Синтез фрагментов белка VP1 вируса ящура штамма А22, обеспечивающих защиту животных от заболевания ящуром тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА ВИРУСА ЯЩУРА ШТАММА А22> ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ЗАЩИТУ ЖИВОТНЫХ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЯЩУРОМ.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в Институте биорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук.

Научный руководитель: доктор химических наук

О.М.Вольпина

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Г.А.Коршунова

доктор биологических наук

Ю.А.Семилетов

Ведущая организация: Научно—исследовательский институт

по изысканию новых антибиотиков РА1

Защита состоится

1996 г. в

час н;

заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защит* диссертаций на соискание ученой степени доктора наук пр! Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинников; РАН по адресу : 117871 ГСП Москва В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/1£

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт; биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеяно!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Традиционные противовирусные вакцины, приготовленные на основе инактивированных вирусов, обладают существенными недостатками, ограничивающими область их применения, такими как неоднородность состава, остаточная ннфекционность, иммуносгимуляция нежелательных процессов, сложность производства и хранения. Достижения последних лет в иммунологии, молекулярной биологии и биоорганической химии позволили разработать концепцию создания вакцин нового поколения, использующих "неинфекционные" молекулы, например, синтетические пептиды, представляющие иммуноактивные участки вирусных белков.

С целью повышения иммуногенности синтетические пептиды обычно конъюгируют с высокомолекулярными белками-носителями, однако развитие нежелательных иммунных реакций у животных при введении им подобиях белково-пептидных конъюгатов делает невозможным их практическое использование в ветеринарии и медицине.

В связи с этим весьма актуальной представляется проблема выявления и синтеза пептидов, способных в свободном виде индуцировать у лабораторных и естественновосприимчивых к вирусу ящура животных выработку противопептидных и вируснейтрализующих антител в количествах, достаточных для защиты животных от заболевания ящуром.

Дели и зад-ачи работы. Настоящая работа посвящена синтезу высокоиммуногенных пептидных фрагментов белка VPt вируса ящура штамма А22- способных в свободной форме, без конъюгации с белками-носителями, обеспечить защиту лабораторных и природновосприимчивых животных при заражении вирусом.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи :

- на основе теоретических методов анализа и данных

Принятые сокращения: Вое - трет-бутилоксикарбонил-; Асм -ацетамидометил-; Tos - тозил-; DCC - дициклогексилкарбодиимид; HOBt - гидроксибензотриазол; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ППА - противопептидные антитела; ВНА -вируснейтрализующие антитела; ИД50 - инфекционная доза вируса, вызывающая заболевание 50% животных; ПАФ - полный адыовант Фрейнда; НАФ - неполный адъювант Фрейнда; ГМДП - N-ацетил-глюкозаминилмурамил-аланил-О-глутамиламид; Palm - пальмитоил.

литературы осуществить выбор потенциальных иммуноактивных участков белка VPj вируса ящура штамма А22, синтезировать выбранные участки белка и их перекрывающиеся фрагменты;

- изучить иммуногенную и протективную активность полученных синтетических фрагментов белка VPt в экспериментах .на лабораторных животных;

- на основе полученных результатов выявить пептид, индуцирующий максимальный противопептидный и противовирусный иммунный ответ и обладающий наибольшим защитным эффектом на лабораторных животных;

- изучить способность выявленного пептида индуцировать образование противопептидных и вируснейтрализующих антител, а также обеспечивать защиту природновосприимчивых к ящуру животных от заболевания;

- осуществить химическую модификацию выбранного пептида, позволяющую улучшить его защитные свойства, изучить свойства модифицированного пептида на лабораторных и природновосприимчивых к ящуру животных, разработать на его основе противоящурный вакцинирующий препарат для сельского хозяйства.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе синтезированы ранее не описанные фрагменты основного иммуногенного района белка VPt вируса ящура штамма А22. а так же новые пептидные фрагменты из других районов белка VPt. Показано, что ряд пептидов из основного иммуногенного района способен после иммунизации в свободном виде индуцировать у лабораторных и природновосприимчивых животных образование специфических вируснейтрализующих антител и защищать животных от заболевания при заражении их вирусом ящура штамма А22. Выявлены пептиды из районов белка VPL, не относящихся к основному иммуногенному району, способные в свободном виде индуцировать у лабораторных животных образование противопептидных антител. На основе полученных результатов синтезирован пептид, пригодный для создания на его основе синтетической противоящурной вакцины. Совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты животных (ВНИИЗЖ) разработан противоящурный вакцинирующий препарат, не уступающий по эффективности действия традиционной противоящурной вакцине.

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе получено два авторских свидетельства и патент РФ.

Апробация полученных данных. Результаты настоящего

исследования были доложены на VII, VIII Всесоюзных симпозиумах "Химия пептидов и белков" (Таллин,1987; Рига,1990), на Реймском научном международном симпозиуме "Иммунологическая диагностика и иммунопрофилактика вирусов животных" (Грейфсвальд,1989) на 7-ом и 8-ом Советско—Западногерманских симпозиумах по химии пептидов и белков (Дилижан,1989; Аахен,1991), на 20-ом и 21-м Европейских пептидных симпозиумах (Тюбинген,1988; Платиа д'Аро,1990), на I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс,1989), на 1-ом Израильско-Советском семинаре по пептидам и белкам (Реховот, 1990), на UCLA симпозиуме "Синтетические пептиды" (Фриско,1990)

Объем работы.Диссертация изложена на ./^страницах, состоит из введения, трех глав и выводов, содержит ^рисунков,/^таблиц, в списке литературы цитировано •^jfисточников. В главе I приведен обзор литературных данных по проблемам создания синтетических противовирусных вакцин, в главе II содержатся результаты исследований и их обсуждение, в главе III изложены экспериментальные методы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Вирус ящура относится к семейству пикорнавирусов и вызывает у сельскохозяйственных животных заболевание, приносящее огромный экономический ущерб. Охарактеризовано семь типов вируса ящура, которые, в свою очередь, включают около семидесяти субтипов. Четыре негликозилированных белка образуют капсид вируса ящура, причем основные протективные эпитопы представлены в последовательности одного из них - VPt.

Район 130-160 белка VP^ характеризующийся повышенной вариабельностью, является иммунодоминантным районом белка, а С-концевой участок 200-213 - минорным иммуногенным районом [Strohmaier et al.,19821. Иммунизация кроликов и морских свинок белковыми конъюгатами пептидов из этих районов белка приводила к появлению вируснейтрализующих антител и защите морских свинок от заболевания ящуром при заражении вирусом [Bittle et al.,1982, Pfaff et al..1982, Вольпина и др.,19881.

