Синтез пептидов-фрагментов белков вирусов гепатитов В и дельта и исследование их иммунохимических свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Прокуронова, Елена Игоревна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1990 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Синтез пептидов-фрагментов белков вирусов гепатитов В и дельта и исследование их иммунохимических свойств»
 
Автореферат диссертации на тему "Синтез пептидов-фрагментов белков вирусов гепатитов В и дельта и исследование их иммунохимических свойств"

Московский Ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Специализированный со^ет Д 063. 41.01

На правах рукописи

ПРОКУРОГОВА Елена Игорегна

СШ1ТЕЗ шшцдаз - срмчя2ггоз б&йюв шансов гепатитов в ii дельта И псаигдспашяг их нйоткмапгоеши свойств

02.00.10. Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

!А"'СК°.-ч 1990 -- /'

' :/' /

О

Работа выполнена в Московском институте тонкой химической технологии им. И. В. Ломоносова и институте кирусгиогии им. Д. И. Ивановского АМН СССг.

Научный руководитель:

член-корр. АН СССР, доктор хим. наук, профессор ЕВСТИГНЕЕВА Р. IX

Официальные оппоненты:

доктор хим. наук ШИБНЕВ Б. А. кандидат хим. наук КРЫСЙН Е. 11

Ведущая организация:

Есесоюзный научно-исследовательский институт лекарственных растений

' Защита состоится "24" АС&с&^/Ь* 1990 г. в . /3 час.

на заседании спе-диализироваиного совета Д- 063. 41.01 . при Московском институте тонкой химической технологии им. Я а Ломоносова (Москва,117571, пр-т Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШГГХГ им. М. В. Ломоносова . , . • •. .

Автореферат разослан

Ученый.Секретарь специализированного совета, кандидат химических наук,

старыий научный сотрудник ■ - п С Лютик А. И.

о

Сх5щаа характеристика работы °

Актуальность проблема. Исследования, связанные с потоком антигенных дете( /инант вирусных белков, имеют большое значение д.т.' решения проблем диагностики и вакцинспрофилактики вирусных заболеваний. Серьезную*опасность для всемирного здравоохранения представляют вирусные гепатиты, среди которых особое место занимает гепатит В. В настоящее время в мире насчитывается около S00 млн. носителей поверхностного антигена вируса гепатита В (HB^Ag). Кромо тоге, в формировании тяжелых, часто летальных форм острого и хронического гепатитов участвует недавно открытый тМекиюпниЯ агент вирус гепатита дельта.

Одним ил методов борьбы с вирусными инфекциями является гаг.. цинация. В настоя нее время для вакцинопрофилактики» гепатита Б практическое применение нашли плазменная субъединичная и рекомби-нантная дрожжевая вакцины, ' имеющие ряд недостатков. Интенсивность и&учения возможностей создания искусственных вакцин на основе синтетических пептидов обусловлена их пре.имущестдами, которые Исключаются в химической гомогенности, неинфекцконяоети, вогмокностп производства в больших масштабах, строгой направленности именного ответа и отсутствии побочных зф!>ектов. В связи с этим представляется перспега'йеной локализация иммуиодошнантнь» элитопов Солков вирусов гепатитов В (HBV) и дельта _(HDV) с помощью синтетических пептидов.

Настоящая работа является частью тематики, разрабатываемой в соответствии с Поста! овлением ЦК КПСС N807- от 23.08.85 и Постановлением ГК1ГГ СССР II АН СССР от 03.02. 87 N26/13 ПО программе 0.74. Qf3. , а также согласно координационным планам АН СССР по направлений^ "Тонкий .органический синтез", . ""Биоорганичесгсая химия" и комплексной научно-исследовательской программе Минвуза РСФСР "Механизмы интеграции апологических систем" по направлении 4.

Целы} работы явилось выявление участков полипептмдных цепей, которые могут находиться на поверхности белков'(pro.Sl-область бзл-;са оболочки HBV и нуклеокапсидного белгеа HDV) и участвовать с организации иммунэдошшантннх эиитопов, с помочью теоретических методов компьютерного анализ:-! аминокислотных последовательностей соответствующих белков, ,синтоза предсказанных участков и их n.-.ivy-

А

(

яологического тестирования.

Научная новизна работы.

