Антигенная структура капсидных белков вирусов растений и белковых антигенов Bordetella pertuosis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ

РГ6 ол

• ' .П1Г л .

На правах рукописи РАДАВСКШ Юрий Леонидович

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА КАПСИДННХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ И БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ Bordetella pertuoois

02.00.10 - Биооргэническая химия, химия природных и физиологически активных векеств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев - 1994

Диссертацией является рукопись

Работа выполнено в Институте биоорганической химии и

нефтехимии АН Украины

О&щиалыше оппоненты:

акаде'жк УААН, доктор биологических наук.

профессор БОЯКО А.Л.

доктор медицинских наук,

профессор БЕРЕЖНАЯ Н.М.

доктор биологических наук,

профессор КИБИРЕВ В.К.

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.В.Памадина АН Украшш

Защита диссертации состоится "22-» ^уик jl 1994 г> на заседании специализированного ученого совета Д.016.65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии All Украины ( 253034, г.Киев-94, ул. Мурманская, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины (253094, г.Киев-94, ул. Мурманская, 1).

Автореферат разослан /'uyVfi^ 1994 г.

Учений се1фетарь v»

специализированного совета Д.М.ФЕДОРЯК

Зам. Ch Формат 60x84/16 Обл.-вид.арк, 2.00

ГИдписано до друку 11.03.1994 р. Тираж 100

Полхграфхина дЬьниця ITS6 iu.М.М.Боголюбова АН Укратни

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние года ознаменовались значительными успехами в изучении антигенных свойств белков, в частности вирусных и бактериальных. Установлено, что антитола рецепторы иммунокомпетентных метек узнают не вс» молекулу белка, а определенный ее участок - антигенную детерминанту или эпитоп. Локализация антигенных детерминант и их синтетическое моделирование позволяют лучпе понять молекулярные основы антигенности. Совместное применение химически простых синтетических антигенов и инбредных линий мышей, создающих генетически однозначную ситуацию, дает неопровержимое доказательство детер-минантной специфичности генетического контроля иммунного ответа.

В настоящее время ведутся многочисленные исследования вирусов высших растений и их компонентов. Интерес к ним вызьан, с одной стороны, значительным влиянием на экономику сельского хозяйства, а с другой - разнообразием структурно-функциональной организации их белков и геномных нуклеиновых кислот. Знание антигенной структуры капсядных белков Х-, У- и М-вирусоз картофеля дзет информацию об их топографии в капсиде, что важно для установления молекулярной организации их вирионов, изучения белок-белкового и белок-нуклеинового взамодействия и понимания таких процессов, как самосборка вирусов и освобождение РНК от белка. Известно, что потери урожая картофеля на 40-80$ связаны с использованием в сельском хозяйстве зараженного вирусами посадочного материала. Поэтому знание антигенной структуры изучаемых вирусов даст возможность усовершенствовать существующие методы их диагностики.

С изучением антигенности белков тесно связана проблема создания искусственных или синтетических вакцин. Такие вакцины содержат не целые вирусы, бактерии или их антигены, а искусственно синтезируемые в больших количествах (методами органической химии им генной инженерии) антигенные детерминанты, включающие только иммунологически значимую часть антигена, вызывающую выработку иммунитета. Основным преимуществом таких вакцин является то, что можно проводить иммунизацию минимальными количества.'® материала и значительно уменьшит нежелательные побочные эффекты. ■ Они не будут

представлять опасность ни для самого вакцинируемого человека, и для окружающих.

В настоящее время в Украине и за рубежом для вакцинацш 1втей применяют, в основном, АКЦС вакцину, состоящую к: Дифтерийного и столбнячного анатоксинов и инактивированногс коклюшного микроба. Однако эта вакцина дает ряд локальных ] системных побочных реакций. Это побочное действие связано, ] больиинстзе случаев, с целькоклеточным компонентом вакцины-коклюишм микробом. Естественно, возникает проблема разрзботм и создания менее реактогенкой вакцины. Она может быть решен« путем выделения из микроба протективных белковых антигенов I создания на их основе вакцины, которая вызывала бы устойчивый иммунитет. Ол^ж из основных протективных антигеноЕ ВогсагеНс реггизз1з являются коклюшный токсин и филамвнтозшй гемагглитинин. Выделение и изучение антигенных свойств этш белков позволяет вплотную подойти к созданию бесклеточных 1 синтетических вакцин против коклюша.

Во многих странах мира ведутся интенсивные научные исследования по созданию химических (синтетических) вакцин. Одш» из подходов в создании таких вакцин является химический синте: пептидов, содержали, аминокислотные последовательности протективных антигенных детерминант, определяющих выработку специфических антител. Для получения сильного иммунного ответа на пептид:, последние конъюгируют с высокомолекулярными носителями с помощью различных поперечносшивающих бифункциональных реагентов. Синтез и применение новых бифункциональных реагентов являете? весьма актуальной задачей при создании синтетических антигенов I вакцин.

Настоящая работа выполнялась в рамках тем Институте биооргашческой химии и нефтехимии АН Украины Л госрегестрацш 01.86.0007421 и * госрегестрации 01.89.00027489 по Постановлен!« Президиума АН Украины от 27.12.85г. и Бюро ВХХТ АН Украины оп 26.12.89г.

Цель. и.задачи исследования. Исходя, из вышеизложенного - цел! настоящей работа заключалась в изучении антигенной структурь капсошшх белков х-.у-, и м-вируров картофеля (рух, руу, рум), i изучении иммуногешшх и Антигенных свойств коклюшного токсинг (К"Г) и филаментоэного гамагглютииина (ФГА) из В.репиаз1з и рядг синтетических пептидов, которые соответствуют амшокислотной

последовательности отдельных функционально важных участков этих белков. Целью работы являлось также изучение возможности использования новых бифункциональных реагентов в иммунологических исследованиях.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-локализовать атигённые детерминанты с помощью шли- и моноклинальных .антител, находящиеся на поверхности капсидных белков РУХ, РГ/ и РУМ;

-изучить химическое строение участков капсидных белков, включающих эпитопц;

-провести сравнение первичных и высших структур капсидных белков изучаемых вирусов;

-выделить в гомогенном виде коклюшный токсин и филаментозшй гемагглютинин В. реПизз1з;

-получить иммуноконъюгаты на основе ряда синтетических пептидов коклюшного токсина и филаментозного гемагглютинина и изучить их иммуногенные и антигенные свойства!

-изучить возможность применения 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров кислот для получения иммуноконъюгатов.

