Синтез иммуноактивных фрагментов белков внешней мембраны менингококка-потенциальных компонентов искусственной противоменингококковой вакцины тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Короев, Дмитрий Отарович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2004
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА
на правах рукописи
Короев Дмитрий Отарович
СИНТЕЗ ИММУНОАКТИВНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ МЕНИНГОКОККА - ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ИСКУССТВЕННОЙ ПРОТИВОМЕНИНГОКОККОВОЙ ВАКЦИНЫ
02.00.10 - Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА-2004
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук
Научный руководитель: доктор химических наук О.М. Вольпина
Официальные оппоненты: доктор химических наук Г.А. Коршунова
доктор медицинских наук А.В. Тимофеев
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии
им. В .А. Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится 200 ^ г. в 10 час. На
заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Автореферат разослан
Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук
В. А. Несмеянов
2004-4 27371
Общая характеристика работы
Актуальность пробчемы Инфекционное заболевание человека, вызываемое бактерией Neisseria meningitidis, характеризуется высокой смертностью и серьезными осложнениями. Наиболее часто причиной менингококковой инфекции становятся бактерии N meningitidis серогрупп А, В и С. Против инфекции, обусловленной менингококками серо-группы А и С, разработаны вакцины на основе капсулъного полисахарида, в то же время для производства вакцины против бактерии серогруппы В полисахарид не используют из-за его низкой иммуногенности. Кроме того, антигенное сходство полисахарида В с молекулярными структурами эмбриональной нервной ткани делает его опасным для применения в вакцине из-за вероятности развития аутоиммунных заболеваний. Поэтому актуальной является задача поиска новых протективных антигенов N. meningitidis, в первую очередь серогруппы В, с целью разработки эффективного противоменингококкового имму-нопрофилактического препарата.
Внешняя мембрана бактерии N. meningitidis содержит множество белков, к которым во время инфекции образуются протективные антитела. Один из перспективных путей создания противоменингококковой вакцины заключается в синтезе фрагментов белков наружной мембраны менингококка и в создании на их основе искусственного вакцинирующего препарата. Такой подход дает возможность проводить вакцинацию «неинфекционными» химически индивидуа^ными соединениями, индуцирующими строго направленный протективный иммунный ответ.
Цели и задачи работы. Настоящая работа посвящена выбору, синтезу и изучению антигенных, иммуногенных и протективных свойств фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA внешней мембраны бактерии N. meningitidis, являющихся потенциальными компонентами искусственной вакцины против менингококка серогруппы В. При этом решали следующие задачи: 1. Выбор потенциально иммуноактивных фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA на основе данных литературы и теоретических методов анатиза; 2. Синтез выбранных фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA; 3. Изучение способности синтетических фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA индуцировать в свободном виде, без конъюгации с белковым носителем, образование антител у мышей трех линий; 4. Изучение способности синтетических фрагментов связываться с противоменингококковыми антителами животных; 5. Изучение способности синтетических фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA обеспечивать защиту лабораторных животных при их экспериментальном заражении менингококком разных штаммов; 6. Выбор синтетических фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis для создания искусственной противоменингококковой вак-
цины.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе с использованием данных литературы, сочетания как известных, так и ранее не описанных методов теоретического анализа белковых последовательностей, выбрано 29 новых потенциально иммуноактивных фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA наружной мембраны N. meningitidis и осуществлен их синтез. Показано, что большинство синтетических фрагментов в свободном виде обладает иммуногенной активностью в экспериментах на мышах различных линий. Выявлены два синтетических фрагмента белка РогА, которые связываются с противоменингококковыми антителами животных, зараженных бактериями N. meningiti-dis. Впервые показано, что б синтетических фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA способны защищать животных от заболевания при их заражении менингококками разных штаммов. Выявленные иммуноактивные синтетические фрагменты белков являются компонентами разрабатываемой в настоящее время искусственной противоменингококковой вакцины.
Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано 23 работы.
Апробация работы. Результаты настоящего исследования доложены на ряде российских и международных симпозиумов: на IV и V Чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 1998,2000); 4-ой Международной летней школе по иммунологии им. Джона Хемфри (Пущино, 1998); на XII Интернациональной конференции по патогенным нейссериям (2000); на ХШ Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001); на Гумбольтовской конференции по биомедицине (Москва, 2001); на 4-ой и 5-ой Научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001, 2002) на XXVI и XXVII Европейских пептидных симпозиумах (Париж, 2001, Сор-ренто, 2003); на X Немецко-русском пептидном симпозиуме (Фридрихрода, 2003).
Объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах, состоит из введения, 3 глав и выводов, содержит 20 рисунков, 18 таблиц, в списке литературы цитировано 181 названий.
Результаты и обсуждение
Среди большого числа белков наружной мембраны N. meningitidis наиболее изученными, стимулирующими развитие антибактериального иммунитета, являются белки РогА, ОраВ и NspA. Данные белки проявляют иммуногенные свойства, они индуцируют образование специфических антител, связывающихся с менингококковыми клетками и обладающих бактерицидными свойствами. Поэтому белки РогА, ОраВ и NspA и их фрагменты можно рассматривать как перспективные компоненты искусственной противоме-нингококковой вакцины нового поколения.
В настоящей работе была использована аминокислотная последовательность белков РогА и NspA штамма менингококка Н44/76, аминокислотная последовательность белка ОраВ штамма Z2491.
Выбор фрагментов белков наружной мембраны N. meningitidis
Выбор фрагментов белка РогА. Белок РогА N. meningitidis относится к главным белкам 1 класса наружной мембраны менингококка. В наружной мембране три субъединицы белка образуют катион-избирательную пору. Известно, что при менинпжокковой инфекции значительная часть антибактериальных бактерицидных антител направлена к эпитопам белка РогА. Гипотетическая модель расположения белка РогА в наружной мембране N. meningitidis изображена на рис.1. Согласно этой модели молекула белка РогА интегрирована в мембрану, а на поверхности мембраны экспонировано 8 петель белка
Рисунок 1. Двумерная модель белка РогА в наружной мембране N. meningitidis |van der Voort E.M.R et al, 1997]. Выбранные для синтеза пептиды обозначены отрезками и пронумерованы.
Для синтеза были выбраны участки, являющиеся потенциальными В-эпитопами белка и перекрывающие последовательность всех экспонированных петель. Выбранные для синтеза фрагменты экспонированных участков белка были удлинены таким образом, чтобы пептиды содержали потенциальные Т-хелперные эпитопы и захватывали часть
трансмембранных участков. Аминокислотные последовательности пептидов (Р-1)-(Р-XIV), соответствующих выбранным участкам белка РогА, приведены на рис. 2.
SGQVKVTKVTKAKSRIRTKI (Р-Ш)
' ASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDD (P-V)
PIQNSKSAYTPAYYTKDTNNNL (P-VI)
YYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS (P-VII)
RHANVGRNAFELFLIGSGSD (P-VIII)
ELFLIGSGSDQAKGTDPLKN (P-IX)
ISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAG (P-XII)
GFDFIERGKKGENTSYDQ (P-XIII)
Рисунок 2. Синтетические фрагменты белка РогА
Пептиды (P-I), (Р-П), (P-IV) - (P-XIII) содержат участки, проявившие активность в экспериментах по стимуляции in vitro Т-клеток крови вакцинированных норвежской ме-нингококковой вакциной добровольцев [Wiertz et al 1991]. Кроме того, пептиды (P-III), (P-V), (P-IX), (Р-Х), (P-XI), (P-XII), (P-XIII) включают теоретически рассчитанные участки, ответственные за стимуляцию у мышей образования антител, т.е. Т-хелперные эпи-топы мышей [Вольпина с соавт. 2002]. Также был проведен теоретический анализ последовательности белка РогА с помощью разработанного в рамках настоящей работы подхода для выявления потенциальных участков, ответственных за стимуляцию образования антител у людей. Подход основан на описанных в литературе закономерностях в аминокислотной последовательности десятичленных пептидов, связывающихся с
молекулами МНС-П человека локусов DR,DP,DQ [Rammensee et al 1995] и на предположении, что наличие МНС-связывающихся участков в последовательности пептида является определяющим в его способности индуцировать образование антител. Потенциальные участки связывания с молекулами МНС-П человека присутствуют в пептидах (P-VI), (Р-VII), (P-VIII), (P-IX), (P-XI), (P-XIII), (P-XIV) (локус DR), (P-I), (P-II), (P-VIII), (P-XI), (P-XIV) (локус DP), (P-V) (локус DQ). Необходимо отметить, что пептид (P-XI) имеет в своей последовательности замену остатка Phe314 -» Leu, которая встречается в белках РогА у 50% всех известных штаммов менингококка серогруплы В. Петлям 1,4, 5 и 7 соответствуют два-три перекрывающихся пептида, петлям 2, 3, 6 и 8 соответствует один пептид.
Выбор фрагментов белка ОраВ. Белок ОраВ является представителем белков 5 класса наружной мембраны менингококка, которые ответственны за адгезию и инвазию бактерии в эпителиальные ткани человека. Известно, что большинство антител у вакцинированных против менингита В людей направлено именно к белкам 5 класса. Кроме того, белки этого класса вносят высокий вклад в активацию цельноклеточным менингококком Т-хелперных клеток [Wiertz et al. 1996]. Согласно гипотетической модели, на поверхности мембраны экспонированы четыре петли, а мембрану пронизывают восемь трансмембранных участков (рис. 3). Гипервариабельные районы белка локализованы во 2-ой и 3-ей петлях белка.
В связи с тем, что белок ОраВ способен активно стимулировать Т-хеллерные клетки, для синтеза в первую очередь были выбраны участки, которые содержали потенциальные Т-хелперные эпитопы. Все выбранные для синтеза пептиды содержат в своей последовательности участки белка, проявившие активность в экспериментах по стимуляции in vitro Т-клеток крови людей [Wiertz et al. 1996]. Аминокислотная последовательность синтетических фрагментов белка ОраВ приведена на рис. 4.
Пептиды (Op-II)-(Op-V), (Op-VII}-(Op-IX) содержат теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы мышей. Рассчитанные в настоящей работе возможные участки связывания с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II человека содержат пептиды: (Op-II), (Op-VII) (локус DR), (Op-I), (Op-II), (Op-VII) (локус DP), (Op-I), (Ор-Ш), (Op-VII), (Op-VIII), (Op-IX) (локус DQ).
Принятые сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; МС -масс-спектрометрия; DIPC - /ЛУ'-диизопропилкарбодиимид; Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил; НОВТ - 1-гидроксибензотриазол; МНС - главный комплекс гистосовместимости; Pbf - 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил; TBTU -тетрафторборат 2-(1 Н-бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметилмочевины; TFA - трифторук-сусная кислота.
Рисунок 3. Двумерная модель белка ОраВ в наружной мембране N. meningitidis. Выбранные для синтеза пептиды обозначены отрезками и пронумерованы [В. Malorny etall998].
