Синтез и исследование иммунологических свойств пептидов- фрагментов вируса ящура А12 и А22 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Р Г Б ОД

1 ■ : На правах рукописи

АШУРОВ СИРОДЖИДДИН ГУЛОМОВИЧ

1

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ-ФРАГМЕНТОВ ВИРУСА ЯЩУРА А12 И А22

Специальность — 02. 00. 03 — Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ДУШАНБЕ — 1996

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории «Пептид» кафедры органической химии Таджикского государственного университета.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор ХАЛИКОВ Ш. X.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, старший научный сотрудник БУРИЧЕНКО В. К-,

кандидат химических наук, доцент КАРИМОВ И. Б.

Ведущая организация: Душанбинский государственный педагогический университет им. К. Джураева.

Института химии им. В. И. Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, Душанбе, ул. Анни, 299/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химии им. В. И. Никитина АН Республики Таджикистан.

Защита диссертации состоится

/(Р часов на заседании диссертационного совета Д. 013.02.01

Автореферат разослан «

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ВОРОЖЦОВА М. Д.

12. VII. 1996 г. ТГУ. Заказ 31. Тираж 100 экз.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Одним из распространенных заболеваний сельскохозяйственных животных.наносящих большой экономический ущерб животноводству является ящур. Б настоящее время наиболее .эффективным средством специфической профилактики явдра является вакцинация препаратами, изготовленными на основе инакти-вированного вируса. Однако, широкая практика производства к использования показала и определённые недостатки таких вакцин. В частности,существуют проблемы изготовления ннактнвированных вакцинных препаратов из штаммов вируса, плохо раэиножавдисся в культурах клеток. Некоторые штаммы вируса ящура нестабильны, разрушаются до субъединнц при проведении различных манипуляций и хранении. Длительное культивирование в различных клеточных линиях может привести к возникновению штаммов,отличающихся по антигенности от исходного вируса. Кроме того, в традиционных вакцинах содержится значительное количество балластных примесей, перегружающих иммунную систему вакцинируемых жизот.чых и оказывающих побочные эффекты, особенно при ревакцинации. Наиболее серьезным недостатком протпволщурн!Г< вакцин, используемых в настоящее время, является то, что произведено их связано с наработкой большого количества вирулентного вируса, ¡три которой не исключается риск неполной инактивации вируса, г результате чего могут вспыхнуть очаги эпизоотии ящура при вакцинации такими препаратами.

Перечисленные зышз и другие недостатки традлаис-шш вгк-цин побуждают к проведению исследований, направленных на создание искусственных вакцин, ь згда в качестве антигенного материала используют синтетические пептиды, ижтгруйодге антпг«а.г:з детерминанты нативного белка и моделнрЗхщ:е, как;:л-л;£бо стразом. их пространственную структуру.

К. преимуществам пептидных синтетически/: ваг.акн мэ«нс отнести: стабильность; отсутсто.1., ? препаратах посторонних белков и нуклеиновых кислот; известный хкмач^.:::?! -•-.г.: ёозмоз-ность получения пептидов, шпиружгх антигенные легерштит'-. тех вирусов, которые не могут быть вьрацеды в количествах. необходимых длА получения вакцин; возможность создания Поливалентной вакцины в ЕИде единого язлимер*. содс-раед-;Го ¿ышя-нантные группы антигенов разных типса вируса; прзкгичесги ул~

« о _

А.

ограниченный срок хранения антигенов.

В начале 80-х годов появились первые сообщения о возможности получения химическим путем пептидов, представляющих антигенные детерминанты вируса ящура и обладающих антигенностью и иммуногенностыо для лабораторных и естественно-восприимчивых к ящуру животных. Однако, полученные препараты по ряду причин не соответствовали требованиям, предъявляемым к вакцинам и поэтому в этом направлении продолжаются интенсивные исследования. .

Цель и задачи исследования.Основной целью- работы являлся синтез пептидов, имитирующих антигенные детерминанты белка VP1 вируса ящура типов A^i A^i изучение их антигенных и иммуноген-ных свойств.

Для достижения поставленой цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести синтез пептидов, включающих последовательности аминокислот белка VP1 вируса ящура типов А^ и Ам;

- изучить физико-химические свойства полученых пептидов;'

- получить' коньюгаты синтезированных пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA) и полиэлектролитами-иммуностиму-ляторами-сополимером N-винилпирролидона и малеинового ангидрида (NM) и сополимером N-винилпирролидона и акриловой кисло-ты(ЫА):

- изучить антигенные и иммуногенные свойства синтезированных коньюгатоз;

Научная новизна работы. Впервые синтезированы пептиды, представляющие собой фрагменты 143-148, 149-159 и 153-159 белка VP1 вируса ящура А^и 134-139, 140-145, 150-155, 134-145 и 150-159 белка VP1 вируса ящура А^. Получены конъюгаты синтезированных пептидов с BSA и полимерами- иммуностимуляторами NA и N74. Показано, что коньюгаты пептидов белка VP1 вируса ящура Ад являются высокоэффективными иммуногенами в плане стимуляции длительного антипептидного иммунного ответа и иммунологической памяти. Конъюгаты пептидов белка VPI вируса ящура Адд способны

при иммунизации защищать животных как от заражения вирусом ящура Ajj. так и от заражения вирусом ящура типа А,д.

Положения, выносимые на защиту. Синтез пептидов 143-148, ,149-159 И 153-159 белка VP1 вируса ящура АДИ 134-139, 140-145, ' 150-155, 134-145 и 150-159 белка VF1 вируса ящура А^:

- Иммунизация животных конъвгатами пептидов с BSA и NA приводящая к образованию с высоким титром антипептидных и внрус-нейтрализующих антител;

- Длительность иммунного отпета при иммунизации зиготных конъюгатами пептидов с НА обеспечивается, по меньшей мере, 140 суток после вторичной иммунизации;

- Иммунизация конъюгатами пептидов белка V-P1 вируса ягдура ^способствующая защите лаборатории;: животных как от заражения вирусом ящура типа kJr так и от зарчжеиия вирусом ящура А,*

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований доложены, обсуздены и одобрены ка первой научной конференции биохимического общества республика Таджикистан "Проблемы биохимии" (Душанбе 1993). апрельской научно-теоретической конференции ТГУ (Душанбе1394}, Научной кск-ференции "Теоретические и прикладние проблем хшп:н" (ДуканСз 1995).