Недостатки применения белковых носителей для повышения иммуногенности синтетических пептидов, подробно обсужденные в обзоре литературы настоящей работы, инициировали исследования, связанные с поиском пептидных фрагментов вирусных белков, проявляющих иммуногенные и протективные свойства в свободном

виде, без конъюгации с белком-носителем. К началу этой работы было синтезировано несколько пептидов, способных в свободном виде обеспечивать защиту морских свинок от заболевания ящуром - это пептиды 141—158—Рго—Cys—Gly, 200-213-Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly, Cys—Cys-200—213-Pro—Рго—Ser—141—158-Pro-Cys-Gly [DiMarchi et al.,19861 и 136-152, 141-152 [Суровой и др.,19881 из белка VPl вируса ящура штамма Oj^K, а также фрагменты 131-149 и 136-142 белка VP1 вируса ящура штамма А22 [Суровой и др.,19891.

При переходе от экспериментов на лабораторных животных к опытам с крупным рогатым скотом протективный эффект проявил лишь 40-членный пептид Cys-Cy3-200-213-Pro-Pro-Ser-141-158-Рго-Суз-Gly, хотя при этом защита животных не была стабильной, а иммунный ответ, получаемый на этот пептид, отличался от противовирусного иммунитета как по подклассу антител, так и по специфичности Т-клеточного ответа [Flynn et al.,1990; Mulcahy et al.,1990].

Настоящая работа посвящена синтезу высокоиммуногенных фрагментов белка VPt вируса ящура штамма А22, способных в свободной форме, без конъюгации с белками-носителями, обеспечивать защиту от заболевания лабораторных и природновосприимчивых животных.

Эксперименты, связанные с работой с вирусом ящура, были проведены во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных в г. Владимире.

I. Выбор пептидов для синтеза.

Для решения поставленных в работе задач были синтезированы две группы пептидов, представленные на рис.1 . Пептиды I-XVII относятся к иммунодоминантному району белка VPt, а пептиды другой группы (XVIII-XXV) не входят в основной иммуногенный район.

Фрагмент 136-152 белка VPt штамма А22 (пептид I). был синтезирован, основываясь на данных литературы о 100 %-ной защите морских свинок,вызываемой введением пептида 136-152 из белка VPt штамма OjK [Суровой и др.,1989]. С целью увеличения иммуногенной и протективной активности этот пептид был удлинен с С-конца на фрагмент 153-159, представляющий собой, согласно теоретическим расчетам, амфипатическую Л-спираль, и являющийся потенциальным Т-эпитопом. С N-конца фрагмент 136-152 был удлинен на остаток Lys135, от дальнейшего удлинения в эту область белка отказались, поскольку, как известно из данных литературы (Суровой и др..

Ра1ш2-135-

135 159

К У Б АСЕИСП й 5 О I Е Р Ь А А й V А А Ч I Р

136-152

135-159

-:-159

136-159

140-159

142-159

143-159

144--159

145---159

146-159

135-

136-

137-

138-

139-

140-

144-

-156-Рго -156-Рго -156-Рго -156-Рго -156-Рго -156-Рго -156-Рго

10 24

39 61

рук1дшнр1нип[.идтнднв1 50 69

7П1МдТНдНЕ1?СА1иАА 170 189

Т Т I Н Е И V й II К Я А Е I У С Р й Р 175 189

иУЙИКВАЕЬУСРЙР 170 189

ТТГНЕНУЙИКЙАЕЬУСРЙР

I

175 189 Асш

иУЙИКЙАЕЬУСРЙР

I

197 Асш 213

Б ч И И й К () К I I А Р А К в I ь

(I) (IX)

(III)

(IV)

(V)

(VI)

(VII)

(VIII)

(IX)

(X)

(XI)

(XII)

(XIII)

(XIV)

(XV)

(XVI)

(XVII)

(XVIII)

(XIX)

(XX)

(XXI)

(XXII)

(XXIII)

(XXIV)

(XXV)

Рис. 1. Синтетические фрагменты белка вируса ящура

штамма А

1988 1, участок 131-139 не важен для индукции фрагментами иммунодоминантного района белка VPj вируса ящура штамма А22 противопептидного и противовирусного иммунитета. Для выбора оптимального фрагмента из основного иммуногенного района белка, обладающего максимальной активностью и содержащего участки, необходимые для развития полноценного противовирусного иммунитета, были получены две серии перекрывающихся пептидов, представляющие С-концевую (пептиды IV-X) и центральную (пептиды XI - XVII) области изучаемого района. Пептиды, оканчивающиеся на Ala156 (XI-XVII), были удлинены с С-конца на остаток Pro для повышения устойчивости к протеолизу.

Кроме того, для индукции более мощного и продолжительного противовирусного ответа у животных был получен липофильный аналог пептида 135-159 - пептид (III).

Представляло интерес изучение пептидов, не относящихся к основному иммуяогенному району, так как, с одной стороны, свойства фрагментов из этих областей белка VP^ мало изучены, с другой стороны, в исследованиях, посвященных вирусу ящура, имеются данные о наличии в этих районах участков, важных для развития противовирусного ответа ¡Brown, 1985; Baxt et al.,19891.

Выбор для синтеза фрагментов, не- относящихся к основному иммуногенному району, был осуществлен на основании традиционных подходов к локализации антигенных детерминант - теоретического анализа первичной структуры белка VP; для выявления гидрофильных, акрофильных, антигенных участков и ß- изгибов. Фрагмент 10-24 (XVIII) является высокогидрофильным и содержит /-изгиб, фрагменты 39-61 (XIX) и 50-69 (XX) перекрывают высоковариабельный район белка VP:. Фрагменты 170-189 (XXI) и 175-189 (XXII) принадлежат консервативному и гидрофильному району белка VPt, что может, по аналогии с гемаглютинином вируса гриппа, оказаться функционально значимым при индукции противовирусного ответа.

