.W. Cytolytic peptide of sea anemones // In: Hall S., Strichartz G. (Eds.). Marine Toxins: Origin, Structure and Molecular Pharmacology ACS. Washington. DC. 1990. P. 304-311.

10. Turk T. Cytolytic toxins from sea anemones // J. Toxicol. Toxin. Rev. 1991. V. 10. P. 223-262.

11. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. V. 105. P. 121-130.

12. Blanquet R. Propeties and composition of the nematocyst toxin of the sea anemone Aiptasia palliada II Сотр. Biochem. Physiol. 1968. V. 25. P. 893-902.

13. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. Assay and properties of the hemolysis activity of pure venom from the nematocysts of the acontia of the sea anemone Aiptasia palliada II Arch. Biochem. Biophys. 1973. V. 159. P. 629-638.

14. Ferlan I., Lebez D. Equinatoxin, a lethal protein from Actinia equina L. Purification and characterization // Toxicon. 1974. V. 12. P. 57-61.

15. Devlin J.P. Isolation and partial purification of hemolytic toxin from sea anemone Stoichactis helianthus И J. Pharmac. Sci. 1974. V. 63. P. 1478-1480.

16. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 467-471.

17. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. V. 40. P. 111-124.

18. Зыкова Т.А., Монастырная M.M., Апаликова O.B., Швец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из морской актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорг. химия. 1997. Т. 24. С. 509-516.

19. Macek P., Lebez D. Isolation and characterization of three lethal and hemolytic toxins from sea anemone, Actinia equina L // Toxicon. 1988. V. 26. P. 441-451.

20. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. Membrane structure and function. Mechanism of hemolysis induced by nematocyst venom: role of phospholipase A and direct lytic factor// Arch. Biochem. Biophys. 1976. V. 173. P. 603-613.

21. Cline E.I., Weibe L.I., Young J.D., Samuel D. Toxic effect of the novel protein Upl from the sea anemone Urticina piscivora II Pharm. Res. 1995. V. 32. P. 309-314.

22. Bernheimer A.W., Avigad L.S. A cholesterol-inhibitable cytolytic protein from the sea anemone Metridium senile II Biochem. Biophys. Acta. 1978. V. 541. P. 96-106.

23. Grotendorst G.R., Hessinger D.A. Purification and partial characterization of the phospholipase A2 and co-lytic factor from sea anemone {Aiptasia pallida) nematocyst venom//Toxicon. 1999. V. 37. P. 1779-1796.

24. Calton G.J., Burnett J.W., Vader W. A study of the nematocyst venoms of the sea anemone, Bolocera tuediae // Toxicon. 1978. V. 16. P. 443-451.

25. Meinardi E., Azcurra J.M., Florin-Christensen M., Florin-Christensen J. Coelenterolysin: a hemolytic polypeptide associated with the coelenteric fluid of sea anemones//Сотр. Biochem. Physiol. 1994. V. 109B. P. 348-354.

26. Malpezzi E.L.A., Freitas J.C. Hemolytic activity of the nematocyst venom from the sea anemone Bunodosoma caissarum II Braz. J. Med. Biol. Res. 1991. V. 24. P. 1245-1249.

27. Cline E.I., Wolowyk M.W., Weibe L.I., George R., Samuel J. Isolation and characterization of a novel cardiac stimulatory and hemolytic protein from sea anemone Urticina piscivora (Sebens and Laakso) // Pharm. Sci. 1995. V. 1. P. 155162.

28. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo H.E., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica II Toxicon. 1993. V. 31. P. 1567-1579.

29. Монастырная M.M., Зыкова T.A., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов из морской актинии Radianthus macrodactylus II Биоорг. химия. 1998. Т. 25. С. 733-741.

30. Shik J.M. A Functional Biology of Sea Anemones // In: Calow P. (Ed.). Functional Biology Series Chapman & Hall. London. 1991. 342 p.

31. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Мабек P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family//Toxicon. 1999. V. 37. P. 1391-1401.

32. Lotan A., Fishman L., Zlotkin E. Toxin compartmentation and delivery in the cnidaria: The nematocyst's tubule as a multiheaded poisonous arrow // J. Exp. Zool. 1996. V. 275. P. 444-451.

33. Sencic L., Macek P. New method for isolation of venom from the sea anemone Actinia cari. Purification and characterization of cytolytic toxins // Сотр. Biochem. Physiol. 1990. V. 97B. P. 687-693.

34. Klug M., Weber J., Tardent P. Direct observation of hemolytic activity associated with single nematocysts // In: Hessinger D.A., Lenhoff H.M. (Eds.). The Biology of Nematocysts. Academic Press. Inc. San Diego. 1988. P. 543-550.

35. Maretic Z., Russel F.E. Stings by the sea anemone Anemonia sulcata in the Adriatic sea//Am. J. Trop. Med. Hyg. 1983. V. 32. P. 891-896.

36. Mebs D. Anemonefish symbiosis: vulnerability and resistance of fish to the toxin of the sea anemone// Toxicon. 1994. V. 32. P. 1059-1068.

37. Giese C., Mebs D., Werding B. Resistance and vulnerability of crustaceans to cytolytic sea anemone toxins // Toxicon. 1996. V. 34. P. 955-958.

38. Meinardi E., Florin-Christensen M., Paratcha G., Azcurra J.M., Florin-Christensen J. The molecular basis of the self non self selectivity of a coelenterate toxin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 216. P. 348-354.

39. Elliot R.C., Konya R.S., Vickneshwara K. Isolation of a toxin from the dahlia sea anemone, Tealia feline L. // Toxicon. 1986. V. 24. P. 117-122.

40. Kem W.R. Sea anemone toxins: Structure and action // In: Hessinger D.A., Lenhoff H.M. (Eds.). The Biology of Nematocysts. Academic Press, Inc. San Diego. 1988. P. 375-405.

41. Saier Jr.M.H. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 354-411.

42. Macek P., Belmonte G., Pederzolli C., Menestrina G. Mechanism of action of equinatoxin II, a cytolysin from the sea anemone Actinia equina L. belonging to the family of actinoporins // Toxicology. 1994. V. 87. P. 205-227.

43. Иванов A.C., Мольнар A.A., Козловская Э.П., Монастырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 1987. Т. 4. № 3. С. 243-248.

44. Norton R.S., Bobek G., Ivanov J.O., Thomson M., Beer E.F., Mortiz R.L., Simpson R.J. Purification and characterization of proteins with cardiac stimulatory and hemolytic activity from the sea anemone Actinia tenebrosa II Toxicon. 1990. V. 28. P. 29-41.

45. Athanasiadis A., Anderluh G., Macek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina И Structute. 2001. V. 9. P. 341-346.

46. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez-Ripol M., Gavilanes J.G. Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure. 2003. V. 11. P. 1-20.

47. Heuck A.P., Hotze E.M., Tweten R.K., Johnson A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric beta-barrel protein. Perfringolysin О creates a pore using ordered and coupled conformational changes // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 1233-1242.

48. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. Cloning, sequencing and expression of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. V. 220. P. 437-442.

49. Wang Y., Chua K.L., Khoo H.E. A new cytolysin from the sea anemone Heteractis magnifica: isolation cDNA cloning and functional expression // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1478. P. 9-18.

50. Anderluh G., Podlesek Z., Macek P. A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role // Biochim. Biophis. Acta. 2000. V. 1476. P. 372-376.

51. Pungercar J., Anderluh G., Gubensek F., Strukelj B. Sequence analysis of the cDNA encoding the precursor of equinatoxin V, a newly discovered hemolysin from the sea anemone Actinia equina И Biochem. Biophys. Acta. 1997. V. 1341. P. 105-107.

52. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. The coding region of the equinatoxin II gene lacks introns // Croat. Chem. Acta. 1995. V. 68. P. 533-542.

53. Anderluh G., Pungercar J., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P. N-terminal truncation mutagenesis of equinatoxin II, a pore-forming polypeptide from the sea anemone Actinia equina II Protein Eng. 1997. V. 10. P. 751-755.

54. Anderluh G., Barlic A., Krizaj I., Menestrina G., Gubensek F., Macek P. Avidin-FITC topological studies with three cysteine mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 242. P. 187-190.

55. Menestrina G., Cabiaux V., Tejuca M. Secondary structure of sea anemone cytolysins in soluble and membrane bound from by infared spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 254. P. 174-180.

56. Killian J.A., Heijne G. How proteins adapt to a membrane-water interface // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 429-434.

57. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. V. 274. P. 1859-1866.

58. Parker M.W., Buckley J.T., Postma J.P., Tucker A.D., Leonard K., Pattus F., Tsernoglou D. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states // Nature. 1994. V. 367. P. 292-295.

59. Belmonte G., Pederzolli C., Macek P., Menestrina G. Pore formation by the sea anemone cytolysin equinatoxin II in red blood cells and model lipid membranes // J. Membrane Biol. 1993. V. 131. P. 11-22.

60. Caaveiro J.M., Echabe I., Gutierrez-Aguierre I., Nieva J.L., Arrondo J.L.R., Gonzales-Manas J. Differential interaction of equinatoxin II with model membranes in response to lipid composition // Biophys. J. 2001. V. 80. P. 1343-1353.

61. Turk Т., Macek P., Gubensek F. Chemical modification of equinatoxin II, a lethal and cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina L. // Toxicon. 1989. V. 27. N. 3. P. 375-384.

62. Narat M., Macek P., Kotnik V., Sedmak B. The humoral and cellular immune-response to a lipid attenuated pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II Toxicon. 1994. V. 32. P. 65-71.

63. Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus Н ДАН СССР. 1984. Т. 277. С. 1491-1493.

64. Doyle J.W., Kem W.R., Vilallonga F.A. Interfacial activity of an ion channel-generating protein cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1989. V. 27. P. 465-471.

65. Zorec R., Tester M., Macek P., Mason W.T. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and increase in intracellular calcium activity I I J. Membrane Biol. 1990. V. 118. P. 243-249.

66. Michaels D.W. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stichodactyla helianthus. I. Formation of transmembrane channels in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 555. P. 67-78.

67. Tejuca M., Serra M.D., Ferraras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilisation by sticholysin I, a cytolysin isolated from the venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1493714957.

68. Shin M.L., Michaels D.W., Mayer M.M. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus. II. Effect of membrane lipid composition in a liposome system // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 555. P. 79-88.

69. Руднев B.C., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная M.M., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1. № 10. С. 10191024.

70. Poklar N., Fritz J., Macek P., Vesnaver G., Chalikian T.V. Interaction of the pore-forming protein equinatoxin II with model lipid membranes: A calorimetric and spectroscopic study // Biochemistry. 1999. V. 38. N. 45. P.14999-15008.

71. Macek P., Zecchini M., Stanek K., Menestrina G. Effect of membrane-partitioned n-alcohols and fatty acids on pore-forming activity of a sea anemone toxin // Eur. Biophys. J. 1997. V. 25. P. 155-162.

72. Hinds M.G., Zhang W., Anderluh G., Hansen P.E., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation //J. Mol. Biol. 2002. V. 315 P. 1219-1229.

73. Anderluh G., Barlic A., Potrich C., Macek P., Menestrina G. Lysine 77 is a key residue in aggregation of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II J. Membrane Biol. 2000. V. 173. P. 47-55.

74. Gallivan J.P., Dougherty D.A. Cation-pi interactions in structural biology // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 9459-9464.

75. Olson R., Nariya H., Yokota K., Kamio Y., Gouaux E. Crystal structure of staphylococcal LukF delineates conformational changes accompanying formation of a transmembrane channel // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. N. 2. P. 134-140.

76. Bellamy H.D., Lim L.W., Mathews F.S., Dunham W.R. Studies of crystalline trimethylamine dehydrogenase in three oxidation states and in the presence of substrate and inhibitor // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. N. 20. P. 11887-11892.

77. Sussman J.L., Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. V. 253. N. 5022. P. 872-879.

78. Gouaux E. Channel-forming toxins: tales of transformation // Curr. Opin. Struc. Biol. 1997. V. 7. P. 566-573.

79. Parker M.W., Pattus F., Tucker A.D., Tsernoglou D. Structure of the membrane-pore-forming fragment of colicin A // Nature. 1989. V. 337. P. 93-96.

80. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa 3.0 A at resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 1310-1324.

81. Li J., Carrol J., Ellar D.J. Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution // Nature. 1991. V. 353. P. 815-821.

82. Van der Goot F.G., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. A 'molten-globule' membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A // Nature. 1991. V. 354. P. 408-410.

83. Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. The mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel paradigm for pore-forming toxins // Cell. 1999. V. 99. N 3. P. 293299.

84. Malovrh P., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Menestrina G., Anderluh G. Structure-function studies of tiyptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. J. 2000. V. 346. P. 223-232.

85. Varanda W., Finkelstein A. Ion and nonelectrolyte permeability properties of channels formed in planar lipid bilayer membranes by the cytolytic toxin from the sea anemone, Stoichactis helianthus II J. Membrane Biol. 1980. V. 55. P. 203-211.

86. Tejuca M., Serra M.D., Ferraras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilisation by sticholysin I, a cytolysin isolated from the venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus II Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1493714957.

87. Брежестовский П.Д., Монастырная M.M., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Действие гемолизина из морской анемоны Radianthus macrodactylus на эритроцитарную мембрану //ДАН СССР. 1988. Т. 299. С. 748-750.

88. Chanturiya A.N. Detection of transient capacitance increase associated with channel formation in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1026. P. 248-250.

89. Turk Т., Macek P., Gubensek F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Acta. 1992. V. 1119. P. 1-4.

90. Khoo H.E., Fong C.L., Yuen R., Chen D.S. Stimulation of hemolytic activity of sea anemone cytolysins by 8-anilino-l-naphtaIenesulphonate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 232. P. 422-426.

91. Campos A.M., Lissi E.A., Vergara C., Lanio M.E., Alvarez C., Pazos I., Morera V., Garcia Y., Martinez D. Kinetics and mechanism of St I modification by peroxyl radicals Hi. Protein Chem. 1999. V. 18. P. 297-306.

92. Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. V. 88. P. 91-142.

93. Yang L., Weiss T.M., Harroun T.A., Heller W.T., Huang H.W. Supramolecular structures of peptide assemblies in membranes by neutron off-plane scattering: method of analysis // Biophys. J. 1999. V. 77. N. 5. P. 2648-2656.

94. Sket D., Draslar K., Ferlan I., Lebez D. Equinatoxin, a lethal protein from Actinia equina II. Pathophysiological action // Toxicon. 1974. V. 12. P. 63-68.

95. Ho C.L., Ко J.L., Lue H.M., Lee C.Y., Ferlan I. Effects of equinatoxin on the guinea-pig atrium // Toxicon. 1987. V. 25. P. 659-664.

96. Drevensek G., Budihna M., Suput D., Bunc M. Nicardipine dose dependency reduces the effect of equinatoxin II on coronary flow in isolated porcine heart // Pflugers. Arch. 2000. V. 440. P. 145-146.

