Структура О-антигенных полисахаридов PSEUDOMONAS AERUGINOSA серогруппы 02 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ хиглии 1шени Н. Д. Зелинского

На правах рукописи

УДК: 579.841 Л 1.577.114.5.543.422.23

ПАРАМОНОВ Николай Альбертович

СТРУКТУРА О-АНТИГЕННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA СЕРОГРУППЫ 02

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных вешестп

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории Химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР.

Научные руководители: академик Н. К. КОЧЕТКОВ, ст. н. сотр., д. х. н. Ю. А. КНИРЕЛЬ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Э. П. СЕРЕБРЯКОВ, кандидат химических наук В. В. ДЕРЯБИН

Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Защита состоится ¿.Ъ о(11£ОоРЯ 1991 г. в

час. на

заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в ИОХ АН СССР (Москва, 117913, Ленинский проспект, 47, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ АН СССР.

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета К 002.62.02

доктор химических наук Н. Я. ГРИГОРЬЕВА

Актуальность проблемы. Условно-патогенный микроб Pseudomonas aeruginosa является возбудителем тяжелых гнойно-септических осложнений у больных, пострадавших от ожогов или перенесших хирургические операции. В связи с часто встречающейся высокой устойчивостью штаммов Р. aeruginosa к антибиотикам наиболее перспективными являются иммунологические методы борьбы с вызыаемой ими инфекцией, для. успешной разработки которых необходимо детальное изучение поверхностных типоспецифических О-антигенов - липополисаха-ридов (ЛПС). Важное значение имеет, в частности, создание на основе ЛПС классификационной схемы P. aeruginosa. Однако, предложенные к настоящему времени многочисленные серологические охемы включают различное число серогрупп и серотипов, во многих деталях противоречат друг другу, и ни одна из них не стала общепринятой.

Особые трудности вызывала классификация одной группы серологически родственных штаммов, пять из которых объединены в схема Ла-ни-Бергйна в серогруппу 02. Согласно другим классификационным схемам, штаммы этой группы образуют от двух до шести серотипов. Такие противоречия связаны с тем, что' 0-антигены этой группы штаммов имеют очень близкие, но не идентичные структуры. Тагам образом, химическое исследование О-антигенов P. aeruginosa является актуальным. Оно позволит связать тонкую структуру их полисахаридных цепей с серологической специфичностью штаммов и решить на молекулярном уровне вопросы классификации этого микроорганизма. Полученные данные будут полезными при создании искусственных антигенов с пониженной токсичностью и протективных вакцин на их основе.

Цель работы. Целью настоящей работы было установление строения О-антигенных полисахаридов штаммоз P. aeruginosa, относящихся к cof «группе 02 класификационной схемы Лани-Бергана, и родственных штаммов и создание на осноио этих данных химической базы для единой классификации P. aeruginosa.

Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенного исследования впервые установлены полные структуры повторяющееся звеньев трех О-специфических полисахаридов (О-антигенов) и исправлено строение исследованных ранее четырех О-антигенов штаммов P. .aeruginosa, входящих в, серогруппу 02 классификации Лани-Бергана, и родственных штаммов. На основании этих данных на молекулярном уровне показана необходимость расширения этой серо-группы за счет включения в нее в качестве самостоятельных 0-серо-типов штамма 025 классификации Вокача и иммунотипа 7 классификационной схемы Фишера. В О-антигенах Р. aeruginosa исследованной се-рогруппы впервые в природе идентифицированы необычные моносахариды,- «вносящиеся к новому классу аминосахаров, - З-ацетамидино-2-

I

ацетамидо-2,3-дидозоксиуроновые кислоты с д-ланно- и L-гудо-конфи-гурацией. Исправлено строение обнаруженного ранее D-лднно-изомера, для которого была ошибочно предложена бициклическая структура.

Для надежной идентификации ацетамидиновых производных диамино-уроновых кислот было впервые применено восстановительное дезамини-рование к масс-спектрометрия бомбардировки ускоренными атомами (БУА). Для подтверждения их строения осуществлен синтез модельного моносахарида, содержащего ацетамидиновую функцию, и проведен сравнительный анализ его химических и физико-химических свойств со свойствами найденных нами природных аналогов.

У ряда полисахаридов серогруппы 02 впервые в О-антигенах выявлена замаскированная регулярность, связанная с нестехиометричес-кой эпимэризацией по С5 производных диаминоуроновых кислот.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киов, 1986).

Публикации. Основной материал изложен в 10 публикациях- в отечественных и международных куриалах.

Объеы и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ("О-Специфические полисахариды грам-отрицатель-ных бактерий"), обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (2J¿ссылок).

Общий объем диссертации/SZ-CTp., включая табл. и £ рис.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первом разделе описаны выделение О-антигенов Р. aeruginosa серогрупы 02, их характеристика и подход к их структурному анализу. Во втором разделе приведен ход структурного исследования 0-специфических полисахаридов P. aeruginosa. Третий раздел посвящен связи химических структур О-антигенов с серогруппированием штаммов P. aeruginosa серогрушш 02, и четвертый - синтезу модельного моносахарида - метил-З-ацетамидино-З.б-дидезокси-а-Ь-глюкопиранози-да и изучению его химических и спектральных свойств.'