2. Синтез пептидов.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном варианте последовательным наращиванием Цепи с С-конца. В качестве носителя при синтезе пептидов I, XVIII и XXV использовали хлорметилированный сополимер стирола и 1% дивинилбензола, а при синтезе пептидов 11-ХУ11 и Х1Х-ХХ1У использовали спейсерную фенилацетамндометильную группировку, существенно повышающую

стабильность связи пептида с полимером, в этом случае в качестве исходного носителя применяли аминометилированный сополимер стирола и дивинилбензола, к которому присоединяли соответствующее фенилацетамидоиетильное производное С-концевой аминокислоты.

Для временной защиты е(,-аминогрупп применяли Вос-группу, удаляемую 5054-ным раствором трифторуксусной кислоты в СН2С12. Для защиты боковых функциональных групп трифункциональных аминокислотных остатков использовали следующие- группы: бензильную (Ser, Thr), тозильную (Arg), ацетамидометильную (Cys), 2-хлорбензилоксикарбонильную (Lys), 2,6-дихлорбензильную (Туг), бензиловые эфиры (Asp, Glu), бензилоксиметильную (His). Все эти группы, за исключением Асш, расчитаны на конечное одновременное удаление жидким фтористым водородом.

Для наращивания пептидной цепи использовали стандартный протокол, включающий двукратную реакцию конденсации - сначала методом симметричных ангидридов в хлористом метилене, затем методом DCC/HOBt в диметилформамиде с предварительной активацией Вос-аминокислот.

Отклонения от протокола имели место при присоединении остатков глутамина и аспарагина - вместо симметричных ангидридов использовали п-нитрофениловые эфиры. При присоединении остатка аргинина первую реакцию конденсации проводили DCC-методом без выделения продукта в связи с нестабильностью симметричного ангидрида Boc-Arg(Tos).

В случаях, когда в роли аминокомпонент выступали остатки глутамина и глутаминовой кислоты, реакции конденсации проводили методом симметричных ангидридов в диметилформамиде, поскольку, как известно, обработка таких пептидов мягкими кислотами (например, HOBt) способствует образованию пироглутаминовой кислоты, что ведет к прерыванию роста пептидной цепи.

Контроль полноты протекания реакций конденсации проводили с помощью нингидринового теста, либо, в случае остатков пролина, -пикринового теста. В процессе синтеза пептидов XIX-XXV не удалось достичь количественного протекания реакций конденсации на некоторых этапах. В этих случаях непрореагировавшие аминогруппы (более 0,5 %) ацилировали смесью хлористый метилен-уксусный ангидрид-пиридин (60:20:20).

В ходе синтеза пептидов II и III для введения остатка Lys159 использовали ди-Вос-производное аминокислоты. После стандартной операции деблокирования для получения дипальмитоильного производ-

ного III свободные,^- и аминогруппы ацилировали раствором пальмитоилхлорида в диметилформамиде до отрицательного нингидринового теста на свободные аминогруппы.

Для удаления Вос-группы с пептидилполимеров, содержащих остаток метионина, для предотвращения модификаций по функциональной группе -S-CH3 в раствор трифторуксусной кислоты в хлористом метилене добавляли 4% меркаптоэтанола.

Пептид I отщепляли от полимера о одновременным удалением защитных групп обработкой жидким фтористым водородом с добавлением 10% пара-крезола. После обессоливания на сефадексе G-10 в 0,1 И растворе уксусной кислоты аналитическая обраценнофазовая ВЭЖХ продукта показала наличие небольшого количества побочного продукта, оказавшегося по данным масс-спектроиетрии и ЯМР-спектроскопии окисленной по остатку метионина формой конечного пептида. Более удобным оказалось применение так называемого "low-high" метода деблокирования пептидил-полимера с использованием на первом этапе 25%-ного раствора фтористого водорода в диметилсульфиде, на втором - жидкого фтористого водорода с добавлением 10% пара-крезола. При использовании "low-high" метода пептид I был получен без побочных продуктов, образующихся при модификации остатка метионина.

В результате проведенных исследований представлялось целесообразным остальные пептиды (II-XXV) отщеплять от полимера с одновременным деблокированием с помощью "low-high" метода, после чего их обессоливали на колонке с сефадексом G-10 и лиофилизоаали. Затем пептиды очищали с помощью препаративной обращеннафазовой ВЭЖХ на колонке (24x250 мм) с сорбентом Silasorb С-18 (размер частиц 6 ji) в градиенте ацетонитрила в 0,05% водной TFA. В случаях, когда по данным аналитической ВЭЖХ степень гомогенности пептида превышала 9О % ( пептиды II-XVII ), к препаративной ВЭЖХ не прибегали.

Для удаления ацетамидометнльной группы с остатков цистеина пептиды ХХШ и XXIV обрабатывали раствором ацетата ртути с последующим обессоливанием и лиофилизацией.

Полученные пептиды охарактеризованы с помощью аналитической обращеннофазовой ВЭЖХ ( колонка TSK ODS 4.6x250 мм. в градиенте ацетонитрила в водной 0.05% TFA ), данными аминокислотного анализа и масс-спектроскопии (метод FAB', прибор Kratos HS 50 ТС; в случае пептида III - прибор MALDI MS).

3.Изучение иммуногенной и протективной активности синтетических фрагментов белка вируса ящура штамма А22.

3.1. Иммуногенная и протективная активность синтетических фрагментов белка УРХ в опытах на лабораторных животных.

Для выявления в ряду синтезированных соединений пептидов, проявляющих наиболее высокую противоящурную активность, были изучены их свойства в опытах на лабораторных" животных - кроликах и морских свинках.

На первом этапе исследования представляло интерес сравнить активности пептидов 136-152 (I), аналогичного фрагмента 136-152 белка штамма 0гК, синтезированного ранее, а также пептида 135-159 (II), который отличается от пептида I на фрагмент 153159, имеющий тенденцию к образованию амфипатической Л-спирали и являющийся потенциальным Т-эпитопом. В результате проведенного исследования было показано (табл. 1), что, по сравнению с пептидом 136-152 из белка УР: штамма О^К, пептид.I обладает более высокой способностью стимулировать у морских свинок образование вируснейтрализующих антител, но, в то же время, пептид I проявил меньшую протективную активность (60% защищенных животных по сравнению со 100% для пептида из штамма 01К). Иммунизация кроликов этими двумя фрагментами не приводила к выработке ВНА.

Таблица 1. Сравнение иммуногенных .и протективных свойств синтетических фрагментов белка УРг вируса ящура штамма А22 и фрагмента 136-152 белка вируса

ящура штамма 01К.