ПУБЛИКАЦИИ ПО РАБОТЕ. " По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

"ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выеодц. список литература и приложение.

Работа иллюстрированна 3 таблицам и •¿".-ill::;—1""»«л«,..

Список литературы включает 83 источника, из них 33 отечественных и 50 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и методы.Синтез пептидов.Синтез пептидов осуществляли классическими методами пептидной химии в растворе используя сочетание ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца и блочной конденсации. Для конденсации аминокислот и пептидных блоков использовали методы карбодиимид-ный, смешанных ангидридов, активированных эфиров и трансэтери-фицпрувщие реагенты.

Для защиты ¿-аминофункции аминокислот использовали Z-, Вое- и Nps-группы, СООН-группы защищали превращением в метиловые. бензиловые и трет-бутиловые эфиры. Боковые ОН-группы серпка и тирозина защищали бензильной защитой, гуанидиновую группу аргинина защищали нитрогруппой.

Конькгирование пептидов с BSА. НА и ИМ.Конъюгирование пептидов с BSA,осуществляли в диметилформамиде с использованием в качестве нуклеофильной добавки п-нитрофенола и fi-оксисук-цинимида.

Конъюгирование пептидов с полиэлектролитами осуществляли в диметилформамиде либо за счет активирования карбоксильных групп NA, либо за счет раскрытия ангидридного кольца NM.

Иммунизация животных.Для иммунизации конъюгатами пептидов белка VP1 вируса ящура кп использовали мышей гибридов СВА.ХС57/В1 //ß/Fl, а конъюгатами пептидов белка' VP1 вируса ящура Донорских свинок. Конъюгаты пептидов, с NA вводили' без адъювантов в дозе 100 мкг мышам и 200 мкг морским свинкам. Конъюгаты пептидов с ВЗА и свободные пептиды вводили в полном адъюзанте Фрейнда (ПАФ) в указанных выше дозах. Реиммунизацию мышеи проводили на 28 сутки свободными пептидами в дозе 10 мкг в физиологическом растворе.' Реиммунизацию морских свинок осуществляли конъюгатами пептидов с BSA в дозе 200 мкг в неполном адъюванте Фрейнда, а конъюгатами пептидов с НА- без аДъювантов в той же дозе. ..■-'■

- 5 -ЗАРАЖЕНИЕ ЖИВОТНЫХ Для заражения использовали вируса ящура типов Ад и Aw в дозе 200 ИД^ . Учет результатов заражения проводили через 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Иммунноферментный анализ (ИФА) пептидов, коньюгатов и сывороток крови животных проводили по видоизмененной методике (Bittie J.L.et al,1982).

Протективный эффект коньюгатов определяли по количеству животных не заболевших генерализованной формой ящура на 7-Я день после заражения.

22.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 2.2.1. Синтез пептидов. На основании литературных данных и теоретического анализа профилей гндрофильности. акрофнльнос-ти. антигенности и спиральных участков были выбраны, а затем синтезированы пептидные фрагмены белка 7Р1 вируса ящура типов АдИ Ад(таблица 1).

Было предположено, что антигендетермиизнтньй участок белка VP1 вируса ящура типа Аа расположен между аминокислотной! остатками 143-159. С целью анализа антигенных свойств этого участка были синтезированы.пептиды, перекрывающие этот фрагмент аминокислотнной последовательности белка VPl (pml.).

Разбивка данной аминокислотной последовательности на указанные фрагменты была осуществлена с целью уменьшения рацемизации на стадиях последующей конденсации фрагментов, а пкге продиктована требованием достаточной растворимости синтезируемых пептидных блоков.

Полные схемы синтеза Фрагментов 143-148 и 119-153, а также промежуточного фрагмента 153-159 приведены на рис.2 к 3.

Временные U-Z -и BZl-защитные группы с пептидов удаляли каталитическим гидрированием «ад Pd/C в иетаношшм растЕср« в присутствии уксусной кислоты. Вое- » защитнее группы снимали дейстбием раствора HCl в уксусной кислоте те. Лля отщепления Вос-защиты в присутствии сяогносХирисй трет-бутильной группы ранее было предложено Испсльгз^зть клекота средней силы: муравьиную и п-тзлуслсуль^сккслот/. Прююне-ние нами 98"-ной муравьиной кислоты для сняг.ш Е^-группн с

Таблица 1. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов.

Фрагмент i i 1 тип 1 Аминокислотная последовательность пептидов

1 вируса!

143-148 1 Ац 1 H-Val-Arg-Gly-Asp-Phe-Gly-OH

153-159 1 А а. 1 H-Arg-Val-Ala-Arg-Gln-Leu-Pro-OH

149-159 1 А /д | H-Ser-Leu-Ala-Pro-Arg-Val-Ala-Arg-Gln-

Leu-Pro-OH

134-139 1 Ам 1 H-Gly-Lys-Tyr-Ser-Ala-Gly-OH

140-145 1 ада 1 H-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-Gly-OH

150-155 1 А м 1 H-leu-Ala-Ala-Arg-Val-Ala-OH

134-145 1 А^ 1 H-Gly-Lys-Tyr-Ser-Ala-Gly-Gly-Leu-Gly-Arg-

Arg-Gly-OH

150-159 1 hl 1 H-leu-Ala-Ala-Arg-Val-Ala-Lys-Gln-Leu-Pro-OH

Рис.1. Фрагменты белка VP1 вируса ящура А12 119 143 145 146 148 149 152 153 155 156 159

i-1 i-1 i-1 i-1 i-1

! V R G i I D F G | ISLAPI'IRVAI |RQLP| ¡_! i_i i___i i_i i_i

пептида (IV) в течение 2.5-3.5ч приводило к заметному отщеплению сложноэфираоП 0В:г -группы. Для подавления зтого процесса реакцию проводили в смеси трет-бутанол-муравьиная кислота (8:2). однако и в этом случае, наблюдалось частичное отщепление сложноэфирной ОВи^ -группы.