-'На основе компьютерного теоретического анализа структуры рге21-области белки оболочки вир/са гепатита В бил выделен участок, ооответствуюэдк аминокислотной последовательности 24-41 (суОтип ауи), который участвует .в организации антигенной детерминанты рге5.-области, что било подтверждено взаимодействием соответствующего синтетического пептида с сыворотками крови больных гепатитом а Дополнительный расчет вторичной структуры выбранного фрагмента 24-41 позволил локализовать в его составе гептапелтид, соответствуют^ аминокислотной последовательности 30-36, проявляющий свойства иммунодоминантного эпитопа;

-' С помощью компьютерных расчетов структуры дельта антигена (НБАе) 'по различным программам было сделано предположение о расположении имму.чодоминантного эпитопа в составе области, соответствующей аминокислотной последовательности 1 Ь?.~\70. и синтезирован ряд пептидов из этого и других перспективных участков дельта-антигена. Действительно, .наиболее воспроизводимые резулЛаты в реакциях с сыворотками больных гепатитом дельта показал пептид 169-179.

Практическая це»вгость работы.

Использованные в данной работе подходы к исследованию структурной организации^ белков вирусов .гепатитов В и дельта могут быть применены для изучения вероятной структуры белков других вирусов и предсказания локализации их антигенных детерминант. Полученные данные о наличии взаимодействия сывороток Сольных и мзноклоналышх антител с синтетическими пептидами могут быть использованы и дальнейшем для разработки доступных средств диагностики гепатитов В и дельта на основе химически синтезированных пептидов.

Половшей, Еьашсилгэ 1ачзкуггу:

1. Исследование структуры рге51-области белка оболочки Нб7(субтипа ау\») и дельта-антигена с помощью теоретических^ методов компьютерного анализа, на основании гаэторого предсказано расположение вероятных иммунологически активных участков этих .белков.

2. Синтез пептидов 24-41, 30-36 , 31-36, Ы-ЗО рг;е31-области белка оболочки ИВУ и пептидов 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82- 94, 106-123, 115-123, 153-167, 169-179; 167-172 ЮАе.

* 3. В результате иммунологических исследований, проведении?, с сыворотками больных гепатитом В и дельту и иммунизированных живот-

них, выявлен один из иммунодоминантных зпитопов preSl-области HBV на участке 30-36 и антигенноактивная с-Одасть HDA? в районе 169-179.

Пубгогкацкн. По результатам проделанной работы опубликогани 2 статьи и тезисы 8 докладов.

Апробации.

Результат раояты дололг-нм на IX Советско-Индийском симпозиуме "по химии природных соединений в г. Риге, май 1089 г.;на V Московской конфедешши но оргашгческсй химии и технологии, июнь 1989 г., на Всесоюзной научной конференции "Оценка фзрмакологичзской активности химических соединений: принципы ч подходи" , г. Москва, ноябрь 1989 г.; на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов , г.Рига, апрель 19SO г.; на мколе-семинаре "Молекулярная биология и медицина", г. Ленинград, май 1990 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Химия белков", г.Тбилиси, май 1990 г.; на Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты: фундаментальные проблемы, эпидемиология, профилактика, лечение", г. Ростов, сентябрь 1990 г.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 150 страницах и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список использованной литературы, включающий 125 ссылок.

I. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИШЮЖШНАНГНТ0 ЭПИТОПА preSI-ОБЛАСТИ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В (субтип ayw)

1.1. Анализ структурной организации preS-области белка оболочки ИВУ.

Компьютерный анализ preS-области белка оболочки HBV проведен с помощью программ по гидрофильности Хоппа и Вудса, а тага® Кайта и Дулитла, В-антигенности Веллинга и подвижности Карллуса и Щульца (рис. 1).

Основная информация о вероятной вторичной структуре получена из расчета по программе Птицына- и Финкелыптейна. По результатам . расчетов и с использованием литературных данных был выбран фрагмент, соответствующий аминокислотной последовательности 'preSl-области 24-41 FFPDHQLDPAFRANTANP.

Гпсчит был произведен |;ак для всей preS- области, так и отдельно дли пептида 24-41. Показана высокая гкдрйфильность яектида и наличие трех симметрично .расположены* изгибов пептидной цепи, предсказанных с достаточно высокой вероятностью (табл.1).

б) Б- антигеннос^ц, в) подвютости ргеЗ-области белка оболочки НВ'/.

Таблица 1.

Расчет вторичной структуры пептида 24-41 ргеЗ-области белка оболочки вируса гепатита В (по Финкельштейну А. а)

р-стп* {¿еюлг

¿леллп.

» г( ** 17 23 « М ~ЛЯ И|ГЛ Я* ШГ и 3°

/а« а. гтлфмл 'хп^идфрп/хо/ия'здо&птьгясаклв

и гг л гзмго п

шгге

пилю

/г <2 «г /г (г п ю

Пептид 'лак в составе белка, так и в свободном 'состоянии в_ растворе содержит участки с Л-спиралью складчатой структурой, причем "в растворе их расчетная вероятность уменьшается.