Последовательность синтетических пептидов соответствует большей части экспонированных на поверхности внешней мембраны петель, т.е. является потенциальными В-эпитопами белка, и полностью покрывает 6 из 8 трансмембранных участков. Все выбранные для синтеза пептиды соответствуют константным, экспонированным на наружной мембране районам белка, кроме двух пептидов (Op-VI) (петля 2) и (Ор-Х) (петля 3) из гипервариабельных участков.
ATGANNSTVSDYFRNIRTHSI (Ор-И)
DYFRNYRTHSIHPRVSVGYDPGD (Op-Ill)
VSVGYDPGDWRIAADYASY (Op-IV)
WRIAADYASYRKWNDNKYSV (Op-V)
RKWNDNKYSVNTKNVQVNKS (Op-Vl) .
TFHAVSSLGLSAIYDFKLNDKF (Op-VII)
AIYDFKLNDKFDKFKPYIGV (Op-VIII)
DKFDKFKP YIGVRVAYGHVKHQV (Op-IX)
RLENTRFKTHEASLGMRYR (Op-Xl) Рисунок 4. Синтетические фрагменты белка ОраВ.
Выбор фрагментов белка NspA. Белок NspA — минорный высококонсервативный белок наружной мембраны менингококка. Известно, что антитела к белку NspA обладают бактерицидными и протективными свойствами. Модель расположения белка NspA в наружной мембране N, meningitidis приведена на рис. 5.
Рисунок 5. Двумерная модель белка NspA в наружной мембране N. Meningitidis [G.R. Мое et al 1999|. Выбранные для синтеза пептиды обозначены отрезками и пронумерованы.
Белок содержит 4 небольших экспонированных на поверхности мембраны петли и 8 трансмембранных районов.
Выбор фрагментов белка NspA N. для синтеза был осуществлён таким
образом, чтобы пептиды содержали в своей последовательности потенциальные В-эпитопы, т.е. охватывали большую часть экспонированных петель, и одновременно содержали теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы мышей и потенциальные участки связывания с молекулами МНС-П человека: пептиды (N-I), (N-II), (N-IV) (локус DR), пептиды (N-I), (NT-II), (N-III), (N-IV) (локус DP), пептиды (N-II), (N-III) (локус DQ). Аминокислотная последовательность синтетических фрагментов белка NspA приведена на рис. 6.
LRFAVDYTRYKNYKAPSTDFKLY (N-II)
KPYLGARLSLNRASVDL (N-III)
Рисунок б. Синтетические фрагменты белка NspA.
Пептиды (N-I) и (N-III) захватывают часть последовательности первой и третьей петель, а пептиды (N-II) и (N-IV) полностью перекрывают вторую и четвёртую петли белка. Все выбранные пептиды консервативны в ряду различных штаммов N. meningitidis, содержат экспонированные на наружной мембране участки белка NspA и включают теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы мышей и людей.
Синтез фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA наружной мембраны Neisseria
meningitidis
Пептиды синтезированы твердофазным методом в ручном варианте на п-алкоксибензильном полимере. Защитные группы боковых функциональных групп аминокислотных остатков выбраны с расчетом на конечное деблокирование TFA. Для защиты а-аминогруппы аминокислот использовали Fmoc-группу. Для защиты боковых функций Fmoc-производных Arg использовали Pbf-группу, для Asp, Glu, Thr, Тут, Ser — Bu', для His - - Вое группы. Для наращивания полипептидной цепи на полимере применя-
ли DIPC/HOBT и TBTU-методы. Реакцию конденсации проводили дважды, при наличии после реакции конденсации непрореагировавших аминогрупп проводили третью реакцию конденсации. Отщепление пептидов от полимера с одновременным деблокированием осуществляли смесью TFA с добавками, предотвращающими протекание побочных реакций . После деблокирования пептиды обессоливали с помощью гель-фильтрации и очища-
ли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выходы синтезированных пептидов со степенью гомогенности >95% в расчете на активную ОН-группу полимерного носителя варьировали от 4,5% до 12,4% и составляли 12-25 мг.
Индивидуальность полученных соединений подтверждена данными аминокислотного анализа, МС и аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ. Результаты МС и времена удерживания пептидов при обращено-фазовой ВЭЖХ приведены в табл. 1.
Таблица 1. Времена удерживания пептидов в условиях аналитической ВЭЖХ, молекулярные массы пептидов и данные масс-спектрометрии.
Пептид Время удерживания, мин.* Молекулярная масса
Расчетная По данным МС (MV*
12-31 (P-I) 13,4 1977,1 1978,0
22-41 (Р-И) 10,6 1917,1 1918,1
32-51 (P-III) 11,0 2228,7 - 223ОД
77-96 (P-IV) 18,3 2095,2 2097,3
118-143 (P-V) 22,2 2900,1 2902,7
166-187 (P-VI) 17,3 2503,7 2505,1
178-199 (P-VII) 22,6 2351,7 2352,2
223-242 (P-VIII) 27,3 2160,4 2161,9
233-252 (P-IX) 24,0 2090,3 2091,0
273-292 (Р-Х) 14,9 2135,3 2135,6
306-321 (P-XI) 17,3 1791,1 1791,7
306-332 (P-XII) 23,3 3017,3 3018,1
311-328 (P-XIII) 14,4 2091,2 2093,0
346-363 (P-X1V) 16,8 1993,2 1994,1
6-24 (Ор-1) 25,0 2173,1 2173,9
30-51 (Ор-Н) 21,3 2324,5 2324,5
41-63 (Ор-Ш) 23,7 2700,3 2700,6
55-73 (Op-IV) 30,2 2105,3 2106,0
64-83 (Op-V) 24,0 2506,8 2507,1
74-93 (Op-VI) 16,5 2422,7 2423,5
109-130 (Op-VII) 26,3 2475,0 2475,6
120-139 (Op-VIII) 22,6 2421,8 2422,3
128-150 (Op-lX) 20,0 2730,5 2731,7
163-181 (Op-X) 19,3 1892,3 1893,1
222-240 (Op-XI) 19,5 2365,7 2366,2
6-21 (N-I) 20,8 1665,8 1666,3
40-62 (N-Il) 28,1 2860,3 2860,6
79-95 (N-1II) 18,5 1873,2 1873,6
128-144 (N-IV) 14,3 2075,7 2075,3
* Для аналитической ВЭЖХ пептидов (P-I)-(P-XIV) использовали колонку Beckman ODS (4,6 x 250 мм, 5 мкм); для пептидов (Op-I)-(Op-XI), (N-I)-(N-IV) - колонку Phenomenex JUPITER С18(4,6 х 250 мм, 5 мкм). Условия аналитической ВЭЖХ: растворитель А -O,1%.TFA в воде, растворитель В - 0,1% TFA в ацетонитриле, градиент растворителя В в А - 1% в мин. Скорость потока элюента 1 мл/мин.
** Масс-спектрометрию проводили методом MALDI.
Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка РогА В связи с тем, что мышей различных линий часто используют для оценки специфической активности вакцинирующих противоменингококковых препаратов, способность синтетических фрагментов белка РогА стимулировать образование антител была изучена в экспериментах на мышах линий BALB/c, C57/B1 и СВА, различающихся гаплтипами молекул МНС II. Мышей дважды иммунизировали с интервалом в 45 дней незащищенными пептидами без конъюгации с белком-носителем. Титры противопептидных антител в сыворотках, полученные на 10-й день после второй иммунизации, приведены табл. 2.
Таблица 2. Иммуногенная активность синтетических фрагментов белка РогА в экспериментах на мышах различных линий
Синтетический фрагмент Титр противопептидных антител*
Мыши линии
Balbfc С57ГС1 СВА
12-31 (P-I) <1,0 <1,0 <1,0
22-41 (Р-И) <1,0 <1,0 4,1
32-51 (Р-Ш) 4,1 1,3 4,1
77-96 (P-IV) <1,0 <1,0 <1,0
118-143 (P-V) 3,5 3,1 3,2
166-187 (P-VI) 3,2 4,1 <1,0
178-199 (P-VII) <1,0 <1,0 4,1
223-242 (P-VI1I) <1,0 <1,0 2,2
233-252 (P-IX) 3,8 2,8 <1,0
273-292 (Р-Х) <1,0 <1,0 <1,0
306-321 (P-XI) 3,8 2,8 3,8
306-332 (P-XII) 4,8 <1,0 4,2
311-328 (P-X11I) 4,5 2,5 3,8
346-363 (P-XIV) 3,5 <1,0 3,1
* Титр антител выражен в -lg разведения сыворотки.
Результаты иммунизации мышей свободными пептидами показали, что все пептиды, за исключением трех неактивных фрагментов 12-31 (P-I), 77-96 (P-IV) и 273-292 (Р-X), индуцировали образование антител хотя бы у мышей одной линии. Полученные данные хорошо согласуются с расчетами Т-хелперных эпитопов. Способность пептида 306332 (P-XII) активировать Т-хелперные клетки была подтверждена в опытах in vitro по ан-тигензависимой пролиферации лимфоцитов мышей Balb/c, иммунизированных этим пептидом.
Таким образом, большинство синтезированных фрагментов белка РогА является иммуноактивными и способно в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем, индуцировать образование антител у мышей.
Для выявления среди синтетических фрагментов белка РогА участков, содержащих В-эпитопы, на которые вырабатываются антитела при менингококковой инфекции, была изучена способность пептидов связываться с полученными в различные сроки сыворотками крови мышей СВА, выживших после заражения сублетальной дозой менингококка се-рогруппы В (штамм Н44/76).
Результаты, приведенные в табл. 3, показывают, что из изученных пептидов белка РогА лишь два - пептиды 178-199 (Р-УП) и 306-332 (Р-Х11) связывались с сыворотками инфицированных менингококком мышей. В течение 4 мес. после иммунизации уровень антител в сыворотках к пептиду (Р-У11) снижаюсь, в то же время антитела к пептиду (Р-XII) появлялись лишь к концу срока наблюдения. Участок 178-199 (Р-У11) соответствует участку 4-ой петли белка РогА (см. рис. 1), против которой, как известно, вырабатываются бактерицидные антитела. Антигенные свойства участка 306-332 (Р-ХИ), соответствующего высококонсервативной 7-ой петле белка, ранее не были описаны.
Таблица 3. Наличие антител к синтетическим пептидам из белка РогА в сыворотках мышей после заражения менингококком.
Анти! ен Титр противопептидных антител
срок после заражения мышей
21 день 30 дней 4 мес.
12-31 (Р-1) <10 <10 <10
22-41 (Р-11) <10 <10 <10
32-51 (Р-Ш) <10 <10 <10
77-96 (Р-1У) <10 <10 <10
118-143 (Р-У) <10 <10 <10
166-187 (Р-У1) <10 <10 <10
178-199 (Р-УН) 640 320 40
223-242 (Р-У1Н) <10 <10 <10
233-252 (Р-1Х) <10 <10 <10
273-292 (Р-Х) <10 <10 <10
306-332 (Р-Х11) <10 <10 80
346-363 (Р-Х1У) <10 <10 <10
1
Таким образом, выявлены фрагменты 178-199, 306-332 белка РогА, способные связывающиеся с противоменингококковыми антителами животных и являющиеся В-зпитопами изученного белка.