1. Выделение, характеристика и подход к структурному анализу О-снецифических полисахаридов Р. aeruginosa.

О-Специфические полисахариды были получены из штаммов P. aeruginosa серогрупгш 02 классификации Лэни-Бергана, а также из серологически родственных штаммов классификационных схем Вокача (серо-тип 025) и Фишера (иммунотилы 3 и 7). ЛП0 выделяли экстракцией бактериальных клеток 45%-ным водным фенолом с последующим диализом объединенных водного и фенольного слоев. ЛПС очищали путем осаждения нуклеиновых кислот цетавлоном и переосаждения JHIC из водного раствора избытком этанола, затем кислотолабильную связь между углеводной и липидной частью ЛПС расщепляли гидролизом 1% СНдСООН (I00°, 2-6 ч). Последующая гель-хроматография углеводной фракции на теф'лдоксо Q-50 приводила к О-сггецифичоским полисахаридам с выходом >:n-?£Z от коса Л1Ю.

ь-Специфические полисахариды серотитлз 02а,¿Ь, 0(2а),2с, Ü'a,2d

и 02a.2d.2e были исследованы в ИОХ АН СССР ранее. Было найдено, что они построены из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих по одному остатку И-ацетил-Б-фукозамина, 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-И-манн- или -Ь-гулуроновой кислоты и 2,3-(1-ацетил-2-метил-2-имидазолино)-2,3-дидезокси-Г-майнуроновой кислоты. Эти же моносахариды входили в состав О-антигена серотипа 0(2а),2с1,2Г, однако в его структуре отсутствовала истинная регулярность и его счроение осталось неустановленным.

1 ч

На основании данных кислотного гидролиза и С-ЯМР-спектроско-пии, впервые выделенные нами О-антигены иммунотипов 3 и 7 схемы ршпера и серотипа 025 классификации Вокача характеризуются аналогичным моносахариднш составом. Ряд данных заставил нас, однако, усомниться в правильности установления строения' моносахарида с имидазолиновым циклом. В связи с этим, кроме установления строения новых полисахаридов, нами было проведено повторное исследование четырех анализировавшихся ранее О-антигенов и структура имидазоли-нового производного маннуроновой кислоты была пересмотрена в пользу ациклического ацетамидинового производного.

' Для структурного анализа в нашей работе использовался подход, основанный на сольволизе полисахаридов безводным НР с последующим установлением, строения полученных олигосахаридов химическими и спектральными методами. В дополнение к применявшимся ранее методам химической модификации олигосахаридов (боргидридное восстановление, щелочной гидролиз), было использовано, восстановительное деза-.

1 14

минирование, а наряду с Н- и С-ЯМР-спектроскопическш анализом использовалась масс-спеетрометрия БУА.

2. Структурный анализ о-специфических полисахаридов Р. аегудьюза. 2.1. 'Идентификация' 3-ацетамидшю-2-ацетамидо-2.3-диде?окси-Р-ман-нуронсвой кислоты в полисахариде иммунотипе 3 и пересмотр структур полисахаридов серотипов 02а,2Ъ. 0(2а).2с, 02е,?Л и 02а.2й,2е.

При действии пэ О-спе цифический полисахарид иммунотипа 3 безводного № образовался трисахарид 1 (схема 1), идентичный про- ' дукту аналогичной обработки полисахарида серотипа 0(2а),2с. Восстановлением трисахарида 1 действием МаВН4 был получен олигосаха-

ркд 2, щелочной гидролиз которого привел к олигомеру 3. При пере-

1 ч

ходе от трисахарида 1 к олтггоспхариду 2 в С-ЯМР-спектрах наблюдалось изменение положения сигналов С1 и Сб остатка Н-ацетилфуко-замина (звено С), а химические сдвиги сигналов ацетамидиновой группы при 2тЬ:.1 по изменялась (0П 2,28 ы.д.; 5С 1Э,Э м.д., СНд, и 167,3 м.д., И=с-Н). Образование олигомера 3 сопровождалось исчезновением сигналов ацетамвдиновой группы и появлением сигнала пятой Н-ацетильной группы (0С 23,3 м.д.) в дополнение к уже. имеющимся четырем сигналам. Действие ЫВН^ на олигосахарид 2 в водном изо-пропаноле приводило к восстановительному дезаминированию ацетами-дипового производного с образованием олигосахарида 4, в котором

звено Л представляло собой 2-ацетамидо-2,3-дидезокси-3--этилвмино-

1 1 я

маннуроновую гаслоту. В соответствии с этим в Н- и С-ЯМР-спек-трах наблюдалось исчезновение характеристических сигналов ацетэми-дцпювой группы и появление сигналов этил аминогруппы 1,28 м.д-, г, ,Т, ? 7 Гц, СНд, 3,14 М.Д., , 3,40 м.д., ¿я, Г 12 Гц, си^; 5Г 11,6 М. Д., СНд, 42,5 М.Д., СН^).