При получении пептидных.; блоков реакцию конденсации осуществляли. в основном, методом смешанных ангидридов. Б ряде случаев применял! метод активированных эфиров (соединение XV) и карбодииыидный метод (соединение VII). Выбор метода смешанных ангидридов в качестве основного был обусловлен доступностью реагентов и простотой постановки эксперимента. Этот метод позволял получать пептиды с достаточно хорошими выходами без применения трудоемких способов очистки.

Рис.2. Схема синтеза Фрагмента 143-148 белка VP1 вируса

ящура типа А^ .

Val Arg Gly Asp PI« Gly

I Boc-^QH HtOCH I BocfOH H+0CH3

. I ' |N0t I I I I III I

I Boc^-HOCH I Boc-I--i-0CH3

I ' INOj, la 1 I I illa I

Вос-ЮН Ii fr-f-OCH Bccipií H i-l-OClij

I II I ' ¡0But: I IV I

Boc-i-^----i-ОС» --—i-iOCHj

I |M0t IIa I |OBu I IVa I

Boc-j—---[ОН H i—----1-I-OCH3

I H% j V lOEtf I Í

Boc-i--^-:-i------ !x--i-—t-0CH3

I iWOj. i Va .|0Blf I - ¡

Boc-I--ir----1------}---i-CH

I l\ I iGBu I i

! .IHot i vi i I i

H J->-1-!--—I----ICH

Как правило, все пептиды, синтезиромянко этим методом, после обычной обработки реакционной счеси ц перекристаллизации или переосаждения получались достаточно чистыми. Некоторые пептиды, полученные методом активированных эфиров п ;<;:рбэг-г.!:-мндннм методом очищались хроматографнчески на колонке с сили-кагелем.

Очистка фрагмента 146-148 (соединение IVa) от исходных н побочных продуктов со свободной Ji-COOH - группой асларзгнновся кислоты путем переосаждения л перекристаллизации приводила к увеличению количества побочных продуктов. Поэтому соединение (IVa) для дальнейшей реакции конденсации использовали сразу послеудаления растворителя и сушки.

Омыление метилового эфира трипептида (1Ь осуществляли действием щелочи на его метано;.:?"^ раствор. В случае метилового эфира (XI) омыление проводили к,со;н.а раствор пептида в смеси хлороформ-метанол (4:1) в течение 3-d : ч. Следует отметить, что после осуществления гидролиза метиловых эфиров арпшш-содержащих пептидов трудно Сш:о вмелить продукты реакции экстракцией оргакичесг/кл растворителями 512

- 8 -

Рис.3. Схема синтеза фрагментов 149-159 VP1 вируса ящура типа А12.

и 153-159 белка

Ser Leu Ala I I I

Pro

Arg Val Ala

Вос-Ц^Н

Bzl

Boc-k^-

Bzl

Boc-t^-

Bzl

H+

|4Bzl

H+-

Boc-

I

I t Nps+OH HfOBzl I Xllll

Hps-j-ftBzlBoc-ЦЩ №

iXIIIai ! NOg,

Z +0H H-l--fOBzlBoc-^-

IXIV | | M0t

4-f-OBzlBoc-^-—

IXIVa I I N0fc ' 40H Boc-J^

I Boc+OH H+OCH, X

IXV

-I-Юн HV

Щ

I

N0t

Щ

I NO,

+

Xa

XI

XIa

Arg Gin Leu . Pro I

I | Nps+OH H 40BZ1 VII f

NpS-Boc+OHH r

I

ОСН»

Boc-

OCHBoctyH H-

lNOt OCHBoc-^—— IN04

OH H^-

XII INQj,

-H*-

Xlla IHO^

НГ

XVI

XVIa | KQj,

-k—

XVII |N0a

40BZ1

VII

40BZ1

Villi

-+0BZ1

Villa!

-fOBzl

IX I

-fOBZl

IXa

-fOBzl

■+0BZ1

-+OBZI

-ЮВ21

40BZ1

-fOH

подкисленной- реакционной смеси. Это было связано с тем. что Н-ацилпептиды. содержащие остаток аргинина со свободной СООН -группой, оказались хорошо растворимыми в таких растворите- , лях как ацетон, метанол, этанол, в их смеси с водой, но не растворимыми в таких не смешивающихся с водой растворителях как эфир» этилацетат. хлороформ, бутанол.. Поэтому продукты реакции после омыления были выделены после удаления катионов натрия и калия . действием катионита-дауэкс 50W (Н-Форма)В . свою очередь, очистка омыленных пептидов осуществлялась путем осаждения их натриевых и калиевых солей из.метанола ацетоном.:

а также перекристаллизацией.

Однако, аргинин-содрржащи;! пептиды с затаенной С-кнапевай СООН-группой и соединение (XV) растворялись только в дима-тилФормамиде. смеси хлороформ-метанол (4:1), а некоторые неп-тидн (II. Па, IV. XI)-еще в ацетоне и метаноле.

Поскольку при кислотном гидролизе М-зицищ£нннх пептидов, содержащих остатки нитроаргинина. наблюдается неполное отщепление ^группы и. как следствие этого, при аминокислотном анализе сильно занижается содержание аргинина, аминокислотный анализ пептидов Па,Х1а и 1Ха осуществляли после удаления Ш^.а также Вг1-групп путем каталитического гидрирования.

Конденсацию вышеописанных фрагментов осуществляли, в основном. методом смешанных ангидридов где образуется меньшее количество побочных продуктов, чем. например, при использовании карбодиимидного метода.

Из всех конденсируемых пептидных блоков, фрагмент 143-145 в качестве С-концевого остатка имеет глицин, еще два (156-159 и 149-152)- нролин и один (153-155)-алзнин. Таким образом, наибольшая опасность рацемизации существует при конденсации фрагмента 153-155 с Фрагментом 156-159 и степень рацемизации может оказаться значительной при неблагоприятных условиях течения реакции.