Пептид" Титр вируснейтрализующих антител, -log2 Защита в X

Кролики ' Морские свинки

136-152(1) < 1.0 2.5 60

136-152 0ГК < 1.0 1.5 100

135-159(11) 4.2 4.0 100

Животных иммунизировали дважды в дозе 200 мкг 'Данные для морских свинок

Значительно более высокую противоящурную активность проявил 25-членный пептид последовательности 135-159 (II): титр ВНА у кроликов составил 4,2, а в случае морских свинок - 4,0 (для пептида I - 2,5), двукратная иммунизация пептидом II в дозе 200 мкг защитила всех испытуемых животных.

Дальнейшие исследования свойств пептида 135-159 показали, что он проявляет высокую активность на морских свинках при однократной иммунизации в более низкой дозе 50 мкг (табл.2). В этом эксперименте было проведено сравнение активности пептида 135-159 и его укороченных с N- и С-концов аналогов (пептиды IV -VII, XII, XVI, XVII). Исследование было предпринято с целью выявления в последовательности 135-159 минимальной структуры, способной обеспечивать 100 Х-ную защиту животных от заболевания и стимулировать высокий уровень противопептидных и противовирусных антител. Выло показано, что укорачивание длины пептидов с N-конца с остатка 135 до остатка 142 (пептиды II-VI) приводило к уменьшению уровня ВНА при сохранении уровня противопептидных антител и протективного эффекта. В то же время при уменьшении длины пептидов с С-конца до остатка 156 и с М-конца до остатка 144 (пептиды XII, XVI и XVII) происходило резкое уменьшение титра ППА и протективного эффекта вплоть до полной потери иммуногенной и протективной активности у фрагмента 144-156 (XVII).

Таблица 2. Иимуногенные и протективые свойства фрагментов иммунодоминантного района белка в опытах на морских свинках.

Пептид Титр ППА, ~log10 Титр BHA.-log2 Защита

135-159(11) 3 4 4 5 5/5

136—159(IV) 3 4 3 7 5/5

140—159(V) 3 4 2 2 5/5

142—159ÍVI) 3 4 <1 0 5/5

143—159(VII) 3 1 <1 0 4/5

136—15б-Рго(Х11) 2 8 <1 0 4/5

140—156-Pro(XVI) 1 7 <1 0 2/5

144—156—Pro(XVII) <1 0 <1 0 0/5

Следует отметить, что хотя четыре пептида (11,1У-У1) из изученных в этом опыте восьми фрагментов были способны обеспечивать полную защиту животных, 25-членный пептид 135-159(Ш обладал наибольшей способностью индуцировать образование

ВНА, причем 24-членный пептид 136-159 (IV), отличающийся всего на один остаток, продемонстрировал существенно более низкую активность.

Следующий этап работы заключался в поиске иммуноактивных фрагментов белка УР1, не входящих в основной иммуногенный район. Иммуногенные и лротективные свойства пептидов 10-24, 39-61, 5069, 175-189, 170-189, 197-213 были изучены в опытах на кроликах и морских свинках (табл. 3).

Двукратная иммунизация животных этими свободными фрагментами белка в дозе 200 мкг не приводила к образованию

ВНА и не защищала морских свинок от заболевания ящуром. В то же время, ряд фрагментов, 39-6НХ1Х), 50-69(ХХ), 175-189(XXII), 170-189(XXI), 197—213(XXV), проявил иммуногеннуп активность и на морских свинках, и на кроликах, индуцируя образование ППА.

Таблица 3. Иммуногенные и протективные свойства фрагментов белка УР:; не входящих в иммунодоМинантный район.

Кролики Морские свинки

Пептид Титр ППА Титр ВНА Титр ППА Титр ВНА Защита (%)

10—24(ХУШ) <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 0

39-61(XIX) 5.0 <1.0 4.1 <1.0 0

50-69(XX) 3.1 <1.0 2.5 <1.0 0

175—189(ХХ11) 4.9 <1.0 <1.0 <1.0 0

170—189(ХХ1) 5.2 <1.0 4.1 <1.0 0

197—213(ХХУ) 3.5 <1.0 2.8 <1.0 0

Среди иммуногенных фрагментов наиболее высокую активность проявили пептиды 39-61(Х1Х) и 170-169(XXI), причем в экспериментах на кроликах значения титров противопептидных антител, индуцируемых этими пептидами, превышали аналогичные значения, полученные для наиболее активного фрагмента основного иммуногенного района, пептида 135-159 (см. табл.1). Особый интерес представляет пептид 170-189(XXI). проявляющий максимальную среди фрагментов белка 7Р: способность индуцировать образование антител. Этот фрагмент содержит вирусспецифический Т-хелперный эпитоп и консервативный в ряду различных серотипов вируса ящура район белка УРг и может быть использован при создании противоящурных вакцин следующего поколения, включающих

набор различных иммунокомпетентных участков вирусных белков. Использование пептида 170-189 в составе такой вакцины позволит не только расширить границы 1г-генного контроля над противопептидным иммунным ответом, но и обеспечит индукцию вирусспецифических Т-клеток памяти, распознаваемых различными серотипами вируса ящура.

3.2.Иммуногенные и протективные свойства пептида 135-159 в опытах на крупном рогатом скоте.

Результаты опытов на лабораторных животных позволили выявить пептид 135-159(11), как проявляющий наиболее высокую активность. Используя пептиды, синтезированные в настоящей работе, было показано (Гельфанов н др.,1991), что пептид 135-159 содержит все участки, необходимые для индукции противовирусного иммунитета : набор В-эпигопов и вирусспецифическяй Т-эпигоп, в итоге пептид 135-159 был выбран для проведения дальнейших исследований на природновосприимчивых к ящуру животных с целью создания противоящурного вакцинирующего препарата.

Иммуногенные и протективные свойства 25-членного пептида были исследованы в многочисленных опытах на крупном рогатом скоте, в которых проверялись различные дозы пептида, схемы иммунизации, адьювангные композиции.

Изучение активности пептида 135-159 (II) и более короткого фрагмента 136-152 (I) было проведено на крупном рогатом скоте при двукратной иммунизации пептидами в дозе 1 мг (таблица 4).

Таблица 4. Протективные свойства фрагментов 135-159(11) и 136-152 (I) на крупном рогатом скоте.