В масс-спектрах БУА олигосахаридов 1, 2 и 3 присутствовали пики ионов СМ+Н]+, соответствующие молекулярным массам этих соединений 720, 722 и 723. До соответственно. Молекулярные массы олигосахаридов 1 и 2 не отвечали ранее предложенной структуре звена А как' 2-ацетамздо-З- (1 -ацетил-2-метил-2-имидазолино)-2,3-дадезокси-р~В-мгшнуропоьол кислоты (олигосахарид 5 на схеме ,1), а показывали, что оно ссдорзт одну И-ацетильную и одну Л-ацетимидоильную грушу (струигурн •>• Такая структура согласуется как с данными 1Н- и !'!(ЛиЛР-спектроь, так и с результатами вышеописанных химических

превращений трисахарида 1 и модельного соединения (см. раздел 4).

Значительное смещение сигнала СЗ от 57,5-57,7 м.д. к 54,6 и 61,4 м.д. при переходе от олигосахаридов 1 и 2 к биозидам 3 и 4 соответственно и от 57,7 м.д. к 55,7 м.д. при переходе от соединений 1 и 2 к исходному полисахариду за счет гликозилирования звена А остатком N-ацетилфукозамина в положение 4 однозначно подтверждало положение N-ацетимидоильной группы при N3 звена А в олигосаха-ридах 1 и 2, а, следовательно, и в полисахариде иммунотипа 3.

р-1>-Ман*о-конфигурация вцетамидинового производного была установлена ранее при структурном анализе О-специфического полисахарида P. aeruginosa серотипа 0(2а),2с, идентичного то данным 1 з

С-ШР-спектра полисахариду иммунотипа 3. Следовательно, как этот О-антиген, так и остальные ранее исследованные полисахариды содержат 3-ацетамидино-2-ацетамидо-2,3-дидезокси-1)-маннуроновую кислоту, и строение повторяющихся звеньев остальных О-антигенов ?. aeruginosa серогруппы 02 должно быть пересмотрено в соответствии с внесенными изменениями в структуру 0-антигена 0(2а),2с, как показано на стр. 19. Причина ранней ошибочной идентификации этого моносахарида связана с близостью ЯМР-характеристик и химического поведения циклического и ациклического ацетамидиновых производных, однозначный выбор между которыми оказался возможным только с применением масс-спектрометрии БУА.

2.2. Структура полисахарида серотипа 025 классификации Вокача.

113

Путем сравнительного анализа Н- и С-ЯМР-спектров 0-антигена серотипа 025 классификации Вокача с полисахаридами- серогруппы 02

был сделан вывод, что он построен из трисахзридных повторяющихся звеньев, содержащих диацетамичное и ацетамидиновое производные ди-аминоуроновой кислоты и N-ацетилфукозамш и несущих 0-эцетильную группу (бп 1,9 м.д., ос 21,5 м.д., CHgj. При обработке этого полисахарида водным триэтиламином был получэн модифицированный полиса-

харид, в котором отсутствовала О-ацетильная группа, а Л-ацетимидо-ильная группа превратилась в Л-ацетильную группу (схема 2).

Сравнительный 13С-ЯМР-спектральный анализ этого модифицированного полисахарида и обработанного аналогичным образом полисахарида серотипа 02а,2Ь указывал на их полную идентичность, и, таким образом, отличие между соответствующими исходными полисахаридами связано с присутствием или отсутствием О-ацетильной группы.

И ш Ас серотип 025 Я - Н серотип 02а,2Ь

НМс

Схема 2

Положение 0-ацетильной- группы при С4 остатка Л-ацетилфукозамина

в полисахариде серотипа 025 было определено при использовании се-

п 1

лективного гетероядерного СС Н> двойного резонанса. Так, при облучении Н4 звена С, сигнал которого смещен в слабое поле к 5,18 м.д. за счет дезэкранирующего эффекта ацетокси-группы, был получен единственный ответ на углеродном сигнале при 72,1 м.д., принадлежащем С4 остатка Н-ацетилфукозамина. Этот вывод подтвераден анали-

1 з

зом а- и р-зффектов ацетилирования в С-ЯМР-спэктрах полисахаридов серотипов 025 и 02а,2Ь, которые составили +1,8 м.д. (смещение

-9в слабое поле) на С4 остатка N-ацетилфукозамина и -2,5 и -1 м,д. (сдвиг в сильное поло) на СЗ и С5 этого моносахарида.

Таким образом, установлено строение О-специфического полисахарида серотипа 025 классификации Вокача, представляющего собой первый обнаруженный бактериальный полисахарид, не содержащий в повторяющемся звено ни одной свободной гидроксильной группы.

2.3. Идентификация 3-ацетамидино-2-ацетамидо-2,3-дидезокси-Ь-гулу-

ропсгой кислоты в полисахариде и.ммуногипа 7 и структурный анализ этого полисахарида.

В результате сольволиза HF 0-антигена иммунотипа 7 (схема 3) в . качестве единственного продукта был выделен олигосахарид 6. Сравнительная характеристика спектральных данных трисахаридов 6 и 1 показала, что трисахарид б также содержит два производных диамино- . уроновых кислот (звенья А и В), одно из которых несет N-ацетимидо-ильную группу, и остаток N-ацетилфукозамина на восстанавливающем конце. Таким образом, б представляет собой повторяющееся ЗЕено полисахарида, а отличие между трисахаридами 1 и б скорее всего связано с различиями в конфигурации звеньев А и/или В.