Имеющуюся опасность рацемизации уменьшали путем тщательного соблюдения "условия Андерсона". Для этого реакции проводили при достаточно низкой температуре (от -25едо - 15'С), уменьшали время образования активированного компонента до 3-5 мин и. кроме того, применяли слабое основание - Н-кети/шсрфэ-лин.. Однако плохая растворимость одного или обоих неходких компонентов, а также получаемых продуктов реакции, ограничивала применение тетрагидроФурана в качестве растворителя, л поэтому, реакции образования смешанного ангидрида и конденсации проводили в диметилформамиде.

Следует отметить, что хорошие и удовлетворительные выхода продуктов конденсации блоков достигались постепенным увеличением избытка карбоксильного компонента по мере увеличения числа аминокислотных остатков в аминокомпокенте. Например, в случае получения 7-членного пептида (Фрагмент 153-153) избыток карбоксильного компонента составлял 10-20%. а э случае синтеза 11-членного пептида (фрагмент 149-159)-50%.

- 10 -

Поскольку все вышеописанные пептиды, после их конъюгиро-вания с различим« носителями [федназначались для дальнейших иммунологических исследований, были получены N - норлейциновые производные этих пептидов. Наличие в пептидах рстатка норлей-цина облегчает определение степени коныогирования их с белковыми носителями. Эти норлейциновые производный получали путем конденсации методом смешанных ангидридов Вос-Й1е-0Н с хлоргид-ратами 7.11-и 6-членных пептидов: Еос-Ще-153-159. вое- Nle-149- 159 и Вое- Nie- 143- 148. Увеличение выходов продуктов конденсации достигалось путем применения 100%-ного избытка карбоксильного компонента, а также более двух экв. нуклеофиль-ной добавки -1 гидроксибензотриазола. Цель» применения последнего реагента было уменьшение образования побочных продуктов уретанового типа путем превращения смешанного ангидрида в 1-гидроксибензотриазоловый эфир карбоксильнрго компонента In situ в процессе конденсации. '

Все полученные пептиды (кроме пептидов 143-148 и Н1е-143-148) плохо растворяются в таких растворителях как эфир, этилацетат. хлороформ. Они малорастворимы в ацетоне и метаноле, но хорошо растворимы' в диметилформаииде, смеси хлороформ - метанол (содержащей 10% и более.метанола).' горячей CHjCOOH. Поэтому синтезированные пептиды невозможно • было очистить от исходных веществ обычным приемом (промыванием растворов реакционной смеси релыми И основными реагентами). Труднорастворимые пептиды рт исходных амино-и карбоксильного компонентов, а также некото^х побочных продуктов реакции следовало осуществить с помощь|. ионообменников. Для этого сначала из хлороформ-метанольного (1:1) или диметилФормамидного . раствора реакционной смеси удаляли карбоксильный компонент (если его невозможно удалить переосаждением) и НС1 йз оставшегося хлоргидрата Н-метилморфолина. действием.ионообменной смолы Аы-берлит IRA-401 (0Н:Форма). затем аминокомпонент и оставшийся N-метилморфолин удаляли действием ионообменной смолы Дауэкс 50W (Н*-фориа). Дополнительную очистку проводили путем пере-сгаадения продуктов из хлороформ - метанольного раствора зти-лацетатом или ацетоном. Поскольку с увеличением молекулярной массы амнно-и карбоксильного компонентов их удаление ионооб-менш:ками замедлялось, приходилось применять новые порции последнего или использовать колоночную хроматографию на силн-

- и -

кагеле (например, в случае пептидов 149-159 и М1е-149-159).

С помощью ТСХ обнаружилось, что в процессе конденсации блоков методом смешанных ангидридов образуется небольшое количество побочных продуктов; которые очень близки по хроматографической подвижности к основным. Хотя образовавшиеся побочные продукты трудно обнаружить в защищенных пептидах, их, если они образовались в достаточном количестве, легко заметать после процедуры снятия защитных групп в смеси хлоргадратоз. Такие образовавшиеся побочные продукты в нашем случае были окончательно удалены на последней' стадии с помощью полупрепаративной ВЭЖХ.

Полное деблокирование , всех пептидов осуществляли каталитическим гидрированием в токе водорода их хлоргидратоз в смеси метанол-муравьиная кислота Д1:1) в присутствии Рй/С. Реакция гидрирования больших пепт^доз протекала медленно и не до конца. Поэтому, чтобы реакция .протекала более чем на 80% в течение 7 сут было необходимо менять катализатор 2-3 раза. Предварительную очистку продуктов гидрирования проводили переосаеде-нием из метанола- эфиром или этилацетатом. Затем очистку пептидов осуществляли ВЭЖХ на полупрепзратнаяой обращбнно-фазовой колонке при градиенте метанола б 0.2% СР^СООН.

Поскольку, в нашем случае, хлоргидраты аргшписодерюадх пептидов оказались лучше ) растворимы:«! в вола, чем форматы, все синтезированные пептиды^ были превращена в хлоргидраты. Аминокислотный анализ полученных пептидов соответствовал их теоретическому составу. 5

Поскольку в странах СНГ, и особенно в Таджикистана. ода?; из самых распространённых типов вируса ящура, является вирус Агл. исследования, направленные на изучешге его антигекисл структуры, представляют особый интерес.

При выборе пептидов для синтеза из , белка V? енруса ящура типа Ацрыл проведен теоретический анализ антигенной структуру данного белка (Вольпина О.М. и др., 1988). Графические изображения профилей гидрофиль^ости,акрофильиоста. аатигеиности, а также вероятных.¿-спиральных, ^-складчатых участков и^-изгибов приведены на рис.4 Согласно данным теоретического анализа, наиболее вероятные антигенные детерминанты основного иммуноген-ного района расположены на участке 131-149. Этот участок обладает высокими акрофильными и гидрофильньш свойствами, на этом

участке также высока вероятность появления ji-изгибов. Исходя из этих данных был синтезирован пептидный фрагмент 134-145 белка VP1 вируса ящура АиОднако, исходя из литературных данных о том. что главные антигенные детерминанты белка VP вируса ящура находятся между аминокислотными остатками 130-160, оыл также синтезирован пептид, отвечающий аминокислотной последовательности 150-159 белка VP вируса ящура типа Ад

Фрагмент 134-145 был синтезирован путём конденсации двух гексапептидных блокоь - 134-139 и 140-145, фрагмент 140-145 был синтезирован путем конденсации двух трипепгидных блоков -140-142 и 143-145. Вышеуказанные трипеитидные блоки и гекса-пептидный фрагмент 134-139 были синтезированы путем ступенчат того наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца. также с использованием метода смешанных ангидридов(рис.5).