Научная новизна работы. Впервые, с применением поли- и моноклональных антител к РУХ и модификацией остатков лизина показано, что в л-концевом участке капсидного белка РУХ содержится одна или две перекрывающиеся антигенные детерминанты в которые входит остаток лизина в позиции 19 полипептидной цепи бежа. Этот участок является иммунодоминантной областью и экспонирован на поверхности вириона. Синтезировано три пептида входящие в эту область и получены конъюгаты. Один из пептидов (нанопептид) взаимодействует с двумя МНА к РУХ, что подтверждает экспонированность этого участка на поверхности РУХ.

С помощью компьютерных расчетных методов доказана принадлежность раму к потексгруппе.

Исследованы два МКА , полученные к штамму Н руг, которые реагируют с целым вирусом, нативным и денатурированным капсидныым белком. Выявлено, что МКА УЗСб реагирует с тремя штаммами руг и воемью другими вирусами потигруппы. С помощью этого МКА локализован гругагоспецифический эпитоп потивирусов, идентифицированных на Дальнем Востоке. МКА ¥20 взаимодействует только с интактными капсидными белками штаммов руу, по не

реагирует с другими потизирусами и продуктами деградации белков по К- и (или) С-копцевым участкам. Отсюда следует, что МКА ¥20 узнает вирусспецифический эпитоп в капсидном белке.

Проведено расщепление капсздного белка рун трипсином и фракционирование смеск пептидов БЭЖХ возращенной фазе. Методом флюороилмуноанализа временного разрешения установлено, что один из пептидов взаимодействует с ЬКА Ш)5, полученным к целому вирусу. Установлена аминокислотная последовательность этого пептида: Е к й Р ь Р т а А Б Р Е с к. Данный пептид расположен в л-концевой области капсидного белка Рте в позиции 21-34 и этот участок экспонирован на поверхности вириона и представляет собой иммунодогдшантную область.

Впервые выделены две формы коклюшного токсина из одного производственного штамма В.рег1изз1э. Эти формы отличаются друг от друга разной электрофорстической подвижностью субъединицы 61 при проведении электрофореза в ПААГ с ДСН. При восстановлении внутрицегючечной -з-з- связи электрофоретичеекая подвижность субъедийнш 51 одной из форм практически не меняется, однако электрсфоретическая подвижность субъедшщы 51 второй формы значительно уменьшается к почти сравнивается с подвижностью субъедктш £1 первой формы.

Найдено, что конъмгат полученный на основе синтетического л-концевого пептида бсрратуушдбкррез субъединицы и

сывороточного альбумина лошади активно реагирует с ПКА к коклюшному токсину. Это свидетельствует о том, что иммукодоминантной область» в и-кокцевсм участке является сайт, входящий в последовательность 1-17 субъединиш 51.

Проведен сравнительный анализ энтигенности субъединиц с использованием ПКА к целому токсину методом иммуноэлоктроблот-тинга.

Найдены закономерности, которые приводят к- протеолизу нативной молекулы филзментозного гемагглютинина в зависимости от культивирования, сроков хранения препаратов, добавления ингибиторов протеаз и условий выделения белка..

Локализована • антигенная детерминанта в районе аминокислотных остатков 1094-1102 полипептидной цепи ФГА, принимающая участие в адгезии бактериальных клеток на макрофагах. Для этого определения использован„ нативный ФГА, синтетический нонппентид ттеРСБРВД и его конъюгаты с БСА и САЧ.

Эпитопспецифические антитела исследованы с помощью иммуноаффин-ной хроматографии к иммуноферментным анализом.

Показана возмоззюсть получения конъюгаг-в гаптен-белок, пептид-белок, белок-белок с использованием 2-нитро-4-сульфофенпловых эфиров моно- и дикарбоношх кислот.

Практическое ..значение работы. Разработана способы выделения пептидов, представляющих поверхностные опитопы pvx, pvy, pvm и являющиеся иммунодоминантжми областями. Эти пептида и полученные их синтетические аналоги позволят усовершенствовать диагностические тест-системы идентификации этих вирусов в растениях.

Получены поликлоналыше антитела к pvx, pvy и fvm, которые являются важным инструментом для иммунодиагностики вирусов в посадочном материале. Иммунологические метода, которые апробированы в данной диссертации могут быть внедрены в семеноводческих хозяйствах Украины.

Получены два вида Мининых мошклоналышх антител к коклюшному токсину 3. pertussis. Определено, что каждая из гибридом продуцирует Г,НА, обладающие сродством к нативному коклюшному токсину с величиной константы связывания ~1.0х10_8М-1. С помощью этих МКА можно надежно определять токсин в биологических образцах, начиная с концентрации 0,5 мкг/мл. Выделенные поликлональные антитела к КГ и ФГА могут найти применение при создании иммунодиагностических тест-систем.

На основе пяти синтетических пептидов из каталитической субъединицы KT и белков-носителей синтезированы иммуноконъюгаты, которые могут быть использованы при разработке синтетических пептидных вакцин против коклюша.

Получен высокопродуктивный токсикогенный серовариант штамма В. pertussis. Выход высокоочщенного токсина с 1л освобожденной от клеток среды культивирования этого штамма составляет 2.1+0.28 мг. Этот штамм защищен авторским свидетельством ( АС СССР М761795) и может применяться при получении коклюшного токсина.

Результаты этой работы отражены в производственном регламенте -"Инструкция по изготовлению и контролю коклюшного токсина, сухого". На базе ИБОНХ АН Украины и НЖВС им.И.И.Мечникова РАМН внедрен в производство препарат коклюшного токсина, который реализуется в Украине и за ее пределами.

Локализация В-эгштопа в участке ФГА, отвечающего за связываше с CR-3 штегршюм макрофагов, свидетельствует о возможности использования синтетического пептида, входящего в эту область, в качестве компонента синтетической вакцины против коклюша.

Предложен способ получения иммуноконъюгатов с помощью 2-нитро-4~сульфофениловых эфиров кислот, который может найти применение в технологии производства синтетических вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, докладывались и представлялись на v-vii. Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Баку, 1980; Рига, 1983; Таллинн, 1987), I Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" (Москва, 1985), V-VI Украинских биохимических съездах (Ивано-Франковск, 1987; Киев, 1992), II Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала, Латвия, 1989), YII съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), II-III Международных симпозиумах "Плюс-цепочечные РНК-вирусы" (Вена, Австрия, 1989; Клируотер, США, 1992), Международном симпозиуме "Оснозше достижения в вирусологии растений"'(Еберсвальде, ГДР, 1989), VII СССР-ФРГ симпозиуме " Химия пептидов и белков" (Дилижан, Армения, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), VIII Международном конгрессе по вирусологии (Берлин, ФРГ, 1990), vi Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), XII Украинском республиканском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Харьков, 1991), Международном симпозиуме "Вирусология, иммунология и общество" (Киев, 1991), II Россия-Израиль симпозиуме "Пептиды и*белки" (Москва, 1992), IX Международном конгрессе по вирусологии (Глазго, Шотландия, 1993)

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 48 работ, включая 2 авторских свидетельства СССР,

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение в 5 главах), заключения, выводов, списка цитированной литератур», приложения.

