Синтез и исследование пептидных фрагментов белков вируса гепатита В и их конъюгатов с различными носителями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ОСЬИАК Андрей Валерьевич

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕГПВДШХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕНАТИТА В И ИХ КОНЬЕГАТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург - 1992

Работа'выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научные руководители - доктор химических наук, профессор И.Л.Куранова,

Официальные оппоненты - доктор химических наук Ш.Власов кандидат химических наук Х.Д.Беспалова

Ведущая организация - Институт органического синтеза АН Латвии (г.Рига)

Залита состоится " 3 " анАлМ 1992 г. в 1*Г часов на заседании специализированного совета Д 063.57.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199004, Санкт-Летербург, Средний пр., д.41.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им.А.Ы.Горького Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург, Университетская наб.,д.7/9.

Автореферат разослан " ДУ" ^¡^ЛЫ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, ^ •

кандидат химических наук "В.П.Арцыбашева

га» »

..'СПЯТ

Актуальность темы: Вирусний гепатит В представляет од -ну из наиболее острых проблем здравоохранения. В настоящее время решение задач иммунодиагностики и иммунопрофилактики гепатита В сопряжено с трудностями репликации поверхностного антигена вируса ( НЕ^з ) в различных системах, развитием побочных реакций организма на введение белков, полученных генно-инженерным способом, а также существованием нескольких субтипов вируса, наличием разных форм и стадий заболевания. Учитывая, что основным источником вирусных белков пока, остается кровь доноров-хронических носителей, становится очевидным, что одннм из перспективных подходов к разработке систем диагностики и вакцинации против гепатита В является химический синтез антигенных детерминант белков вируса.

Известно, что использование синтетических пептидных фрагментов вирусных белков позволяет вести серологическую диагностику инфекций без ложноположительных результатов и фактически использовать такие тест-системы как верификационные, а также проводить дифференциальную диагностику различных форм и стадий заболевания. Синтетические антигены, в отличие от рекомбинантных, безопасны в производстве и хранении, их получение более дешево и технологично.

Так как пептидные фрагменты вируснкх белков являются, как правило, лишь слабими иммуногенями, проблемой является вьбор носителя, поскольку именно им в значительной степени определяется иммуногенность конъюгата. Поэтому создание норых высокомолекулярных, слабоиммуногенных носи!«лей, усиливающих иммунный ответ организма на введение антигена , ягляется важнейшей задачей при конструировании вакцинирующих препаратов.

Настоящая работа выполнена в рамках программы ГКНТ СССР 0.74.05 ¥ 01660Ш263 - "Синтез биологически активных соединений пептидной природы".

Целью габсти является разработка рациональных схем синтеза и синтез потенциальных антигенных детерминант белков вируса гепатита В (НЬ\' ) и их коныогатов с различными при-родш-уи и синтетическими носителями для решения проблем им-

мунодиагностики и иммунопрофилактики вирусного гепатита В.

Научная новизна. Проведен компьютерный анализ антигенной структуры поверхностного и корового белков по про-, гракмам выявления В- и Т-клеточных эпитопов. Разработаны схемы синтеза потенциальных антигенных детерминант НВУ ,их аналогов и фрагментов. Предложены новые синтетические носители антигенных детерминант.Получены коююгаты синтезированных пептидов с природными и синтетическими носителями. Показана возможность использования синтезированных пептидов и их кокызгатов в системах диагностики НВУ • С помощью полученных соединений проведено Т-клеточное эпитопное картирование химерных структур> полученных на основе кор-анти-гена вируса гепатита В.

Практическая ценность работы. Полученные пептиды и их конъюгаты могут служить основой для создания диагностических тест-систем и вакцинирующих препаратов.

Синтезированные высокомолекулярные носители пептидной природы могут быть использованы для получения конъюгатов с различными антигенами с целью увеличения их имыуногенно-стл.

На защиту выносятся следующие положения и результате:

- синтез потенциальных антигенных детерминант поверхностного и корового белков вируса гепатита В, их аналогов и фрагментов, выявленных на основании данных компьютерно-аналитического расчета;

- синтез высокомолекулярных секвенционных полипептидов-носителей антигенных детерминант;

- исследование иммунологических свойств синтезированных пептидов и их конъюгатов с природными и синтетическими носителями.