Пептид И животного Доза, мг I имиу- II иммунизация низация Титр ППА "1ое10 Титр ВНА -1ог2 Защита

135-159 1 1 1 4.4 5.76 +

135-159 2 1 1 4.4 6.00 +

135-159 3 5 3.5 4.66 -

135-159 4 5 4.1 5.23 -ь

136-152 5 1 1 3.5 2.32 -

136-152 6 1 1 3.5 <1.0 -

Было показано, что иммунизация пептидом 135-159 индуцирует образование ВНА и ППА и защиту животных от заболевания при

введении им 10 000 ИД50 вируса ящура штамма А22. В то же время, однократная иммунизация пептидом 135-159 в дозе 5 мг защищала одно животное из двух при некотором снижении титров антител. Двукратная иммунизация пептидом 136-152 по той же схеме не обеспечивала протективного эффекта, титр ППА снизился, и в то же время'существенно уменьшился уровень ВНА.

В другом эксперименте на крупном рогатом скоте, проведенном в Индийском ветеринарном исследовательском институте, изучали различные варианты адъювантов для проведения иммунизации. Поскольку полный адъввант Фрейнда непригоден для применения в ветеринарии, в данном эксперименте и в ряде последующих испытаний предпринимались попытки замены ПАФ на другие адъввантные системы (табл. 5).

Таблица 5. Протективные свойства пептида 135-159 (II) на крупном рогатом скоте.

Группа и номер животного Титр ВНА,- "1оё10 (тигр ППА, - 1.оё 10 Защита

10 Дни после 20 иммунизации 30 45 60

Гр.1 1 1 0(1 5) 2.0(2 1) 2 7(2 7) 2 .2(2 .7) 3 .4(>3.0) +

2 2 0(1 а) 2.7(2 7) 2 7(2 7) 3 0(2 .7) 3 2(2.7) +

3 0 4(1 4) 1.0(2 3) 2 0(2 6) 1 .7(2 .6) 2 .2(3.0) -

4 0 5(1 8) 2.5(2 7) 3 0(3 0) 3 0(3 .0) 3 ,6(>3.0) +

Гр. II 5 0 0(1 5) 0.5(2 0) 0 5(2 3) 0 5(2 .3) 2 .5(>3.3)

6 1 0(1 7) 1.0( 1 7) 2 0(2 3) 2 0(2 .7) 3 .0(3.0) +

7 1 0(1 8) 1.0(2 6) 2 0(2 6) 1 0(2 .4) 3 .3(>3.3)

8 0 5(1 5) 1.0(1 8) 1 0(2 1) 1 0(2 .4) 3 0(>3.3) +

Гр.Ш 9 2 3(2 0) 2.6(2 1) 3 0(2 1) 2 .7(2 .3) 3 .7(2.1) +

10 2 0(2 0) 2.4(2 1) 2 5(2 3) 2 7(2 .3) 3 .7(2.1) +

11 1 5(2 3) 1.5(2 1) 1 5(1 8) 2 .0(1 .7) 3 .2(2.0) +

12 2 3(1 8) 2.5(1 7) 2 5(2 4) 2 7(1 .7) 3 .6(2.1) +

Первой группе животных вводили двукратно пептид II в дозе 2 мг в ПАФ, второй группе - пептид в НАФ с добавлением ГМДП (препарата, разработанного в ИБХ РАН и представляющего собой синтетический аналог фрагмента клеточных стенок бактерий, способный заменить бактериальный компонент в ПАФ и пригодный для применения в ветеринарии). Третьей группе вводили традиционную противоящурную вакцину. При заражении вирусом ящура в первой

группе не заболели три животных из четырех, а во второй и третьей группах были защищены все животные, что показывает возможность замены неразрешенного к применении в ветеринарии ПАФ на синтетический адыовант ГМДП. Следует отметить, что высокий уровень ППА у животных первой и второй групп не всегда сопровождался высокой вируснейтрализусщей активностью антител. С другой стороны, при использовании традиционной вакцины титры ППА были не столь высоки, а их вируснейтрализующая активность была выше, чем в случае групп I и IX.

В другом эксперименте, проведенном в ВНИИЗЛ, при изучении различных адьювантных композиций для введения пептида 135—159 крупному рогатому скоту ( табл. 6) были получены менее удовлетворительные результаты по защите животных.

При использовании НАФ протективный эффект у пептида 135—159 отсутствовал, применение ПАФ привело к защите одного животного из двух, при использовании адъпванта А (синтетическое масло на основе полиметилсилоксана (патент БИ 1615917 А1. А 61 К 39/135)) с добавлением ГМДП было защищена одно животное из трех.

В дальнейших экспериментах по иммунизации крупного рогатого скота пептидом 135-159 выяснилось, что защитный эффект пептида 135-159 не является стабильным и варьирует от эксперимента к эксперименту в широком диапазоне от 0 % до 100%, причем ни увеличение дозы пептида и кратности иммунизации, ни изменение адъювантной системы не приводили к стабильному протективному ответу.

Таблица 6. Протективная активность пептида 135-159 (XI) при двукратной иммунизации крупного рогатого скота в дозе 1 мг.

N жи- Адью- Титр ВНА, 2 (титр ППА, -log12 ) За-

вот- вант Дни после иммунизации щи-

ного 21 42 50 64 75 та

1 ПАФ 1 5(3.8) 2 66(3.5) 4 0(3 а) 4.33(4.1) 5 0(4 1) -

2 —\\— 4 0(3.8) 7 0 (3.8) 8 0(3 8) 7.33(4.1) 8 3(4 1) +

3 Ад-т А 5 0(4.1) б 17(4.1) 5 7(3 5) 6.12(4.1) 6 1(4 1) -

+ ГМДП

4 —\\— 1 5(2.9) 5 66(3.8) 6 0(3 5) 6.0(4.1) 6 0(3 8) -

5 —\\— 2 0(4.9) 6 63(3.2) 6 6(3 5) 6.0(4.1) 7 5(3 8) +

6 НАФ 1 0(1.9) 2 5(2.6) 4.6(3.2) -

7 —\\— 1 0(<1) 3 0(2.9) 3.0(3.2) -

3.3. Иммуногвнные и протективные свойства пептида 135-159 на овцах.

Овцы, в отличие от крупного рогатого скота, оказались животными, для которых введение пептида 135-159 приводило к более сильному и стабильному противовирусному иммунному ответу. Двукратная иммунизация овец (первая иммунизация в дозе 1 мг в ПАФ, вторая - на 20-ый день в дозе 0,1 мг в НАФ) приводила к защите всех животных в эксперименте через два месяца после первой иммунизации (табл. 7).