Трисахарид б был обработан NaBH^ в годе, что дало олигомер 7, в 1 3

котором по данным С-ЯМР-спектра произошло восстановление остатка N-ацетилфукозамина в N-ацетилфукозамйнитол (звено С); это проявилось в смещении сигнала' CG от 16,5 м.ц. к 19,3 м.д., исчезновении сигналов cía и С1р при 92,3 и 96,0 м.д. и появлении сигнала С1 при 61,9 м.д..Кроме того, при этой обработке произошло восстанови-' тельное дезаминирование N-ацетимидоильной' группы в N-этильную группу, о чем говорило исчезновение сигналов ацетамидановой функции (ед 2,42 м.д.; бс 20,6 мл., CHg, 167,8 м.д., N=C-N) и появление сигналов этиляминогруппы (SR 1,37 м.'д., CHg, t, J1 п 7,1 Гц, 3,25-3,4? м.д., CHg, ш; бс 10,9 м.д., СНд, 45,1 м.д., 011ц). С помощью этой же реакции восстановления с использованием NaBD, олиго-

ЕМ

в с ИМЛс

. Нр! иммунотип 7

МаВН4-Н3Б03

Схема 3

модифицированный полисахарид

адон

-НМАс.

:нгон НМАс

0

1

сахарид 6 был превращен в продукт 8, являющийся аналогом олигомера

7, в котором протоны СНз этиламиногруппы и один из протонов при С1

звена С замещены атомами дейтерия. Для получения восстановленного

олигомера, сохраняющего ацетамидиновую функцию, олигосахарид б был

обработан КаВН^ в насыщенном водном растворе НдВОд, в результате

1

чего был получен олигосахарид 9, С-ЯМР-спектр которого содержал сигналы С1 и С6 11-ацетилфукозаминитола при 61,9 и 19,3 м.д. соответственно и сохранял характерные сигналы Л-ецетимидоилъной группы при 20,6 и 167,8 м.д. Олягомэр 9 бил далее превращен действием водного триэтиламина в олигосахарид 10, в котором присутствовало пять М-ацетильных групп. Строение всех полученных олигомеров было ' дополнительно подтверждено определением их молекулярнцх масс по данным масс-спектров БУА.

Относительные конфигурации звеньев А и В в биозиде 7 были определены при анализе его 1 Н-ЯМР-спектра, расшифрованного с использованием селективного гомоядерного двойного резонанса. Так, из значений КССВ Л", 5 4,0, 10",0 и 10,0 Гц соответстве но следовало, что звено В имеет р-июнно-конфигурацию, а по данным КССВ 5' 3,0 и 3,0 ^ был сделан вывод об а-гуло-кон-фигурации звена А. Характерные химические сдвиги сигналов С2 и СЗ звена А при 47,3 и 58,0 м.д. и звена В при 52,2 и 54,2 м.д. соответственно показывали, что оба моносахарида являются производными 2,3-диамино-2,3-дидезоксиуроновых кислот'.

Структура олигосахарида 7 была определена при помощи экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера, показавших, что звено А замещает звено В в положение 4, а звено В связано со звеном С 1,3-гликозидной связью. Положение этильной группы было 'определено пре-доблучением ее метильшх протонов, вызвавших ответ на НЗ звена А. что однозначно доказывало ее положение при N3 этого моносахаридно-го остатка. Этот вывод был подтвержден путем анализа изменений хи-

мического сдвига СЗ звена А в 13С-ЯМР-спектрах олигосахаридов 7, 9 и 10. Характерные слабопольный и сильнопольный сдвиги от 54,6 м.д. в олигосахариде 9 к 53,0 м.д и 51,6 м.д. в олигосахаридах 7 и 10 отвечали превращению Л-ацетимидоильной группы в Ы-этильную и Л-ацетильную группу соответственно. Следовательно, звено А в олигосахариде б представляет собой остаток З-ацетамидино-2-ацетамидо-2,3-дидезоксигулуроновой кислоты, а звено В является остатком 2,3-диацетамидо-2,3-дидезоксиманнуроновой кислоты.

Абсолютные конфигурации остатков диаминоуроновых кислот опреде-

1 3

лялись при анализе эффектов гликозилирования в С-ЯМР-спектре •трисахарида б с использованием известных закономерностей. Так, на С4' рвена С (остатка Л-ацетил-Ю-фукозамина) наблюдался малый р-эффект (-0,9 м.д.), выззанный его гликозилированием звеном В (остатком 2,3-диацетамвдо-2,3-дидезокси-р-маннуроновой кислоты) в положение 3, в результате чего был сделан вывод о Б-конфигурации звена В. р-Эффект на СЗ звена В, вызванный его гликозилированием звеном А (производным 2,3-диамино-2,3-дидезокси-а-гулуроновой кислоты) в положение 4, составил величину -1,0 м.д., что свидетельствовало об Ь-конфигурации звена А.