Апробация работа. Результаты работы, докладывались на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига-Юрмала, 1990 г),на научно-практической конференции УНЦХ СП61У (С.-Петербург,1990), на семинарах кафедры химии природных соединений химического факультета СПбГУ.

- 3 -

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертация содержит 219 страниц машинописного текста, включая 12 таблиц, 10 рисунков, 13 схем.Работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного структуре НЬ\/ , созданию диагностических и вакцинирующих. препаратов НВ\' и проблемам получения новых носителей антигенных детерминант, обсуждения результатов, экспериментальной части, списка литературы, включающего 162 наименования, и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Выбор пептидам* фрагментов белкоп

Внешняя оболочка вируса гепатита В состоит из главного компонента - 5- белка и двух минорных полипептидов, представляющих собой 5-белок, удлиненный рп и ргс21 -областями. В состав внутренней оболочки входит коровий антиген (3 и возникающий из него при посттрансляционном расщеплении е -антиген ().

Выбор пептидных фрагментов - потенциальных антигенных детерминант ¡|Ь7 осуществлен на основании результатов компьютерного анализа аминокислотной последовательности поверхностного и корового белков НоУ по двум программам поиска функционально важных эпитопов вирусных белкоп

- "В^е" и "Л»ЕРТ"(НПС "Вектор",пос.Кольцове, Новосибирской обл.).которые включают расчеты относительной гкд-рофильности/гидрофюбнссти, подвижности -атомов, антиген-ности, элементов вторичной структуры ( о1 -спиралей, р -складок,р -изгибов).вариабельности и амфипатичности. По результатам расчета , а также анализа литературных данных был выбран ряд фрагменточ белков Н¿V и их аналогов (табл.1).

£— Аминокапроновую кислоту («ЛЬ ) вводили в аминокислотную последовательность в качестве спейсерной группировки (пептиды 2,3,4,11,24). В пептиде (3) цистеин в

Таблица I

Аминокислотные последовательности синтезированию: пептидов.

Вэмер Белок, Формула соединения

сое л. область

I 2 3

1 НВвАй S (140—146) HThrLysProTlirABpGlyAsnOH

2 S(140-146) HeAtaTbrbysProThrAspGlyAsnOH

3 S(140-146) HeAhzAlaAlaThrLysProThrAspGlyAsnOH

4 S(140-146) (PalmJglys-eAhxAlaAlaThrlysProTlirAspGlyAsrion

5 SC139-146) HCys(Acm)ThrLyeProThrAspGlyAenOH

б S(139-14T) ECyaThrIyoProThrAspGlyAsnCy3GlyOH

Т S(139-147) HCysThrlysProThrAspGlyAsnCysGlyNHEt

8 S(19-28) HPhePheleuIeuThrArglleLeuTlirlleOH

9 preS2(133-151) HAspProArgYalArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValOH

10 preS2(133-151) HAspProArgValArgGlyLeuTyrbeuProAlaGIyGlySerSeröerGlyThrValOH

II preS2(133-139) HeAhxAspProArgValArgGlyLeuOH

12 preSI(36-47) HAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnProOH

13 preS1(33-47) HAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpABpPheAsnProOH

Таблица I (продолжение)

I 2 3

u preSI (22-32) HLeuClyPhePheProAspHisClnleuAspProOH

15 preSI (12-21) HHe tClyThrABriLeuSerValProAsnProOH

16 preSI(12-26) HMe tGlyThrAsnbeuSerValProAsnProLeuGlyPhePheProOH

IT preSI(22-32) HMetGlyTto-AsnLeiiSerValiroAmiProI^uGXyPhel^ProABpHlsGlnLeuAflpProOH