Способность синтетических пептидов индуцировать протективный иммунитет была изучена в экспериментах по активной защите мышей линии СВА. Животных иммунизировали пептидами двукратно, через два месяца после второй иммунизации мышей заражали менингококком серогруппы В (штамм 44/76), используя три дозы бактерии. Контрольная группа мышей получала инъекцию адъюванта. Все эксперименты по изучению
протективной активности пептидов, были проведены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБХ РАН им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Таблица 4. Протективная активность синтетических фрагментов белка РогА при заражении мышей культурой менингококка штамма Н44/76.
Синтетический фрагмент Протективный эффект*
доза менингококка (число микробных клеток) суммарно % выживших животных
106 107 108
12-31 (Р-1) 7/10 6/10 0/10 13/30 43,3
22-41 (Р-Н) 10/10 6/10 3/10 19/30 63,3
32-51 (Р-Ш) 8/9 8/10 5/10 21/29 72,4
77-96 (Р-1У) 9/10 5/10 2/10 16/30 53,3
118-143 (Р-У) 10/10 7/10 4/10 21/30 70,0
166-187 (Р-У1) 8/10 5/10 1/10 14/30 46,7
178-199 (Р-УН) 8/8 9/10 6/10 23/28 82,1
223-242 (Р-УШ) 9/10 7/10 3/10 19/30 63,3
233-252 (Р-1Х) 9/10 7/10 4/10 20/30 67,0
273-292 (Р-Х) 9/10 8/10 6/10 23/30 76,7
306-332 (Р-ХИ) 10/10 8/10 6/10 24/30 80,0
346-363 (Р-Х1У) 10/10 7/10 4/10 21/30 70.0
Контроль 8/10 4/10 0/10 12/30 40,0
* Соотношение числа выживших животных к общему числу животных в эксперименте (суммарные результаты двух экспериментов).
Результаты, приведенные в табл. 4 показывают, что при низкой дозе заражения, 106 микробных клеток (м.к.) наибольшую активность проявили пептиды (Р-11), (Р-У), (Р-У11), (Р-Х11) и (Р-Х1У). Заражение дозой менингококка 107 м.к. выявило один наиболее протек-тивный пептид - (Р-У11), также высокую протективную активность проявили пептиды (Р-III), (Р-У), (Р-УШИР-Х), (Р-Х11), (Р-Х1У). При высокой дозе заражения (108 м.к.) наиболее активными оказались пептиды (Р-Ш), (Р-У11), (Р-Х) и (Р-ХН) и меньшую активность проявили пептиды (Р-У), (Р-1Х) и (Р-Х1У).
Суммирование результатов выживаемости мышей по каждому пептиду показало, что выраженную способность индуцировать защиту животных от заболевания при заражении менингококком проявили шесть пептидов (Р-Ш), (Р-У), (Р-У11), (Р-Х), (Р-Х11) и (Р-Х1У), которые защитили 70-82% животных. Пептид 32-51 (Р-Ш) расположен в гипервариабельной 1-ой петли белка РогА, содержит теоретически рассчитанный Т-хелперный эпитоп мышей. Этот пептид проявляет иммуногенную активность в экспериментах на мышах линии СВА и стимулирует развитие противоменингококковой защиты. Протек-тивную активность пептидов из 1-ой экспонированной петли белка можно было прогнозировать, поскольку в литературе была описана активность антител, направленных к 1-ой петле белка РогА. Интересно, что из трех перекрывающихся фрагментов 1-ой петли белка
(P-I)-(P-III) только один фрагмент 32-51 (P-HI) проявил выраженные протективные свойства.
Аминокислотная последовательность протективных пептидов 118-143 (P-V), 273292 (Р-Х), 306-332 (P-XII) и 346-363 (P-XIV) соответствует высококонсервативным областям белка РогА. Пептид 118-143 (P-V) соответствует последовательности 3-ей петли белка РогА. Пептиды 273-292 (Р-Х), 306-332 (Р-ХН), 346-363 (P-XIV) соответствуют последовательности 6-ой, 7-ой и 8-ой петель соответственно и захватывают прилегающие к ним трансмембранные участки. В литературе отсутствуют данные о свойствах этих участков белка, либо антител, направленных к этим районам. Из этих четырех пептидов три фрагмента 118-143 (P-V), 306-332 (Р-ХИ) и 346-363 (P-XIV) проявили иммуногенную активность на мышах линии СВА, причем теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы содержат пептиды 118-143 (P-V), 306-332 (P-XII). Пептид 273-292 (Р-Х), несмотря на содержание в его последовательности теоретически рассчитанных Т-хелперных эпитопов, при иммунизации не индуцировал образование антител у мышей всех трех линий. Это может означать индукцию этим пептидом клеточных путей защиты от заболевания менингококком. В то же время не исключено, что антитела к этому пептиду, образуясь в количествах ниже предела обнаружения, обладают высокой бактерицидной и протективной активностью. Протективный пептид 306-332 (P-XII) обладает иммуногенными свойствами, содержит теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы и активирует Т-лимфоциты т vitro. В сыворотках переболевших менингитом мышей содержится хотя и невысокий, но достоверно различимый уровень антител к фрагменту 306-332 (P-XII) (табл. 3).
Протективные свойства фрагмента 178-199 (P-VII) сочетаются с его иммуногенной активностью на мышах линии СВА и подтверждают результаты зарубежных исследований о бактерицидной активности антител, направленных к этому участку белковой цепи [van der Ley et al 1991]. Пептид 178-199 (P-VII) расположен в 4-ой экспонированной петле белка, имеющей высокую вариабельность в ряду различных штаммов менингококка и отвечающей за серосубтиповую специфичность бактерии. Важно отметить, что сыворотка мышей, переболевших менингитом, содержит высокий уровень антител к этому пептиду (табл. 3).
Пептиды 118-143 (P-V), 178-199 (P-VII), 346-363 (P-XIV) содержат теоретически рассчитанные потенциальные Т-эпитопы человека, поэтому существует возможность того, что эти пептиды проявят протективную активность на людях.
Поскольку синтетическая противоменингококковая вакцина должна обладать широкой специфичностью, представляло интерес изучить протективную активность синтетических фрагментов белка при заражении мышей гетерологичным штаммом менинго-
кокка В2394 (В:2а.Р1.1,2), отличающегося от штамма Н44/76 серосубтиповыми детерминантами. Мышей линии СВА иммунизировали пептидами (Р-Ш), (Р-У11), (Р-Х), (Р-Х11) и (P-XГV), проявившими суммарную активность более 70% в предыдущем эксперименте, и заражали менингококком штамма В2394 в двух дозах - 107 и 108 м.к. (табл. 5).
Таблица 5. Протективная активность синтетических фрагментов белка РогА при заражении мышей культурой менингококка штамма В2394.
Синтетический фрагмент Протсктивный эффект*
доза менингококка (число микробных клеток) Суммарно % выживших животных
10' 108
32-51 (Р-Ш) 5/5 3/5 8/10 80
178-199 (Р-УН) 1/5 0/5 1/10 10
273-292 (Р-Х) 4/5 0/5 4/10 40
306-332 (Р-ХН) 4/5 2/5 6/10 60
346-363 (Р-ХГУ) 5/5 1/5 6/10 60
Адъювант 1/5 0/5 1/10 10
* Соотношение числа выживших животных к общему числу животных в эксперименте.
При низкой дозе заражения мышей (107 м.к.) протективным действием обладали все пептиды, кроме 178-199 (Р-У11). При заражении в дозе 108 м.к. наиболее активными оказались пептиды 32-51 (Р-Ш) и 306-332 (Р-Х11). Суммарные результаты согласуются с данными, полученные в отдельных группах. Наиболее высокую протективную активность проявили пептиды 32-51 (Р-Ш), 306-332 (Р-Х11) и 346-363 (Р-Х1У), защитившие от гибели от 60 до 80% животных. Пептид 273-292 (Р-Х) также проявил протективную, хотя и несколько более низкую активность, суммарно защитив 40% животных.
Обращает на себя внимание, что синтетический фрагмент 178-199 (Р-У11) вариабельной 4-ой петли белка РогА защищает животных от заболевания при заражении гомологичным штаммом и связывается с сывороткой переболевших менингитом мышей, однако, вследствие своей высокой вариабельности, он не способен защищать животных от заболевания при заражении их гетерологичным штаммом менингококка.
Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено 4 фрагмента белка РогА 32-51 (Р-Ш), 273-292 (Р-Х), 306-332 (Р-Х11), 346-363 (Р-Х1У), иммунизация которыми индуцирует у мышей развитие протективного иммунитета и защиту от заболевания при заражении как гомологичным штаммом менингококка Н44/76, так и гетероло-гичным штаммом менингококка В2394. Пептиды охватывают последовательность 1-ой (частично), 6-ой, 7-ой и 8-ой (полностью) экспонированных петель белка, пептиды (Р-Ш), (Р-ХН) и (Р-Х1У) способны индуцировать в свободном виде у мышей образование антител, пептиды (Р-Ш), (Р-Х) и (Р-Х11) содержат теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы мышей, а пептиды (Р-Х11), (Р-Х1У) - Т-хелперные эпитопы людей.
Изучение иммуногенных. антигенных и протективных свойств фрагментов белка
QpaB Neisseria menmsitidis. Способность синтетических фрагментов белка ОраВ стимулировать образование антител была изучена в экспериментах на мышах трех линий. Мышей дважды иммунизировали незащищенными пептидами, обнаруженные титры противопеп-тидных антител приведены в табл. 6.
Таблица 6. Иммуногенная активность синтетических фрагментов белка ОраВ в экспериментах на мышах различных линий
Синтетический • фрагмент Титр противопептидных антител*
Мыши линии
Balb/c C57/BI СВА
6-24 (Ор-1) 3,2 4,2 4,5
30-51 (Ор-Н) 3,2 4,1 <1,0
41-63 (Ор-Ш) 4,2 3,8 4,8
55-73 (Op-IV) 4,2 1,0 3,5
64-83 (Op-V) 2,5 3,8 4,8
74-93 (Op-VI) 3,8 2,5 <1,0
109-130 (Op-VII) 4,8 4,8 4,5
120-139 (Op-VlII) 3,1 2,2 1,9
128-150 (Op-IX) 4,1 4,1 4,2
163-181 (Op-X) <1,0 <1,0 3.1
222-240 (Op-XI) 3,8 4,1 4,1
* Титр антител выражен в -lg разведения сыворотки.
Все синтетические фрагменты белка ОраВ, кроме пептидов (Op-II), (Op-VI) и (Ор-X), оказались способными индуцировать образование антител у мышей трех линий. Пептиды (Ор-Н), и (Ор-У1) были активными в экспериментах на мышах двух линий, а пептид (Ор-Х) проявил активность на одной линии. Таким образом, все пептиды из белка ОраВ способны активировать Т-хелперные клетки мышей. Способность пептида (Ор-У) активировать Т-хелперные клетки была подтверждена в опытах по антигензависимой пролиферации лимфоцитов мышей Ва1Ь/с, иммунизированных этим пептидом.
Таким образом, установлено, что все синтетические фрагменты белка ОраВ являются иммуноактивными и способны индуцировать в свободном виде, без конъюгации с белковым носителем образование антител у мышей.