Вывод об а-конфигурации звена С в полисахариде иммунотипа 7 был сделан на основании положения сигнала С1 в 13С-ЯМР-спектре при 95,5 м.д., а также из значения КССВ «ГС1 Н1 169,2 Гц. Значения КССВ 171,1 и 162,8 Гц, определенные для сигналов С1 звена А при 99,9 м.д. и звена В при 101,0 м.д. подтверждали а- и р-конфигурацшо ■ этих звеньев соответственно. Эффекты гликозилирования звена А остатком Л-ацетил-Б-фукозамина (а-эффект на С4 +3,3 м.д. и р-эффект на СЗ -4,6 м.д.; определены сравнением ■3С-ЯМР-спектров полисахарида" и трисахарида 6) подтверждали 1-конфигурацию звена А.'

Таким образом, повторяющееся звено О-специфического полисахарида Р. аегщШоаа иммунотипа 7 имеет структуру, показанную на

схеме 3.

2.4. Структурный анализ полисахарида серотипа 0(2а),2с1,2:С.

13С-ЯМР-спектр (рис.) полисахарида серотипа 0(2а),2й,2Х содержал две серии сигналов с соотношением интегральных интенсивностей и указывал на его нерегулярный характер. Ио присутствию ряда характеристичных сигналов был сделан вывод, что в состав этого полисахарида, как и в состав остальных полисахаридов серогруппы 02, входят П-ацетилфукозамш! и производные диаминоуроновых кислот, включая Ы-ацетимидоильное производное- Кроме того, спектр содержал сигналы 0-ацетильных групп (Зс 21,1-21,5 м.д., СНд).

Рис. 'Зс-ямр-спектр О-специфического полисахарида }'. аеги£1поза серотипа 0 (2а) ,2с1,2Г.

С целью превращения ацетамидиновых групп в ацетамидные и удаления О-ацетильных груш полисахарид серотипа 0(2а),2(1,21 был обработан водным тризтиламином (сх-зма 4). Анализ 13С-ЯМР-спзктра модифицированного полисахарида показал, что он также содержал две

rIh, rIcooh

R=OOOH, iäH

HF

cepoTim 0(2a),2d,2f

11 R=H, R=COOH 1Z R=COOH, RIH

COOH

uri \NH HNV. yVNH HN/ HOHO \i itrc. Ac^L—Yflc

B 13

:H2OH

-HNAC. -OH

различагациеся по интенсивности сер!.1 сигналов, причем спектр, образованный сигналами преобладающей серии, был практически идентичен спектру аналогично модифицированного полисахарида иммунотипа 7, а минорная серия сигналов представляла собой спектр обработанного водным три этил амином полисахарида серотипа 02а,2(1. На основании этого было сделано предположение о "гибридной" структуре 0-ан-тигенного полисахарида серотипа О(2а) ,2<Х,21.

Для подтверждения этого исходный и модифицированный полисахариды были подвергнуты сольволизу безводным НР. В результате из исходного полисахарида была получена смесь олигосахаридов 11 и 12, которые по данным 13С-ЯМР-спектров являлись трисахаридами и содержали все моносахаридные и неуглеводные компоненты полисахарида 0(2а),2(1,2Г за исключением О-ацетильных групп. Кроме того, было наедено, что 11 идентичен олигосахариду 6, полученному сольволизом НЕ' 0-антигена иммунотипа 7, а 12 - продукту 1гроведенного ранее сольволиза НР полисахарида серотипа 02а,2й.

Смесь олигосахаридов 11 и 12 была восстановлена ИаВН^ с образо-

1 ^

ванием смеси биозидов 13 и 14. Из данных С-ЯМР-спектра получен-ченной смеси следовало, что биозид 13 идентичен олигосахариду Т, полученному при восстановлении олигосахарида б, и содержит, таким образом, остатки Н-ацетилфукозаминитола, 2,3-диацетамидо-2,3-

дидезоксиманнуроновой кислоты и 2-ацетамидо-2,3-дидезокси-3-

1 ч

этиламиногулуроновой кислоты. При анализе С-ЯМР-спектров олиго-меров 12 и 14 был сделан вывод, что в их состав входят два произ- ' водных 2,3-диамино-2,3-дидезоксиманнуроновой кислоты, одно из которых несет Л-ацетимидоильную группу в положении 3, а второе является ди-Ы-ацетильным производным. Превращение Ы--ацетшидоильноЙ группы производного гулуроновой кислоты в Н-этильрую группу при превращении 11 в 13 и ее сохранение в производном маннуроновой кислоты при превращении 12 в 14 согласуется с различием в химичес-

ком поведении этой группы, наблюдавшимся при анализе полисахаридов иммунотипов 3 и 7 (см. разделы 2.1 и 2.3). Вероятнее всего оно связано с ее аксиальной ориентацией в одном случае и экваториальной в другом. При обработке смеси 13 и 14 водным триэтиламином получена смесь непрореагировавшего 13 и олигомера 15, в котором вместо М-ацетимидоильной группы присутствует Н-ацетильная группа.

При сольволизе безводным ИГ модифицированного действием водного триэтиламина О-антигена 0(2а),2с1,2Г были также получены два олиго-сахарида 16 и 17 (схема 5). Их восстановление КаВН^ привело к смеси идентифицированных ранее биозидов 10 и 15 (схемы 3 и 4).

Полисахарид 0(2а),2с1,2Г

НР

А

В

>2.