НВсАЯ/НВеАд

18 (150-159) HArgArgArgGlyAr^erProArgATgArgGlyOH

19 (145-149) HGluThrThrValValArgArgArgGlyAr^erProArgArgArgGlyOH

20 (131-140) HAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuOa

21 (120-130) HValSerPheGlyValTrpIleArgTIirProPrDOH

22 (120-140) HValSerPheGlyValTrpIleArg^ProProAlaTyrArgProProABnAlaProIleLeuca

23 (135-146) HProAmiAlaProllel^uSerTlirLeuProGluThiOT

24 (122-126) HeAlaPheGlyYalTrpIleOH

25 (T6-89) HLeuGluAapProAlaSerArgAspLeuValValSer'PyrVaiaH

i

сл i

положениях 136 и 139 последовательности нативного белка заменен на аланин. Для закрепления конформации, близкой к природной (предполагаемый £ -изгиб), в пептиде (6) осуществлено замыкание дисульфидного цикла, кроме того получен его втиламид,(пептид 7).Для увеличения стабильности цистеин в пептиде (5)защищен .Яст -группой..При замене РЬе в положении 141 фрагмента последовательности 133-151рге52-области НВ^ субтипа (пептид 9) на1еч получали фрагмент данной последовательности субтипа Ыи (пептид 10).

2. Синтез пептидных фрагментов белков НВУ .

Синтез фрагментов НЕ^ и НЬс^з проводили классическими методами пептидной химии в растворе, сочетая фрагментную конденсации с последовательном наращиванием аминокислотной цепи. Фрагменты или отдельные остатки аминокислот присоединяли методом активированных зфиров. При этом карбоксильная группа амино-компонента зачищалась только при образовании дипептидов. Во все последущие стадии ацилирования (за небольшим исключением) ашнокомпонент вводился со свободной карбоксильной группой. Данный подход оказался особенно удобным при синтезе пептидов, имеющих в своем составе последовательности , Жр-Рле,

Дф-На .склонные к о!-»/ транспептидации в присутствии как кислот, так и сснований (пептиды 1-7,12-14,17).

Для защиты Л -аминофункции аминокислот использовали бен-зилоксикарбокильнув и трет.бутилоксикарбонильную группы.Гуа-нидиновую функция аргинина защищали протокированием или с помощью нитрогруппы, с-Аминогруппу лизина защищали ВОС-группой. Гидроксильные функции серина и треонина,в отдельных случаях, защищали с помощь» образования трет.бутилового эфира, а 0Н--функцию тирозина - бензильной группой. Защитные группы уда. лялн методом каталитического гвдрогенолиза или ацидолитичес-хим расщеплением. £-Карбоксильную грушу аспарагиновой кислоты защищали бензильной или трет.бутильной группами, а сульф-гидрильнув функцию цистеина - ацетамидсметильной и пирроли-докнлметильной группами.

Полученные вещества очищали с помощью адсорбционной хроматографе! на силикагеле,ионообменной хроматографии на ДЕАБ-

- 7 -

и ЗР-сефадексах, гель-хроматографии на сефадексв б -25,а также, в случае необходимости,с помощыз препаративной ВЭКХ.

Синтезированные пептиды имели корректный аминокислотный состав, были гомогенны при контроле методам» ТСХ, электрофореза и ВЭЖХ. Полученные соединения охарактеризованы в»личиной удельного вращения И^ , а промежуточные защищенные пептиды -- и температурой плавления. Среднее содержание вещества в лм-офилиэате составляло 95-97?.

2.1. Синтез пептидных фрагментов 5 -белка

Пептид (I) послвдоватегьности 140-146 5-белка получали конденсацией фрагментов по схеме 3*(2+2). По аналогичной схеме был синтезирован ряд его «налогов (пептида 2-5).

Схема синтеза дгкапептидов (б)и(7) составлена таким образом, чтобы, с одной стороны,снизить опасность рацемизации при конденсации фрагментов,с другой стороны,свести к минимуму число ацидолитических обработок, необходимых для деблокирования Вос-защицеиных пептидов,содержащих последовательность Поэтому декапептиды (6) и (7) получади по схеме (4+3)+3 (схема I).

'»Сч

Т|Г

Рго "IV Л« С?

г

н

г

«

Мт

г«х

г-4он

Аа

1ЛМ

3».