Несмотря на проявленные синтетическими фрагментами белка ОраВ иммуноген-ные свойства, связывания сывороток переболевших менингококковой инфекцией мышей с пептидами из белка ОраВ выявлено не было. Результаты этого исследования не означают, что антитела к белку ОраВ не играют роли в формировании противоменингококкового иммунитета. Не исключен вариант, что эти антитела, образуясь в низких концентрациях, обладают высокой бактерицидной активностью.
Способность синтетических фрагментов белка ОраВ индуцировать протективный иммунитет была изучена в экспериментах по активной защите мышей СВА. Животных иммунизировали пептидами двукратно, через два месяца после второй иммунизации мышей заражали менингококком серогруппы В (штамм Н44/76). Для заражения животных использовали дозы культуры бактерии м.к. Животные контрольной группы
получали инъекцию адьютанта. Результаты по защите мышей синтетическими пептидами представлены в табл. 7.
Таблица 7. Протективная активность синтетических фрагментов белка ОраВ при заражении мышей культурой менингококка штамма Н44/76.
Синтетический фрагмент Протективный эффект*
доза менингококка, м.к. суммарно % выживших животных
106 107 108
6-24 (Ор-1) 8/10 3/10 1/10 12/30 40,0
30-51 (Ор-11) 8/10 7/10 4/10 19/30 63,3
41-63 (Ор-Ш) 7/10 6/10 3/10 16/30 53,3
55-73 (Ор-1У) 7/10 3/10 1/10 11/30 36,7
64-83 (Ор-У) 8/10 7/10 4/10 19/30 63,3
74-93 (Ор-У1) 8/10 7/10 5/10 20/30 66,7
109-130 (Ор-УН) 10/10 6/10 3/10 19/30 63,3
120-139 (Ор-VIII) 7/10 4/10 2/10 13/30 43,3
128-150 (Ор-1Х) 7/10 5/10 4/10 16/30 53,3
163-181 (Ор-Х) 4/10 2/10 1/10 7/30 23,3
222-240 (Ор-Х1) 4/10 2/10 0/10 6/30 20,0
Контроль 3/10 2/10 0/10 5/30 16,7
* Соотношение числа выживших животных к общему числу животных в эксперименте (суммарные результаты двух экспериментов).
При низкой дозе заражения 10б м.к. наибольшую активность проявил пептид (Ор-VII) и несколько меньшую активность проявили пептиды (Ор-1), (Ор-11), (Ор-У) и (Ор-VI). При средней дозе заражения (107 м.к.) высокую активность проявили пептиды (Ор-II), (Ор-Ш), (Ор-У)-(Ор-УП), а при высокой дозе заражения (108 м.к.) наибольшую активность проявили пептиды (Ор-П) и (Ор-У), (Ор-УТ). Суммарные результаты коррелировали с данными, полученными в отдельных группах при разной дозе заражения: защиту более 63% проявили пептиды (Ор-П), (Ор-У), (Ор-УТ) и (Ор-УП). Поскольку все изученные пептиды были высокоиммуногенны, различия в их протективной активности, по-видимому, связаны с разной антимикробной активностью индуцируемых пептидами антител.
Пептид (Ор-Н) расположен в консервативной части 1-ой петли белка, содержит теоретически рассчитанный Т-хелперный эпитоп мышей, этот пептид был иммуногепен на мышах линий Balb/c и С57/В1. Пептид (Ор-У) соответствует консервативному трансмембранному и части 2-ой экспонированной петли белка ОраВ, содержит теоретически
рассчитанный Т-хелперный эпитол мышей, индуцирует образование антител у мышей трех линий, стимулирует пролиферацию лимфоцитов in vitro. Часть пептида (Op-VI) соответствует консервативному району 2-ой петли, а часть захватывает гипервариабельный район этой петли. Пептид (Op-VI) не содержит расчетных Т-эпитопов, однако он проявляет иммуногенные свойства в экспериментах на мышах двух линий. Пептид (Op-VII) целиком соответствует консервативной трансмембранной области белка ОраВ, расположенной между 2-ой и 3-ей экспонированными петлями, он индуцирует образование антител у мышей с высокими титрами и содержит расчетный Т-хелперный эпитоп мышей. Однако пептид (Op-VII) не захватывает экспонированной на поверхности мембраны петли и не является потенциальным В-эпитопом белка.
Способность защищать мышей от заболевания при заражении менингококком штамма В2394 изучали при иммунизации пептидами (Ор-Н) и (Op-V) Эти пептиды проявили протективную активность в предыдущем эксперименте, они захватывают консервативную часть экспонированных на поверхности наружной мембраны районов, т.е. являются потенциальными В-эпитопами белков из различных штаммов бактерии. Для сравнения была изучена активность пептида (Ор-Ш), который проявил более низкую протек-тивную активность при заражении мышей менингококком штамма Н44/76. Результаты эксперимента представлены в табл. 8.
Таблица 8. Протективная активность синтетических фрагментов белка ОраВ при заражении мышей культурой менингококка штамма В2394.
Соотношение числа выживших животных к общему числу животных в эксперименте.
Проведенное исследование показало, что самую высокую активность проявил пептид (Ор-Н), который защитил 5 животных из 10. Пептиды (Ор-III) и (Op-V) проявили более низкую активность, защитив соответственно 1 и 2 мыши из 10.
Таким образом, в результате проведенных исследований выявлен фрагмент 30-51 (Ор-Н) из белка ОраВ, иммунизация которым индуцирует у мышей развитие протектив-ного иммунитета и защищает от заболевания при заражении штаммами Н44/76 и В2394 N. meningitidis. Этот пептид расположен в верхушке 1-ой петли белка ОраВ, при иммунизации в свободном виде индуцирует образование антител и содержит теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы мышей и человека.
Изучение иммуногенных и протективных свойств фрагментов белка NspA Neisseria meningitidis. Способность синтетических фрагментов белка NspA стимулировать образование антител была изучена в экспериментах на мышах трех линий, полученные титры противопептидных антител приведены в табл. 9. Пептиды (N-II) и (N-IV) проявили имму-ногенную активность при иммунизации мышей всех трех линий. Пептиды (N-I) и (N-III) были иммуногены только при иммунизации мышей линий С57/В1 и СВА. Таким образом, все четыре пептида являлись иммуноактивными и индуцировали образование антител у мышей двух или трех линий.
Таблица 9.- Иммуногенная активность синтетических. фрагментов белка NspA в экспериментах на мышах различных линий
Синтетический фрагмент Титр противопептидных антител*
Мыши линии
Balb/c C57/BI СВА
6-21 (N-I) <1,0 3,2 3,5
40-62 (N-1I) 4,8 4,1 2,5
79-95 (N-III) <1,0 2,2 2,0
128-144 (N-IV) 3,2 3,5 2,5
* Титр антител выражен в -lg разведения сыворотки.
Несмотря на проявленные синтетическими фрагментами белка №рА иммуноген-ные свойства, связывания сывороток переболевших менингококковой инфекцией мышей с этими фрагментами обнаружено не было. Иммунологическое «молчание» белка №рА во время менингококковой инфекции может быть связано с недоступностью его В-эпитопов на наружной мембране из-за недостаточной экспонированности петель белка или же малым содержанием в наружной мембране самого белка №рА [Мое е1 а1 1999].
Для исследования протективной активности фрагментов белка №рА мышей линии СВА двукратно иммунизировали пептидами (^Г)-^-ГУ), в качестве контрольной использовали группу животных, получивших инъекции адъюванта без добавления пептидов. Через месяц после 2-ой иммунизации часть мышей заражали летальной дозой живой вирулентной культуры менингококка штамма Н44/76, другую часть животных заражали менингококком штамма В2394. Также была проведена оценка бактериемии в крови мышей через 3 ч после введения бактерий. Для этого у мышей отбирали образцы крови, наносили на питательную среду, проводили подсчет числа выросших колоний бактерий (КОЕ) индивидуально для каждой мыши и рассчитывали среднее число КОЕ в группе. Затем подсчитывали количество мышей, имеющих число КОЕ в 2 раза ниже, чем в контрольной группе. Результаты исследований приведены в табл. 10.
Таблица 10. Протективная активность синтетических фрагментов белка NspA при заражении мышей культурой менингококка штаммов Н44/76 и В2394.
Штамм Н44/76 Штамм В2394
Среднее Кол-во Число Среднее Кол-во Число
Синтети- число мышей выживших/ число мышей выживших/
ческий КОЕ с КОЕ общее КОЕ с КОЕ общее
фрагмент <50% от число <50% от число
контроля мышей в контроля мышей в
группе группе
6-21 (К-1) 380 0/5 1/5 313 0/6 0/6
40-62 (N-11) 48 4/5 3/5 130 3/6 2'6
79-95 (N-111) 310 1/5 2/5 280 0/6 2/6
128-144 290 0/5 1/5 325 0/6 0/6
Контроль 510 0/5 0/5 467 0/6 0/6
При заражении животных бактерией штамма Н44/76 наибольшую активность проявил пептид ^-Щ, защитив 3 животных из 5, и несколько менее активен был пептид III), он индуцировал развитие протективного иммунитета только у 2 животных. При заражении бактерией штамма 2394 иммунизация каждым из пептидов ^-П) и ^-Ш) стимулировала протективный эффект у 2 из 6 мышей. При заражении животных менингококком штамма Н44/76 наименьшее число колоний менингококка наблюдалось в образцах крови мышей, иммунизированных пептидом ^-Щ. Этот же пептид показал наилучшие результаты при подсчете числа мышей с КОЕ <50% от контроля. Заражение животных бактерией штамма В2394 и последующий подсчет числа КОЕ показал, что и в этом случае наиболее активен был пептид ^-П).
Проведенные исследования выявили наиболее выраженную протективную активность пептида ^-П). Для выяснения механизмов индукции пептидом ^-П) протективно-го иммунитета представляло интерес исследовать, является ли стимулируемый эффект ан-тителозависимым. Для этого была проведены однократная, двукратная с интервалом в 30 суток или трехкратная с интервалами 20 и 10 суток иммунизация мышей СВА пептидом ^-П), последующее заражение менингококком и был измерен уровень противопептид-ных антител в крови иммунизированных животных и число КОЕ N. memngitidis (табл. И).
Таблица 11. Влияние числа иммунизаций мышей пептидом 40-62 ^-П) на уровень противопептидных антител и число КОЕ в крови животных, зараженных бактериями штамма Н44/76
Число иммунизаций Титр противопептидных антител* Среднее число КОЕ Число выживших/общее . число мышей в группе
1 <1,0 44 4/5
2 3,5 48 3/5
3 4,2 42 4/5
* Титр антител выражен в разведения сыворотки.