С

ю и1=н, и2=соЬн

15 Н1=С00Н, Н2=Н

А

в

с

Схема Б

Полученные данные показывали, что модифицированный 0-антиген 0(2а),2(1,21 построен из трисахаридных звеньев двух типов. Рвеньл первого типа, представленные в большем количестве, идентичны повторяющимся звеньям аналогично модифицированного О-специфического

полисахарида иммунотипа 7, а звенья второго типа совпадают с повторяющимися звеньями модифицирозагаюго о-антигена 02а,2й.

Локализация О-ацешльной группы в положении 4 остатка

И-ацетилфукозамина в полисахариде серотипа 0(2а),2(1,21 была прове-

1 ^

депа путем сравнительного анализа С-ЯМР-спектров исходного и модифицировашого полисахаридов, а также О-антигенов иммунотипа ,7 и серотипа 02а,2(1 с учетом а- и р-эффектов ацвтилировашя.

Таким образом, 0-антиген серотипа 0(2а),2й,21 можно рассматривать как полисахарид с замаскированной регулярностью, построенный из трисахаридных звеньев двух типов, причем одни из них идентичны повторяющимся звеньям О-антигена иммунотипа 7, а другиз - серотипа 02а,2(1 с единственным различием, заключающимся в присутствии 0-ацетильной группы при С4 остатка П-ацетилфукозамина. Такая структура может быть результатом особенности биосинтеза, включающего, по-видимому, стадию частичной эпимеризации по С5 Н-адетжащоилыю-го производного р-Б-маннуроновой кислоты з п&рвэтно синтезированном регулярном полисахариде с р-В-ж»шо-конфигурацяей обоих остатков уроновых кислот с образованием производного а-Ь-гулуроновой

1 ч

кислота. Интересно, что по данным С-ЯМР-спектров другие 0-ан-тигенн, содержащие производные 2,3-диамино-2,3-дйдезокси-Ь-гулуро-новой кислоты, (серотипов 02а,2Ь, 025, шадунотипа 3) наряду с основным типом трисахаридных звеньев включает небольшое количество (около 10%) звеньев, в которых производное а-Ь-гулуроновой кислоты замещено соответствующим производным р-Б-маннуроновой кислота. Этот тип нерегулярности характерен для некоторых полисахаридов водорослей и внеклэточных полисахаридов бактерий, тогда как у 0-ан-

тигенов он обнаружен впервые.

3. Строение О-антигенов как молекулярная основа классификации Рашктотюз аепщ1поза серогруппы 02 и родственных штаммов.

Как следует из проведенного исследования, О-антигены Р. аепщ1-поза серогруппы 02 и родственных штаммов имеют одинаковый или очень близкий моносахаридный состав и сходную структуру, отличаясь только отдельными элементами строения (стр. 19). Так, все семь изученных О-антигенов построены из трисахаридных повторяющихся звеньев, включающих два производных 2,3-диамино-2,3-дидезоксиуро-новых кислот и М-ацетил-Б-фукозамин, а вариации связаны с присутствием или отсутствием О-ацетильных групп, с заменой одного из изомеров уроновой кислоты на другой (р-Ъ~манно- на а-Ъ-гуло- или наоборот) и/или с изменением конфигурации гликозидной связи Ы-ацетил-Б-фукозамина. При этом во всех О-антигенах строго сохраняется последовательность моносахаридных остатков, при которой 2-Н--ацетил-3-Н-ацетимидоильное производное 2,3-диамино-2,3-диде-зоксиуроновой кислоты Замещает 2,3-ди-11-ацетильное производное в положение 4, а оно, в свою очередь, присоединено к остатку Н-аце-тилфукозамина в положение 3.

Полученные в настоящем иссследовании данные показывают, что с химической точки зрения классификационная схема Лани-Бергана, в которой выделены серотипы 02а,2Ь, 0(2а),2с, 02а,2(1, 02а,2(1,2е и 0(2а),2с1,21, является наиболее обоснованной по сравнению с другими схемами, не дающими такой тонкой дифференциации штаммов. Получила также обоснование на уровне структур О-антигенов целесообразность предложенного Акатовой и Смирновой включения серотипа 025 Бокача в серогруппу 02 в качестве самостоятельного серотипа 02а,2Ь,2е.

Что касается серологически родственных серогруппе 02 штаммов классификации Фишера,' то 0-антиген •иммунотипа 3 имеет такую же структуру, что и 0-антиген серотипа 0(2а),2с, в то время как для

COÛH

HN Г" _

cooH

i

-0

<\ Уч

l\NH HN/

зЧ—Уас

„NH HNx

Ac\__y Ac

HNAc

серотип 02a,2b

HN

CH5C,

COOH

■ \V,W Hli)6 "Vx^H HNV -ON—/Ас Ac\| VAc

HNAc,

HN ÇÛÛH COOH CH.,

/ V hq/4

\NH HNx. -0 4__J^Ac

HNAc

серотип 0(2a),2c = иммунотип 3

серотип 02a,2d

HNAc

серотип 02a,2d,2e

Вокач 025 s серотип 02a,2b,2e

HNAc

R^H, R2=C00H

r'=cooh, r2=h

иммунотип 7

серотип 0(2a),2d,2í

иммунотипа 7 такой корреляции не наблюдается. Согласно серологическим данным, иммунотип 7 попадает в серотип 02a,2d, однако его 0-антиген отличается присутствием 3-ацетамидино-2-ацетамидо-2,3-дидезокси-Ь-гулуроновой кислоты в качестве основного компонента, тогда как в состав 0-антигена серотипа 02а,2d входит соответствующий D-ланно-изомер. Из этих данных следует вывод о том, что серо-группа 02 Лани-Бергана должна быть расширена за счет включения в нее иммунотипа 7 Фишера в качестве самостоятельного, седьмого 0-серотипа. Таким образом, полученные данные по структурам 0-анти-1'внов представляют собой химическую основу для классификации серо-группы 02, язляющейся частью общей классификации P. aeruginosa.