7ч X,

8«

Ьх.

бес

е«

6с;

сн м

1?«!. »-¡«¡ым

ОН г}«^ Н СИ I

за«'

ОЬи1

■СЫ СИ

•ОН «*•

ов»'

Мм*

Ми1

Оби

08 и

СН V-

•сн н-1.Г

н

л,

щ,И

Щ

1Л

кп

к*

"ТЯГ

•Он|«жО

СН(НЧ1) •СН(»«1)

■0Н(«И1

•0Н(|Ш) ■0м(*н.'0

Схема I.Синтез фрагментов последовательности 139-147 5-белка (пгптиды 6,7)

3

- а -

Реакцию образования дисульфидиого цикла проводили действием раствора иода в метаноле в условиях,обеспечивающих максимальный выход целевого продукта (большое разбавление, низкая температура реакционной смеси). Продукт циклизации очищали с помощью гель-хроматографии и препаративной ВЭЖХ. В результате был получен пептид,гомогенный по данным ТСХ и ВЭЖХ (рисЛ).

Рис Л. Аналитическая ВЭЖХ пептида(б) на колонкеикпм;р-16(5мкм,4х250мн) в системе 23%о^ип 17?, 0.05%водной

СГ/1ГН.

19 "л" ^

Данные ИК-спектроскопии показали отсутствие циклического аминосукцинильного производного после конечной стадии ацидоли-гической обработки декалептида (отсутствие полосы поглощения при 1780 см"1).

Декалептид (8) последовательности 19-28 2-белка получали по схеме (6+4). Конденсацию фрагментов проводили с помощью "комплекса Г",при этом активируемым остатком являлся остаток аргинина.На стадиях выделения и -защищенных пептидов со свободным С-концевым аргинином был использован метод колоночной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ-метанол.

2.2. Синтез пептидных фрагментов /«¿^-области КВ^.

Фрагменты последовательности 133-151 р"£2-области(пепти-ды 8,10) .субтипы аци и о:!« соответственно .получали по схеме 6+-(7+б) (схема 2).

Первоначально,для получения нонадекапептида (9) использовали N-концевой гексапептид.в котором гуанилиновую группу остатков аргинина защищали протонированием.Однако конденсация фрагментов (&+13) в различных условиях приводила к продукту реакции .содержащему трудноотделимые примеси.В дальнейшем гуанилиновую функцию остатков аргинина защищали нитрогруппой.Продукт конденсации фрагментов с помощью "комплекса Г"после перекристаллизации и деблокирования очищали4 методом ионообменной хроматографии на БР-сефадексе С-25 в градиенте пиридин-ацетатного буфера. Данные БЭХХ подтвердили индивидуальность выделенного . пептида (9).рис.2.

WJkp Pro V=i .»г, G?, Lit' Тцг Pp Pro Ло Ser Ser Ser TV Vofm

H-OH

Bot

ûfirf 1- OPj, »4M

Cêif

cerf

lO&rf

•он h l.f

fia ■

К

M,

NOt

s«- к-»ач

ta «« «■

Hi. ITFA

Ci

«J

«И,

си г

OH H l.f

z-

zw

«p H" M •

GH Z-fi^ H си г

in.

Z-fOfyH г+йч н-гоо г

Ж

w

su

SirfiSO

C-25

•OW H l.f

SÛT iHi.W/C

C-25

он h

l F'

z-

Z40fy, M-

4H Z jOfy. H CM Z

71).

z-pOi^ н|с« г z-

OH H l.f"

m.

к.«*

Oh OH OH

■OH ,

■ОН Ф

I

CH

Схема 2. Синтез фрагмента последовательности I33-I5I p^Sj -области H65.(3 (пептида 9,10).

Рис.2.Аналитическая ВЭЯХ пептида(9) на колонке Uhreiwi RP -18(5мкм, 4x250 ми) в системе: А-0.1% водная с мот ,В-ацетонитрил, градиент 25--Zl% В за 2 мин. .скорость элщии I мл/мин.