Разбивка аминокислотной последовательности на указанные Фрагменты была продиктована, в основном, стремлением к упрощению синтеза и уменьшению рацемизации на стадии последующей конденсации (у всех пептидных бликов С-концеьым остатком является глицин), а также требованием достаточной растворимости синтезируемых блоков.

Выбор метода смешанных ангидридов в качестве основного был обусловлен доступностью реагентов и простотой постановки эксперимента. Этот метод позволял получать пептиды с достаточно хорошим выходом без применения трудоёмких способов очистки. Как правило, все пептиды, синтезированные этим методом, после обычной обработки реакционной смеси и перекристаллизации или переосакдения получались достаточно чистыми.

При синтезе данного пептида временные МА-г-защитные. группы. а так&е bzl и группы в конце синтеза удаляли каталитическим гидрогенолиэом над Pd/C Б метанольном растворе б присутствии уксусной кислоты. Вос-эащитную группу снимали действием раствора HCl в уксусной кислоте или этилацетате. Омыление метиловых э^ирзв осуществляли действием щелочи на метанольный раствор пептида.

фрагмент 150-159 был синтезирован согласно схеме, изображенной на рис.6 путем конленсации фрагментов 150-155 и l5f-159 методом сыеганных ангидридов. Поскольку С- кснцс-вым остатком фрагмента 150-155 является аланин. то нм-'кцаяся в этом случае опасность рацемизации, уменьшалась путем тцатель-

3О «О $0 «С /X НО Д/Р

4'1 Данные теоретического анализа годро^ильныхСа),акро-^ильных(б), <Л-спиральных{гКантигенннх(ь) и .л -йэгибов(д) белка yPj. Расчёт проводили по усреднении коэ^ицеитом г<ьк-сапептидныяс фрагментов.

Ью.5. Схема синтеза фрагмента 134-145 белка йирусЙ щура А^

Л» Ьр Ту

«ое Ткя.

; и

вое-ОН Н

Л

он и г

ЛЬ «у Г5, Ц« % А

Ъос

ш

'»¿Г

Ш

В*

г

В2*

Ы

ВЛ

02/! Ы Ш

т к

I

и

На

М

та

V/

\7Л

ЧА

оси, оси,

■ОСИ,

оси, оси,

сс^Ьл-

ОСИ, ЪсС, СЩВеС ЛЕЯ,

ОЙ н

у/т.

оог,

ОСЙД

ОДВ*, ОС^Ье 0«

Н-

Н

'.Вое

И

V

«л*

мь

Шг

щ

т.

ио* щ

Юг

В-

(Щ

щ

шь щ

ос*, осе» оаь ои

ОЙ

он

Рис.6.Схема синтеза фрагмента 150-159 белка УР^ вируса щура кд>

- ного соблюдения условий Андерсона и использованием нуклеофиль-ной добавки-1-гидроксибензтриазола. Синтез фрагмента 150-155 был осуществлен путем последовательного наращивания пептидной ,цепи. Начиная с Суконца либо методом смешанных ангидридов, либо методом активированных эфироз.Пентафторфениловый эфир ;Nps-Al3^ÖPfp.был синтезирован с использованием трансэтерифи-цирующе'рЬ реагента-дипентафторфенилкарбоната. Полученные таким образом.; активированные эфиры были использованы для реакции конденсации без выделения продукта из реакционной смеси и дополнительной очистки. Фрагмент 156-159 был получен также путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с с-конца с использованием карбодиимидного метода (дипептид Nps- Leu- Рго-OBzl) и метода смешанных.ангидридов.

- Пм&ое деблокирование фрагментов 134-145 и 150-159 а также промежуточных защищенных гексапептидов 134-139, 140-145 и 150-155;осуществляли после удаления Boc-, Nps- и -оНе груп ха-. талитичбеким гидрированием их хлоргидратов в муравьиной кислоте в присутствии Pd/C. Реакция гидрирования Фрагментов 134-145 и 150г15Э протекала медленно и не до конца. Поэтому, чтобы обеспечить протекание реакции на 80% и более, било необходимо проводи^ гидрирование в течение 6-7 сут и менять катализатор 2-3 раз!-.

Предварительную очистку продуктов гидрирования осуществляли 'переосаждением из метанола эфиром или ацетоном. Затем очистку* пептидов 134-145 и 150-159 осуществляли с помощью БЭЖХ на полуфеларативней обращенио-фазовей колонке при градиенте концентрации метанола в 0,2% СЕ, СООН.

Аминокислотный анализ синтезированных пептидов показал соответствие их структуры теоретическому составу.

г.к г. КОНЪЮГИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ НОСИТЕЛЯМ^.

Дл$ проведения иммунологических исследований деблокированные рептиды были коньки??чны с различными высокомолекулярными носителями. В качестве носителей использоЕакы: сукцининфованный BSA. сополимер НА с молекулярной массой 100000 ¿s сополимер ИМ с молекулярной массой 43000.

Bgô исходные данные и. яоаученкые при кснъьгироьг.еп-тидоа 5ёлка VP1 вируса ящура тага Аарезультаты приведены в таблице 2. .

Таблица 2. Исхолние данные и результаты, полученные при конъюгировании пептидов белка УРА вируса ящура Ад.