Работа изложена на 275 страницах машинописного текста,.

вклк-:ает 53 рисунка , 16 таблиц. Список цитированной литературы включает 355 источников.

Отдельные фрагменты работы выполнены при участии Д.П.Грамы (Институт микробиологии и вирусологии АН Украины) - наработка вирусов; Л.Ярвекюльг (Институт химической и биологической физики АН Зстонии) - помощь.при проведении радиоиммуноанализа-и фдюорс-иммуноанализа временного разрешения; Э.М.Кавуна (Институт биохимии АН Украины) - получение МКА к КГ и иммуноанализ синтетических пептидов ФГА; Л.А.Баратовой (МГУ), А.В.Шишкова (Институт химической физики, Москва), А.В.Ефимова (Институт бежа, Нущино) -мечение тритием капсидного бежа pyx и расчет его третичной структуры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись: средневирулентный штамм рух, русский штамм pvm, три штамма pvy, коклюшный токсин и филаментозшй гемагглютинин из штаммов К75 и Ж305 В. pertussis.

Моноклональные антитела к изучаемым вирусам были получены из Института химической и биологической физики АН Зстонии. МКА к коклюшному токсину нарабатывались в отделе молекулярной иммунологии Института биохимии им. А.В.Палладина АН Украины.

Пептиды из si субъединивд КГ, пептид из ФГА и пептзд из капсидного белка PVY были синтезированы в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова АН России Е.Макаровым и В.Абакумовым. Пептид последовательности 11-17 субъединицы S1 КГ и пептид ipdgdff из капсидного белка PVX были синтезированы в Институте биоорганической химии АН Украины А.Дыбенко и А. Гершковичем. Сорбент фонил-сефароза был получен А.Терентьевым в Институте молекулярной биологии и генетики АН Украины.

Эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

При выполнении диссертации использовали следующие (основные) методы исследования:

- анализ белков и пептидов электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсуфата натрия (baemmll, 1970; Swank и Munkers, 1971);

- иммуноэлектроблоттинг (Totfbin et al. 1979);

- различите модификации твердофазного иммунофермептного анализо в полистироловых планшетах;

- радиоиммунологичесюй ans.ras, в котором рескцц» ентхгек- антитело определяли количественно при помощи связывания белка А меченого изотопом

•• флуоротмуноаналкз временного разрешав с применением антител конъагированкцх хелатсм европия (siaio'arv et al. 1988):

- расщепление белков бромцианом (Steers, 1965), трипсином (Descalzi-Cancedda, 1984), протеиназой V8 из St. aureus (Aitken, 1984);

- определение аминокислотной последовательности белков и пептидов в "ручном" и автоматическом вариантах;

- фракционирование белков и пег.тидоз гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, высокоэффективной жидкостной хроматографией в обращеннсГ; фазе ;

- модификацию остатков лизина цитраяоновим ангидридом (Hospatta-kîcar, 1S84 ) ;

- гт'унсгда-гнную хроматографию с применением ВгСК-агарозы;

- получение конъюгатов пептид-белок с помощью различных бифункциональных реагентов;

- расчет профилей гидрофилыюсти (Норр, 1985), акрофильности (Норр к Y/cods, 1981), гидропатии (Kyte и Bcolittle, 1982) белков

- расчет вторичной структуры белков (Chou и Pasman, 1974; Lim, 1974);

.- компьютерный анализ структурно-функциональных особенностей исследуемых белков по их аминокислотным последовательностям (программы PC Gone и Gencbee).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ' КАПСИДНОГО БЕЛКА PVX Для определения гомогенности капсидного белка pvx, выделенного соловым методом (LiCl) проводили электрофорез в ПААГ с ДСН и К-концевой анализ.

Анализ капсидного белка PYX показал наличие одной полосы, соответствующей белку с М.м. 27 кДа. Молекулярная масса белка, расчиташтя по первичной структуро его гепа, составляет 25 кДа ( Морозов и др., 1983 ). Известно, что белок PYX при проведении электрофореза в денатурирующих условиях ведет себя аномально. Такое поведение белка связано с большим содержанием остатков со-

рина и треошша в N-копцевом участке, что приводит к меньшему связыванию с ДСН и определению завышенного значения М.м. бежа.

N-концевой анализ, проведенный дансилхлоридным методом, показал отсутствие свободной a-аминогруппы в исследуемом белке.

Тагам образом с помощью электрофореза и N-концевого анализа было показано, что выделенный белок является гомогенным и пригоден для структурно-функциональных исследований.

С целью локализации антигенных детерминант в кагхсидном белке PVX его расщепляли бромцианом.

Аминокислотная последовательность капсидного белка PVX представлена на рисунке 1. Как видно из рисунка, белок PVX содержит всего семь остатков метионина и, такта образом, в результате расщепления его бромцианом можно получить ограниченное число крупных фрагментов, что крайне ва:кно для локализации в них антигенных детерминант. Кроме того бромциан обладает высокой селективностью и расщепляет только пептидную связь Met-X, поэтому первоначально для гидролиза белка бил выбран именно этот реагент После расщепления бромцианом в смеси полученных фрагментов дансилхлоридным методом были идентифицированы следующие и-конце-вые аминокислотные остатки:

Leu, Ile, Ala, Asp, Lys И Pro, что соответствовало последовательностям Met-X первичной структуры гена кёпсидного белка PVX (рис. 1).

смесь бромциакоЕых фрагментов фракционировали на сефздексе G-50 в 20% уксусной кислоте (рис.2). В результате гель-фильтрации были получены четыре фракции пептидной природы, в которых дансилхлоридным методом были определены следующие к-концевые аминокислотные остатки:

I фракция - Asp, Leu, Ile;

II фракция - Ala, Leu, Ile;

III фракция - Pro; . IV фракция - Lys.