Как показали рез}льтаты испытаний, увеличение числа иммунизации приводит к росту титра противопептидных антитет от значения <1,0 при однократной иммунизации до значения 4,2 при трехкратной иммунизации Однако при этом уровень противопептидных антител не коррелировал с количеством бактерий в крови зараженных животных при любой кратности иммунизации число КОЕ существенно не изменялось Также число иммунизации не влияло на количество выживших животных в каждой группе
Одно из возможных объяснений наблюдаемого эффекта заключается в клеточном механизме индуцируемого пептидом протективного иммунитета Ранее методом адоптивного переноса лимфоцитов иммунных животных интактным реципиентам было показано, что Т-клетки играют важную роль в формировании противоменингококкового иммунитета у переболевших менингококковым менингитом серогруппы В мышей, причем в формировании защиты в одинаковой степени были эффективны и СЭ4+- и СВ8+-лимфоциты [Несмеянов с соавт 2001] Поскольку защитный эффект Т-клеток не может объясняться их прямым действием на бактериальные клетки, очевидно, что противоменингококковая защита обеспечивается активацией клеток-фагоцитов природного звена иммунитета, ней-трофилов и макрофагов Подобная активация протекает под действием Т-клеточных цито-кинов, фактора-а некроза опухолей и интерферона-у. Возможно, что пептид (N-11) вызывает иммунную реакцию у лабораторных животных против менингококка посредством аналогичного клеточного механизма
Таким образом, исследование протективной активности синтетических фрагментов трех белков внешней мембраны менингококка позволило выбрать пептиды, которые защищают лабораторных животных от заболевания при заражении их штаммом менингококка Н44/76 серогруппы В и штаммом В2394 Эти пептиды представляют собой фрагменты 32-51 (Р-Ш), 273-292 (Р-Х), 306-332 (Р-ХН), 346-363 (Р-ХТУ) белка РогА; фрагмент 30-51 (Ор-Н) белка ОраВ и фрагмент 40-62 (N-11) белка №рА Выбранные на основании проведенной работы пептиды предложено использовать в качестве компонентов искусственной противоменингококковой вакцины В настоящее время в группе синтетических вакцин совместно с лабораторией иммунохимии ИБХ РАН им. М М Шемякина и Ю А Овчинникова в рамках Межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» на основе выбранных пептидов разрабатывается синтетический иммунопрофилактичесхий препарат, защищающий от заболевания менингококковой инфекцией
Выводы
1. На основе данных литературы и теоретических методов анализа осуществлен выбор потенциально иммуноактивных фрагментов белков наружной мембраны менингококка Осуществлен синтез 14 фрагментов белка РогА, И фрагментов белка ОраВ и 4 фрагментов белка NspA внешней мембраны менингококка.
2. Установлено, что большинство синтетических фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA способно проявлять иммуногенную активность в свободном виде, без конъюгации с белковым носителем.
3. Выявлены фрагменты 178-199, 306-332 белка РогА, связывающиеся с противоменин-гококковыми антителами животных, зараженных бактериями N. meningitidis, и являющиеся В-эпитопами.
4. Показано, что синтетические фрагменты 32-51, 118-143, 178-199, 306-332, 346-363 белка РогА, 30-51,64-83, 74-93, 109-130 белка ОраВ и 40-62 белка NspA обеспечивают индукцию протективного иммунитета у лабораторных животных при их экспериментальном заражении менингококком штамма Н44/76.
5. Установлено, что синтетические фрагменты 32-51, 273-292, 306-332, 346-363 белка РогА, 30-51 ОраВ и 40-62 белка NspA наиболее эффективно индуцируют защиту при экспериментальном заражении лабораторных животных менингококком штамма В2394.
6. Выявленные иммуноактивные синтетические фрагменты белков РогА, ОраВ и NspA являются компонентами разрабатываемой в настоящее время искусственной противо-менингококковой вакцины.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
1. Несмеянов В.А., Агафонова С.А., Аллилуев А.П., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Короев ДО., Котельникова О.В., Куприянова М.А., Литвинов И.С., Иванов В.Т. Разработка синтетической пептидной вакцины против менингита В. International journal on immunorehabilitation. N 8. 1998. П. 49, 205.
2. Вольпина О.М., Короев ДО.. Жмак М.Н., Куприянова М.А., Аллилуев А.П. Синтез иммуноактивных фрагментов белков ОМР1 и ОраВ из возбудителя менингита В. Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 1998,29.
3. Несмеянов В.А., Агафонова С.А., Аллилуев А.П., Вольпина О.М.; Жмак М.Н., Короев Д.О.. Котельникова О.В., Куприянова М.А., Литвинов И.С. Развитие протективного ответа и иммунологической памяти на эпитопы ОМР1 белка N. meningitidis серогруп-пы В. Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 1998,30.
4. Kuprianova M.A., Volpina O.M., Koroev P.O.. Zmak M.N., Litvinov I.S., Kotelnikova O.V., Agafonova S.A., Alliluev A.P., Nesmeyanov V.A., Ivanov V.T. Immunogenic fragments of OMP1 protein from N. meningitidis serotype B. Abstracts of the 4th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Pushchino, 1998,35.
5. Короев Д.О.. Котельникова О.В., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Куприянова М.А., Агафонова С.А., Аллилуев А.П., Литвинов И.С, Несмеянов В.Л., Иванов В.Т. Индукция противоменингококкового иммунитета с помощью синтетических пептидов. I. Имму-ноактивные синтетические фрагменты РогА из Neisseria meningitidis. Биоорганическая химия. 2000. N5. 323-329.
6. Короев Д.О.. Котельникова О.В., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Куприянова М.А., Ар-хипова B.C., Аллилуев А.П., Литвинов И.С, Агафонова С.А., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Разработка синтетической пептидной вакцины против менингита В. Иммуноген-ность и противоменингококковая активность синтетических фрагментов белка РогА. Новости науки и техники, серия медицина, 1999, N9, стр.3 8-41.
7. Котельникова О.В., Несмеянов В.А., Вольпина О.М., Архипова B.C., Аллилуев А.П., Куприянова М.А., Короев Д.О.. Жмак М.Н., Иванов В.Т. Иммуногенная и протектив-ная активность фрагментов поверхностных белков Neisseria meningitidis. Медицинская иммунология. 2000. Т. 2. N2, стр. 169-170.
8. Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Архипова B.C., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Короев Д.О.. Куприянова МА., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Разработка синтетической
пептидной вакцины против менингококка серогруппы В. Аллергология и иммунология, 2000, т. 1, N3, стр.87.
9. Volpina О., Kuprianova М., Koroev P.. Zmak М., Kotelnikova О., Archipova V., Alliluev A., Nesmeyanov V., Ivanov V. Synthetic fragments of Neisseria meningitidis proteins PorA and OPA В induce protection against experimental infection. J. Peptide Sci., 2000, suppl. to v.6,S210,P441.
10. Короев Д.О.. Жмак М.Н., Титова МЛ., Волкова Т.Д., Обозная М.Б., Котельникова О.В., Архипова B.C., Аллилуев АЛ, Вольпина О.М., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Синтетические фрагменты белков внешней мембраны менингококка. Перспективы создания искусственной вакцины против менингита В. Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика ЮЛ. Овчинникова, Москва, 2000, стр.69.
11. Nesmeyanov V., Kotelnikova О., Volpina О., Aichipova V., Zmak M., Koroev P.. Kuprianova M., Ivanov V. Peptide fragments of Neisseria meningitidis serogroup В outer membrane proteins as inducers of anti-meningitis immunity. Abstract guide of Twelfth international pathogenic Neisseria conference, 2000, P.48, abst 128.
12. Volpina O., Kuprianova M., Koroev P.. Zmak M., Kotelnikova O., Archipova V., Alliluev A., Nesmeyanov V., Ivanov V. Synthetic fragments of Neisseria meningitidis proteins Рог А and OPA В induce protection against experimental infection. In Peptides 2000. Proceedings ofthe twenty-sixth European peptide symposium, Editions EPK, Paris, 2001, p.88I-882.
13. Короев Д.О.. Вольпиа О.М., Жмак М.Н., Куприянова М.А., Несмеянов ВА., Аллилуев А.П., Котельникова О.В., Иванов В.Т. Индукция противомеюшгитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. II. Иммуноактивные синтетические фрагменты белка ОраВ из Neisseria meningitidis. Биоорган, химия, 2001, т.27, N 1, с.21-26.
14. Вольшша О.М., Котельникова О.В., Короев Д.О.. Жмак М.Н., Титова МЛ., Волкова Т.Д., Обозная М.Б., Аллилуев А.П., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Синтетические фрагменты белка ОраВ внешней мембраны менингококка - потенциальные компоненты искусственной вакцины против менингита В. Новости науки и техники. Серия медицина, № 1, Москва 2001, стр. 34-36.
15. Обозная М.Б., Короев Д.О.. Жмак М.Н., Титова М.А., Волкова Т.Д., Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Вольпина О.М., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Изучение иммуно-генных и протективных свойств фрагментов белка NspA внешней мембраны менингококка. Тезисы докладов и стендовых сообщений XIII зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2001, стр.90.
16. Котельникова О.В., Несмеянов В.А., Лахтина О.Е., Королева И.С., Вольпина О.М., Аллилуев А.П., Титова М.А., Короев Д.О.. Жмак М.Н., Иванов В.Т. Протективная ак-
тивность некоторых пептидных фрагментов поверхностных белков Neisseria meningitidis. Медицинская иммунология, 2001, т.З, N2, стр.224.
17. Nesmeyanov V.A., Volpina O.M., Kotelnikova O.V., Zmak M.N., Lakhtina O.E., Koroev P.O. Volkova T.D., Oboznaya M.B., Koroleva I.S., Ivanov V.T. Peptide fragments of Neisseria meningitidis serogroup В outer membrane proteins induce anti-meningitidis resistance in mice. Humboldtian conference Biomedical Science 2001. Abstracts. 2001, Moscow, p. 12.
18. Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Лахтина О.Е., Несмеянов В.А., Вольпина О.М., Короев Д.О., Титова М.А., Жмак М.Н., Королева И.С., Обозная М.Б., Сотникова А.А. Формирование иммунитета к менингококку серогруппы В с помощью синтетических лептидов - фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка. Биомедицинские технологии. Вып. 16. Москва. 2001. С. 216-223.
19. Несмеянов В.А., Вольпина О.М., Котельникова О.В., Короев Д.О.. Жмак М.Н., Титова МА., Волкова Т.Д., Обозная М.Б., Литвинов И.С., Аллилуев А.П., Королева И.С., Иванов В.Т. Фрагменты белков наружной мембраны менингококка как потенциальные компоненты вакцины против менингита В. Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов 4-го Конгресса РААКИ. 2001. Т.1. С.357-374.
20. Короев Д.О.. Обозная М.Б., Жмак М.Н., Волкова Т.Д., Титова М.А., Котельникова О.В., Волышна О.М., Несмеянов ВА., Аллилуев А.П., Иванов В.Т. Индукция проти-воменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. III. Иммуноактив-ные синтетические фрагменты белка NspA из Neisseria meningitidis. Биоорган, химия. 2002. Т. 28. №4. С. 291-297.
21. Volpina O.M., Titova M.A., Koroev P.O.. Volkova T.D., Oboznaya M.B., Nesmeyanov V.A., Kotelnikova O.V., Timofeev A.V. Immunogenic synthetic fragments of bacterial and viral proteins. X German-Russian Peptide Symposium 2003. Abstracts. 2003, Friedrichroda.