Таблица 7. Протективные свойства пептида 135-159(11) при двукратной иммунизации овец.

N животного Тигр ВНА,-1ой2 (титр Ш1А,-1ое10)" Защита

Дни после первой иммунизации 10 20 30 40 50 60

1 2 3 <1.0 3.7(<1) 3.5 4.5(2.1) 6.0 6.2(2.6) 1.23 4.3(2.6) 5.5 5.7(2.6) 6.3 6.3(3.2) <1.0 4.5(2.6) 5.2 5.7(2.6) 5.0 5.3(2.9) + + +

Титр ППА определяли на 20, 40 и 60 день после первой иммунизации, титр ВНА - каждые 10 дней.

Как видно из таблицы 7, иммунизация овец пептидом 135-159 индуцирует выработку антител с высокой вируснейтрализующей активностью, хотя титры ППА невысоки.

Дальнейшие эксперименты на овцах были посвящены изучению различных адъювантов для введения пептида животным (таблица 8), проводили однократную иммунизацию пептидом 135-159 в дозе 1 мг, защиту животных определяли на 32 день после иммунизации.

Животным первой группы пептид вводили в ПАФ, для второй группы использовали масляный адъювант А , третья группа получала пептид в адыованте А с добавлением ГМДП, для четвертой группы использовали широко применяемый в ветеринарии адъювант -гидроксал с сапонином. Хорошие результаты были получены при использовании адъюванта А с ГМДП: 100%-ная защита животных на фоне высоких титров ППА и ВНА (за исключением животного N 6, у которого титры ППА и ВНА были невысоки, но, в то же время, развития заболевания не наблюдалось). При применении ПАФ титры

были немного меньше при сохранении высокого уровня защитного эффекта, а при использовании чистого адъюванта А защита животных была лишь частичной при существеном снижении уровня ППА и ВНА.

Таблица 8. Протективная активность пептида 135-159(11) на овцах в различных адыовантных системах.

Адъювант N живот- Титр ВНА (титр ППА) Защита

ного 11 Дни после иммунизации 21 32

ПАФ 1 1 .0(<1 .0) 2 4(3.2) 3.7(3.2)

2 <1 .0(<1 0) 3 0(2.6) 3.5(2.3) +

Адъювант 3 <1 .0(<1 0) <1 0(<1.0} 2.8(2.3) +

А 4 <1 ,0(<1 0) 1 8(<1.0) 3.3(1.0)

5 <1 • 0(<1 0) <1 0(<1.0) <1.0(<1.0) -

Адъювант 6 <1 .Я(<1 0) <1 0(<1.0) 2.0(1.0) +

А + 7 <1 0(<1 0) 7 7(2.6) 8.0(3.5) +

ГМДП 8 <1 0(<1 0) 5 0(2.6) 5.5(2.9) +

Сапонин+ 9 <1 0(<1 0) <1 0(<1.0) <1.0(<1.0) -

гидро- 10 <1 0(<1 0) <1 0(<1.0) <1.0(<1.0) -

ксал 11 . <1 0(<1 0) <1 0(<1.0) <1.0(<1.0) -

Применение а качестве адъюванта сапонина с гидроксалом не приводило к индукции противопептидного и протективного иммунитета. Таким образом, наилучшие результаты были получены при использовании адъюванта А с добавлением ГМДП.

На следующем этапе исследований был изучен протективный эффект при иммунизации пептидом 135-1-59 в дозе 0,5 мг в НАФ с добавлением 1 мг ГМДП. При проведении заражения четырех животных на 21 день после иммунизации 10 000 ИД50 вируса ящура ни одно животное не заболело (табл.9).

Таблица 9. Протективные свойства пептида 135-159(11) при иммунизации овец в дозе 0,5 мг.

N

животного

1 2

3

4

Титр ВНА,-1оё2 на 21 день после иммунизации

зП

1.3 4.5 5.7

Защита

При исследовании продолжительности защитного действия пептида 135-159 выяснилось, что и при однократной иммунизации овец 1 мг пептида в НАФ с добавлением 1 мг ГМДП, и при двукратной иммунизации (вторую иммунизацию проводили аналогично первой через 45 дней) при заражении животных через шесть месяцев защиту наблюдали лишь у одного животного из двух (табл.10).

Таблица 10. Исследование продолжительности протективного эффекта пептида 135-159 (II) на овцах.

M жи- Титр ВНА, -log. (тигр ППА, ~logi0) За-

вот- Дни после иммунизации щи-

ного 30 45 60 90 120 180 та

Г 1.5(1.9) 3.3(3.5) 2.7(2 .9) 1.7(3.5) 1.5(3. 8) 1 .0(2.9) +

2' <1(1.9) <1(3.5) <1(3 .0) <1(3.1) <1(3. 1) <1(<1)

3" <1(<1) 2.3(2.0) 4.5(3 .8) 3.2(3.8) 2.9(2. 5) 2 .0(1.6) -

4" ' <1(<1) .3.0(2.6) 5.5(3 .5) 6.5(5.1) 7.0(4. 5) 7 .0(4.1) +

Животных иммунизировали однократно в дозе 1 мг в НАФ с добавлением 1 мг ГМДП.

Животных иммунизировали дважды в дозе 1 мг пептида в НАФ с добавлением 1 мг ГМДП (вторая иммунизация на 45 день в том же адъюванте).

Поскольку шестимесячные испытания на овцах протективного действия пептида 135-159 продемонстрировали уровень его активности, не обеспечивающий длительный протективный иммунитет, была предпринята попытка путем модификации структуры пептида увеличить его прогективную активность. Из данных литературы известно, что введение в пептид липофильиых группировок приводит к дополнительной неспецифичной активации В-лимфоцитов и макрофагов, а так же к активации Т-хелперных клеток, что повышает иммуногенность пептидов и увеличивает их протективный эффект [Rouaix et al.]. В связи с этим был получен липофильный аналог пептида 135-159, представляющий собой дипальмитоильное производное по остатку Lys135: C1SH3202-N -К(M "Ог^зг^гб -G-G-M-G-R-R-G-D-L-E-P-L-A-A-R-V-A-A-Q-L-P.

4.3.Иммуногенная и протективная активность пептида Рд1шг-135-159(111) на лабораторных животных и овцах.

Для оценки активности липофильного пептида (III) были проведены эксперименты на лабораторных животных - морских свинках (табл.11).