"Непрямой" иммуноферментный анализ показал, что только

фракция I дает специфическую реакцию с ПКА и МКА, и, следовательно, содержит антигенные детерминанты нативного белка. Так как наша цель - изучение антигенной структуры белка оболочки PVX, в дальнейшем мы исследовали именно эту фракцию. Для дальнейшей очистки фракцию I хроматографировзли на ионообменникв

ю т!го зо

ЗАРАЗТТаАТОЗТ'ТБТТ ТШТ АСАТРАТАЭС

-ВгСН-1-—-

-У8-1-

40 т1 50 У81 60

Ь Р Т П И О I Г Р г Т А И А V Т А Б О А V А Т Н Е Б Ь 3 Е

-ВгСЯ-1-

-У8-1--

У81 ч'вгСИ 1 70 ВгСМ! 80 т! 90

1ЕАУТК0МКУР1А1МАААА1!ВЬТЙНСАВТ0

-ВгСН-1--

,-.-У8-2-:-:-

,ВгСЛ

Ув1 1 100 110 120

ЗБАОТЕМОЮРУБМа 15КАНЬААА1КЕУС

-У8-2-

ВгСл! 130 Вг(ж1 140 "" 150

ПйаРсмктАРТуинймивнвррАН^дАо

160 170 Вгсг4 180

СРКРЕНКРААРВРРИ0УТНРАА1МРКВ0Ы

Вгсы1 190 200 210 КРРБЕАЕМЫААОГААРУ. К1ТКАВА08НБРА --ВгСЫ-2-

220 230 236 ВЬВААУ1ЙС111Т01Т1АЕА7У!1ЬРРР -ВгСЛ-2-:-

Рис. 1 Аминокислотная последовательность капсидаого белка ХВК ( Морозов и др., 1983 ) Стрелками показаны атакуемые бромвданом, трипсином (Т) и проте-азой из аигеиз (У8) пептидные связи. Прямыми линиями отмечены выделенные пептиды. В рамке остаток лизина, входящий б антигенную детерминанту. .

Рис. 2 Фракционирование фрагментов о роданового расаешю-ния капсидного Сежа РУХ на сефадексе С-50 в 2055 СНдСООН

Колонка 2,8x45 см, скорость элюции 30 мл/ч, объем фракции - 3 мл

Рис. 3 Хроматография фракции I ( рис. 2 ) на колонке с

БЕАЕ-Тоуореаг1-650 Колонка 1,6x12 см. Линейный градиент (—) 0,01-0,5 моль га^йСО-рН 9,0. Объем фракции 3 мл. 1 - оптическая плотность при 220 нм, 2 - оптическая плотность при 280 им

БЕАЕ-Тоуореаг1-650 (рис. 3.). В результате хроматографического разделения были получены две фракции содержащие пептидный материал в гомогенном состоянии. Во фракции А в качестве я-концевой 'была идентифицирована аспэрагиновая кислота, а во фракции Б не обнаружено свободной а-гп^-группы. Исходя из данных о нуклеотид-ной последовательности гена капсидного белка РУХ, С-концевой бромцианоБый фрагмент должен иметь н-кокцевую аспарагиновую кислоту. Таким образом, фракция А, погвидимому, содержит С-концевой бромциановый фрагмент белка оболочки РУХ, а фракция Б, с учетом данных об отсутствии свободной а-гш2-группы в белке, соответствует к-концевому фрагменту (ВгСИ-1). Определение аминокислотного состава подтвердило правильность этого предположения. Фракция В - негомогенна и в дальнейшем не исследовалась.

Смесь бромциановых фрагментов и отдельных фракций и пептидов, полученных после разделения анализировали электрофорезом в ПААГ с ДСН (рис.4).

' а 5 3 г д е.

Рис. 4. Электрофорез в ПААГ с ДСН и иммуноблоттинг капсидного белка РУХ и его бромционових фрагментов а - копсидный белок РУХ; . О - смесь бромциановых фрагментов; в - фракция I ( рис. 2 ); г - фракция А ( рис. 3 ); д - Фракция Б ( рис. 3 ): е - иммуноблоттинг смсси бромциановых Фрагментов и капсидного' болка РУХ.

Как видно из рисунка фракция I содержит, в основном, два крупных фрагмента М.м. около 7 и 5 кДа, соответственно. Это также свидетельствует о том, что указанная фракция содержит и- и 0-концевые крупные фрагменты. Данные, представленные на рисунке 4 (гид), свидетельствуют также о том, что в результате ионообменной хроматографии были получены два гомогенных бромциановых пептида (Вгск-1 и Вгсгг-2).

Результаты иммунохимического анализа РУХ, его белка оболочки, л- и С-концевых фрагментов методом "непрямого" ИФА с ПКА и с МКА 21ХВ4, 21X02 и 23ХА5 представлены в таблице 1. Как видно из приведенных данных, Н-концевой бромциановый фрагмент содержит антигенную детерминанту ( детерминанты ). Все три МКА взаимодействуют с РУХ и его капсидным белком. Более того, МКА 21X1)2 и 23ХА5 специфически взаимодействуют также с и-концевым бромциановым фрагментом и со смесью л- и С-концевых фрагментов. МКА 21ХВ4 узнает белок оболочки РУХ, но не дает специфической реакции со смесью бромциановых фрагментов. Возможно, что антигенная детерминанта узнаваемая МКА 21ХВ4 локализована на расщепленном участке капсидного белка.

Результаты "непрямого" радиоиммуноанализа подтверждают тот факт, что м-концевой бромциановый фрагмент капсидного белка РУХ узнается МКА 21X02 ( Табл. 2 ). Таким образом, можно утверждать, что один или два эпитопа, узнаваемые этими МКА. локализованы в Л-концевом участке капсидного белка РУХ. Необходимо отметить, С- концевой бромциановый фрагмент также взаимодействует с ПКА, но слабее чем Ы-концевой фрагмент.

Для локализации антигенных детерминант мы применяли также иммуноэлектроблоттинг, в котором были использованы только МКА 21ХБ2. Согласно данным иммуноблоттинга (рис. 4,в) три полосы с электрофоретической подвижностью 27,0, 7,0 и 6,5 кДа дали реакцию с антителами. Известно, что помимо интактного белка только Л-концевой.бромциановый фрагмент ( 68 аминокислотных остатков ) может находиться в этой зоне. Второй по величине, С-концевой бромциановый фрагмент ( 48 аминокислотных остатков ) обладает большей подвижностью (рис. 4.5,г). При иммуноблоттинге гомогенного И-концевого бромцианового фрагмента с МКА наблюдается специфическое окрашивание (рис. 4,е). Однако, в ряде случаев при проведении электрофореза Вгси-1 давал две или три полосы. Наличие

Таблица 1

Сравнение антигенной 'активности РУХ, капсидного белка РУХ, и- и С-концевых бромцианових фрагментов кансидного белка методом ИФА

Антиген

Антитело

рух Белок Смесь К- и С-оболочки концевых Фрагментов • ы-кон— цевой фрагмент С-коя- цевой фрагмент

21ХВ4 21X1)2 . 23ХА5 ПКА оооо | «о-зсло! -зсл^со 1 1 0,33 0,46 0,45 0,79 _+ 0.35 0,36 0,69 _+ 0,42 0,42 0,75 _+ оТю 0,21 0,41

Результаты представлены в единицах поглощения при длине волны 414 нм. '"'Взаимодействие МКА 21ХВ4 с М- и С-концевыми фрагментами белка оболочки РУХ не являлось специфическим (наблюдалась лишь высокая фоновая реакция, 0,2 ед. оптической плотности, при разных концентрациях антигена ), поэтому цифровые значения этих данных в таблице не приведены.