гз го в

го га го

ft

Выбранный пептид не обладает повышенной подвигаостьи и имеет сравнительно упорядоченную пространственную структуру. Наиболее интересным ее элементом представляется d-спираль с накладывающимся на нее ^-поворотом - участок 30-36 LDPAFRA - что,по литературным данным, является признаком потенциальной антигенной детерминанты. Наличие на N- и С-концах этого участка аминокислот, имеющих противоположно заряженные ионогенные боковые функции (Asp 31 и Art: 35) молет способствовать стабилизации^-изгиба. Дополнительный расчет вторичной структуры пептида 30-35, вычлененного из состава фрагмента "4-41, подтвердил наличие устойчивого^-поворотз в центре этого Фрагмента. При этом показано, что остаток Leu 30 не участвует з организации/-поворота. Кроме того, для синтеза был выбран такте фрагмент 24-30, который показался интересным тем, что он соответствует. максимальному значению В-антигенности, предсказанной программой Веллинга, а таюга содержит последовательность Asp-His, склонную к транспептидации и входящую в состав активных центров многих Ферментов.

1.2. Сгжлл !тзirnc^ia фрагментов preSl-области 6a.'2ta обо- . етмгет шсруса гст-пзта В

Все пептиды были синтезированы.твердофазным методом на хлор-метилированном носителе - тефлоне с рздиацизнно привитым полистиролом (16%). Е синтезе фрагмента, соответствующего аминокислотной последовательное:;.! 24-41, о-концевая аминокислота присоединялась к носителю с использованием соответствующей цезиевой соли. Пептидную цепь наращивали ступенчато с С-гсснца с применением активированных с°]иров М -трет. бутилсксикарбонил-Ь-аыянокислот (схема 1). Деблоки-:-ова;ше й-КНг-групп осуществляли 50£ раствором трифторуксусной кис-

(TFA) в хлористом метилене и 4 и раствором хлористого водорода в диокеане.

Известно, что введение остатка аргинина в пептидилполимер может проходить с низким выходом, сопровождаться модификацией гуа-нидинового звена и рацемизацией аминокислоты. Обычно при"-~:е:,(ые для защиты боковой фунгадии Arg гозильнач и нитрогруппа отцепляются в достаточно жестких условиях и не всегда успешно, поэтому Г';:' разработан метод введения остатка Are о высоким выходом и без побочных реакций с помощью BocArg- HCl- H20.

Для предотвращения реакции транспептидации, возможной при кислотном отщеплении пептида от полимера в последовательности Asp-

о

а

о

а

с отери^тивованной -СООН-груг.юй Asp, эта боковая функция временно блокировалась трет, бутильной защитой, которая отщеплялась в иледувдсм цикле деблокирования пептидилполимера 100% TFA. Пептид отцепляли от носителя действием бромистого водорода в' TFA и с-тюлли гель-фильтрацией на носителе Гоуо-Pearl НУ-40 в водной ук-еуской кислоте. Пе: "ид был получен с выходом 12,6% ( в расчете на исходное содержание пролина на полимере).

Схема 1.

Схема твердофазного синтеза пептида preSli24-41)

fie Лу

fi. Л,, А /и Пг Л а X, ^

I I I МО* &

„ -г® '-----1......@

tyfr---—;—

е «

(¿)- тефлон' с радиациопно привитым полистиролом, Бос - трет, бутилоксикарбонил, ОРГр - певтафторфенил, _ ..

0!1р - п-нитрофенил, Ей] - бензил, Ви*- трет, бутил.

Пептид, соответствующий аминокислотное .«свяыюсти 30- _

о

30, был синтезирован в основном теми же методами пептидной химии (схема Я). е Стартовая аминокислота присоединялась к хлорметилиро-ванному носителю в присутствии иодистого натрия и трнзтиламина при освещении. Деблокирования аминогрупп проводили 50% раствором ТГА в хлористом метилене. ' •

1.Х0МП

Схема твердофазного синтеза пептида preSHOCKifi)

Leu J)sp Pro JJla РЛс

Рос

OPfp Sx M

doc

м .

OPfp la-

»,/ M

toe

OPfp ioc r M

toe

OPfp Hoc ' (M

TfnSH/TF/!