По аналогичной схеме были синтезированы пептид (10) и укороченный фрагмент последовательности 133-139 рге£2-области

2.3,Синтез пептидных фрагментов -области ЛБ^Лд.

Фрагмент последовательности 36-47 -области НВ^Лд (пептид 12) получали конденсацией фрагментов (1-6) и(7-12) с помощью "комплекса Г" (схема 3).

Ъ* -J-I Вое

7-fO%>H 7-

Sft Jls п Ал ft-o М)> Тгр Jlsp

, N

Бос

7+ОИ

7

~те;

|ти

0.1 0И ОН

■он гон г

--он н 1Г-

п%

г-

■ОЦ» »■

гг-

z|(% и-

fV

в*

Ьх

г4«ин

Л«(

н-

»1 i

Tlx

I «„»1С

in.

Jlsn P

иг I то

■Oil OH •CM OH ■OH ■OH

Схема 3.Синтез фрагмента последовательности 36-47 pre-области HBsJlg (пептид 12).

Для косвенного доказательства структуры полученного пептида (12) был синтезирован ряд модельных пептидов с неприродным (.р ) сочленением остатков Ж.р -[¡к . С увеличением времени реагирования компонентов реакционной смеси (до 24 ч) при получении целевых пептидов появлялся,по данным ТСХ,дополнительный продукт,который отвечал соответствующим модельным соединениям с аспарагиновой кислотой,включенной в последовательность через р -карбоксильную группу.Сокращение времени реагирования за счет использования высокореакционноспособных пентафторфениловых эсеров позволило получить пептиды, не содержащие, по данным ТСХ, продуктов транспептидации .Пептид (12) очищали методом

ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе.

Конденсацией пептида (12) с защищенным пептидом с последующими деблокированием и хроматографической очисткой был получен пептид (13).

Пептид(14) получали по схеме (2+3)+б, при этом фрагменты получали последовательным наращиванием цепи методом активированных э$иров. Данные ферментативного гидролиза с помощью лей-цинаминспептидазы подтвердили оптическую чистоту пептида (14).

Декапептид (15) был синтезирован конденсацией фрагментов по схеме (2+8) с помощью "комплексаГ".

Пептиды (17) и (16) получали конденсацией Вос-защищенно-го пептида (15) с пептидом (14) или его //-концевым пенталеп-тидом соответственно, деблокированием и очисткой выделенных продуктов.

2.4 .Синтез пептидных фрагментов НОД/НМ].

Выбор схемы 5+[4+(3+4)] синтеза фрагмента 145-159 НВЛд (пептид 19) обусловлен тем, что фрагмент последовательности дважды повторяется в последовательности гексадекао пептида. Гуанидиновую функцию аргинина защищали нитрогруппой. При получении пептида (19) применяли избыток 30%) ацилъного компонента. Конечный продукт очищали методом гель-хроматогр&> фии на сефадексе й-25.

Синтез фрагмента последовательности 120-140 НВс>д (пептид 22) осуществляли по схеме (11+10). С-концевой декапептид (20) получали блочной конденсацией фрагментов (1-5) и (&-10),

V - 12 -

при этом С-концевую карбоксильную группу защищали образованием трет.бутилового эфира.

Ундекапептид (21) получали конденсацией фрагментов по схеме (4+7). Гидроксильные группы серина и треонина защищали образованием О-третбутиловых эфиров.

Конденсацией Вос-защищенного ундекапептида (21) и трет, бутилового эфира декалептида (20) с помощью "комплекса Г" был получен пептид, который после деблокирования и очистки методом ионообменной хроматографии был выделен в индивидуальном состоянии (пептид 22).

Синтез пептида (23) проводили по схеме 1+(£н-б), при этом ОН-функцип треонина защищали образованием трет.бутилового эфира. Полученный пептид очищали методом адсорбционной хроматографии на силикагеле.

Пептид (25) последовательности 76-89 НМд получали по схеме'(4+3)+7. Карбоксильную группу С-концсвого валина защищали образованием трет.бутилового эфира. Продукт конденсации фрагментов деблокировали и очищали с помощью ионообменной и адсорбционной хроматографии.

3.Синтез полимернъпс носителей.