Таблица 2

Сравнение антигенной активности РУХ, капсидного бе'лка РУХ, Н- и С-концевых бромциановых фрагментов капсидного белка методом радиоиммуноанализа

Антиген

Антитело

РУХ Белок Смесь и- и С-оболочки концевых фрагментов • К- концевой Фрагмент С-кон-цевой фрагмент

21X02 23ХА5 ПКА 3199 3356 4820 699 433 1106 304 1897 454 647 863 1254 252 139 392

Реакцию взаимодействия антиген - антитело определяли количественно при помощи 1251 белка А. В лунки плат вносили по 3,75 нюори (8000 имп/мин) меченного иодом белка А. Результаты радиоиммуно-энализа представлеш в имп/мин с вычитанием фонового значения ( 550 имп/мин ), полученного при взаимодействии исследуемых АТ к РУХ с серологически не родственным вирусом - ВТМ.

двух или более полос связано с обработкой материала перед нанесе нием на гель, а тагам с условиями проведения электрофреза, так, при использовании концентрирующего геля било отмечено более одной полосы. Необычное поведение N-концевого фрагмента при электрофорезе можно объяснить аномальным связыванием с ДСН за счет присутствия в этом участке большого числа остатков серина и треонина, что отмечалось выше. Не.исключено , что аномальная подвижность белка и фрагмента Егсм-1 связана с различной степенью гликозилирования.

Данные, полученные "непрямым" ИФА и кммуноблоттглгсм с применением ПКА и МКА, свидетельствуют о наличии в и-концсвом участке белка оболочки PYX по крайней мере одного эпитопа. Этот участок содержит большое число гидрофильных аминокислотных остатков. Известно, что антигенные детерминанты белков очень часто содержат именно гидрофильные остатки [ Lerner, 1981 ].

N-концевой бромциановый фрагмент ( ВгСи-1 ) содержит два остатка лизина в позицях 19 и 66 и остаток аргинина в лозшш 44 ( рис. 1 ). С целью получения пептидов, возможно Еключакщкх антигенные детерминанты, фрагмент расщепляли трипсином. Однако, при анализе смеси триптических петидов дот- Олоттингом и ИФА ( Табл. 3 ) с помощью МКА на было отмечено положительной реакции. Это свидетельствовало о том, что остатки лизина или аргинина входят в антигенную детерминнэнту или-детерминанты, для которых специфичны используемые антитела.' Для доказательства важности участия остзтков лизина во фрагменте BrCN-1 при взаимодействии с МКА проводили его модификацию цитраконовым ангидридом. Известно, что цитраконовый ангидрид модифицирует а-ш2-груп1ш лизина и остаток приобретает отрицательный заряд. Цитраконилированный пептид не давал специфической реакции с МКА ( Табл. 3 ), однако, при снятии цитраконовой защиты была отмечена полсгмтельнзя реакция. Полученные результаты свидетельствовали о том, что в антигенную детерминанту или детерминанты, взаимодействующие с обоими МКА входит остаток лизина. •*'

Так как фрагмент BrCN-1 содержит два остатка лизина, необходимо было ■установить, какой из этих остатков специфичен для МКА 21XD2, а какой для 23ХА6, или оба МКА специфичны для одного и того же остатка лизина. С этой целью капсидный оелок PVX расщепляли протвазой V8 из St. aureus. В результате расщепления протеазой V8 можно было ожидать получения двух крупных фраг-

Таблица 3

Сравнение антигенной активности белка оболочки рух и его фрагментов методом "непрямого" ИФА

Антитело " МКА АНТИГЕН

Белок болоч-ки Триптичес-кий гидро-лизат ВгСМ-1 Фрагмент Модкфи-ВгСМ-1 цирован- Шй ВгС:чт-1 Пептид У8-1 Пептид У8-2 ВТМ

21X02 23ХА5 0,47 0,46 0.04 0,04 0,43 0,05 0,44 0,06 0,52 0,50 0,04 0,03 0,02 0,03

Результаты представлены в единицах поглощения при длине волны 414 нм. В качестве контроля использовался белок оболочки ВТМ.

ментов, включающих остатки 1-Б6 и 64-96 (рис. 1). Первый из этих фрагментов содержит остаток лизина в позиции 19, з второй - в позиции €6 последовательности белка оболочки РУХ .

Продукт расщепления белка протеазой У8, фракционировали ВЭКХ в обращенной фазе ( рис 5 ) и полученные фракции анализировали "непрямым" методом ИФА. Из всех пептидных фракций, представленных на рисунке, только материал фракции 15 взаимодействовал с обоими МКА.

к-концевым анализом не было обнаружено свободной а-амино-грушш в материале данное фракции. Анализируя вышеизложенное, а также данные по аминокислотному составу полученного фрагмента, можно утверждать, что фракция 16. представляет собой гомогенный к-концевой пептид ( У8 - 1 ) белка оболочки РУХ, включающий 56 аминокислотных остатков. Результаты иммуноанализа этого пептида представлены в таблице 3. Пептид У8-2 не взаимодействует ни с одним из используемых МКА ( табл. 3 ), следовательно.: не входит в состав соответствущих детерминант. ,

Таким образом, МКА 21X02 и 23ХА5 взаимодействуют с участком полипотгшшоп цепи . капсидного белка РУХ, включающим остаток лизина в позиции 19. Можно предположить, что:

161.Т»

10 ю ыгп

Рис. 5 Разделею10 пептидов, полученных в результате гидролиза капсидного белка РУХ протеазой У8 из Б1.аигеиз с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе Состав подвижной фазы: А - 355 изопропиловый спирт, 0,1$ ТФУ, 0.1Ж и-этилморфолин; В - 60* изопропиловий сшфт, 0,1% ТФУ, 0,1$ м-этилморфолин. ( — ) - изменение концентрации буфера В.

а) этим МКА соответствует одна общая детерминанта;

б) имеются две перекрывающиеся антигенные детерминанты входит один и тот же остаток лизина.

По-видимому, для взаимодействия с МКА заряда на остатке лизина существенно числа гидроксиаминокислотных остатков

в которые

гидроксиаминокислотных

-Б-Т-Т-Т-К-Т-А-С-А-Т-,

помимо положительного также наличие большого в последовательности

которые могут образовывать водородные связи в активном центре антител.

С целью подтверждения результатов, полученных при иммуно-анализе природных фрагментов капсидного белка РУХ были синтезированы три пептида, включающие остаток лизина в позиции 19: 1КТА0 (П-5) ТТТКТАО (П-7) ТБТТТКТАО 01-9)

Синтез пептидов мы начинали с С-концового цистоина вместо глицина позиции 22 аминокислотной последовательности капсидного Сежа рта (рис. 1) для возмохмости присоединения синтезированных пептидов через БК-груипу цистеина к белку носителю с учетом того, что боковые радикалы остатков глицина обычно вносят незначительный вклад во взаимодействие энитоп-паратоп. Одним из наиболее широко применяемых в настоящее время реагентов для присоединения пептидов к белкам-носитолям является малеинкмидобензоил-н-гидр0ксисукц1ши1.шдный эфир (МБС), используя который мы получили конъюгат БСА--П9.

На следующем этапе нами был проведен анализ пептидов П-5, П-7, П-9 и конъюгата БСА-П-9 ' методом иммунофлюороанализа временного разрешения. Из таблицы 4 следует, что пептида П-5, П-7 и П-9 не взаимодействуют с МКА 21XD2, а МКА 23ХА5 реагирует только с пептидом П-9. Реакция антител с конъюгатом БСА--П-9 отсутствует. Это можно объяснить тем, что в процессе конъюгации конформация пептида претерпела изменения по сравнению с конфор-мацией интактного пептида. Не исключено также, что во время конъюгации была экранирована а-ш2-группа лизина, который, как ранее было показано, играет важную роль во взаимодействии с антителами. Результаты иммуноанализа свидетельствовали о том, что для взаимодействия МКА 23ХА5 с синтезированными пептидами значительную роль играет длина пептида. Пептид П-9 имеет на два и-кощввых остатка (Thr-Ser) больше, чем пептид П-7, оксигруоты которых, возможно, уча ствуют в образовании дополнительных водородных связей с паратопом ЫКА 23ХА5.

Таким образом, иммунохимический анализ синтетического пептида П-9 подтвердил данные об участии остатка лизина в позиции 19 аминокислотной последовательности капсидного белка PYX в формировании антигенной детерминанты, взаимодействующей с МКА, а также показал, что данный N-концевой участок экспонирован на поверхности вириона.

1.1. Тритиевая планиграфия FVX и моделирование трехмерной структуры капсидного белка pyx.

Этот раздел работы выполнен совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского МГУ, Института химической физики и Института белка АН России и посвящен определению топограф;ш капсидного Солка PVX в

Таблица 4

Антигенная активность (имп/сек) пептидов П-5, П-7, П-9 и конъюгата БСА—П9 в методе иммунофлуороанализа временного разрешения с моноклональными антителами к PVX

Моноклональныэ антитела

Антиген 23ХА5 21ВД2

Инкубация антигена

с МКА без МКА с МКА без МКА

П-5 2351 2144 1979 1849

П-7 2095 2093 1909 1734

П-9 35589 10740 5082 4675

БСА—П-9 2161 2239 3075 2836

Белок PVX 20099 2498 22566 2236

Буфер 2131 2390 2276 1898

вирусной частице с помощью термически активированных атомов трития. На основании этих результатов, данных по топографии капсвд-ного белка PYX о помощью МКА, теоретических расчетов вторичной и третичной структуры белка мы предлагаем модель структурной организации субъединицы капсидного белка в вирионе ?vx.

Капсидный белок PVX может частично расщепляться протеазами сока растений и трипсином в N-концевой области и, иногда в С-кон-цевой области, что показано на ряде вирусных препаратах. Экспериментально установлено , что интактная форма капсидного бежа (Бм форма, медленнее движется при электрофорезе) расщепляется до продукта, который быстрей движется при электрофорезе (Бб форма). Форма Бб характеризуется отсутствием 19 - 25 аминокислотных остатков в N-концевой области. Аминокислотный анализ, N-кощевое секвенированйе и сравнение триптических пептидов ВЭЖХ в обращенной фазе Бм и Бб форм показало, что Бб форма капсидного белка PVX короче на 19.и 21 остаток по сравнению Бм формой.

Ранее (Шишков с соавт. 1976) было показано, что при бомбардировке в вакууме горячими атомами трития пептидов и белков, происходит замощение водорода в С—Н-связях на тритий с образованием меченой материнской молекулы, причем вероятность реакции зависит как от химической природа остатка, так и от его

расположения в пространственной структуре. Малая величина пробега реакционноспособных атомов трития в конденсированной фазе (2-о

'ЗА) обусловливает локализацию радиоактивной метки прекмуществен-'но в тонких поверхностных слоях мкшенк, что позволяет на основании данных о распределешш трития получать сведения о пространственной структуре белков, а также о топографии белковых и нук-леопротеидакх комплексов.

Бомбардировка двух типов вирусных частиц pvx (содержащих Бм и Бб формы капсидного белка ) термически активированными атомами трития и определения профиля доступности аминокислотных остатков в капсидаом белке для тритиевой метки позволило нам сравнить топографию поверхности экое, двух препаратов.

Для анализа внутримолекулярного распределения тритиевой метки в капекдном белке pvx мы использовали фрагментацию меченого тритием бежа трипсином с последующим аминокислотным анализом гомогенных пептидов и одновременным измерением радиоактивности каждого типа аминокислотного остатка. Для анализа капсидного белка pvx гидролиз трипсином с последующим разделением пептидов ВЗЖХ, по-видимому, является оптималышм подходом. Мы думаем, что фрагментация белка на 18 пептидов (рис. 6) явилась успешной для сравнения основных различий в доступности тритиевой метки для двух типов частиц pvx. Из рисунка 6 очевидно, что профили доступности для тритиевой метки частиц pvx, содержании Бм и Бб формы белков значительно отличаются. Пептиды И, Т2,- ТЗ и Т4 содержат 85% всей тритиевой метки интэктного белка - Бм форма (рис 6. А ). Интересно, что за исключением первых.19 или 21 аминокислотных осатков (Т1) доступность аминокислотных остатков С-конце-вой области формы Бб для тритиевой мотки значительно увеличивается (рис. 6, В). Пептида от Т9 до Т18 содержат около 13.6% общего количества тритиевой метки Бб формы капсидпого белка и около 44.7% в случае Бм формы капсидного белка. С-концевой пептид-Т18 Бб форш капсидного белка содержит 13.5$ общей радиоактивности Бб белка, тогда как идентичный пептид Т18 в интактной Бм форме капсидного бежа содержит только 1.6% тритиевой метки. Таким образом, данные по бомбардировке тритием иитоктных вирусных частиц показали, что С-концевой участок капсидного белка pvx спрятан в вирусной частице. Однако удаление первых 19 или 21 аминокислотных остатков М-кошевой.области капсидного белка (фор ма Бб) приводит к конформацшпшм изменениям капешшого.белка и

Л <

о

1 ^ * ¡о

о я

а.

' СО I

о.

mi i iLil lit > It .и. JH.I ,11_JL

Ii

lili

Iii

номер остатка

20 W 80 НО 149 179 209 гм

II

Hill

II

TJ П П Ч 111

Т4 И Т» по

TU Til TIT TIÍ TM TU TU

Рис. 6. Тритиевая плшшграфия PYX, содержащего две формы иапсидного белка А - Бм форма белка, Б - Бб форма белкаs Т-1 - Т18 триптические

пептида , (

<а-а угол

) область а-спиралей, с*-***) область р-структури РНК интерьер

Рис. 7. Схематическое изображение укладки полипептнд-ной цепи капсидного белка PVX а-спирали представлены цилиндрами. р-складки представлены стрелами} н и о - к- и о-концевые участки полипбшвдной цепи. Пронумерованы некоторые позиции v аминокислотных остатков

экстерьер

делает доступным С-концевые остатки для тритиовой метки. Данные по бомбардировке горячим тритием подтвердили результаты по иммунохимическому анализу'Капсидного бежа pvx, свидетельствующие о поверхностном расположении N-концевого-участка бежа в вирусной частице. Кроме того, тритиевая планиграфия показала, что С-концввой участок не экспонирован на поверхности интактных частиц pyx и открывается только после удаления N-концевого участка.

Для моделирования трехмерной структуры капсидного бежа PVX мы использовали метод Лима (1974) по предсказании элементоз Бторичной структуры белков. На ■ основании элементов вторичной структуры моделировали компактную структуру , учитывая принципы упаковки а-спиралей и р-структур в глобулярных белках, предложенные Ефимовым (1977,1984)', а также наши экспериментальные данные по топографии капсидного бежа PVX. На рисунке 7 представлена модель третичной структуры капсидного бежа. Эта модель предполагает отщепление растительными протеазами первой (3-склад-ки с удалением 35 N-концевых аминокислотных остатков. Тем не ме- • нее в наших экспериментах (рис. 6), только 19 иди 21 N-концевой аминокислотный остаток удалялись протеазами. Данные по бомбардировке горячим тритием четко свидетельствуют о том, что около 35 N-кслцеьых аминокислотных остатков метятся (рис. 6). Простым объяснением этого несоответствия является то, что при отщеплении растительными протеазами N-концевой (3-складки могут возникать стерические препятствия, тогда как очень маленькие атомы трития способны проникать и метить этот участок. Предсказанная молекулярная модель капсидного бежа в PVX (рис. 7-) соответствует экспериментальным данным, полученным иммунохимическим анализом и тритиевой планиграфией.

2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ КАИСИДНЫХ БЕЛКОВ ШТАММОВ PYY И КАПСИДНОГО БЕЛКА PVM

Основным представителем вирусов потигруппы является PVY. В 1986 году была установлена первичная структура капсидного бежа одного из штаммов PVY, включающая 267 аминокислотных остатков (Shulila et al., 1986).

Наши исследования были проведены на трех штаммах PVY» PVY-0 (.обычный - отличается суровыми симптомами на картофеле ), PVY-H (/некротический - вызывает суровый некроз жилок табака ) и iVY-0 :

[ отличается от остальных штаммов отсутствием передачи характерном вектором pvy - Myzus peraicae Sulz ). Белки указанных штам-иов анализировали электрофорезом в ПААГ с ДСН. Результаты пред-зтавлены на рисунке 8. Анализ электрофореграммы свидетельствует > частичном расщеплении капсидных белков в процессе выделения ?ирусов. Помимо основной мажорной полосы с М.м. 32 кДа, соответ-зтвующей М.м. интактного кзпсидного бежа, присутствует несколько полос с более низким значением М.м. Часть препаратов капсид-$ого белка pyy-C проявлялась в виде .двух белковых полос в экви-лолярном соотношении, одна из них находилась на уровне интактного белка (рис.8,3). Для капсидных белков pvy-О и pyy-H была от-лечена тенденция к расщеплению на два белковых компонента (рис8, L-2). Эти данные свидетельствуют о штаммовых различиях первичных структур капсидных белков pyy.

Рис. 8, Электрофорез в ПААГ с ДСН капсидных белков трех штаммов PYY:

1 - PVY-0, 2 - PVY-H, 3 - PVY-C, 4 - белки маркеры: фосфорилаза (94 кДа), БСА (67 кДа), овальбумин (43 кДа, карбангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа

С целью сравнения антигенных свойств штаммов руу-о, руу-Н и РУУ-С был проведен иммуноблоттинг о ПКА и МКА. Для анализа использовали три ПКА, полученные к каждому из исследуемых атаммов. Все белковые полосы РУУ-О и РУУ-С в равной степени реагировали со всеми антителами (рис.9.). Как видно из рис.9-<5,д,з интактный капсидный белок руу-Н в иммуноблоттинге реагировал о ПКА. полученными к каздому из,трех аташов, тогда как белковая полоса с М.м, приблизительно 30 кЯа.не давала реакции ни с одним из Ш, в том числе полученным к Ртг-Н (рис. Это, по-вши-

нему, указывает на отсутствие в данном белкоиом компоненте им-мунодоминантних областей. Отметим, что высокоактивная иммунодо-минантная область во всех белках исследуемых штаммов выявлялась при иммуноблоттинге в зоне 'полипептидов М.м. 12-14 кДа и имела высокую степень антигенного родства с антителами. Мы предполагаем, что это полипептиды, представляющиеи С-концевые фрагменты капещшх белков со штаммоспецифичпыми эпитопами. Эти дашше соответствуют результатам, получешшм для других потивирусов (Б1гик1а ег а!., 1988).

б в г д е я: з А Б В

Рис. 9 Иммуноблоттинг капшщшх белков штаммов рту о поли-клоналышми антитела: А - 11КА к руу-0; Б - ПКА к руу-н; В - ПКА к руу-с; а,г,Ж - бОЛОК руу-о; о,д,з -белок руу-Н: в,е,и - белок руу-С

Результаты с использованием в иммуноблоттинге МКА У306 и у4в1 подтвердили дашше с ПКА, но в этом эксперименте не было отмечено реакций с полипептидами небольшой М.м, Это говорит о направленности применяемых МКА на общие эпитопы коровой, более устойчивой части капсидных белков штаммов руу.

Ограниченный протеолиз трипсином потивирусов отщепляет и- и С-концевые участки и оставляет трипсиноустойчивую (коровую) часть капсидного белка с группоспецифичными эпигонами (8Ь\Л1а ег ■а\, 1983).- С целью локализации поверхностных эпитопов в РУУ-Н

вирус подвергая! ограниченному про те о ли зу трипсином.