4. Синтез и свойства метил-З-ацетамидино-З.б-дидезокси-а-Ь-глюко-пиранозида.

М-Ацетимидоильные производные 2,3-диамино-2,3-дадезоксиуроновых кислот, идентифицированные в составе О-антигенов P. aeruginosa св-рогрупш 02, не были выделены в свободном виде, и их структуры били установлены при исследовании содержащих их полисахаридов и оли-госахаридных фрагментов на основании не описанных ранее в ряду углеводов данных ШР-спектров и химических превращений N-ацетимидо-ильной группы в водной среде (щелочного гидролиза в ацетильную группу и восстановительного дезаминирования в этильную группу). В связи с этим для подтверждения строения N-ацетимвдоильной функции был предпринят синтез и последующее изучение химических и спектральных свойств модельного соединения - метил-3-ацетамидино-3,6-ди-дезокси-а-Ь-глнжопиранозида (18, схема 6).

МетшьЗ.б-дидезокси-З-нитро-а-Ь-глюкопиранозид (19), полученный из метал-а-Ь-рамнопиранозида по известной методике, восстановлением скелетным никелем Ренея был превращен в метил-3-амино-3,6-диде-зокои-а-Ь-глюкопиранозид (20), строение которого было подтверждено с.юктрплышми дашшми, положительной реакцией с ниш'идрином и

И-ацетилированивм с образованием метил-3-ацетамидо-3,6-дидезокси-а-Ь-глюкопиранозида (21). И-Адвтимидоилирование аминосахара 20 было проведено действием зтилацетимидата, и полученный моносахарид 18 был выделен с помощью ионообменной ВЭЖХ.

Строение моносахарида 18 подтверждено данными 1Н- и 13С-ЯМР-спехтров, в которых присутствовал сигнал Л-ацетимидоилъной группы (бн, 2,27 м.д.; бс 20,5 м.д., СНд, 168,6 м.д., Н=С-Н). В 'н-ЯМР-спектрах исследованных природных Н-ацетимидоильных производных сигнал СНдО(=Ю лежит в области 2,17-2,42 м.д., а в 13С-ЯМР-спект-рах - при 19,6-20,9 м.д., (СНд) и 167-168,4 м.д. ( 11=0-11). Таким образом, как в модельном, так и в природных соединениях химические сдвиги сигналов Ы-ацетимидоильной функции находятся в сравнительно узком интервале, являющемся характеристическим для этого класса производных моносахаридов.

Схема 6

При действии водного триэтиламина ацетамидиновое производное 18 гидролизовалось в соответствующее ацетамидное производное, идентичное соединению 21, полученнсму Ы-ацетилированием моносахарида 20. Соединение 18 не вступало в реакцию восстановительного дезьми-

нирования при действии NaBH4 в воде, но восстанавливалось LiBH4 в

водном,изопропаноле с образованием метил-з.б-дидезокси-з-этилами-

1 п

но-а-Ь-глюкопиранозида (22), Н- и С-ЯМР-спектры которого показали исчезновение сигналов N-ацетимидоильной группы и появление сигналов N-этильной гру1шы . (öH 1,45 м.д., t, J1 2 с%>

3,42 м.д., q, CHgl öc 12,6 м.д., CHg, 43,2 м.д., CHg), а также смещение сигналов пиранозного цикла (НЗ от 3,86 к 3,62 м.д., СЗ от 59,5 к 62,1 м.д).

Щелочной гидролиз и восстановительное дезаминирование изученных в настоящей работе природных олиго- и полисахаридов, несущих Н-ацетимидоильную i'pynny при СЗ 2,3-диамино-2,3-дидезоксиуроновых ' кислот, протекали по тому же пути и приводили к аналогичным продуктам, причем как модельное соединение 18, так и природные D-лзнно-производные, в которых ацетамидиновая группа занимает экваториальное положение, не восстанавливались NaBH4 в отличие от L-гудо-изомеров, и для их восстановительного дезаминирования необходимо использовать Ь1ВН4. Хорошо коррелировали также изменения в

1 о -

1°С-ЯМР-спектрах природных соединений и синтетического аналога 18, сопровождающие превращения N-ацетимидоильной группы в N-этильную и N-ацетильную группы.

Таким образом, синтез и исследование модельного соединения подтвердили отроение моносахаридов с N-ацетимидоильной группой, впервые обнаруженных в природе в качестве компонентов полисахаридов Р. aeruginosa серогруппы 02. Полученные даные могут быть использованы для идентификации других представителей этого класса Сахаров.