97. Drevensek G., Bunc M., Budihna M., Suput D. Lowering of the coronary flow in isolated rat heart by equinatoxin II depends upon extracellular Ca2+ concentration // Pflugers. Arch. 2000. V. 439. P. 150-151.

98. Bunc M., Drevensek G., Budihna M., Suput D. Effects of equinatoxin II from Actinia equina (L.) on isolated rat heart: The role of direct cardiotoxic effects in equinatoxin II lethality//Toxicon. 1999. V. 37. P. 109-123.

99. Teng C.M., Lee L.G., Lee C.Y., Ferlan I. Platelet aggregation induced by equinatoxin //Thromb. Res. 1988. V. 52. P. 401-411.

100. Thomson M., Moritz R.L., Simpson R.J., Norton R.S. Tenebrosin-A, a new cardiostimulant protein from the Australian sea anemone Actinia tenebrosa II Biochem. Intl. 1987. V. 15. P. 711-718.

101. Galettis P., Norton R.S. Biochemical and pharmacological studies of the mechanism of action of tenebrosin C, a cardiac stimulatory and hemolytic protein from the sea anemone, Actinia tenebrosa И Toxicon. 1990. V. 28. P. 695-706.

102. Khoo H.E., Lim J.P.C., Tan C.H. Effects of sea anemone (Heteractis magnifica and Actinia equina) cytolysins on synaptosomal uptake of GABA and choline // Toxicon. 1995. V. 33. P. 1365-1371.

103. Migues P.V., Leal R.B., Mantovanni M., Nicolau M., Gabilan N.H. Synaptosomal glutamate release induced by the fraction Be 2 from the venom of the sea anemone Bunodosoma caissarum // NeiroReport. 1999. V. 10. P. 67-70.

104. Bunc M., Frangez R., Horvat I., Turk Т., Suput D. Effects of Equinatoxins in vivo. Possible role of degranulation of thrombocytes and granulocytes // Ann. NY Acad. Sci. 1994. V. 710. P. 162-167.

105. Suput D., Frangez R., Bunc M. Cardiovascular effects of equinatoxin III from the sea anemone Actinia equina (L.) // Toxicon. 2001. V. 39. P. 1421-1427.

106. Batista U., Jezernik K., Macek P., Sedmak B. Morphological evidence of cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II // Period. Biol. 1987. V. 89. P. 347-348.

107. Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A new immunotoxin built by linking a hemolytic toxin to a monoclonal antibody specific for immature T lymphocytes // Int. J. Cancer. 1988. V. 142. P. 568-571.

108. Pederzolli C., Belmonte G., Dalla Sera M., Macek P., Menestrina G. Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transeferrin with equinatoxin II, a cytolysin from a sea anemone // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 166-173.

109. Batista U., Macek P., Sedmak B. The cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina II Cell Biol. Int. Rep. 1990. V. 14. N. 11. P. 1013-1024.

110. Batista U., Jezernik K. Morphological changes of V-79 cells after equinatoxin II treatment//Cell Biol. Int. Rep. 1992. V. 16. N. 2. P. 115-123.

111. Meunier F.A., Frangez R., Benoit E., Ouanounou G., Rouzaire-Dubois В., Suput D., Molgo J. Ca(2+) and Na(+) contribute to the swelling of differentiated neuroblastoma cells induced by equinatoxin-II // Toxicon. 2000. V. 38 P. 1547-1560

112. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. Degradation of red cell membrane phospholipids by sea anemone nematocyst venom//Toxicon. 1974. V. 12. P. 379-383.

113. Hessinger D.A. 1988. Nematocyst venoms and toxins // In: Hessinger D.A., Lenhoff H.M. (Eds.). The Biology of Nematocysts. Academic Press Inc. San Diego. P. 369374.

114. Grotendorst G.R., Hessinger D.A. Enzymatic characterization of the major phospholipase A2 component of sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom // Toxicon. 2000. V. 38. N. 7. P. 931-943.