Таблица 11. Протективные свойства пептида 135-159(11) и его липофилього аналога (III) при однократной иммунизации морских свинок.

Пептид Доза (мкг) Адьювант Защита

135-159 50 ПАФ 5/5

135-159 10 ПАФ 0/5

135-159 10 НАФ 0/5

135-159 5 ПАФ 0/5

Ра1ш2135-159 50 ПАФ 5/5

Palm2135-lS9 10 ПАФ 5/5

Palm2135-lS9 10 НАФ 3/5

Palm2135-159 5 ПАФ 4/5

В качестве пептида сравнения был выбран фрагмент 135-159(11), индуцирующий 100%-ную защиту морских свинок от заболевания при иммунизации 50 мкг пептида. Как видно из таблицы, при снижении дозы иммунизации до 10 мкг пептид 135-159 утратил свои протективные свойства. В то же время, липофильный пептид (III) в тех же условиях защитил пять животных из пяти при использовании в качестве адъюванта ПАФ и три из пяти при замене ПАФ на НАФ. При дальнейшем уменьшении дозы липофильного пептида до 5 мкг было защищено четыре животных из пяти. Таким образом, введение в пептид 135-159 липофильных групп значительно повысило его протективную активность в опытах на. морских свинках.

В следующем эксперименте было проведено сравнение протективной активности пептида 135-159(11) и его липофильного аналога III на овцах (табл. 12 ). Животных иммунизировали однократно в дозе 0,5 мг пептида в адъюванте А с добавлением 1 мг ГМДП. Результаты испытаний показали, что липофильный пептид III обладает, по сравнению с пептидом 135-159. более высокой способностью вызывать образование ППА и ВНА. Оба пептида обеспечивали 100г.-ную защиту животных.

Таблица 12. Протектианые свойства пептида 135-159 (XI) и его липофильного аналога (III) на овцах.

N животного Пептид Титры ВНА, - log2(титры ППА .-lg) Защита

Дни 14 после иммунизации 21 31

1 135-159 5 0(3 3) 5 3(3.5) 6.5(4 1) +

2 135-159 9 2(3 9) 9 2(4.4) 9.0(4 1) +

3 135-159 1 5(3 5) 1 0(4.1) 2.2(4. 4) +

4 135-159 5 3(3 9) 9 3(4.7) 9.5(5. 0) +

5 135-159 8 2(3 9) 8 5(4.7) 8.6(4. 4) +

6 Ра1ш2135-159 10 3(4 9) 10 3(5.2) 10.2(5. 5) +

7 Ра1ш2135-159 7 7(4 9) 10 2(5.5) 10.7(5 8) +

а Palm2135-159 8 3(5 8) 11 5(5.2) 11.3(5 8) +

9 Ра1ш2135-159 8 3(5 2) 11 3(5.5) 11.0(6 1) +

10 Ра1ш2135—159 10 6(4 9) 11 5(5.5) 11.0(5 5) +

В эксперименте по выбору оптимальной адъювантной системы для введения овцам пептида Palm2135-159 исследовались композиции из ГМДП, адъюванта А на основе полиметилсилоксана и адъюванта Б, представляющего собой продукт глубокого гидрирования нефтяного сырья, содержащий предельные и нафтеновые углеводороды с числом атомов углерода >16 [патент SU 1797204 AI, А 61 К 39/135] (табл.13). Защиту овец определяли на 25 день после введения им 0,5 мг пептида в присутствии соответствующего адъюванта, заражение проводили 10000 ИД50 вируса ящура. Оказалось, что, в отличие от немодифицированного пептида (II), при использовании липофильного аналога (III) добавление к маслу А препарата ГМДП не приводит к повышению титров ВНА, а при сопоставлении результатов для двух масел оказалось, что более высокий протективный эффект пептид (III) проявляет при использовании адъюванта А.

Следующий этап работы был посвящен выяснению зависимости протективного эффекта от дозы пептида. Пептид вводили овцам в адьюванте А, начальная доза составляла "2 мг, конечная - 0,22 мг, использовали трехкратное разведение. Иммунизация животных в дозах 2 мг и 0,67 мг приводила к полной защите животных, а при использовании дозы 0,22 мг было защищено 3 животных из 5, при этом наблюдалась корреляция между дозой пептида и уровнем ВНА.

Таблица 13. Антигенная и ммуногенная активность пептида Ра1ш2135-159(111) в сочетании с ГМДП и маслинными адъювантами для овец.

N животного Доза ГМДП (мг) Масл. адью-вант Титры ВНА, -log2 Защита

Дни после иммунизации 14 21 25

1 1 А 1 .23 4.33 ' 6.5 +

2 1 А 2 .0 4.33 6.33 +

3 1 А 4 .33 6.16 6.5 +

4 1 В 1 .0 1.66 2.5 +

5 1 Б 1 .0 1.75 2.32 -

6 1 Б 1 .48 3.0 4.0 +

7 - А 4 .0 3.3 5.24 +

8 - А 3 .75 4.33 7.33 +

9 - А 4 .0 5.0 6.33 +

10 - Б 1 .0 1.0 1.0 +

11 - Б 1 .0 0.66 1.0 -

12 — Б 1 .0 2.0 2.33 +

Основываясь на результатах, приведенных в табл. 14, была определена величина ПД50 (доза пептида, обеспечивающая 50%-ную защиту животных) согласно формуле ПД5а — Дмакс / Kp(CyM-0'S), где Дмакс - максимальная доза пептида, Кр - кратность разведения, Сум - сумма отношений количества защищенных животных к общему числу животных, участвующих в каждом эксперименте. Величина ПД50 для пептида III в опытах на овцах составила 0,2 мг.

Таблица 14. Влияние дозы пептида Ра1ш2135-159 (III) на его протективную активность.

Доза пептида, мг Кол-во зараженных животных Кол-во защищенных животных Средний титр ВНА(—log2)"

2.0 5 5 8.4(8.3-8.5)

0.67 5 5 6.0(4.2-7.5)

0.22 5 3 4.0(2.2-5.7)

"Титр ВНА определялся на 23 день после иммунизации. В скобках приведен максимальный и минимальный титр группы.