вывода

1. Установлены полные структуры повторяющихся звеньев семи 0-спе-цифических полисахаридов, продуцируемых Pseudomonas aeruginosa се-, pnrpymiu 02 и серологически родственными штаммами. ?. Со.чд.-ц;п молекулярная основа классификации штаммов РашЬжопп.ч •

aeruginosa серогрупгш 02 и даны рекомендации по уточнению существующей серологической классификации.

3. В составе изученных полисахаридов впервые идентифицировано N-ацетимидоильное производное 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Ь-гулуро-новой кислоты и пересмотрено строение N-ацетимидоильного производного 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Б-маннуроновой кислоты.

4. Обнаружены полисахариды с замаскированной регулярностью нового для О-антигенов типа, связанной с различиями в конфигурации С5 производных уроновых кислот.

5. Впервые синтезировано N-ацетимидоильное производное аминосахара - метил-3-ацетамидино-3,6-дидезокси-а-Ь-глюкопиранозид и изучены его химические и спектральные свойства.

Основное содержанчэ работы изложено в следующих публикациях:

1. Виноградов Е.В., Парамонов Н.А., Книрель Ю.А. Структура 0-спе-цифической полисахаридной цепи липополисахарида Pseu/iomonaa aeruginosa иммунотип 7 // Тез. стелд. сообщ. V Всесоюзный биохимический съезд.-1936.-Т.3.-С.314-315.

2. Книрель Ю.А., Парамонов Н.А., Виноградов Е.В., Шашков А.С., Кочетков Н.К. Идентификация 3-ацетамидино-2-ацетамидо-2,3-дидезокси-L-гулуронсвой кислоты в составе липополисахарида Pseudamonas aeruginosa, иммунотип 7 //Биоорган.хшия.-1986.-Т. 12.-N 7.-С.992-994.

3. Книрель Ю.А., Парамонов Н.А., Виноградов Е.В., Шашков А.С., Дмитриев В.А., Кочетков Н.К. Строение О-специфического полисахарида Paemlomonas aeruginosa иммунотип 3; пересмотр структуры ацета-мидинового производного 2,3-диамино-2,3-дидезокси-В-маннуроновой кислоты //Биоорган. xiuua.-1986.-T.12.-N 7.-С.995-99?.

4. Книрель Ю.А., Виноградов Е.В., Парамонов II.А., Шашков Н.К., Кочетков Н.К., Станиславск'лй Е.С., Маиилова Г. V. Антигенные полиса-.хариды бактерий. 16. Структура О-специфическоЯ полисахаридной цепи липополисахарида Psevdorponaa aeruginosa 025 {Bov.m) //Биоорган. хи-

-24' Jtua.-1986.-T.12.-N 9.-C.1263-1267.

5. Книрель D.A., Парамонов H.A., Виноградов Е.В., Шашков A.C., Дмитриев Б.А., Кочетков Н.К., Станиславский Е.С. Антигенные полисахарида бактерий. 20. Структура О-специфической полисахзридной цепи липополисахарида Pseudomonas aeruginosa 0(3a),3d,3f (Лани) //Виоорган. £ШШя.-1986.-Т.12.-Ы 12.-С.1649-1657.

6. Елькин Ю.Н., Книрель Ю.А., Виноградов Е.В., Парамонов H.A., Трошков М.Л., Аминев И.Х. Масс-спектры бомбардировки ускоренными атомами аминоолигосахаридов // Биоорган, хихия.-1986.-т.12.-N 12. -С.1659-1661.

7. Книрель Ю.А., Кочарова H.A., Виноградов Е.В., Парамонов H.A., Дмитриев Б.А., Кочетков Н.К., Станиславский Е.С., Холодкова Е.В. Антигенные полисахариды бактерий. 21. Структура О-специфических полисахаридных цепей и серологическая специфичность липо.толисаха-ридов семи иммунотипов Pseudomonas aeruginosa //Биоорган.хшшя. -1987.-Т.13.-N 1.-С.88-96.

8. Knirel У.А., Paramonov N.A., Vinogradov E.V., Shaahkov A.S., Draltrlev В.A., Kochetkov N.K., Kholodkova E.V., Stanislavsky E.S. Somatic antigens ot Pseudomonas aeruginosa . The structure or 0-apeclilc Polysaccharide chains ol llpopolysaccharldes of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher imrounotypes 3 and T //Eur .J. ВI ochem. -1987. -V. 167\ -N 3.-P.549-561.

9. Knlrel Y.A., Vinogradov E.V., Kocharova N.A., Paramonov N.A., Kochetkov N.K., Draltrlev E.A., Stanislavsky E.S., lanyl B. The structure of O-speclIlc polysaccharides and serological classiri-cation.of Pseudomonas aeruginosa//Acta ificrot>tol.flung.-1988.-V.35. -N 1.-P.3-24.

10. Парамонов H.A., Книрель Ю.А., Кочетков H.K. Синтез и свойства метил-3-ацетамидино-3,6-дидезокси-а-Ь-глюкопиранозида // Биоорган, иалия. -1ЭЭ1 .-Т.17.-N'8.-С.1111-1115: