Синтез пептидов-фрагментов белков вирусов гепатитов В и дельта и исследование их иммунохимических свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Прокуронова, Елена Игоревна
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1990
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
Московский Ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова
Специализированный со^ет Д 063. 41.01
На правах рукописи
ПРОКУРОГОВА Елена Игорегна
СШ1ТЕЗ шшцдаз - срмчя2ггоз б&йюв шансов гепатитов в ii дельта И псаигдспашяг их нйоткмапгоеши свойств
02.00.10. Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
!А"'СК°.-ч 1990 -- /'
' :/' /
О
Работа выполнена в Московском институте тонкой химической технологии им. И. В. Ломоносова и институте кирусгиогии им. Д. И. Ивановского АМН СССг.
Научный руководитель:
член-корр. АН СССР, доктор хим. наук, профессор ЕВСТИГНЕЕВА Р. IX
Официальные оппоненты:
доктор хим. наук ШИБНЕВ Б. А. кандидат хим. наук КРЫСЙН Е. 11
Ведущая организация:
Есесоюзный научно-исследовательский институт лекарственных растений
' Защита состоится "24" АС&с&^/Ь* 1990 г. в . /3 час.
на заседании спе-диализироваиного совета Д- 063. 41.01 . при Московском институте тонкой химической технологии им. Я а Ломоносова (Москва,117571, пр-т Вернадского, 86).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШГГХГ им. М. В. Ломоносова . , . • •. .
Автореферат разослан
Ученый.Секретарь специализированного совета, кандидат химических наук,
старыий научный сотрудник ■ - п С Лютик А. И.
о
Сх5щаа характеристика работы °
Актуальность проблема. Исследования, связанные с потоком антигенных дете( /инант вирусных белков, имеют большое значение д.т.' решения проблем диагностики и вакцинспрофилактики вирусных заболеваний. Серьезную*опасность для всемирного здравоохранения представляют вирусные гепатиты, среди которых особое место занимает гепатит В. В настоящее время в мире насчитывается около S00 млн. носителей поверхностного антигена вируса гепатита В (HB^Ag). Кромо тоге, в формировании тяжелых, часто летальных форм острого и хронического гепатитов участвует недавно открытый тМекиюпниЯ агент вирус гепатита дельта.
Одним ил методов борьбы с вирусными инфекциями является гаг.. цинация. В настоя нее время для вакцинопрофилактики» гепатита Б практическое применение нашли плазменная субъединичная и рекомби-нантная дрожжевая вакцины, ' имеющие ряд недостатков. Интенсивность и&учения возможностей создания искусственных вакцин на основе синтетических пептидов обусловлена их пре.имущестдами, которые Исключаются в химической гомогенности, неинфекцконяоети, вогмокностп производства в больших масштабах, строгой направленности именного ответа и отсутствии побочных зф!>ектов. В связи с этим представляется перспега'йеной локализация иммуиодошнантнь» элитопов Солков вирусов гепатитов В (HBV) и дельта _(HDV) с помощью синтетических пептидов.
Настоящая работа является частью тематики, разрабатываемой в соответствии с Поста! овлением ЦК КПСС N807- от 23.08.85 и Постановлением ГК1ГГ СССР II АН СССР от 03.02. 87 N26/13 ПО программе 0.74. Qf3. , а также согласно координационным планам АН СССР по направлений^ "Тонкий .органический синтез", . ""Биоорганичесгсая химия" и комплексной научно-исследовательской программе Минвуза РСФСР "Механизмы интеграции апологических систем" по направлении 4.
Целы} работы явилось выявление участков полипептмдных цепей, которые могут находиться на поверхности белков'(pro.Sl-область бзл-;са оболочки HBV и нуклеокапсидного белгеа HDV) и участвовать с организации иммунэдошшантннх эиитопов, с помочью теоретических методов компьютерного анализ:-! аминокислотных последовательностей соответствующих белков, ,синтоза предсказанных участков и их n.-.ivy-
А
(
яологического тестирования.
Научная новизна работы.
-'На основе компьютерного теоретического анализа структуры рге21-области белки оболочки вир/са гепатита В бил выделен участок, ооответствуюэдк аминокислотной последовательности 24-41 (суОтип ауи), который участвует .в организации антигенной детерминанты рге5.-области, что било подтверждено взаимодействием соответствующего синтетического пептида с сыворотками крови больных гепатитом а Дополнительный расчет вторичной структуры выбранного фрагмента 24-41 позволил локализовать в его составе гептапелтид, соответствуют^ аминокислотной последовательности 30-36, проявляющий свойства иммунодоминантного эпитопа;
-' С помощью компьютерных расчетов структуры дельта антигена (НБАе) 'по различным программам было сделано предположение о расположении имму.чодоминантного эпитопа в составе области, соответствующей аминокислотной последовательности 1 Ь?.~\70. и синтезирован ряд пептидов из этого и других перспективных участков дельта-антигена. Действительно, .наиболее воспроизводимые резулЛаты в реакциях с сыворотками больных гепатитом дельта показал пептид 169-179.
Практическая це»вгость работы.
Использованные в данной работе подходы к исследованию структурной организации^ белков вирусов .гепатитов В и дельта могут быть применены для изучения вероятной структуры белков других вирусов и предсказания локализации их антигенных детерминант. Полученные данные о наличии взаимодействия сывороток Сольных и мзноклоналышх антител с синтетическими пептидами могут быть использованы и дальнейшем для разработки доступных средств диагностики гепатитов В и дельта на основе химически синтезированных пептидов.
Половшей, Еьашсилгэ 1ачзкуггу:
1. Исследование структуры рге51-области белка оболочки Нб7(субтипа ау\») и дельта-антигена с помощью теоретических^ методов компьютерного анализа, на основании гаэторого предсказано расположение вероятных иммунологически активных участков этих .белков.
2. Синтез пептидов 24-41, 30-36 , 31-36, Ы-ЗО рг;е31-области белка оболочки ИВУ и пептидов 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82- 94, 106-123, 115-123, 153-167, 169-179; 167-172 ЮАе.
* 3. В результате иммунологических исследований, проведении?, с сыворотками больных гепатитом В и дельту и иммунизированных живот-
них, выявлен один из иммунодоминантных зпитопов preSl-области HBV на участке 30-36 и антигенноактивная с-Одасть HDA? в районе 169-179.
Пубгогкацкн. По результатам проделанной работы опубликогани 2 статьи и тезисы 8 докладов.
Апробации.
Результат раояты дололг-нм на IX Советско-Индийском симпозиуме "по химии природных соединений в г. Риге, май 1089 г.;на V Московской конфедешши но оргашгческсй химии и технологии, июнь 1989 г., на Всесоюзной научной конференции "Оценка фзрмакологичзской активности химических соединений: принципы ч подходи" , г. Москва, ноябрь 1989 г.; на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов , г.Рига, апрель 19SO г.; на мколе-семинаре "Молекулярная биология и медицина", г. Ленинград, май 1990 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Химия белков", г.Тбилиси, май 1990 г.; на Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты: фундаментальные проблемы, эпидемиология, профилактика, лечение", г. Ростов, сентябрь 1990 г.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 150 страницах и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список использованной литературы, включающий 125 ссылок.
I. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИШЮЖШНАНГНТ0 ЭПИТОПА preSI-ОБЛАСТИ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В (субтип ayw)
1.1. Анализ структурной организации preS-области белка оболочки ИВУ.
Компьютерный анализ preS-области белка оболочки HBV проведен с помощью программ по гидрофильности Хоппа и Вудса, а тага® Кайта и Дулитла, В-антигенности Веллинга и подвижности Карллуса и Щульца (рис. 1).
Основная информация о вероятной вторичной структуре получена из расчета по программе Птицына- и Финкелыптейна. По результатам . расчетов и с использованием литературных данных был выбран фрагмент, соответствующий аминокислотной последовательности 'preSl-области 24-41 FFPDHQLDPAFRANTANP.
Гпсчит был произведен |;ак для всей preS- области, так и отдельно дли пептида 24-41. Показана высокая гкдрйфильность яектида и наличие трех симметрично .расположены* изгибов пептидной цепи, предсказанных с достаточно высокой вероятностью (табл.1).
б) Б- антигеннос^ц, в) подвютости ргеЗ-области белка оболочки НВ'/.
Таблица 1.
Расчет вторичной структуры пептида 24-41 ргеЗ-области белка оболочки вируса гепатита В (по Финкельштейну А. а)
р-стп* {¿еюлг
¿леллп.
» г( ** 17 23 « М ~ЛЯ И|ГЛ Я* ШГ и 3°
/а« а. гтлфмл 'хп^идфрп/хо/ия'здо&птьгясаклв
и гг л гзмго п
шгге
пилю
/г <2 «г /г (г п ю
Пептид 'лак в составе белка, так и в свободном 'состоянии в_ растворе содержит участки с Л-спиралью складчатой структурой, причем "в растворе их расчетная вероятность уменьшается.
гз го в
го га го
ft
Выбранный пептид не обладает повышенной подвигаостьи и имеет сравнительно упорядоченную пространственную структуру. Наиболее интересным ее элементом представляется d-спираль с накладывающимся на нее ^-поворотом - участок 30-36 LDPAFRA - что,по литературным данным, является признаком потенциальной антигенной детерминанты. Наличие на N- и С-концах этого участка аминокислот, имеющих противоположно заряженные ионогенные боковые функции (Asp 31 и Art: 35) молет способствовать стабилизации^-изгиба. Дополнительный расчет вторичной структуры пептида 30-35, вычлененного из состава фрагмента "4-41, подтвердил наличие устойчивого^-поворотз в центре этого Фрагмента. При этом показано, что остаток Leu 30 не участвует з организации/-поворота. Кроме того, для синтеза был выбран такте фрагмент 24-30, который показался интересным тем, что он соответствует. максимальному значению В-антигенности, предсказанной программой Веллинга, а таюга содержит последовательность Asp-His, склонную к транспептидации и входящую в состав активных центров многих Ферментов.
1.2. Сгжлл !тзirnc^ia фрагментов preSl-области 6a.'2ta обо- . етмгет шсруса гст-пзта В
Все пептиды были синтезированы.твердофазным методом на хлор-метилированном носителе - тефлоне с рздиацизнно привитым полистиролом (16%). Е синтезе фрагмента, соответствующего аминокислотной последовательное:;.! 24-41, о-концевая аминокислота присоединялась к носителю с использованием соответствующей цезиевой соли. Пептидную цепь наращивали ступенчато с С-гсснца с применением активированных с°]иров М -трет. бутилсксикарбонил-Ь-аыянокислот (схема 1). Деблоки-:-ова;ше й-КНг-групп осуществляли 50£ раствором трифторуксусной кис-
(TFA) в хлористом метилене и 4 и раствором хлористого водорода в диокеане.
Известно, что введение остатка аргинина в пептидилполимер может проходить с низким выходом, сопровождаться модификацией гуа-нидинового звена и рацемизацией аминокислоты. Обычно при"-~:е:,(ые для защиты боковой фунгадии Arg гозильнач и нитрогруппа отцепляются в достаточно жестких условиях и не всегда успешно, поэтому Г';:' разработан метод введения остатка Are о высоким выходом и без побочных реакций с помощью BocArg- HCl- H20.
Для предотвращения реакции транспептидации, возможной при кислотном отщеплении пептида от полимера в последовательности Asp-
о
а
о
а
с отери^тивованной -СООН-груг.юй Asp, эта боковая функция временно блокировалась трет, бутильной защитой, которая отщеплялась в иледувдсм цикле деблокирования пептидилполимера 100% TFA. Пептид отцепляли от носителя действием бромистого водорода в' TFA и с-тюлли гель-фильтрацией на носителе Гоуо-Pearl НУ-40 в водной ук-еуской кислоте. Пе: "ид был получен с выходом 12,6% ( в расчете на исходное содержание пролина на полимере).
Схема 1.
Схема твердофазного синтеза пептида preSli24-41)
fie Лу
fi. Л,, А /и Пг Л а X, ^
I I I МО* &
„ -г® '-----1......@
tyfr---—;—
е «
(¿)- тефлон' с радиациопно привитым полистиролом, Бос - трет, бутилоксикарбонил, ОРГр - певтафторфенил, _ ..
0!1р - п-нитрофенил, Ей] - бензил, Ви*- трет, бутил.
Пептид, соответствующий аминокислотное .«свяыюсти 30- _
о
30, был синтезирован в основном теми же методами пептидной химии (схема Я). е Стартовая аминокислота присоединялась к хлорметилиро-ванному носителю в присутствии иодистого натрия и трнзтиламина при освещении. Деблокирования аминогрупп проводили 50% раствором ТГА в хлористом метилене. ' •
1.Х0МП
Схема твердофазного синтеза пептида preSHOCKifi)
Leu J)sp Pro JJla РЛс
Рос
OPfp Sx M
doc
м .
OPfp la-
»,/ M
toe
OPfp ioc r M
toe
OPfp Hoc ' (M
TfnSH/TF/!
&„
-ONo foe юг""
JrS Jtla
■ilfL „ OH Bet en)
MCI
на
■■t'iL net
c2> 0J>
<29 + ©
он
После отщепления от носителя действием трифторметги'судьфоио-вой , кислоты (ТГМЗА) в трифторуксусной кислоте пептид был очищен гель-хроматографией на сефадекее в-10 в 10% уксусной кислоте. Вы-.ход пептида составил 28%.
/Ьго
о,з ■ од он
10 ~20 ^о "время (мин)
Рис. 2. Профиль элюции пептида preSl( 30-36} (ВЭЖХ'на колонке 3,2 х 250 мм с носителем J4-Bondapack CIS, 10 мкм. Элюция в градиенте ацетонитри.ца со скоростью 1 мл/мин).
С целью повышения селективности процесса связывания пептида с белковым носителем для проведения иммунологических исследований был синтезирован пептид рге31(Ь0-36) с С-концевым остатком цистерна, заселенного по боковой функции ацетамидометильной группой (Асгп). Остит о к Суэ( Аст) был присоединен к С-концам еще двух пептидов - рге31(31-3б) и рге31(24-30). Пептид рге31(31-3б)-суг(лсгг,) был синтезирован с использованием метода симметричных ангидридов "з соответствии со схемой 3.
и -
Схема тьердо&дзвого сжеса пептида ргеГ)1( 31-36) -СуэС Лет)
Б ж
Рга ' Л1а
РЛе
.«.у
Ыс
ОН £и 1ГС №>
&х
СИ бакс М
ЛИ Вт
Ш /Ьс КС I")
кл Ья*Сн ¿а 1"1
ля/ггл
О! бог ОССМ
Схема 3.
.«VI.
О
ЙСЪ >
Яа» С23
йст ■ ф
&т
■ 09
Аст СИ
Пептид ргеБК £4-30)-Суз(Аст) синтезирован в соответствии со схемой 4.
¿4 « *Г ¿4 ¡о
РЬе РЫ Р,о Пар Яп ¿е„ £уз'
№ '¡к Ы'р В-У ¿Я** бх бос ОН Ва <а £х АЬх ОН ¿ос ш<">
г
ПГЪА/ ТГЛ
Схема 4.
Схема твердофазного синтеза пептида ФГОБК 24-30)-Суз(Асш)
Аст ГР
Я/у
' р .
/Ч-
Л*,.
Шптида 31.-36 и 24-30 после гель-хроматографии были получены ; выходами соолгетстьенно 33,6Х и 16,ОХ. Синтезированные пеитидн характеризованы а ломота результатов тонкослойной и вксокоз^и:«;-"¡пшзй гзщкеегкой хротгегрфт, аминокислотного аиашги, оя^да-удзгьпых углов оптического врасенил и М-коицевих а^шокве-
и
я
1.3. Розултази гатиолсгачсскхх исследовали/! полгиднш Орпп-оитоз рта Sl-облпкп! Салка оболочки JIBV Для проведения иммунологических исследований сиитезиро!»чш!1;>: пептидов были приготовлен» их коиьюгаты с ОелкотЯ! носителям« (бычий сывороточный альбумин, гокоцнанкн улитки), которыми иммунизированы лзбороторные нивотние.
Коньюгацию проводили с использованием глутлральдегида и водорастворимого 1-згил-3-(3:димет1и!Лминопропнл)ьгфСодт?мпда. Пептиду 30-20, 31-36, 24-30, содержащие на О-кошю остаток цистеича, конь-кгировали с бел)сами с помощью активирующих г.гйнтоп Н-сугашнимиднл 3-(2-шфИдмл-дитио)прописната (SPDP) и И-скснеукцнчнмидного зфирз З-маленнимидобензсйнсй кислоты (МЕЗ). Степень коньюгашш пептидов с белками определяли по данным количественного аминокислотного анализа; она составляла 7-17 моль пептида /моль белка.
Иммунизация кроликов и белых мышей приводила во всех случаях л индукции специфических антипептидных антител, что определялось .'.егодом твердофазного иммуноферментного анализа (рис.3).
га 1.3 1.« та то ся са Q.4 ЦП
Lai
Г- Г1
п
ГЗ здоропое
жиоотноп i'.'i иглглунизи-решамнее жипагпнаэ
ö V а
Рис. 3. Выработка специфических антител у мыией на пептид preSl(24-4l) Коиыог&ты пептидов исследовались таю» на епосооиость ьшв-чть антитеза в енторотках больных гепатитом В методом твердофаз-эго ';>г;:с>:-р!,;знткого акалива При анализе сыьороток крозя 42 ояии:г [ •• • ».том В с НЕэ-антигашмией на 3-1,4 день язжеутего яе-;:о,г,а •> г с помощью иояыегата пептида preSl(2i-4i> с сдашзд
jhoooToiг-,;- i .'Альбумином (BSA) в ^о.аыпл.чогье' образцов cwoporox (30 i -12) нолучеи поеет-ивный результат, причем в Некоторых случаях гпс'г.ие р/n (преклеииэ положительного сигнала над отр'л'ательн:-'; >пзн) еосгоихядл Солов 30, В качестве огривФгельясго контроля i*;-'ль'С"'1"!! стоорг";« крогй здеровш: л;*;:. >
При исследовании коньюгата пептида 30-36 в пеакции с сыворотками Сольных было показано, что его антигенные свойства подобны свойствам коньюгата пептида 24-41. Кроме того, пептиды 24-41, 30-35 и 31-36 и их коньюгаты дали позитивный результат в реакции с моноююнальными антителами к preSl-области, любезно предоставленными д-ром В. Г.Герлихом (ФРГ, 1'еттингенский университет). Что касается фрагмента preSl( 24-30)-Cys(Acin), то при исследовании его свойств не было получено позитивных ревультатов ни в реакции с сыворотками больных, ни в реакции с моноклональными антителами.
На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что участок preSl-области, соответствующий аминокислотной последовательности 30-36, входит в состав одного из иммунодоминантных опитопов preSl-области белю оболочки вируса гепатита В.
11. исследование' антигенной структуры нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта с использованием синтетических •пептидов
II. 1. Анализ структурной организации дельта-антигена
В настояще"; работе предпринят теоретический анализ расположения иммунодоминантных участков в составе белка нуклеокап-сида HDV и исследованы свойства серии пептидов из состава* предсказанных В-эпитопов.
Для предсказания вероятной структуры белка были применены методы., указанные в п. 1.1. (рис. 4,5).
Кроме того, с использованием описания программы по акрофиль-ности был получен профиль акрофильности для дельта-антигена.
При интерпретации результатов проведенных расчетов учитывалась специфика нуклеокапсидного белка, связанная с вовлеченностью ряда его участков во взаимодействие с РНК; превде всего это фрагменты, содержащие положительно заряженные радикалы. При выборе потенциально антигенно активных- участков мы, в основном,. руководствовались следующими критериями: они долины быть максимально гидрофильны, подвижны, экспонированы на поверхности нуклеокапсида, должны содердать^-повороты во вторичной структуре и не иметь положительно заряженных радикалов. .-
О
Рис. 4. Профили а)относительной гидрофильности по Хоппу и Вудсу, б)В-антигенности, в) подвижности дельта-антигена.
---------г } "<?»>.'."??) ""■
'*■"' У * 1 л ' ' Т
Г^-----/// : п п / ';
VI" П-- ( ;
•п.;'.''.'-."
З-ОЛ/Ч^Э-О-О '."ЛА ГГ.'-чч" 1}-".:Ч-.ПП---------ч -
Рис. Г). Расчет вероятной вторичной структуры дельта-антигена
Для синтеза были выбрали фрагменты HDAg. соответствующие аминокислотным последовательностям 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82-94,. 106-123, 115-123, 153-167, 169-179, 167-179 (рис.С). Ü G G г? Е Е I LEQ19 17LEQVVAGZ3 ' 11GGREEM. EQWVAG23 40 К I К К L Е Е D N Р <9 02DAGPRKRPLRGSF94 100 KALE II К R К Q L S S G 6 К S L S 123 115 L S С C> G К S L 3 123 153 N P L E Ü (3 S R Q A P G G G F 167 iOOPSMQOVPESPF179 157 F V P S M 0 Q V F E S P F 178
Рис. 6. Синтезированные фрагменты дельта-антигена
При выборе указанных фрагментов учитывалось, 'что N-концевая часть белка соответствует наибольшей предсказанной гидрофилыюстл и В-антигеиности по сравнению с С-концевой. Kpotie того, из литературных данных было известно, что антигенной активностью обладают фрагменты 20-80 и 15->б0, входящие в состав перекрывающихся полипептидов, полученных генноинкенерными методами. Расчет вторичной структуры показал, что область, соответствующая аминокислотной последовательности 15-60, структурирована и содергат<1-спираль с высокой степенью вероятности (рис.5). На участке 40-4901с1шралиаацил нарушается, образуя неструктурированную, иысскогндрофильную область, обладающую умеренной акрофильностью. За исключением этого фрагмента, все остальные пептиды ио N-концевой части содержат в качестве элемента вторичной структуры/-повороты, предсказанные в составе белка или отдельного фрагмента. Перекрывающиеся пептиды из аминокислотной последовательности 11-23 соответствуют области повышенной подвижности и гидрофильности. Участок 11-23 описывался в одном из последних литературных сообщений, как обладающий сильной активностью при связывании с человеческими поликлснальными ан-TK-HDV-антителами. Эта же активность описана и 0для области 10G-123, которая с точки зрения предсказанной структуры интересна тем, что содержит 2поворота./-Повороты входят и в состав гидрофильного участка 82-94, обладающего к тому же и акрофильностью.
При исследовании С-концевой части белка с помощью компьютерных прбграмм была показана существенно более низкая гидрофильность
и практически полнее отсутствие В-антигенности, однако эта область является высокоструктурированной, высокоакрофильной и она не содержит аминокислот с положительно заряженными боковыми радикалами. В отличие от N-концевой части, основным элементом вторичной структуры здесь являются повороти складчатая структура. Если в N-концевой ч~сти вероятность ¿-поворотов не превышала 6-8%, тс в с-конпевой она составляла 11-27%. Наиболее интересным здесь нам показался участок 144-180, для которого предсказанные элементу вторичной структуры -ß-повсроти- и/-складчатая структура - с небольшими изменениями сохранялись гак при расчете белка, так и при расчете отдельного фрагмента в растворе. Кроме того, в составе фрагмента 144-180 на участке 152-158 предсказываетсяоС--спираль, накладывающаяся на^-поворот, что, по литературным дан и иг:, является признаком потенциальной антигеиой детерминанты. Интересен участо: 150-166, для которого предсказан самый "сильный"_р-поворот (27% вероятности) и высокая акрофильность. Эти перспективные элементы структуры вошли в состав выбранного пептидного фрагмента 153-167. Наибольшая акрофильность наблюдалась для пептида 16Ü-179, причем этот участок практически не содержит заряженных аминокислотных радикалов. Кроме того, расчет структуры óтого пептида в составе белка показал наличие трех симметричных р-изгибов.
II. 2. Crntrea пептидных фрагментов дельта-антигена
Синтез пептидов из состава белка нуклеокапсида вируса гелати-<яа дельта проводили твердофазным методом с использованием в качестве полимерного носителя хлорметилированного тефлона с радиаци-онно привитым полистиролом (10%). Для временной запиты dr аминогрупп использовали Вос-группу. В качестве постоянной защитной группы боковых функций Asp, Qlu, Thr, Ser использовали бензильную группу, £-аминогруппу Lys защищали бензилоксикарбонильной группой (Z), гуа-нидиновую функцию Arg - протонированием или широгруппой, суль-фгидрильную функцию Cys - ацетамидоиетильной (Аст) группой. Стартовую аминокислоту присоединяли к носителю в присутствии триэтиламина и йодистого натрия при освещении. Содержанке якорной аминокислоты в полимере составляло 0,2-0,4 ммоль/г полимера. Деб-локированиеА-аминогрупп пептидилполимеров проводили - £0% раствором трифторукпусной кислоты в хлористом метилене с последующей нейтрализацией аюмокомпонента 10% раствором этилдиизосропилампна в хлористом метилене. Конденсации проводили, в основной, методом симметричных ангидридов. Ниже приведены типичные схемы сште&а.
Схема 5.
Схег/а твердофазного синтеяа пептида 169-179-Суе(Аст) ТОАг
к / р>о (V/ а,!
л_
415
■Он дог*
-Ъ
Схема 6.
Схема твердофазного синтеза пептида И-19-Суз(Асв1) НСАе
Я)" «у Л} Си Ян
к
КО
4/
III ии С!„ С!л ' Г,г
«ягМ
«"У1»
да --44'
ОН !х («»
Ш Д* Кст
Лт
Лт
■-< р->
ИЫ
-гг-,
ч2>
КЮ /и -да
-4?
• Синтезированные пептиды отщепляли от полимера действием трифторметансульфокислоты в трифгоруксусной кислоте в присутствии тиоакизола Полученные продукты очишали гель-хроматографией на се-дадоксе &10 в водной уксусной кислоте. Выходы пептидов составляли 10-30?«. Гюптиды охарактеризованы 7ОХ и ВЭЖХ, определением удельного угла оптического вращения, й-концевой аминокислоты и количественным аминокислотным анализом.
А
гго ■ OA о,л 0,2 0.1
U
1. МеОН
(00 %
20 • GO - 40 20
10 бремя (мни)
Рлс.7. Профиль элгсции пептида ll-19-Cys(Acm) HDAç (ВЭЯХ на колонке 3,2 х 250 мм с носителем Silasorb С18, 10 мкм. Элюция 0,17. TFA - 0,1% 7FA в 80% метаноле' со' скоростью 1 мл/мин). *
II. 3. Результаты »-etynaTOrcrsocjGSi гссслвдазаннй пептидных <Й>ап£энтов дэльта гигггагена.
Для проведения исследований синтезированные пептиды были ¡«шьюгированы о белковыми носителями (как описано в п. 1.3.)Полученными коньюгатами иммунизировали лабораторных животных (кроликов и мышей), в результате чего в высоком титре образовывались антипептидные антитела, с которыми эффективно реагировали пептидные коньюгаты. Коньюгаты пептидов исследовались5также в реакции твердофазного иммуноферме-нтного аиапиза с пула»,m сывороток больно гепатитом дельта. Из пептидов N-концевой части положительный результат был получен только для пептида 40-49. Негативные результат" для остальных пептидов , возможно, объясняются тем, что синтезированные нами фрагменты из участка 11-23 соответствуют амшюглс.потной последовательности HDAg, пассированного на пимпанзе. При этом дельта-антиген претерпевает некоторые изменения в первичной структуре, которые могли оказаться существенными. Пептид 82-94 не проявил антигенной активности, возможно, из-за того, что, несмотря на наличие предсказанного р-поворота и и составе белгл, и в отстав-? фрагмента, он обладает л1иь умеренными гид'ро-тильнссп 1 »- я ¡з»^'"'^-
постьь, а та1 сл.- содержит большое количество положительно заря,*ен-ных радикалов.
. Пептиды из С-концевой части белка реагировали с сыворотками крови больных гепатитом дельта, но довольно слабо. Р отличие от других пептидов, пептид 169-179 эффективно и регулярно реагировал с болылинс-вом использованных пугав сывороток. Тот факт, что пептид 169-179 демонстрировал положительную реакцию не со всеми пулами сывороток, объясняется, возможно, высокой гетерогенностью популяции ант и-дельта-антител в индивидуальных сыворотках. Воз можнотакже, v/o этот факт является отражением не качественных, а чисто количественных различий в содержании тех или иных видов анти-дельтаантител в использованных пулах. Кроме того, возможна неадекватность конформации синтезированных коротких пептидов по сравнении с конформацней соответствующих участков в составе натив-ного антигена. Тем не менее, сравнение полученных результатов с результатами пептидного сканирования дельта-антигена, недавно проведенного американскими ученья«!, позволяет сделать определенные выводи. По результатам поискана была обнаружена умеренная активность синтетических гексалептидов в области 152 -165, что, в общем, совпадает с нашими результатами. Наибольшую .активность, по результатам пепскана, проявлял гексапептид 167- 172. В наашх опытах наиболее стабильно регистрировалось взаимодействие с сыворотками больных пептида 169-179. Такое сходство результатов позволяет утЕервдать, что участок 160-180 является Еерслтним районом расположения иммунодоминантного эпитопа
в ц в о п ц
1. Проведен компьютерный анализ структуры preS-области белка оболочки HBV (с помощью программ по гидрофильности, Е-антигеннос-ти, подвижности, расчета вторичной структуры белка) и выбраны участки для исследования ■ их антигенной активности.^ Осуществлен твердофазный синтез пептидов, соответствуют!« аминокислотным последовательностям preSl-области 24-41, 30-36 , 31,. 35 , 24-30, и получены их ксньюгаты с бычьим сывороточным альбумином и гемоцианином виноградной улитки, из которых антигенную активность в реакции с сыворотками крови иммунизированных тавотных, больных гепатитом В и моноклональными антителами показали коныогаты цептидов £4-11, 30-36, 31-36 и сами пептиды в неконьюгироьанном состоянии.
2. Локализован один из иммунодоминантлых эпитопов pr«3l-области белка ободочки НВУ на участке, * соответствуюцэм аминокислот-
в
к','»
- 17 в ,
ной последовательности 30-36. Антигенная активность пептида preSl(3Û-38) сравнима с активностью пептида preGl(24-41).
3. Исследована структура нуклео1сапсиднога белка HDV теорети-vecraiMH методами кошыотерного анализа и выбран для иммунологических исследований ряд пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям дельта-антигена 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82-94, 106-123, 115-123, 153-167, 167-179, 169-179, И по-■лучены их коньюгаты с BSA и KLH. Показано, что наибольшей f>nïnre;i-ной активность» в реакции иммуксферментного анализа с адти'ДельтА-позитивными сыворотками крови больных обладает пептид 169-179 . Небольшую антигенную активность проявили такха пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 40-49 и 153-167.