22. Короев Д.О., Обозная М. Б., Жмак М.Н., Волкова Т.Д., Титова М.А., Котельникова О.В., Лахтина О.Е., Волъпина О.М., Несмеянов ВА., Аллилуев А.П., Иванов В.Т. Синтез иммуноактивных фрагментов белков внешней мембраны менингококка - потенциальных компонентов искусственной противоменингококковой вакцины. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. 2003. С. 29,
23. Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д-Р., Волкова Т.Д., Обозная М. Б., Волъпина О.М. Выбор белковых фрагментов, способных вызывать образование антител у мышей различных гаплотипов. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. 2003. С. 45.
* -202 T
РНБ Русский фонд
2004-4 27371
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
РОЛЬ БЕЛКОВ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ БАКТЕРИИ NEISSERIA MENINGITIDIS В ФОРМИРОВАНИИ ИММУННОГО ОТВЕТА.
1. Эпидемиология менингококковой инфекции.
2. Проблемы противоменингококковой иммунопрофилактики.
3. Участие белков наружной мембраны Neisseria meningitidis в индукции антибактериального иммунитета.
3.1. Белок структурного класса 1 - РогА.
3.1.1. Структура белка РогА и его расположение в наружной мембране
Neisseria meningitidis
3.1.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка РогА.
3.1.3. Картирование В-эпитопов белка РогА.
3.1.4. Картирование Т-хелперных эпитопов РогА.
3.1.5. Изучение иммуногенных свойств белка РогА с помощью синтетических пептидов.
3.2. Белки структурного класса 2/3 - РогВ.
3.2.1. Структура белков РогВ и их расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.2.2. Антигенные и иммуногенные свойства белков РогВ.
3.2.3. Картирование Т-эпитопов белка РогВ.
3.3. Белок структурного класса 4 — Rmp.
3.3.1. Структура и расположение белка Rmp в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.3.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка Rmp.
3.4. Белки структурного класса 5.
3.4.1. Семейство белков Ора.
3.4.1.1. Структура и расположение белков Ора в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.4.1.2. Картирование В-эпитопов белков Ора.
3.4.1.3. Картирование Т-хелперных эпитопов белков семейства Ора.
3.4.2. Белок Орс.
3.4.2.1. Структура, расположение белка Орс в наружной мембране Neisseria meningitidis и его функции.
3.4.2.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка Орс.
3.5. Железорегулируемые белки.
3.5.1. Белки ТЬр трансферринового рецептора.
3.5.1.1. Структура белка ТЪрВ и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.5.1.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка ТЬрВ.
3.5.1.3. Структура белка ТЬрА и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.5.1.4. Антигенные и иммуногенные свойства белка ТЬрА.
3. б. Белок NspA.
3.6.1. Структура белка NspA и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis.
3.6.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка NspA.
3.7. Белок GNA33.
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Выбор фрагментов белков наружной мембраны Neisseria meningitidis. I. Выбор фрагментов белка Рог А.
1.2. Выбор фрагментов белка ОраВ.
1.3. Выбор фрагментов белка NspA.
2. Синтез фрагментов белков наружной мембраны PorA, ОраВ и NspA Neisseria meningitidis.
3. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка PorA.
4. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка ОраВ Neisseria meningitidis.
5. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка NspA Neisseria meningitidis.
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ВЫВОДЫ.
Бактерия Neisseria meningitidis вызывает инфекционное заболевание, которое приводит к высокой смертности среди заболевших людей, а в случае выздоровления - к частым осложнениям, связанным с поражениями центральной нервной системы. Без оказания: своевременной медицинской помощи смертность от менингококковой инфекции достигает 80%. Для лечения этого заболевания используют антибиотики, при этом смертность снижается до 10%, однако более эффективной и с экономической точки зрения выгодной мерой борьбы с менингококковой инфекцией на сегодняшний день является вакцинация.
По специфичности полисахаридной капсулы менингококков делят на несколько серогрупп, причем наиболее частой причиной менингококковой инфекции являются три серогруппы - А, В и С. Против инфекции, обусловленной менингококками серогрупп А и С, разработаны довольно эффективные вакцины на основе капсульного полисахарида, которые, однако, обладают определенными недостатками (непродолжительность защитного действия и неэффективность при использовании на малолетних детях). Кроме того, вакцина против менингококка одной серогруппы не может защищать от заболевания, вызванного менингококком другой серогруппы.
Для производства вакцины против бактерии серогруппы В полисахарид не используют по причине низкой иммуногенности данного полисахарида, который индуцирует образование только лишь IgM-антител в малых количествах, не защищающих от заболевания менингококковой инфекцией. Кроме того, антигенное сходство с молекулярными структурами эмбриональной нервной и некоторых других тканей делает полисахарид В опасным для применения в вакцине из-за вероятности развития аутоиммунных заболеваний.
В настоящий момент актуальной является задача поиска новых, отличных от полисахарида, протективных антигенов N. meningitidis с целью разработки эффективного им-мунопрофилактического препарата, защищающего в первую очередь от инфекции, вызываемой менингококком серогруппы В.
Наружная мембрана бактерии //, meningitidis содержит множество белков, к которым: во время инфекции образуются протективные и опсонизирующие антитела. Чем больше этих антител у человека, тем менее он восприимчив к менингококковой инфекции. Идея использования белков наружной мембраны менингококка для индукции протектив-иого гуморального иммунного ответа прочно утвердилась за последние 30 лет.
Новый и перспективный подход к созданию противоменингококковой вакцины заключается в синтезе фрагментов белков наружной мембраны менингококка и в создании на их основе искусственного вакцинирующего препарата. Такой подход дает возможность проводить вакцинацию «неинфекционными» химически индивидуальными соединениями, индуцирующими строго направленный протективный иммунный ответ.
С целью выявления пептидных компонентов потенциальной искусственной вакцины против менингококка серогруппы В в рамках настоящей работы была поставлена задача выбора иммуноактивных участков трех белков наружной мембраны менингококка: РогА, ОраВ и NspA, химического синтеза этих участков и изучения их иммуногенных, антигенных и протективных свойств.
выводы
1. На основе данных литературы и теоретических методов анализа осуществлен выбор потенциально иммуноактивных фрагментов белков наружной мембраны менингококка Осуществлен синтез 14 фрагментов белка РогА, И фрагментов белка ОраВ и 4 фрагментов белка NspA внешней мембраны менингококка.
2. Установлено, что большинство синтетических фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA способно проявлять иммуногенную активность в свободном виде, без конъюгации с белковым носителем.
3. Выявлены фрагменты 178-199, 306-332 белка РогА, связывающиеся с противоменин-гококковыми антителами животных, зараженных бактериями N. meningitidis, и являющиеся В-эпитопами.
4. Показано, что синтетические фрагменты 32-51, 118-143, 178-199, 273-292, 306-332, 346-363 белка РогА, 30-51, 64-83, 74-93, 109-130 белка ОраВ и 40-62 белка NspA обеспечивают индукцию протективного иммунитета у лабораторных животных при их экспериментальном заражении менингококком штамма Н44/76.
5. Установлено, что синтетические фрагменты 32-51, 273-292, 306-332, 346-363 белка РогА, 30-51 ОраВ и 40-62 белка NspA наиболее эффективно индуцируют защиту при экспериментальном заражении лабораторных животных менингококком штамма В2394.
6. Выявленные иммуноактивные синтетические фрагменты белков РогА, ОраВ и NspA являются компонентами разрабатываемой в настоящее время искусственной противоменингококковой вакцины.
1. Weichselbaum A. Uber die Aetiologie der akuten Meningitis cerebro-spinalis // Fortschr. Med. 1887. V.5. P.573-583.
2. Peltola H. Meningococcal disease: still with us // Rev. Infect. Dis. 1983. V.5. P.71-91.
3. Poolman J.T. Development of a meningococcal vaccine // Infect. Agents Dis. 1995. V.4. P.13-28.
4. Schwartz В., Moore P.S., Broome C.V. Global epidemiology of meningococcal disease // Clin. Microbiol. Lett, (suppl.) 1989. V.2. P.S118-S124.
5. Дельвиг А. А., Семенов Б.Ф. Перспективы разаботки везикулярной менингококковой вакцины серогруппы В // Журн. мкробиол. 1998. №1. С.91-96.
6. Achtman М., van der Ende A., Zhu P., Koroleva I.S., Kusecek В., Morelli G., Schuurman
7. G.A., Brieske N., Zurth K., Kostyukova N.N., Platonov A.E. Molecular Epidemiology of Serogroup A Meningitis in Moscow, 1969-1997 // Emerging Infectious Diseases. 2001. V.7. P.420-427.
8. Frasch C.E. Vaccines for prevention of meningococcal disease // Clin. Microbiol. Rev. 1989. V. 2 (suppl.). P. S134-S138.
9. Romero D.J., Outschoorn I.M. Current status of meningococcal group В vaccine candidates: capsular or noncapsular? // Clin. Microbiol. Rev. 1994. V. 7. P. 559-575.
10. Jay D., Wenger M.D. Serogroup В meningococcal disease. New outbreaks, new strategies//JAMA. 1999. V. 281. P. 1541-1543.
11. Goldschneider I., Lepow M.L., Gotsclich E.C., Mauck F.T., Bachl F., Randolph M. Immunogenicity of group A and group С meningococcal polysaccharides in human infants // J. Infect. Dis. 1973. V. 128. P. 769-776.
12. Hankins W.A., Gwantley G.M., Hendley J.O., Farquhar J.D., Samuelson J.S. Clinical and serological evaluation of a meningococcal polysaccharide vaccine groups A, C, Y and W135 // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1982. V. 169. P. 54-57.
13. Mandrell R.E., Zollinger W.D. Measurement of antibodies to meningococcal serogroup В polysaccharide: Low avidity binding and equilibrium binding constants // J. Immunol. 1982. V. 129. P. 2172-2177.
14. VVyle F.E., Artenstein M.S., Brandt B.L., Tramont E.C., Kasper D.L., Altieri P.L., Berman S.L., Lowenthal J.P. Immunological response in man to group В meningococcal polysaccharide vaccines//J. Infect. Dis. 1972. V. 126. P. 514-522.
15. Jarvis G.A., Vedros N.A. Sialic acid of group В Neisseria meningitidis regulates alternative complement pathway activation// Infect. Immun. 1987. V. 55. P. 174-180.
16. Rieger F.M., Grumet M., Edelman G.M. N-CAM at the vertebrate neuromuscular junction//J. Cell. Biol. 1985. V. 101. P. 285-293.
17. Филатова Т.Н., Гамзулииа JI.H. Антитела к белкам менингококков в сыворотках больных и доноров // Журн. Микробиол. 2000. № 3. С. 58-65.
18. Verheul A.F.M., Snippe Н., Poolman J.T. Meningococcal Lipopolysaccharides: Virulence Factor and Potential Vaccine Component // Microbiol. Rev. 1993. V. 57. P. 34-49.
19. Tinsley C.R., Nassif X. Analysis of the genetic differences beetwen Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae: Two closely related bacteria expressing two different pathogenicities//PNAS. 1996. V. 93 P. 11109-11114.
20. Goldschneider I., Gotschlich E.C., Artenstein M.S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies // J. Exp. Med. 1969. V. 129. P. 1307-1326.