-!-т-1-

N I Пептид I Исходное м:лярное| Степень конъюгации

(соотношение носи-|-1-

(тель:пептид 1в % по пептиду |моль пептида/ I I |моль носителя

BS А ! НА ( !JM. I ВГ.А | NA I NM 1 BSA I НА IHM -1-1-1-1-1—I-1-(—

1.1153-159 11:30 11:30 11:30 123.3 (89.3 I 7 |26.5| -2.1149-159 11:30 (1:30 (1:20 ЦЗ.З (53.3 |20| 4 ( 16 l 4

3. Ц43-148 |1:30 11:30 |l:20 llC.3 |26,6 |25| 5 | 8 | 5

4. |Wie—153—15911:40 I - I - I 55 I - I 22| - I -

5. (Kle-t49-159(1:40 ( - I - I 20 I - I -| 8 | - | -

При конъкгировании пептидов 153-159.149-159 и 143-148 с BSA карбодиимидным методом с использованием п-нитрофенола у полученных коныогатов невысокая степень конъюгации - 7,4 и 5 моль пептида на 1 моль BSА. соответственно. Как известно реакция конденсации'при карбодиииидном методе в присутствии п-нитрофенола идет через образование активированных (п-нитрофенило-внх) эфиров. Поэтому было предположено, что использование N-оксисукцинимида, вместо n-нитрофенола, может привести к увеличению степени конъюгации.

На увеличение степени конъюгации может также повлиять увеличение молярного соотношения белок: пептид. Для проверки этого предположения при конъюгировании пептидов Н1е-153-159 и Nie-149- 159 с BSA вместо n-нитроФенола был использован N-оксисукцинимид и молярное соотношение белок - пептид было .увеличено до 1:40. И действительно такие изменения привели к значительному увеличению степени конъюгации: 7 и 22 моль пептида на 1 моль белка в случае пептидов 153-159 и 111е-153-159, 4 и 8 - В случае пептидов 149-159 и Н1е-149-159.

Расчет числа молеп пептида присоединенного к BSA по данным аминокислотного анализа проводили двумя методами. Первым методом эпитопную плотность определяли по соотношению таких аминокислот, как глицин. фенллаланин. лейцин и аланин в исходном ВЗА и в f'-онъюгате. При использовании второго метода учитывались все аминокислоте входящие и в исходный BSA и в пептид. Здесь.

определялась разница в содержании аминокислот входящих в пептид, BSA и коньюгат. Расхождения в значениях эпитопной плотности полученных этими методами состовляло 1-2 моль, В таблице 2 приведены усредненные значения. Эпитопная плотность конъюга-тов пептидов. Nle-153-159 и Nle-149-159, расчитанная по содержанию норлейцина в коныогате, почти не отличалась от рассчитанной с другими методами.

Для конъюгирования пептидов с полимерами иммуностимуляторами использовали полимеры, отличающиеся структурной цепи и содержащие различные функциональные группы. При конъюгации с NM конъюгироваиие проходит за счет раскрытия ангидридного кольца. При коньюгировании с NA образование амидной связи идёт за счет активных N-оксисукцинимидных групп полимера. Тем не менее, было показано, что природа функциональной группы влияет на степень коньюгации только у пептида 149-159.

Было выявлено также, что при коньюгировании различных пептидов с одним и тем же полимером, степень коньюгации различна. Это. по-видимому, связано не только с различной растворимостью пептидов, но и с природой аминокислоты.. находящейся на Н-конце пептида. Так. например, для пептидов со стерически затрудненной аминогруппой валина степень коньюгации на всех носителях была ниже, чем для пептидов, содержащих на N-конце другие аминокислоты. Подобную зависимость можно заметить при коньюгировании пептидов с BSA.

Данные, полученные при коньюгировании пептидов 134-139, 140-145.150-155,134-145 и 150-159 белка VP1 вируса ящура типа Au приведены в таблице 3.

Степень конъюгирования определяли фотометрически по содержанию аргинина в образцах, а также по данным аминокислотного анализа.

Таким образом, полученные результаты показывают, что замена n-нитрофенола на N-оксисукцинимид при конъюгаровании пептидов с белком приводит к увеличению степени коньюгации для данных пептидов. Кроме активирующих, реагентов.на степень коньюгации влияет и природа аминокислоты, находящейся на N-конце пептида, причем это влияние, вероятно, сильнее, чем влияние длины пептида.

Таблица 3. Исходные данные и результаты, полученные конъюгировании пептидов белка ЧР1 вируса ящура А^.

при

-1-——г

Пептид |Исходное молярьое I соотношение

Степень коньюгации

в % по пептиду

моль /моль петида .носителя

~г

ВБА

ИА

ВБА

НА

ВБА

НА

134-13911 140-145Ц 150-155Ц 134-14511

150-15911 _

30 30 30 30 30

1:30

1:30

1:30"

1:30

1:30

" 70 63,3 46,6 20 56,6

63,3 21 . 19

73,3 19 22

53,3 14 16

56,6 6 17

50 17 15

2.2.3. АНТИГЕННЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ КОНЪЮГАТОВ. _ '

Антигенные и иммуногенные свойства пептидов вируса ящура А^и их коньюгатов изучали на мыщах-гибридах СВАхС57/В1/6/Т массой 20-22г. Животных иммунизировали внутрибрюшннно различными дозами конъюгатов пептидов с НА,а также свободными пептидами в ПАФ и в физиологическом растворе. Вторичную иммунизацию проводили гомологичными пептидами, не коныогированными с носителем, в физиологическом растворе.

С целью изучения динамики образования антител к пептидам, через каждые десять дней после однократного-и двукратного введения синтезированных антигенов у мышей брали крсвь из ретро-орбитального синуса. Исследование гуморального иммунного ответа проводили методом иммуноферментного анализа, . определяя уровни антипептидных антител в сыворотках крови животных.

Результаты опытов, оценивающие уровни антипептидных антител при двукратной иммунизации мышей синтетическими антигенами.. представлены на рис.8,9. Животных иммунизировали яонъюга-тани пептидов 143-148, 153-159 и 149-153 и свободными пептидами в дозе 100 мкг по пептиду на мышь. Через 28 дней во всех группах' иммунизированных-ишотных проводили повторное введение

Рйс. 7. Вторичный иммунный ответ на иммунизацию неконьюгиро-ванными пептидами после иммунизации свободными пептидами в ПАФ. Антипептидныё Jg С-антитела определяли методом ИФА на 30-е сутки после повторной иммунизации.