&„

-ONo foe юг""

JrS Jtla

■ilfL „ OH Bet en)

MCI

на

■■t'iL net

c2> 0J>

<29 + ©

он

После отщепления от носителя действием трифторметги'судьфоио-вой , кислоты (ТГМЗА) в трифторуксусной кислоте пептид был очищен гель-хроматографией на сефадекее в-10 в 10% уксусной кислоте. Вы-.ход пептида составил 28%.

/Ьго

о,з ■ од он

10 ~20 ^о "время (мин)

Рис. 2. Профиль элюции пептида preSl( 30-36} (ВЭЖХ'на колонке 3,2 х 250 мм с носителем J4-Bondapack CIS, 10 мкм. Элюция в градиенте ацетонитри.ца со скоростью 1 мл/мин).

С целью повышения селективности процесса связывания пептида с белковым носителем для проведения иммунологических исследований был синтезирован пептид рге31(Ь0-36) с С-концевым остатком цистерна, заселенного по боковой функции ацетамидометильной группой (Асгп). Остит о к Суэ( Аст) был присоединен к С-концам еще двух пептидов - рге31(31-3б) и рге31(24-30). Пептид рге31(31-3б)-суг(лсгг,) был синтезирован с использованием метода симметричных ангидридов "з соответствии со схемой 3.

и -

Схема тьердо&дзвого сжеса пептида ргеГ)1( 31-36) -СуэС Лет)

Б ж

Рга ' Л1а

РЛе

.«.у

Ыс

ОН £и 1ГС №>

СИ бакс М

ЛИ Вт

Ш /Ьс КС I")

кл Ья*Сн ¿а 1"1

ля/ггл

О! бог ОССМ

Схема 3.

.«VI.

О

ЙСЪ >

Яа» С23

йст ■ ф

■ 09

Аст СИ

Пептид ргеБК £4-30)-Суз(Аст) синтезирован в соответствии со схемой 4.

¿4 « *Г ¿4 ¡о

РЬе РЫ Р,о Пар Яп ¿е„ £уз'

№ '¡к Ы'р В-У ¿Я** бх бос ОН Ва <а £х АЬх ОН ¿ос ш<">

г

ПГЪА/ ТГЛ

Схема 4.

Схема твердофазного синтеза пептида ФГОБК 24-30)-Суз(Асш)

Аст ГР

Я/у

' р .

/Ч-

Л*,.

Шптида 31.-36 и 24-30 после гель-хроматографии были получены ; выходами соолгетстьенно 33,6Х и 16,ОХ. Синтезированные пеитидн характеризованы а ломота результатов тонкослойной и вксокоз^и:«;-"¡пшзй гзщкеегкой хротгегрфт, аминокислотного аиашги, оя^да-удзгьпых углов оптического врасенил и М-коицевих а^шокве-

и

я

1.3. Розултази гатиолсгачсскхх исследовали/! полгиднш Орпп-оитоз рта Sl-облпкп! Салка оболочки JIBV Для проведения иммунологических исследований сиитезиро!»чш!1;>: пептидов были приготовлен» их коиьюгаты с ОелкотЯ! носителям« (бычий сывороточный альбумин, гокоцнанкн улитки), которыми иммунизированы лзбороторные нивотние.

Коньюгацию проводили с использованием глутлральдегида и водорастворимого 1-згил-3-(3:димет1и!Лминопропнл)ьгфСодт?мпда. Пептиду 30-20, 31-36, 24-30, содержащие на О-кошю остаток цистеича, конь-кгировали с бел)сами с помощью активирующих г.гйнтоп Н-сугашнимиднл 3-(2-шфИдмл-дитио)прописната (SPDP) и И-скснеукцнчнмидного зфирз З-маленнимидобензсйнсй кислоты (МЕЗ). Степень коньюгашш пептидов с белками определяли по данным количественного аминокислотного анализа; она составляла 7-17 моль пептида /моль белка.

Иммунизация кроликов и белых мышей приводила во всех случаях л индукции специфических антипептидных антител, что определялось .'.егодом твердофазного иммуноферментного анализа (рис.3).

га 1.3 1.« та то ся са Q.4 ЦП

Lai

Г- Г1

п

ГЗ здоропое

жиоотноп i'.'i иглглунизи-решамнее жипагпнаэ

ö V а

Рис. 3. Выработка специфических антител у мыией на пептид preSl(24-4l) Коиыог&ты пептидов исследовались таю» на епосооиость ьшв-чть антитеза в енторотках больных гепатитом В методом твердофаз-эго ';>г;:с>:-р!,;знткого акалива При анализе сыьороток крозя 42 ояии:г [ •• • ».том В с НЕэ-антигашмией на 3-1,4 день язжеутего яе-;:о,г,а •> г с помощью иояыегата пептида preSl(2i-4i> с сдашзд

jhoooToiг-,;- i .'Альбумином (BSA) в ^о.аыпл.чогье' образцов cwoporox (30 i -12) нолучеи поеет-ивный результат, причем в Некоторых случаях гпс'г.ие р/n (преклеииэ положительного сигнала над отр'л'ательн:-'; >пзн) еосгоихядл Солов 30, В качестве огривФгельясго контроля i*;-'ль'С"'1"!! стоорг";« крогй здеровш: л;*;:. >

При исследовании коньюгата пептида 30-36 в пеакции с сыворотками Сольных было показано, что его антигенные свойства подобны свойствам коньюгата пептида 24-41. Кроме того, пептиды 24-41, 30-35 и 31-36 и их коньюгаты дали позитивный результат в реакции с моноююнальными антителами к preSl-области, любезно предоставленными д-ром В. Г.Герлихом (ФРГ, 1'еттингенский университет). Что касается фрагмента preSl( 24-30)-Cys(Acin), то при исследовании его свойств не было получено позитивных ревультатов ни в реакции с сыворотками больных, ни в реакции с моноклональными антителами.

На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что участок preSl-области, соответствующий аминокислотной последовательности 30-36, входит в состав одного из иммунодоминантных опитопов preSl-области белю оболочки вируса гепатита В.

11. исследование' антигенной структуры нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта с использованием синтетических •пептидов

II. 1. Анализ структурной организации дельта-антигена

В настояще"; работе предпринят теоретический анализ расположения иммунодоминантных участков в составе белка нуклеокап-сида HDV и исследованы свойства серии пептидов из состава* предсказанных В-эпитопов.

Для предсказания вероятной структуры белка были применены методы., указанные в п. 1.1. (рис. 4,5).

Кроме того, с использованием описания программы по акрофиль-ности был получен профиль акрофильности для дельта-антигена.

При интерпретации результатов проведенных расчетов учитывалась специфика нуклеокапсидного белка, связанная с вовлеченностью ряда его участков во взаимодействие с РНК; превде всего это фрагменты, содержащие положительно заряженные радикалы. При выборе потенциально антигенно активных- участков мы, в основном,. руководствовались следующими критериями: они долины быть максимально гидрофильны, подвижны, экспонированы на поверхности нуклеокапсида, должны содердать^-повороты во вторичной структуре и не иметь положительно заряженных радикалов. .-

О

Рис. 4. Профили а)относительной гидрофильности по Хоппу и Вудсу, б)В-антигенности, в) подвижности дельта-антигена.

---------г } "<?»>.'."??) ""■

'*■"' У * 1 л ' ' Т

Г^-----/// : п п / ';

VI" П-- ( ;

•п.;'.''.'-."

З-ОЛ/Ч^Э-О-О '."ЛА ГГ.'-чч" 1}-".:Ч-.ПП---------ч -

Рис. Г). Расчет вероятной вторичной структуры дельта-антигена

Для синтеза были выбрали фрагменты HDAg. соответствующие аминокислотным последовательностям 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82-94,. 106-123, 115-123, 153-167, 169-179, 167-179 (рис.С). Ü G G г? Е Е I LEQ19 17LEQVVAGZ3 ' 11GGREEM. EQWVAG23 40 К I К К L Е Е D N Р <9 02DAGPRKRPLRGSF94 100 KALE II К R К Q L S S G 6 К S L S 123 115 L S С C> G К S L 3 123 153 N P L E Ü (3 S R Q A P G G G F 167 iOOPSMQOVPESPF179 157 F V P S M 0 Q V F E S P F 178

Рис. 6. Синтезированные фрагменты дельта-антигена

При выборе указанных фрагментов учитывалось, 'что N-концевая часть белка соответствует наибольшей предсказанной гидрофилыюстл и В-антигеиности по сравнению с С-концевой. Kpotie того, из литературных данных было известно, что антигенной активностью обладают фрагменты 20-80 и 15->б0, входящие в состав перекрывающихся полипептидов, полученных генноинкенерными методами. Расчет вторичной структуры показал, что область, соответствующая аминокислотной последовательности 15-60, структурирована и содергат<1-спираль с высокой степенью вероятности (рис.5). На участке 40-4901с1шралиаацил нарушается, образуя неструктурированную, иысскогндрофильную область, обладающую умеренной акрофильностью. За исключением этого фрагмента, все остальные пептиды ио N-концевой части содержат в качестве элемента вторичной структуры/-повороты, предсказанные в составе белка или отдельного фрагмента. Перекрывающиеся пептиды из аминокислотной последовательности 11-23 соответствуют области повышенной подвижности и гидрофильности. Участок 11-23 описывался в одном из последних литературных сообщений, как обладающий сильной активностью при связывании с человеческими поликлснальными ан-TK-HDV-антителами. Эта же активность описана и 0для области 10G-123, которая с точки зрения предсказанной структуры интересна тем, что содержит 2поворота./-Повороты входят и в состав гидрофильного участка 82-94, обладающего к тому же и акрофильностью.

При исследовании С-концевой части белка с помощью компьютерных прбграмм была показана существенно более низкая гидрофильность

и практически полнее отсутствие В-антигенности, однако эта область является высокоструктурированной, высокоакрофильной и она не содержит аминокислот с положительно заряженными боковыми радикалами. В отличие от N-концевой части, основным элементом вторичной структуры здесь являются повороти складчатая структура. Если в N-концевой ч~сти вероятность ¿-поворотов не превышала 6-8%, тс в с-конпевой она составляла 11-27%. Наиболее интересным здесь нам показался участок 144-180, для которого предсказанные элементу вторичной структуры -ß-повсроти- и/-складчатая структура - с небольшими изменениями сохранялись гак при расчете белка, так и при расчете отдельного фрагмента в растворе. Кроме того, в составе фрагмента 144-180 на участке 152-158 предсказываетсяоС--спираль, накладывающаяся на^-поворот, что, по литературным дан и иг:, является признаком потенциальной антигеиой детерминанты. Интересен участо: 150-166, для которого предсказан самый "сильный"_р-поворот (27% вероятности) и высокая акрофильность. Эти перспективные элементы структуры вошли в состав выбранного пептидного фрагмента 153-167. Наибольшая акрофильность наблюдалась для пептида 16Ü-179, причем этот участок практически не содержит заряженных аминокислотных радикалов. Кроме того, расчет структуры óтого пептида в составе белка показал наличие трех симметричных р-изгибов.

II. 2. Crntrea пептидных фрагментов дельта-антигена

Синтез пептидов из состава белка нуклеокапсида вируса гелати-<яа дельта проводили твердофазным методом с использованием в качестве полимерного носителя хлорметилированного тефлона с радиаци-онно привитым полистиролом (10%). Для временной запиты dr аминогрупп использовали Вос-группу. В качестве постоянной защитной группы боковых функций Asp, Qlu, Thr, Ser использовали бензильную группу, £-аминогруппу Lys защищали бензилоксикарбонильной группой (Z), гуа-нидиновую функцию Arg - протонированием или широгруппой, суль-фгидрильную функцию Cys - ацетамидоиетильной (Аст) группой. Стартовую аминокислоту присоединяли к носителю в присутствии триэтиламина и йодистого натрия при освещении. Содержанке якорной аминокислоты в полимере составляло 0,2-0,4 ммоль/г полимера. Деб-локированиеА-аминогрупп пептидилполимеров проводили - £0% раствором трифторукпусной кислоты в хлористом метилене с последующей нейтрализацией аюмокомпонента 10% раствором этилдиизосропилампна в хлористом метилене. Конденсации проводили, в основной, методом симметричных ангидридов. Ниже приведены типичные схемы сште&а.

Схема 5.

Схег/а твердофазного синтеяа пептида 169-179-Суе(Аст) ТОАг

к / р>о (V/ а,!

л_

415

■Он дог*

Схема 6.

Схема твердофазного синтеза пептида И-19-Суз(Асв1) НСАе

Я)" «у Л} Си Ян

к

КО

4/

III ии С!„ С!л ' Г,г

«ягМ

«"У1»

да --44'

ОН !х («»

Ш Д* Кст

Лт

Лт

■-< р->

ИЫ

-гг-,

ч2>

КЮ /и -да

-4?

• Синтезированные пептиды отщепляли от полимера действием трифторметансульфокислоты в трифгоруксусной кислоте в присутствии тиоакизола Полученные продукты очишали гель-хроматографией на се-дадоксе &10 в водной уксусной кислоте. Выходы пептидов составляли 10-30?«. Гюптиды охарактеризованы 7ОХ и ВЭЖХ, определением удельного угла оптического вращения, й-концевой аминокислоты и количественным аминокислотным анализом.

А

гго ■ OA о,л 0,2 0.1

U

1. МеОН

(00 %

20 • GO - 40 20

10 бремя (мни)

Рлс.7. Профиль элгсции пептида ll-19-Cys(Acm) HDAç (ВЭЯХ на колонке 3,2 х 250 мм с носителем Silasorb С18, 10 мкм. Элюция 0,17. TFA - 0,1% 7FA в 80% метаноле' со' скоростью 1 мл/мин). *

II. 3. Результаты »-etynaTOrcrsocjGSi гссслвдазаннй пептидных <Й>ап£энтов дэльта гигггагена.

Для проведения исследований синтезированные пептиды были ¡«шьюгированы о белковыми носителями (как описано в п. 1.3.)Полученными коньюгатами иммунизировали лабораторных животных (кроликов и мышей), в результате чего в высоком титре образовывались антипептидные антитела, с которыми эффективно реагировали пептидные коньюгаты. Коньюгаты пептидов исследовались5также в реакции твердофазного иммуноферме-нтного аиапиза с пула»,m сывороток больно гепатитом дельта. Из пептидов N-концевой части положительный результат был получен только для пептида 40-49. Негативные результат" для остальных пептидов , возможно, объясняются тем, что синтезированные нами фрагменты из участка 11-23 соответствуют амшюглс.потной последовательности HDAg, пассированного на пимпанзе. При этом дельта-антиген претерпевает некоторые изменения в первичной структуре, которые могли оказаться существенными. Пептид 82-94 не проявил антигенной активности, возможно, из-за того, что, несмотря на наличие предсказанного р-поворота и и составе белгл, и в отстав-? фрагмента, он обладает л1иь умеренными гид'ро-тильнссп 1 »- я ¡з»^'"'^-

постьь, а та1 сл.- содержит большое количество положительно заря,*ен-ных радикалов.

. Пептиды из С-концевой части белка реагировали с сыворотками крови больных гепатитом дельта, но довольно слабо. Р отличие от других пептидов, пептид 169-179 эффективно и регулярно реагировал с болылинс-вом использованных пугав сывороток. Тот факт, что пептид 169-179 демонстрировал положительную реакцию не со всеми пулами сывороток, объясняется, возможно, высокой гетерогенностью популяции ант и-дельта-антител в индивидуальных сыворотках. Воз можнотакже, v/o этот факт является отражением не качественных, а чисто количественных различий в содержании тех или иных видов анти-дельтаантител в использованных пулах. Кроме того, возможна неадекватность конформации синтезированных коротких пептидов по сравнении с конформацней соответствующих участков в составе натив-ного антигена. Тем не менее, сравнение полученных результатов с результатами пептидного сканирования дельта-антигена, недавно проведенного американскими ученья«!, позволяет сделать определенные выводи. По результатам поискана была обнаружена умеренная активность синтетических гексалептидов в области 152 -165, что, в общем, совпадает с нашими результатами. Наибольшую .активность, по результатам пепскана, проявлял гексапептид 167- 172. В наашх опытах наиболее стабильно регистрировалось взаимодействие с сыворотками больных пептида 169-179. Такое сходство результатов позволяет утЕервдать, что участок 160-180 является Еерслтним районом расположения иммунодоминантного эпитопа

в ц в о п ц

1. Проведен компьютерный анализ структуры preS-области белка оболочки HBV (с помощью программ по гидрофильности, Е-антигеннос-ти, подвижности, расчета вторичной структуры белка) и выбраны участки для исследования ■ их антигенной активности.^ Осуществлен твердофазный синтез пептидов, соответствуют!« аминокислотным последовательностям preSl-области 24-41, 30-36 , 31,. 35 , 24-30, и получены их ксньюгаты с бычьим сывороточным альбумином и гемоцианином виноградной улитки, из которых антигенную активность в реакции с сыворотками крови иммунизированных тавотных, больных гепатитом В и моноклональными антителами показали коныогаты цептидов £4-11, 30-36, 31-36 и сами пептиды в неконьюгироьанном состоянии.

2. Локализован один из иммунодоминантлых эпитопов pr«3l-области белка ободочки НВУ на участке, * соответствуюцэм аминокислот-

в

к','»

- 17 в ,

ной последовательности 30-36. Антигенная активность пептида preSl(3Û-38) сравнима с активностью пептида preGl(24-41).

3. Исследована структура нуклео1сапсиднога белка HDV теорети-vecraiMH методами кошыотерного анализа и выбран для иммунологических исследований ряд пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям дельта-антигена 11-19, 17-23, 11-23, 40-49, 82-94, 106-123, 115-123, 153-167, 167-179, 169-179, И по-■лучены их коньюгаты с BSA и KLH. Показано, что наибольшей f>nïnre;i-ной активность» в реакции иммуксферментного анализа с адти'ДельтА-позитивными сыворотками крови больных обладает пептид 169-179 . Небольшую антигенную активность проявили такха пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 40-49 и 153-167.

. 4. В соответствии с полученными результатами, антнгекно активный район дельта-антигена располагается в области 155-180, обладающей наибольшей акрсфильностыо, содержащей ^-повороты во вторичной структуре и минимальное, количество псложительно заряженных радикалов.

Ocuown.tr) рэзультати дассжртации изложены а сяедукдах работа?:

1. Евстигнеева F. П., Желтухина Г. А., Прокуронова Е. Л , Смирнов а Д., Семилетоа Ю. А., Калинина Т. И., Худяков Ю. Е. , Хромов U.C., Фаворов к 0., Яшина Т.Д. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента preS-области бедка оболочки вируса гепатита' а // Биоорган, химия. - 1990. - Т. 16, N1. - С. 34-40.

2. Евстигнеева Р. IL . Прокурора Е. И., ¡Келтухина Г, А. , Смирнов а Д., Семилетов Ю. А., Худяков Е Ё.. Калинина Т. И. , Гер л их Е Г, Сйнтеэ и иммунологические свойства. пептидного фрагмента 30-38 preS.t-области белка оболочки вируса гепатита а// Докл. ,АН СССР,-1Й90.- Т.313 ,N5.- С.II35-II38.-

3. Евстигнеева Р. П., Яелтухина Г. А. , Прокуронова Е. И., Смирнов ЕД., Семилетов R А., Калинина Т. И., . Худяков Ю. Е. , Хромов И. С.. Фаворов М. О. , Яшина Т. Л. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента preS-областн белка оболочки вируса гепатита а //Тезисы докладов IX Советско-Индийского симпозиума по химии природных соединений, Рига. - 1989. - С. 5.

4. Евстигнеева P. IL , Келтухина Г. А. . Прокуронова Е. И. , Худяков Ю. Е., Семилетов Ю. А. Синтез и иммунохимические свойства пептидных фрагментов белка оболочгаОируса гепатита В. // Тезисы докладов V Московской конференции., ВХО по органической химии *и

а

технологии. Часть I. - 1989. - С. 135.

5. Евстигнеева Р. Л , Желтухина Г. А., Прокуронова Е. И., Смирнов Б. Д. , Семилетов К1 А., Худяков ¡0. В. Предсказание локализации антигенных детерминант, синтез и иммунологические свойства пептидного Фрагмента preL области белка оболочки вируса гепатита В. // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", Москва. Часть I.- 1089.- С. 109.

6. EscrjinieeEa ?. Я , Прокуроноьа Е. X., 'Желтухина 'Г. А., Смирнов, В. Д., Семилетов Ю. А., Павлюченкова Р. П. , Вязоз С. О. Применение синтетических пептидов для исследования антигенной структуры белка ьяруса гепатита дельта. //Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, Рига. - 1990. - С. 44.

7. Евстигнеева Р. а , Прокуронова Е. К., Желтухина Г. А., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А., Худяков ЕЕ., Калинина T. Il Синтез пептидных фрагментов и локализация антигенной детерминанты в участке 24-41 preSl-области белка оболочки вируса гепатита R //Тезисы докладов -Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, Рига - 1990,- С. 4.

С. Прокуронова Е. И. , Сопот И. Н., "Желтухина Г. А., Евстигнеева Р. П., Семилетов К). А., Калинина Т. И. , Худяков Ю. Е. Анализ структурной организации, синтез и локализация антигенной детерминанты в участке 24-41 рге51-облаети белка оболочки вируса гепатита &// Тезисы докладов Всесоюзной штолы-семинара "Молекулярная биология и медицина", Ленинград.- 1990.- С.9.

Евстигнеева Р. II, Прокуронова Е. И., Желтухина Г. к., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А. , Павлюченкова Р. П., Вязов С. О. Исследование антигенной структуры белка вируса гепатита дельта. // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Химии белков", Тбилиси.- 1ЬЭ0.-С. 35.

1С. Семи тов Ю. А., Карпова В. А., Прокуронова Е. И. , Смирнов

B. Д., Калинина Т. И. , Худяков а Е. , Кзлтухина'Г. А., _ Евстигнеева Р. Е Синтез и иммунологические свойства пептидов из белков вириона вируса гепатита В.// Итоги наук; и техники. Сер. вирусология.-1990. -Т. 22. Вирусные гепатиты. Материалы международного симпозиума. -

C. 68.

H','TÏ~>

О