21. Goldschneider I., Gotschlich E.C., Artenstein M.S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity//J. Exp. Med. 1969. V.129. P.1327-1378.
22. Gotschlich E.C., Goldschneider I., and Artenstein M.S. Human immunity to the meningococcus. IV. Immunogenicity of serogroup A and serogroup С polysaccharides in human volunteers//J. Exp. Med. 1969. V. 129. P. 1367-1384.
23. Frasch C.E. Status of a group-B Neisseria meningitidis vaccine // Eur. J. Clin. Microbiol. 1985. V.4. P.533-536.
24. Frasch C.E., Tsai C.-M., Mocca L.F. Outer membrane proteins of Neisseria meningitidis: structure and importance in meningococcal disease // Clin. Invest. Med. 1986. V. 9. P. 101-107.
25. Tsai С.М., Frasch С.Е., Mocca L.F. Five structural classes of major outer membrane proteins in Neisseria meningitidis // J. Bacterid. 1981. V.146. P.69-78.
26. Costantino P., Viti S., Podda A., Velmonte M.A., Nencioni L., Rappuoli R. Development and phase 1 clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and С // Vaccine. 1992.V. 10. P. 691-698.
27. Jennings H.J., and Lugowski C. Immunochemistry of groups A, B, and С meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates.//J. immunol. 1981. V. 127. P.1011-1018.
28. Anderson E.L., Bowers Т., Mink C.M., Kennedy D.J:, Belshe R.B;, Harakeh H., Pais L., Holder P., Carlone G.M. Safety and immunogenicity of meningococcal A and С polysaccliaride conjugate vaccine in adults // Infect. Immun. 1994. V. 62. P. 3391-3395.
29. Fairley C.K., Begg N., Borrow R. , Fox A.J., Jones D.M., Cartwright K. Conjugate meningococcal serogroup A and С vaccine: reactogenicity and immunogenicity in United Kingdom infants // J. Infect. Dis. 1996. V. 174. P. 1360-1363.
30. Bjune G., Gronnesby J.K., Hoiby E.A., Closs O., Nokleby H. Results of an efficacy trial with an outer membrane vesicle vaccine against systemic serogroup В meningococcal disease in Norway//NIPH Ann. 1991. V. 14. P. 125-130.
31. Tommassen J., Vermeij P., Struyve M., Benz R., Poolman J.T. Isolation of Neisseria meningitidis mutants deficient in class I (PorA) and class 3 (PorB) outer membrane proteins // Infect Immun. 1990. V. 58. P. 1355-1359.
32. Barlow A.K., Heckels J.E., Clarke I.N. The class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis: gene sequence and structural and immunological similarities to gonococcal porins // Mol. Microbiol 1989. V. 3. P. 131-139.
33. Poolman J.T., Timmermans Н.А.М., Teerlink Т., Seid R.C.Jr. Purification, cyanogen bromide cleavage, and amino terminus sequencing of class 1 and class 3 outer membrane proteins of meningococci // Infect. Immun. 1989. V. 57. P. 1005-1007.
34. Ulmer J.B., Burke C.J., Shi C., Friedman A., Donnelly J.J., Liu М.А. Pore formation and mitogenicity in blood cells by the class 2 protein of Neisseria meningitidis II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 19266-19271.
35. Murakami K., Gotschlich E.G., Seiff M.E. Cloning and characterisation of the structural gene for the Class 2 protein of Neisseria meningitidis. Infect. Immun. 1989. V. 57. P. 2318-2323.
36. Gotschlich E.C., Seiff M.E., Blake M.S., Koomey M. Porin protein of Neisseria gonorrhoeae-, cloning and gene structure // PNAS. 1987. V. 84. P. 8135-8139.
37. Carbonetti N.H., Sparling P.F. Molecular cloning and characterization of the structural gene for protein I, the major outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae II PNAS 1987. V. 84. P. 9084-9088.
38. Hitchcock P.J. Unified nomenclature for pathogenic Neisseria species // Clin. Microbiol. Rev. 1989. V. 2(Suppl.). P. S64-S65.
39. Derrick J.P., Urwin R., Suker J., Feavers I.M., Maiden M.C.J. Structural and Evolutionary Inference from Molecular Variation in Neisseria Porins // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 2406-2413.
40. Maiden M.C.J., Suker J., McKenna A.J., Bygraves J.A., Feavers I.Mi Comparison of the class 1 outer membrane proteins of 8 serological reference strains of Neisseria meningitidis И Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 727-736.
41. E. Wedege, Freholm L.O. Human antibody response to a group-B serotype 2a meningococcal vaccine determined by immunoblotting // Infect. Immun. 1986. V. 51. P. 571-578
42. Saukkonen K., Leinonen M., Abdillahi H., Poolman J.T. Comparative evaluation о potential components for group В meningococcal vaccine by passive protection in the infant rat in vitro bactericidial assay // Vaccine. 1989. V. 7. P. 325-328.
43. Abdillahi: H., Poolman J.T. Whole-cell ELISA for typing Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies // FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 48. P. 367-371.
44. Suker J., Feavers I.M., Achtman M., Morelli G., Wang J.-F., Maiden M.C.J.The porA gene in serogroup A meningococci: evolutionary stability and mechanism of genetic variation 11 Mol. Microbiol. 1994. V. 12. P. 253-265.
45. Geysen H.M., Meloen R.H., Barteling S.J. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to resolution of a single amino acid // PNAS. 1984. V. 81. P. 3998-4002.
46. Geysen H. M., Rodda S.J., Mason T.J., Tribbick G., Schoofs P.G. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis // J. Immunol. Methods. 1987. V. 102. P. 259-724.
47. Jeanteur D., Lakey J.H.,. Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction//Mol. Microbiol. 1991. V. 5: P. 2153-2164.
48. Amon R. Synthetic peptides as the basis for vaccine design // Mol. Immunol. 1991. V. 28. P. 209-215.
49. Christodoulides M., Heckels J.E. Immunization with a multiple antigen peptide containing defined B- and T-cell epitopes: Production of bactericidal antibodies against group В Neisseria meningitidis II Microbiology. 1994. V. 140. P. 2951-2960.
50. Wolff K., Stern A. The class 3 outer membrane protein (PorB) of Neisseria meningitidis: gene sequence and homology to the gonococcal porin PIA // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 83. P. 179-186.
51. Minetti C.A.S.A., Blake M.S., Remeta D.P. Characterization of the Structure, Function, and Conformational Stability of PorB Class 3 Protein from Neisseria meningitidis И J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 25329-25338.
52. Mandrell R.E., Zollinger W.D. Use of a zwitterionic detergent for the restoration of the antibody-binding capacity of electroblotted: meningococcal outer membrane proteins // J. Immunol. Methods. 1984. V. 67. P. 1-11.
53. Poolman J.T., Hopman C.T.P., Zanen H.C. Immunogenicity of meningococcal antigens as detected in patient sera // Infect. Immun. 1983. V. 40. P. 398-406.
54. Frasch С.E., Peppier M.S. Protection against group В Neisseria meningitidis disease: preparation of soluble protein and protein polysaccharide immunogens // Infect. Immun. 1982. V. 37. P. 271-280.
55. Wright J.C., Williams J.N., Christodoulides M., Heckels J.E. Immunization with the Recombinant PorB Outer Membrane Protein Induces a Bactericidal Immune Response against Neisseria meningitidis II Infect. Immun. 2002. V. 70. P. 4028-4034.
56. Guttormsen H.-K., Wetzler L.M., Nasss A. Humoral immune response to the class 3 outer membrane protein during the course of meningococcal disease // Infect. Immun. 1993. V. 61. P. 4734-4742.
57. Guttormsen H.-K., Wetzler L.M., Solberg C.O. Humoral immune response to class I outer membrane protein during the course of meningococcal disease // Infect. Immun. 1994. V. 62. P. 1437-1443.
58. Brodeur B.R., Larose Y., Tsang P., Hamel J., Ashton F., Ryan A. Protection against infection with Neisseria meningitidis group В serotype 2b by passive immunization with serotype-specific monoclonal antibody// Infect. Immun. 1985. V. 50. P. 510-516.
59. Michaelsen Т.Е., Aase A., Kolberg J., Wedge E., Rosenqvist E. РогВЗ outer membrane protein on Neisseria meningitidis is poorly accessible for antibody binding on live bacteria// Vaccine. 2001. V.19. P.1526-1533.
60. Naess M.L., Oftung F., Aase A., Wetzler L.M., Sandin R., Michaelsen Т.Е. Human T-cell responses after vaccination with the Norwegian group В meningococcal outer membrane vesicle vaccine. 1988 // Infect. Immun. V. 66. P. 959-965.
61. Дельвиг Л.Л., Семенов Б.Ф., Розенквист Э., Робинсон Д.Г. Neisseria meningitidis: от антигенной структуры к новому поколению вакцин // Москва. «Медицина». 2000. С. 5763.
62. Lytton E.J., Blake M.S. Isolation and partial characterization of the reduction-modifiable protein of Neisseria gonorrhoeae II J. Exp. Med. 1986. V. 164. P. 1749-1759.
63. Newhall W.J., Sawyer W.D., Haak R.A. Cross-linking analysis of outer membrane proteins of Neisseria gonorrhoeae И Infect. Immun. 1980 V. 28. P. 785-790.
64. Prinz Т., Tommassen J. Association of iron-regulated outer membrane proteins of Neisseria meningitidis with the RmpM (class 4) protein // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 183 P. 49-53
65. Blake M.S., Wetzler L.M., Gotschlich E.C., Rice P.A. Protein III: structure, function, and genetics // Clin. Microbiol. Rev. 1989. Rev. 2 (Suppl.). P. S60-S63.
66. Sugawara E., Steiert M., Rouhani S., Nikaido H. Secondary structure of the outer membrane proteins OmpA of Escherichia coli and OprF of Pseudomonas aeruginosa И J. Bacterid. 1996. V. 178. P. 6067-6069.
67. Ried G., Koebnik R., Hindennach I., Mutschler В., Henning U. Membrane topology and assembly о ft he о uter m embrane p rotein О mpA of E scherichia с oli К12 // Mol. G en. G enet. 1994. V. 243. P. 127-135.
68. Viqi M., Heckels J.E. Location of a blocking epitope on outer membrane protein III of Neisseria gonorrhoeae by synthetic peptide analysis // J. Gen. Microbiol; 1989. V. 135. P. 18951899.
69. Koebnik R. Proposal for a peptidoglycan-associating alpha-helical motif in the C-terminal regions of some bacterial cell-surface proteins // Mol. Microbiol. 1995. V. 16. P. 12691270.
70. Rice P.A., Vayo H.E., Tarn M.R., Blake M.S. Immunpglobulin G antibodies directed against protein III block killing of serum-resistant Neisseria gonorrhoeae by immune serum // J. Exp. Med. 1986. V. 164. P. 1735-1748.
71. Joiner К., S cales R .A., Warren K. A., F rank M .M., Rice P .A. M echanism о faction о f blocking immunoglobulin G for Neisseria gonorrhoeae II J. Clin. Invest. 1985. V. 76. P. 17651772.