115. Cline E.I. Upl: In vivo studies involving the potent cardiac stimulant and heamolysin from the sea anemone Urticinia piscivora II Phytother. Res. 1997. V. 11. P. 348-353.

116. Монастырная M.M., Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар А.А., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Действие метридиолизина из морской анемоны Metridium senile на биологические и модельные мембраны // Биол. мембраны 1988. Т. 5. № 8. С. 830-835.

117. Bernheimer A.W., Avigad L.S., Kim K.S. Comparison of metridiolysin from the sea anemone with thiol-activated cytolysins from bacteria // Toxicon. 1979. V. 17. P. 6975.

118. Gaphurov J.M., Bulgakov A.A., Galkin V.V., Rasskazov V.A. Some properties of alkaline Dnases of tentacles of actinia Radianthus macrodactylus and their hemolytic activity // Toxicon. 1999. V. 37. P. 1591-1604.

119. Harvey H.L. Cytolytic toxins // In: Shier W.T., Mebs D. (Eds.). Handbook of Toxicology. Marcel Dekker. New York. 1990. P. 1-66.

120. Menestrina G., Schiavo G., Montecucco C. Molecular mechanisms of action of bacterial protein toxins // Mol. Aspects Med. 1994. V. 15. N. 2. P. 79-193.

121. Panchal R.G. Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells // Biochem. Pharmacol. 1998. V. 55. P. 247-252.

122. Anderluh G. and Menestrina G. Pore-forming proteins from sea anemones and the construction of immunotoxins for selective killing of harmful cells // In: Fingerman M. and Nagabhushanam R. (Eds.). Bioorganic Compounds: Chemistry and

123. Biochemistry Applications. Enfield (NH) USA Science Publishers Inc. 2001. P.13I-148.

124. Монастырная M.M. Гемолизины морских актиний Radianthus macrodactylus и Metridium senile: выделение, свойства и механизм действия // Диссертация . к.х.н., Владивосток. 1988. 149 с.

125. Monastyrnaya М.М., Zykova Т.А., Apalikova O.W., Shwets T.W., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. V. 40. P. 1197-1217.

126. Kem W.R., Dunn B.M. Separation and characterization of four different amino acid sequence variants of a sea anemone (Stichodactyla helianthus) protein cytolysin // Toxicon. 1988. V. 26. P. 997-1008.

127. Bernheimer A.W., Lai C.Y. Properties of a cytolytic toxin from the sea anemone, Stoichactis kenti II Toxicon. 1985. V. 23. P. 791-799.

128. Ferlan I., Jackson K.W. Partial amino acid sequence of equinatoxin // Toxicon. 1983. V. 21. N. 3. P. 141-144.

129. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTLW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acid Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.

130. Ichikawa Т., Terada H., Determination of phenylalanine, tryptophan and tyrosine in a mixture of amino acid by 2nd derivative spectrophotometry // Chem. Pharm. Bull. 1981. V. 29. P. 438-444.

131. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism// Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 33-37.

132. Malavasic M., Poklar N., Macek P., Vesnaver G. Fluorescence studies of the effect of pH, guanidine hydrochloride and urea on equinatoxin II conformation // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1280. P. 65-72.

133. Poklar N., Volker J., Anderluh G., Macek P., Chalikia T.V. Acid- and base-induced conformational transitions of equinatoxin II // Biophys. Chem. 2001. V. 90. P. 103121.149150,151.152.153.154,155.156157158159160161

134. Mancheno J.M., De Los Rios V., Martinez Del Pozo A., Lanio M.E., Onaderra M., Gavilanes J.G. Partially folded states of the cytolytic protein sticholysin II // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1545. P. 122-131.

135. Веньяминов С.Ю., Косых В.Г., Холодков O.A., Бурьянов Я.И. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы £coRII и ДНК-метилазы EcoRII // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. № 1. С. 47-51.