Результаты исследования напряженности и длительности иммунитета у овец представлены в таблице 15. Животных иммунизировали пептидом III однократно в дозе 2 мг в адьюванте А, титры ВНА измеряли в различные сроки после иммунизации, начиная с 1 месяца и заканчивая 12 месяцами. В течение года наблюдалось постепенное снижение титров ВНА с 7,2 (через 1 месяц) до 3,2 (через 12 месяцев после иммунизации), но, как оказалось, этого уровня антител было достаточно, чтобы обеспечить эффективную защиту от заболевания: протективный эффект составил 100% через 7 месяцев и 90% через 12 месяцев после иммунизации.

Таблица 15. Напряженность и длительность иммунитета у овец, иммунизированных 2 мг пептида Palm2135-159(III) в адьюванте А.

Кол-во животных ' Сроки испытаний (мес.) Средний титр ВНА -log2* Защита (%)

5 1 7.2(5.2-8.5) 100

8 3 5.5(5.0-6.8) 100

8 5.5 .5.2(3.5-6.5) 100

5 7 5.0(3.0-6.0) 100

8 9 4.2(1.6-6.0) * •

10 12 3.2(1.0-4.0) 90

* В скобках приведен минимальный и- максимальный титр группы.

** Измерений не проводилось.

В настоящее время совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты животных (г. Владимир) на основе синтетического липофильного пептида Ра1ш2135—159 (III) разработан, противоящурный вакцинирующий препарат для овец, не уступающий по эффективности действия традиционной противоящурной вакцине, получаемой из инактивированного вируса. Этот препарат успешно прошел контрольные испытания и его применение разрешено на территории России.

выводы.

1. Синтезировано 25 четырнадцати-двадцатипятичленных пептидных фрагментов белка УР1 вируса ящура штамма А22, выбранных на основе данных литературы и теоретических методов анализа потенциальных иммунокомпетентных участков вирусных белков.

2. Показано, что синтетические фрагменты основного иммуногенного района белка УРг вируса ящура штамма А22: 136-152, 135-159, 136-159, 140-159, 142-159, 143-159, 136-156, 140-156, обладают собственной иммуногенностью и способны без конъюгации с белками-носителями индуцировать образование противопептидных антител и вызывать защиту экспериментальных животных от заболевания ящуром при заражении вирусом штамма А22.

3. Показано, что синтетические фрагменты белка УРХ вируса ящура штамма А22 > не входящие в основной иммуногенный район: 3961, 50-69, 175-139, 170-189, 197-213, способны без конъюгации с белками-носителями вызывать образование противопептидных антител.

4. Установлено, что в ряду изученных пептидов фрагмент 135159 белка УРг вируса ящура штамма А22 проявляет максимальную протективную и вируснейтрализующую активность, обеспечивая 100%-ную защиту от заболевания экспериментальных животных к овец.

5. Синтезирован высокоактивный липофильный аналог фрагмента 135-159 белка вируса ящура штамма А22, Ра1ш2-135-159, и на его основе разработан противоящурный вакцинирующий препарат для овец.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Яров A.B., Гельфанов В.И., Гречанинова Л.А.. Суровой А.Ю., Вольпина О.И., Иванов В.Т., Чепуркин A.B., Луговской A.A., Дрягалин H.H., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Антигенная структура вируса ящура. IV. Синтез и иммуногенные свойства новых фрагментов белка VPj вируса ящура штамма А22. — Биоорган.химия, 1989, т. 15,

9, с. 1193-1205.

2. Яров A.B., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А., Суровой А.¡0., Вольпина О.М., Иванов В.Т., Чепуркин A.B., Дрягалин H.H., Иванющенков В.Н. Антигенная структура вируса ящура. V. Защита природновосприимчивых животных от заболевания ящуром с помощью синтетического пептида. - Биоорган, химия, 1989, т.15, 10. с.

1313-1317.

3. Yarov A.V., Grechaninova L.A., Gelfanov V.M.. Surovoy A.Yu., Vol'pina O.M., Chepurkin A.V., Ivanov V.T. Protection from foot-and-mouth disease with synthetic peptides. - Kurzreferate 3 Riemser Wissenschaflichen Simposium "Immunologische diagnostic und immunoprophllexe animaler vlrosen" mit internaler Beteiligunge Greifswald, 1939, p. 19-20.

4. Яров A.B., Гельфанов B.M.. Гречанинова JI.А., Суровой А.Ю., Чепуркин A.B., Вольпина О.И., Иванов В.Т. Определение иммунокомпетентных участков белка VPX вируса ящура штамма А22 и подходы к конструированию синтетической противоящурной вакцины. -Тезисы докл. VIII Всесоюзн.симп.химии пептидов, Рига, 1990, стр.8.

5. Vol'pina 0. М. , Surovoy A.Yu., Gelfanov V.M., Grechaninova L.A., Yarov A.V., Ivanov V.T. Immunogenicity of synthetic VP: protein fragments and FMDV vaccine. -J.Cell.Biochen»., 14C, 1990, p.239.

6. Гельфанов B.M., Яров A.B., Гречанинова Л.А., Суровой А.Ю., Вольпина О.М., Иванов В.Т., Антигенная структура вируса ящура. VI. Функциональные участки иммунодоминантного района белка VPj вируса ящура штаммов OjK и А22. - Биоорган, химия, 1991, т. 17, 5, с.596-606.

7. Vol'pina О.М., Gelfanov V.M., Yarov A.V., Surovoy A.Yu., Chepurkin A.V., Ivanov V.T. New virus-specific T-helper epitopes of foot-and-mouth disease viral VPt protein. - FEBS Lett., 1993. v.333, N 1,2. p. 175-178.

8. Vol'pina O.M., Yarov A.V., Zhmak M.N., Kuprianova M.A., Chepurkin A.V.,Toloknov A.S., Ivanov V.T. Synthetic vaccine against foot-and-mouth disease based on a palmitoyl derivative of the VPt protein 135-159 fragment of the A22 virus strain. Vaccine, accepted 6.02.1996.

9. Яров A.B., Гельфанов B.M., Гречанинова Л.А., Суровой

A.Ю., Вольпина О.М., Иванов В.Т.. Чепуркин A.B., Иванющенков

B.Н., Дрягалин H.H., Бурдов А.Н. Пептид, обладающий защитным действием против вируса ящура штамма А22 - Авторское свидетельство 1702657 (приоритет от 15.11.1988).

10. Яров A.B.. Чепуркин A.B., Суровой A.D., Волкова Т.Д.. Вольпина О.М.. Иванов В.Т. Пептид, обладающий защитным действием против вируса ящура штамма А22. - Авторская заявка 5050539 (приоритет от 28.04.1992).