Поскольку тетрапептид тафтсин ТЬгЬ^ГгсЛг^ стимулирует все известные функции макрофагов, было высказано предположение о том, что и его полимер -ро^^гЦьГгр^г^,являясь носителем антигенных детерминант, вероятно, будет усиливать иммунный ответ организма на введение антигена посредством активации макрофагов. .

В литературе известен синтез полимерного носителя антигенных детерминант - политафтсика, обладающего свойством им-муноадьюванта наряду со слабой иммуногенкостью. Нами были модифицированы схемы синтеза политафтсина и получен полимер с большей молекулярной массой.

Синтез политафтсина рс^(тьгЦ5РгсЛ^)(1)проводили по схеме 5. Поликонденсацию осуществляли двумя методами: методом активированных эфиров и азидным методом. После деблокирования, диализа и лиофилизации в обоих случаях получали продукты с молекулярной массой 10-11 кД.

Для снижения риска рацемизации на стадии поликонденсации была разработана схема синтеза аналога тафтсина, в котором остаток аргинина перенесен на ]! -конец последовательности (схема 6). Исходный тетрапептид Х^ТКЯ^в^йо'Нполучали последовательным наращиванием цепи. Поликонденсации осуществляли методом активированных (05и;С^(.') эфиров. Продукт/^У^ТМ-уЙ^ II) фракционировали на колонке с сефадексом & -50. Молекулярная масса основной фракции в случае N -гидроксисукцинишдного эфира составляла 11-13 кД, а при использовании пентафторфенилового эфира-13-15кД. Таким образом, по схеме б получали политафтсин с большей молекулярюй массой и лучшим выходом, чем по схекеб.

ро^тмЦЦвоОРгоЛу] ^[Тк^'б^/Н'»^

2НЦН

о^ и

1"*! Рп

с^р н

1л

'а/р

Р*х

Ас

8«

в«-

6«

он

(Км^р)

Ч Зиа^

ро(у[Л^(НС/ДЬг1.^(ни)Рго]

Схема 5.Синтез политафтсина Схема б.Синтез политафтсина (ТЬгЦгРгоЛг;'. ро{у (Лг^ТЬ- 1рРго[.

По схемам, аналогичным схеме б, был получен ряд полимерных носителей, где в качестве мономеров использовали известные имыуноактивнке пептида - аналоги тафтсина. В результате были синтезированы следующие полипептиды: полиригин - ро?ч1)го&ЬМлРго) (ф),/»^Уг}«(1(Ц1Рго) (|у), |»^(Лг51еиЦ$Рг»)(у).

Воздействие секвенционных полипэптидов на фагоцитозный

г

процесс изучалось на примере стимулирования дыхательного взрыва в фагоцитах в сравнении с известным иммуностимулятором --тафтсином в опытах in vitro , Работа проводилась в Институте экспериментальной медицины АШ СССР. Было показано ,что изменение мономерного звена тафтсина не влияет на фагоцитстимули-руххцую активность полимеров (Ги II), активность которых была соизмерима с активностью самого тафтсина и полиригина, а активность полипептидов (1У и У) примерно в два раза выше активности тафтсина.

Таким образом, нами предложены схемы синтеза аргининсо-держащих секвенционных полипептидов и синтезирован ряд потенциальных носителей антигенных детерминант.

4.Получение конъюгатов.

Для увеличения иммуногенности синтезированных пептидных фрагментов белков HbV их коньюгировали с различными природными (HLH.BSA )и синтетическими носителями. При получении конъю-гатов использовали два способа связи молекулы галтена с носителем: с помощью глутарового альдегида и метод, основанный на активации карбоксильных групп предварительно сукцинилированно-го носителя. Степень конъюгации составляла 9-12 молекул пептида на один моль носителя.

б.Исследование иммунологической активности синтезированных пептидов и их конъюгатов.