татры антител 1бЮ 3+

г-

1

п

—1~!

-1-1

щ

ей

п

1.0 2.П

3 О

1

143-148+ПАФ 149-159+ПАФ 153-159+ЛАФ

143-148 149-159 153-159

•контроль (не иммунизированные животные)

Рис.8. Вторйчкый иммунный ответ на ктаунязацию свободными пептидами посла иммунизации коньвгатами пептидов с НА. Актипеп-тидкые антитела выявляли методом ИФА на 30-е сутки после повторной шмукизации.

тйтры 3-аитител 1810

1

-I-

-1-1

1

-1-1

-1-1

2 □ з.О

143-148+ПЭ; 149-159+ПЭ; 153-159+ПЭ;

И

■ 143-148 149-159 153-159

контроль (не иммунизированные животные)

соответствующего пептида в дозе 10 мкг. не конъюгироваиного с носителем. Из рисунка вилно, что примирование кокьюгатами пептидов 143-148 и 149-159 о последующей реиммунизацией свободныг ми пептидами в физиологическом растворе приводило к образованию антип£птидных 1вС-антител. Повтбрная иммунизация на 28-е сутки свободным пептидом 153-159 животных, примированных соответствующим коньюгатом, не вызывала индукции иммунного ответа, уровень которого незначительно отличался от уровней антител в группах животных, двукратно иммунизированных свободным пептидом 153-159. В то же время, иммунизация животных изолированными пептидами 143-148 и 149-159 также не индуцировала образования антипептидных антител ни при двукратном, ни при однократ-г ном введении, в отличие от гомологичных конъюгатов. Титры антипептидных антител в этих группах практически не отличались от фонового уровня контрольных, неиммунизированных животных. Для сравнения иммуностимулирующего действия полимерного носителя синтезированные пептиды вводили мышам в ПАФ в дозе 100 мкг. Результаты опытов показали, что однократная иммунизация изолированными пептидами, вводимыми в адъюванте, не обеспечивала существенного уровня антипептидных антител. Повторное введение всех изученных пептидов в таких группах животных не приводило к повышению уровней антител. Титры антител во всех группах соответствовали контрольному уровню.

Иммуногенные свойства синтетических пептидов, представляющих последовательности различных районов УР1 вируса ящура, изучались во многих работах. Согласно литературным данным.- в этих экспериментах выраженный анамнестический иммунный ответ развивался при многократном введении больших доз пептидов, ко-ныогированных с различными белковыми носителями, совместно с ПАФ или каким-либо другим адъювантом. Причем, наиболее эффективным было введение конъюгата пептида с высокомолекулярным носителем К1Н с последующей, инокуляцией неконъюгированного пептида в адъюванте. Эффект, как было показано ранее, зависел от вида носителя. Анализ результатов, полученных в наших экспериментах. показал, что однократная иммунизация мышей синтезированными конъюгатами пептидов 143-148 и 149-159 с повторным введением гомологичных пептидов,не конъюгированных с носителем, в стсуствие дополнительного введения адъквакга. приводила к значительному увеличению уровней антипелтидных антител

IgG-класса во всех указанных группах.

Протективный эффект конъюгатов пёптидов белка VP1 вируса яшура Aja определяли на морских свинках. Первичную иммунизацию осуществляли конъюгатами пептидов с BSA в смеси с ПАФ в дозе 200 мкг пептида на одно животное. Вторичную иммунизадцию проводили через 42 сут в той же дозе, но В сочетании с неполным адыо'вантом Фрейнда. Первичную и вторичную иммунизацию конъюгатами пептидов с НА проводили без адшванта. Заражение проводили через 55 сут вирусом яшура А^ и Адд в дозе 200 ИД^ . Данные . иммунологических исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4. Протективный эффект, проявляемый коньвгатами пептидов вируса яшура Л^д.

Коныогат

Протективный эффект

защ./зар 1 %

Контроль

число заболевших/ число зараженных

134-139-BSA

134-139-NA

140-145-BSA

140-145-МА

150-155-BSA

150-155-НА

134-145-BSA

134—145—WA ■

150-159-BSA

150-159-МА

2,0 2, Г 2.0 2,1 3.1 2.1 2,1 2. 1 3,0 3.0

J 0, 8 |0. 9 Ю.8 11.1 12,2 12,0 Ю,8 11.2 12,2 11.5

0/6 0/6 0/6 1/4 2/4 3/6 2/6 0/3 3/6 3/6

о о о

25 50 50 33 О

50 50

6/6 6/6 6/6 4/4' 4/4 6/6 6/6 3/3 6/6 6/6

а) антипептидные антитела (Ig)

б) вируснейтрализующие антитела (log )

в) заражение проводили вирусом яшура типа Ац

Из таблицы видно, что конъюгаты пептидов 134-139-BSA, 134-139 NA, 140-145 BSA, хотя и вызывают образование антипептидных антител с достаточно высоким титром, но титр вируснейт-'

рализующих антител меньше или чуть больше I. и как следствие этого, иммунизация данн ми коньюгатами не приводит к защите животных от заражения гомологичным типом вируса ящура. Иммунизация коньюгатами 140-145-NA. 150-155-BSA и 150-155-NA наряду с образованием с достаточно высоким титром как антипептидных, так и вируснейтрализующих антител, способна обеспечивать защиту 25-50% животных от заражения ящуром. ■

Неожиданным оказался тот факт, что протективный эффект конъюгатов пептидов 134-145 и 150-159 белка VP1 вируса ящура % проявляется против заражения.вирусом типа причем защитными свойствами обладают оба коньюгата пептида 150-159, тогда как в случае фрагмента 134-145-только коньюгат пептида с BSА.

Этот факт, по всей вероятности, можно обьяснить тем, что аминокислотная последовательность' участка 150 -159 у вируса ящура типов Ад .и А д.а_различается только двумя аминокислотными остатками, в то время как на участке 134-145 аминокислотные последовательности различаются шестью аминокислотными остатками (Рис. 9-).