. 4. В соответствии с полученными результатами, антнгекно активный район дельта-антигена располагается в области 155-180, обладающей наибольшей акрсфильностыо, содержащей ^-повороты во вторичной структуре и минимальное, количество псложительно заряженных радикалов.
Ocuown.tr) рэзультати дассжртации изложены а сяедукдах работа?:
1. Евстигнеева F. П., Желтухина Г. А., Прокуронова Е. Л , Смирнов а Д., Семилетоа Ю. А., Калинина Т. И., Худяков Ю. Е. , Хромов U.C., Фаворов к 0., Яшина Т.Д. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента preS-области бедка оболочки вируса гепатита' а // Биоорган, химия. - 1990. - Т. 16, N1. - С. 34-40.
2. Евстигнеева Р. IL . Прокурора Е. И., ¡Келтухина Г, А. , Смирнов а Д., Семилетов Ю. А., Худяков Е Ё.. Калинина Т. И. , Гер л их Е Г, Сйнтеэ и иммунологические свойства. пептидного фрагмента 30-38 preS.t-области белка оболочки вируса гепатита а// Докл. ,АН СССР,-1Й90.- Т.313 ,N5.- С.II35-II38.-
3. Евстигнеева Р. П., Яелтухина Г. А. , Прокуронова Е. И., Смирнов ЕД., Семилетов R А., Калинина Т. И., . Худяков Ю. Е. , Хромов И. С.. Фаворов М. О. , Яшина Т. Л. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента preS-областн белка оболочки вируса гепатита а //Тезисы докладов IX Советско-Индийского симпозиума по химии природных соединений, Рига. - 1989. - С. 5.
4. Евстигнеева P. IL , Келтухина Г. А. . Прокуронова Е. И. , Худяков Ю. Е., Семилетов Ю. А. Синтез и иммунохимические свойства пептидных фрагментов белка оболочгаОируса гепатита В. // Тезисы докладов V Московской конференции., ВХО по органической химии *и
а
технологии. Часть I. - 1989. - С. 135.
5. Евстигнеева Р. Л , Желтухина Г. А., Прокуронова Е. И., Смирнов Б. Д. , Семилетов К1 А., Худяков ¡0. В. Предсказание локализации антигенных детерминант, синтез и иммунологические свойства пептидного Фрагмента preL области белка оболочки вируса гепатита В. // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", Москва. Часть I.- 1089.- С. 109.
6. EscrjinieeEa ?. Я , Прокуроноьа Е. X., 'Желтухина 'Г. А., Смирнов, В. Д., Семилетов Ю. А., Павлюченкова Р. П. , Вязоз С. О. Применение синтетических пептидов для исследования антигенной структуры белка ьяруса гепатита дельта. //Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, Рига. - 1990. - С. 44.
7. Евстигнеева Р. а , Прокуронова Е. К., Желтухина Г. А., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А., Худяков ЕЕ., Калинина T. Il Синтез пептидных фрагментов и локализация антигенной детерминанты в участке 24-41 preSl-области белка оболочки вируса гепатита R //Тезисы докладов -Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, Рига - 1990,- С. 4.
С. Прокуронова Е. И. , Сопот И. Н., "Желтухина Г. А., Евстигнеева Р. П., Семилетов К). А., Калинина Т. И. , Худяков Ю. Е. Анализ структурной организации, синтез и локализация антигенной детерминанты в участке 24-41 рге51-облаети белка оболочки вируса гепатита &// Тезисы докладов Всесоюзной штолы-семинара "Молекулярная биология и медицина", Ленинград.- 1990.- С.9.
Евстигнеева Р. II, Прокуронова Е. И., Желтухина Г. к., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А. , Павлюченкова Р. П., Вязов С. О. Исследование антигенной структуры белка вируса гепатита дельта. // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Химии белков", Тбилиси.- 1ЬЭ0.-С. 35.
1С. Семи тов Ю. А., Карпова В. А., Прокуронова Е. И. , Смирнов
B. Д., Калинина Т. И. , Худяков а Е. , Кзлтухина'Г. А., _ Евстигнеева Р. Е Синтез и иммунологические свойства пептидов из белков вириона вируса гепатита В.// Итоги наук; и техники. Сер. вирусология.-1990. -Т. 22. Вирусные гепатиты. Материалы международного симпозиума. -
C. 68.
H','TÏ~>
О