Для оценки способности синтезированных соединений выявлять антитела в оыворотках больных гепатитом В пептиды и их конызгаты исследовались методом твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИМ); в качестве позитивного контроля использовались сыворотки крови больных гепатитом В различных форм и стадий заболевания. Работа проводилась в лаборатории вирусных гепатитов НИИЭМ им.Л.Пастера.чБыли опробованы различные схемы анализа в которых использовали разные способы иммобилизации пептидов, варьировали температурный и временной режим проведения И5А, концентрацию пептидов, а также титры исследуемых сывороток. Наиболее перспективными оказались пептида (6) и (7) из S -белка, (II) из р«¿¡¡-области, а также (14) и( 17) из f^-v

-области HbsSg и их коньюгаты. Однако лучше результаты получены в случае пептидов (б) и(14), которые позволяли достоверно выявлять антитела в 77 и 85Ç5 случаев соответственно. Пептид (7) обладал лучшей сорбционной способностью на полистирольных планшетах, однако он проявлял более высокий уровень ложнопо-ложительных реакций. При использовании сочетания пептидов (б) и (14) в И5А наблюдалось увеличение количества выявляемых сывороток, но чувствительность анализа падала. Кроме того, было показано, что использование конъвгатов с политафтсином позволяет избежать значительного уровня ложноположителькых результатов по сравнению с конъюгатами с KLH и BSA .

Конъюгаты получе!ших пептидов использовались для иммунизации лабораторных животных. Показано, что даже после первичной иммунизации наблюдается превышение уровня антител в сыворотках иммунизированных мышей по сравнению с контрольной группой в 4-8 раз. Особенно иммуногенны коньюгаты пептидов (II) и (17). Также было показано, что уровень антител в случае конь-югатов с политафтсином выше, чем в случае конъюгагов с KLH , в 4 раза.

Одним из наиболее перспективных подходов при разработке вакцинирующих препаратов является создание химерных структур на основе вирусных белков. Такие структуры, полученные генно-инженерным путем, состоят из слабоиммуногенного вирусного белка с внедренными в него высокоиммуногенными участками из других вирусных белков. Такие химерные структуры на основе корового антигена вируса гепатита В с включенными фрагментами S-.prigj.prtSj -областей H6Ja были созданы в Институте органического синтеза АН Латвии. Для оптимизации структуры таких химерных иммуногенов проведено их Т-эпитопное картирование с помощью синтезированных нами пептидов и иг конъюгатов и локализованы Т-клеточнь з эпитопы в пределах всех трех областей поверхностного белка и коровом белке HBV.

вывода

1. На основании анализа данных компьютерно-аналитического расчета поверхностного и корового белков вируса гепатита В выявлен ряд пептидных фрагментов, являющихся потенциальными антигенными детерминантами.

2. Классическими методами пептидной химии в растворе синтезированы 25 пептидных фрагментов белков вируса гепатита В и их аналогов, из которых 17 синтезированы впервые.

3. Разработаны оригинальные схемы синтеза 5 секвенцион-ных аргининсодержащих полипептидов-потенциальных носителей антигенных детерминант.

4.. Выявлены методом твердофазного иммуноферментного анализа соединения, обладающие способностью специфически связвать-ся с антителами к вирусу гепатита В, которые могут найти применение для диагностики гепатита В.

С помощью синтезированных пептидов и их конъюгатов проведено Т-клеточное эпитопное картирование химерных структур, полученных на основе кор-антигена вируса гепатита В.

Основное содержание диссертации отражено в работах:

1. Осьмак A.B., ^ркина С.И., Филонова Е.Б., Людмирова

В.Л., Куранова И.Л. Синтез антигенных детерминант поверхностного белка вируса гепатита В. //Всесоюз. симпоз. по химии пептидов: Тез. докл.-Рига-Юриала, 1990, С.42.

2. Осьмак A.B., Чуркина С.И., Людмирова В.Л., Филонова Е.Б., Куранова И.Л.Синтез и иммунохимические свойства фрагментов pnS{ -области поверхностного белка вируса гепатита В. //Вестн.Ленингр.ун-та, Сер.4,1991,Выл.4(№25),С.95-98.

3. Осьмак A.B., Чуркина С.И.,Куранова И.Л. Синтез антиген-полимерных конъюгатов.//КОХ,1991,Т.61,Вып.12,С.2784.