Рис.? '. Сравнение аминокислотных последовательностей 134145 и 150-159 белка VPlBupyca ящура типов А^й Приведены только отличающиеся остатки.

134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 A¿2 ASn Lys Туг Ser Phe Asn Туг Ser Cly Val Arg Cly AnCIy____Ala Cly Cly Met _ Arg ___

150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 ''

Ад Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Gïn Leu Pro Au__Ala___Lys___■

Таким образом, коныогаты пептидов 143-148 и 149-154 белка VP1 вируса ящура типа А^с- НА являются эффективными иымуногена-ми в плане стимуляции длительного антипептидного гуморального иммунного ответа. Продолжительность иммунного ответа, по нашим данным, наблюдалась з течение длительного периода времени после повторной иммунизации. В использованной схеме иммунизации низкие примирующне дозы пептидов в составе коньюгата после повторной стимуляции пептидом вызывали сходные уровни иммунологической памяти при сравнении с иммунным ответом на высокие лри;улрувд!е дозы антигена. Кокъюгаты пептидов белка VP1 вируса

ящура Аус синтетическим полианионом (NA), в отличие от не конъюгированных. способны примировать мышей для вторичного ответа на гомологичный свободный пептид. Низкие дозы коньюгатов. в отличие от высоких, не индуцируют первичного ответа, однако-способны вызывать сходные уровни иммунологической памяти. Повторное, после примирования конъюгатами введение свободного пептида, не связанного с носителем, и без адьюванта. индуцирует длительное образование циркулирующих IgC-антител. Конъюгаты пептидов 143-148 и 149-159 белка VP1 зируса ящура А& обладают сходныим иммуногенными свойствами. Конъюгаты пептидов белка VP1 вируса ящура 140-145-NA, 150-155-BSA и 150-155-NA способны при иммунизации ими вызывать образование с высоким титром антипептидных и . вируснейтрализующих антител и обеспечивать 25-50% - ную защиту морских свинок от заражения гомологичным типом вируса ящура. .Обнаружено образование перекрестной защиты между вирусами ящура типов и ки при иммунизации конъюгатами пептидов 134-145 и 150-159 белка VP вируса ящура кц, при заражении вирусом ящура типа

ВЫВОДЫ.

1. 'Синтезированы пептиды, имитирующие участки предполагаемого основного антигендетерминантного района белка VPI вируса ящура типов Ац.и Адд,и получены их конъюгаты с бычьим сывороточным альбумином и полиэлектролитами-йммуностнмуляторами-сополимером М- винилпирролидона и акриловой кислоты и сополимером М-винил-пирролидона и малеинновогоангидрада.

2. При коныогировании пептидов с белком в органическом растворителе карбодиимидным методом замена п-нитрофенола на N-оксисукцинимид приводит к увеличению степени конюгации/ На степень конъюгации также оказыват влияние природа N-концевой аминокислоты пептида.

3. Установлено, что коньюгаты пептидов 143-148 и 149-159 белка VPI вируса яшура Aj^c сополимером N-винилпирролидона и акриловой кислоты является эффективными иммуногенами в плане стимуляции длительного антипептидного гуморального иммунного 'ответа, продолжительность которого составляет, по крайней мере. 140 суток после повторной иммунизатции.

4. Коньюгаты пептидов белка VPI вируса яшура Ад140-145-М, 150-155-КА и 150-155 BSA способны при иммунизации ими вызывать

образование с высоким титром антипептидных вируснейтрализующих антител и обеспечивать 25-50% -ную защиту морских свинок от ' заражения гомологичным типом вируса яшура.

5. Показано .наличие перекрестной защиты между вирусом ящура, типов Ад и A¿¿ при иммунизации конъюгатами пептидов 134-145 и 150-159 белка VPI вируса ящура A1Z. с NA при заражении вирусом ящура типа А^..

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ш.Х. Халиков, С.В.Алиева, С.Г.Ашуров, Синтез новых аналогов фрагментов ■ VPI вируса яшура типа Аад.. Синтез фрагментов 134-139,' 134-145, 140-145, 150-155, 150-159. //Биоорганическая химия, 1994. -Т.20.-N £4.-С. 393-405

2. Ш.Х.Халиков, С.В.Алиева, С.Г\Ашуров, Вируснейтрализующие синтетические пептиды.//Тез. докл. ТГУ,Душанбе г 1993.-С.41

3. Ш.Х.Халиков, С.В.Алиева. С.Г.Ашуров. Вируснейтрализующие свойства синтетических пептидных Фрагментбв белка VPI вируса ящура типа //Первая научная конференция биохимического общества Республики Таджикистан Проблемы биохимии, Душанбе, 1993, С. 96. ■ •

4. Халиков Ш.Х, Ашуров С.Г, Алиева C.B. Синтез новых аналогов фрагмента 143-148 белка VPI вируса ящура типа ktí //Тезисы ' апрельской научно-теоритической конференции ТГУ, Душанбе, 1994. -С. 72

5. С. Г. Ашуров, С.В.Алиева. Ш.Х. Халиков. • Антигенные и имму-ногенные свойства пептидных конъюгатов. Материалы научной конференции //Теоретические и прикладные проблемы химии:

ДГПУ (Тезисы докладов). Душанбе.-С.53.

6. С.Г. Ашуров. C.B. Алиева. Ш.Х. Халиков. Ант}1вирусная активность синтетических олигепептидов..// Материалы научной конференции теоретические и прикладные проблемы химии:. ДГПУ.

(Тезисы докладов), Душанбе. 1995 -С.55. .

7.. С. Г. Ашуров. С.В.Алиева. Ш.Х. Халиков. Синтез и иммуноло- : гические свойства пептидов вируса ящура //ДАН Республики Таджикистан. . 19Э6. т. 38. N 5-6.

8.с.Г. Ашуров..Ш.X.Халиков. .C.B. Алиева..А.Н.Шахматов. Протек-тивная активность синтетических пептидов. //Материалы научной конференции посвященной 50-лети» института химии им. В. И. Никитина-АН Рэспублнкл Таджикистан. ;Тезпои докладов).Душанбе

1D96. .С-13.