136. France L.L., Kieleczawa J.J., Dunn J.J., Hind G., Sutherland J.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1120. P. 59-68.

137. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии // М.: Мир. 1986. 351 с.

138. Эфтинг М.Р. Использование флуоресцентных методов для изученияразворачивания белков // Биохимия. 1998. Т. 63. № 3. С. 327-337.

139. Alvarez С., Lanio М.Е., Tejuca М., Martinez D., Pazos F., Campos A.M., Encinas

140. M.V., Pertinhez Т., Schreier S., Lissi E.A. The role of ionic strength on theenhancement of the hemolytic activity of sticholysin I, a cytolysin from

141. Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1998. V. 36. N. 1. P. 165-178.

142. Macek P., Lebez D. Kinetics of hemolysis induced by equinatoxin, a cytolytic toxinfrom the sea anemone Actinia equina. Effect of some ions and pH // Toxicon. 1981.1. V. 19. N. 2. P. 233-240.

143. Костецкий Э.Я, Герасименко Н.И. Фосфолипидный состав и филогения иглокожих//Биология моря. 1984. № 1. С. 39-46.

144. Korn E.D., Carlier M.F., Pantaloni D. Actin polymerization and ATP hydrolysis // Science. 1987. V. 238. P. 638-644.

145. Smith P.R., Fowler W.E., Pollard T.D., Aebi U. Structure of the actin molecule determined from electron micrographs of crystalline actin sheets with a tentative alighnment of the molecule in the actin filament // J. Mol. Biol. 1983. V. 167. P. 641660.

146. Ishikawa H., Bischoff R., Holtzer H. Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types // J. Cell Biol. 1969. V. 43. P. 312-328.164. IAsys manual. 1993.

147. Gremm D. and Wegner A. Co-operative binding of Ca2+ ions to the regulatory binding sites of gelsolin // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 330-334.

148. Lowiy O.H., Rosebrough N.J., Fearr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

149. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-682.

150. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // In: Hirs C.H.W., Timasheff S.N. (Eds.). Methods in Enzymology. 1972. V. 25B. Acad. Press. New York. London. P. 121-139.

151. Беленький Б.Г., Ганкина E.C., Нестеров B.B. Экспрессный ультрачувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // ДАН СССР. 1967. Т. 172. С. 91-93.

152. Allen G. Amino acid analyses // In: Burdon R.H., Van Knippenberg P.H. (Eds.). Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Sequencing of Proteins and Peptides. Elsevier. Amsterdam. New York. Oxford. 1989. 40 p.

153. Hunkapiller M.W., Hood L.E. Direct microsequence analysis of polypeptides using an improved sequenator, a nonprotein carrier (polybrene), and high pressure liquid chromatography // Biochemistry. 1978. V. 17. N. 11. P. 2124-2133.

154. Awdeh Z.L., Williamson A.R., Askonas B.A. Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its application to immunoglobulins // Nature. 1968. V. 219. P. 66-68.

155. Vascovsky V.E., Suppes Z.S. Phospholipases of marine invertebrates. I. Distribution of phospholipase A // Сотр. Biochem. Physiol. 1972. V. 43. P. 601-609.

156. Muller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phis. Chem. 1963. V. 67. P. 534-535.

157. Бузников Г.А., Подмарев B.K. Методы биологии развития // М.: Наука. 1975. С. 188-222.

158. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 2303-2308.

159. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

160. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

161. Winder A.F. and Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spectrophotometric protein determinations // Biopolymers. 1971. V. 10. N. 7. P. 1243-1251.

162. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server//Nucleic Acids Research. 2003. V. 31. P. 3381-3385.

163. Stayton P.S., Sligar S.G. The cytochrome P-450cam binding surface as defined by site-directed mutagenesis and electrostatic modeling // Biochemistry. 1990. V. 29. N. 32. P. 7381-7386.

164. Schuck P. Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. V. 26. P. 541-566.