72. Gotschlich E.C. The meningococcal; serogroup В vaccine protection trials: concluding remarks at the report meeting second day // NIPH Ann. 1991. V. 14. P. 247-250.
73. Nassif X., Pujol C., Morrand P., Eugene E. Interactions of pathogenic Neisseria with host cells. Is it possible to assemble the puzzle // Mol. Microbiol; 1999. V. 32. P. 1124-1132.
74. Sarkari J., Pandit N., Moxon E.R:, Achlman M. 1994. Variable expression of the Opc outer membrane protein in Neisseria meningitidis is caused by size variation of a promoter containing poly-cytidine//Mol. Microbiol. 1994. V. 13. P. 207-217.
75. Viiji M., Makepeace K., Moxon R. Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. P. 173-184.
76. Chen Т., Gotschlich E.G. CGMla antigen of neutrophils, a receptor of gonococcal opacity proteins // PNAS 1996. V. 93. P. 14851-14856.
77. Viiji M., Watt S.M., Barker S., Makepeace K., Doyonnas, R. The N-domain of the humain CD66a adhesion molecule is a target for Opa proteins of Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae I/ Mol. Microbiol. 1996. V. 22. P. 929-939.
78. Viiji M„ Makepeace K., Ferguson D.J.P., Watt S.M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae // Mol. Microbiol. 1996. V. 22. 941-950.
79. DeVries F.P., van der Ende A., van Putten J.P.M;, Dankert J. Invasion of Primary Nasopharingeal Epithelial Cells by Neisseria meningitidis Is Controlled by Phase Variation of Multiple Surface Antigens // Infect. Immun. 1996. V. 64. P. 2998-3006.
80. Sacchi C.T., Gorla M.C.O., de Lemos A.P.S., de Cunto Brandileone M.C. Considerations on the use of Neisseria meningitidis class 5 proteins as meningococcal ВС vaccine components // Vaccine. 1995. V. 13. P. 112-118.
81. Blake M.S., Blake C.M., Apicella M.A., Mandrell R.E. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 1434-1439.
82. Malorny В., Morelli G., Kusecek В., Kolberg J., Achtman M. Sequence diversity, predicted two-dimensional protein structure, and epitope mapping of neisserial Opa proteins // J. Bacterid. 1998. V. 180. P. 1323-1330.
83. Stern A., and Meyer T.F. Common mechanism controlling phase and antigenic variation in pathogenic neisseriae// Mol. Microbiol. 1987. V. 1. P. 5-12.
84. Olyhoek A.J., Sarkari J., Bopp M., Morelli G., Achtman M. Cloning and expression in Escherichia coli of Opc, the gene for an unusual class 5 outer membrane protein from Neisseria meningitidis II Microbiol. Pathog. 1991. V. 11. P. 249-257.
85. Rosenquist E., Hoiby E.A., Wedege E., Kusecek В., Achtman M. The 5С protein of Neisseria meningitidis is highly immunogenic in humans and induces bactericidial antibodies // J. Infect. Dis. 1993. V. 167. P. 1065-1073.
86. Seiler A., Reinhardt R., Sarkari J., Caugant D.A., Achtman M. Allelic polymorphism and site-specific recombination in the opc locus of Neisseria meningitidis // Mol. Microbiol. 1996. V. 19. P. 841-856.
87. Thiesen В., Greenwood В., Brieske N., Achtman M. Persistence of antibodies IgAl protease versus decay of antibodies to group A polysaccharide and Opc protein // Vaccine. 1997. V. 15. P. 209-219.
88. Carmenate Т., Mesa С., Menendez Т., Falcon V.,. Musacchio A. Recombinant Opc protein from Neisseria meningitidis reconstituted into liposomes elicits opsonic antibodies following immunization // Biotechnol. Appl. Biochem. 2001. V. 34. P. 63-69.
89. Musacchio A., Carmenate Т., Delgano M., Gonzalez S. Recombinant Opc meningococcal protein, folded in vitro, elicits bactericidal antibodies after immunization// Vaccine. 1996. V. 15. P. 751-758.
90. Griffiths E., Stevenson P., Ray A. Antigenic and molecular heterogeneity of the transfernn-binding protein of Neisseria meningitidis IIFEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 69. P. 3136.
91. Mickelsen P.A; and Sparling P.F. Ability of Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, and commensal Neisseria species to obtain iron from transferrin and iron compounds// Infect. Immun. 1981. V. 33. P. 555-564.
92. Simonson C., Brener D., DeVoe I.W. Expression of a high-affinity mechanism for acquisition of transferrin iron by Neisseria meningitidis 11 Infect. Immun. 1982. V. 36. P. 107113.
93. Schryvers A.B., Morris L.J. Identification and characterization of the transferrin receptor from Neisseria meningitidis. 11 Mol. Microbiol. 1988. V. 2. P. 281-288.
94. Schryvers A.B., Morris L.J. Identification and characterization of the human lacloferrin-binding protein from Neisseria meningitidis II Infect. Immun. 1988. V. 56. P. 1144-1149.
95. Ala'Aldeen D.A., Davies H.A., Wall R.A., Borrielio S.P, The 70 Kilodalton iron regulated protein of Neisseria meningitidis is not the receptor for human transferrin7/ FEMS. Microbiol. Lett. 1990. V. 69. P. 37-42.
96. Schryvers A.B., Gonzalez G.C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitids infection in mice // Infect. Immun. 1989. V. 57. P. 24252429;
97. Evans R.W., Oakhill J.S. Transferrin-mediated iron acquisition by pathogenic Neisseria И Biochemical Society Transactions. 2002. V. 30. Part 4. P. 705-707.
98. Schryvers A.B., Stojiljkovic I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria II J. Mol. Microbiol. 1999. V. 32. P. 1117-1123.
99. Ferreiros C.M., Criado M.T., Pinto M., Ferron L. Analysis of the molecular mass heterogeneity of the transferrin receptor in Neisseria meningitidis and commensal Neisseria II FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 83. P. 247-254.
100. Legrain M., Mazarin V., Irwin S.W., Bouchon В., Quentin-Millet M.-J;, Jacobs E., Schrivers A.B. Cloning and characterization of Neisseria meningitidis genes encoding the transferring-binding protein Tbpl and Tbp2 // Gene. 1993. V. 130. P. 73-80.
101. Gorringe A.R., Borrow R., Fox A.J., Robinson A. Human antibody response to meningococcal transferrin binding proteins: evidence for vaccine potential // Vaccine. 1995. V. 13. P. 1207-1212.
102. Pintor, M., Ferron L., Gomez J.A., Gorringe A., Criado M.T., Ferreiros C.M. Blocking of iron uptake by monoclonal antibodies specific for the Neisseria meningitidis transferrin-binding protein 2 // J. Med. Microbiol. 1996. V. 45. P. 252-257.
103. Pintor M., Gomez J.A., Ferron L., Ferreiros C.M., Criado M.T. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis II J. Med. Microbiol. 1998. V. 47. P. 757-760.
104. Rokbi В., Mignon M., С augant D .A., Quentin-Millet M.-J. Heterogeneity of tbpB, the transferrin-binding protein В gene, among sero-group В Neisseria meningitidis strains of the ET-5 complex // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1997. V. 4 P. 522-529.
105. Rokbi В., Mazarin V., Maitre-Willmotte G., Quentin-Millet M.-J. Identification of two major families of transferrin receptors among Neisseria meningitidis strains based on antigenic and genomic features // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 110. P. 51-58.
106. Ala'Aldeen D.A., Borriello S.P. The meningococcal transferrin-binding proteins I and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains // Vaccine. 1996. V. 14 P. 49-53.
107. Coppens I., Alonso S., Antoine R., Jacob-Dubuisson F., Renauld-Mongenie G., Jacobs E., Locht C. Production of Neisseria meningitidis Transferrin-Binding Protein В by Recombinant Bordetella pertussis // Infect. Immun. 2001. V. 69. P. 5440-5446.
108. Pajon R., Chinea G., Marrero E., Gonzalez D., Guillen G. Sequence analysis of the structural tbpA gene: protein topology and variable regions within neisserial receptors for transferrin iron acquisition // Microb. Pathog. 1997. V. 23. P.71-84.
109. Johnson A.S., Gorringe A.R., Fox A.J., Borrow R., Robinson A. Analysis of the human' Ig isotype response to individual transferrin binding proteins A and В from Neisseria meningitidis И FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. V. 19. P. 159-167.
110. Martin D., Cadieu N., Hamel J., Brodeur B.R. Highly conserved Neisseria meningitidis surface protein confers protection against experimental infection // J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 1173-1183.
111. Plante M., Cadieux N., Rioux C.R., Hamel J., Brodeur B.R., Martin D. Antigenic and molecular conservation of the gonococcal NspA protein // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 28552861.
112. Cadieux N., Plante M., Rioux C.R., Hamel J., Brodeur B.R., Martin D. Bactericidial and cross-protective activity of a monoclonal antibody directed against Neisseria meningitidis NspA outer membrane protein// Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 4955-4959.
113. Мое G.R., Tan S., Granoff D.M: Differences in surface expression of NspA among N. meningitidis group В strains // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 5664-5675.
114. Martin D., Brodeur B.R., Hamel J., Couture F., de Alvis U., Lian Z., Martin S., Andrews D., Ellis R.V. Candidate Neisseria meningitidis NspA vaccine // J. Biotecnol. 2000. V. 83. P. 2731.
115. Вольпина O.M., Титова M.A., Жмак M.H., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание струткуры петидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорг. химия. 2002. Т. 28. № 5. С. 387-395.
116. Rammensee H.-G., Friede Т., Stevanovic S. МНС ligands and peptide motifs: first listing // Immunogenetics. 1995. V. 41. P. 178-228.
117. Udenfriend S., Meienhofer J. The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology // London. Academic Press, Inc. 1987. V.9. P. 27-30.
118. Fontenot J.D., Ball J. M., Miller M.A., David C.M., Montelaro R.C. A survey of potential problems and quality control in peptide synthesis by the fluorenylmethoxycarbonyl procedure // Pept. Res. 1991. V. 4. P. 19-25.
119. Головина Л.И., Кувакина В.И., Аллилуев А.П., Баснакьян И.А., Сивко Р.И. Реакция иммунного бактериолиза для оценки иммунологической эффективности менингококковой вакцины серогруппы В // Клинич. лаборат. диагностика. 1995. Т. 1. С. 26-29.
120. Perrin D.D. Purification of Laboratory Chemicals. // N.Y.: Pergamon Press. 1980. P. 1563.
121. Sarin V.K., Kent S.B.H., Tam J.P., Merrifield R.B. Quantitative monitoring of solid phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction // Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 147-157.
122. Gisin B.F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid // Anal. Chim. Acta. 1972. V. 58 P. 248-249.
123. Агафонова С. А., Аллилуев А.П., Котельникова O.B. Формирование иммунологической памяти у мышей при экспериментальной менингококковой инфекции // Иммунология. 1997. С. № 1. 39-41.
124. Mishel В.В., Shady С.М. Selected methods in cellular immunology // Ed. W.H. Freeman. San Francisko, 1979, ch. 1,281-296.