После проведения протеслиза корозые вирусные частицы удаляли ультрацентрифугированием при 142000 g, а супернатант анализировали ВЭЖХ в обращенной фазе ( рис.10. ). Полученные фракции лиофилизировали и детектировали методом флуороанализа. временного разрешения с использованием МКА УЗС6 и У20, получешшм к руу-Н.

/Мое ■■. 0.6

<Н

6.1

3 :

и

чз

Рис.

4P ьо ммн

10. Разделение пептидов, полученных в результате ограниченного протеолиза трипсином rvY-H с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. Солонка сю (218 тр, 5 мкм, 4,6x260 мм, zorb^x cds), соединенная : Du pont 8300 прьс-системой. Элюирование в лшейпом градиенте )-75% ацетонитрила.в 0,1%-ном растворе тфув точение 30 мин. при :корости 1 мл/м1ш. Детектирование при длине волны 220 км.

МКА У20 реагировало только с интактными капещщкми белками наймов РУУ, но не взаимодействовало с другими потивирусами, а •акже с деградированными капсидными белками у которых отсутство-1али Я- и (или) С-концевые участки. Мы заключили, что МКА У20 знаот вирусспецифический эпитоп в капсидаом белке РУУ.

■ Из 18 триптических пептидов полученных при проведении ВЭЖХ рис.10.), только пептид 17 давал сильную реакцию'с МКА ГЗС6. ¡ила определена аминокислотная последовательность этого пептида: УАРБРУЕУТЗК

Эта последовательность соответствует позиции 198-203 полппептид-ной цепи исследуемого капсидного белка. Гомологичная последовательность имеется.еще в 17 капсидных белках вирусов потигруппы хвким образом эта последовательность является группослецифичным эпитопом, экспонированным на. поверхности вкрионов потивирусоз. Эти результаты нашли подтверждение при постановке иммуноблоттин-га с тремя штаммам pvy и еще с семью представителями вирусов потигруппы с ПКА к pvy-H. Была отмечена реакция всех капсидных белков, хотя и разной степени интенсивности.

В литературе есть информация о структуре генома и сравнешш капсидных белков некоторых представителей вирусов карлагруппы, однако нет данных по изучению антигенной структуры капсидных белков этих вирусов.

Капсщцшй белок рте, Еыделенный из русского штамма вируса анализировали электрофорезом в ПААГ с ДСН. В результате электрофореза на геле была обнаружена одна полоса М.м. около 36 кДа.

Для локализации антигенных детерминант в капсидном белке рте, последний гидролизовали трипсином и продукт гидролиза под-вергади ВЗЖХ в обращенной фазе (рис. . 11.). Для иммунсхимического анализа капсидного. белка и тркдтических пептидов использовали два МКА: M6D5 и М4С1, получешшх к целым вирусным частицам. МКА М4С1 не взаимодействовало ни с одним из трилтических пептидов. МКА U6D5 взаимодействовало только с фракцией л' 15 (рис.11.) при применении флуороиммуноанализа временного разрешения (табл. 5.).

Определение аминокислотной последовательности этой фракции показало, что она представляет собой тетродекапептид:

earplptaadfegk (т-15) Зта последовательность занимает позицию 21-34 полипептидной цепи капсидного белка рте.

Таким образом иммунохимический анализ пептида Т-15. показал, что и-концовой участок капсидного белка рта экспонирован на поверхности вириона и представляет собой иммунодоминантную область. Выше мы показали, что л-концевая область капсидного белка pyx также экспонировала на поверхности вируса. В литературе отмечалось значительное подобие в геномной организации, и аминокислотной последовательности капсидных белков различных вирусов карла-и потекох^упп. Результаты по иммунохимическому анализу' капсидного белка рта, представленное наш, подтверждают общность молекулярной организации вирусов потеке- и карлагрупп.

I

¿* ъ

4«

5 »

-о

~~О То 20 30 АО 50 60

Рис. 11. Разделение пептидов, полученных в результате гидролиза трипсином капсиднсго белка РУМ о помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. Колонка ЫСЛгговогЪ ЕР-18 (5 ыкм, 4,6x250мм), соединенная с РЬаг-тао!а-ькв нрьс-системой. Элюирование в линейном градиенте 2-50» ацетоиитрила в 0,1* растворе ТФУ в течение 60 мин при скорости 1.0 мл/ют. Детектирование при 206 нм.

Таблица 5

Антигенная активность РУМ, капсидного белка РУМ и его триптического пептида Т-15 в методе флуороиммуноанализа временного разрешения с применением МКА. Значения даны в имп/сек.-

Антиген Моноклональные антитела

М6Б5 М4С1

МКА* МКА- МКА+ МКА-

РУМ 109908 2453 27944 250Э

капищшй белок рта 77910 5686 21495 2087

пептид Т-15 31687 2126 6308 1897

РАМУ 1819 1800 1544 1418

мка)- антигены инкубировали с мка, мка- антигены инкубировали без мка, раму - вирус аукуба мозаики картофеля

3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ИММУН0Х12Л11ЧЕСКМЙ АНАЛИЗ КОКЛЮШНОГО ТОКСИНА

3.1. Получение и очистка коклюшного токсина.

Выделение коклюшного токскнз из надосадочной жидкости среды культивирования Bordstolla pertU33io проводили, используя двустадийпый метод очистки, основанный на применении аффинной хроматографии (Sekura et al., 1983). Применяя этот метод удается достигнуть степени очистки КТ в 600-800 раз.

Полученный белок идентифицировали как КТ и оценивали его гомогенность электрофорезом в ПААГ с ДСН (рис. 12.).'

На электрофореграмме (рис. 12.) наблюдается пять белковых полос в диапазоне М.м. от 9 до 28 кДа, что соответствует субъединицам si - S5 КТ. Электрофоретическаи подвижность субъединиц S1, S3 и S5 уменьшается если проба КТ перед нанесением на гель была восстановлена 2-меркаптоэтанолом (рис. 12 - 5, 6, 7), что свидетельствует о наличии в этих субъедшшцах внутрицепочечных дисульфкдних связей.

Ферментативная и биологическая активность полученного наш КТ изучалась в НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Институте биоорга-ническ'й химии им. М.М. Шемякина v. Ю.А. Овчинникова'АН России и Институте химической и биологической физики АН Эстонии.

Цитопатогенное действие КТ на культуру клеток" яичника китайского хомячка определялась в дозах от 63 до 78 мг/мл; лейкоцитозстимулирующее и гистаминсенсибилизирующее действие при Енутрибрюшинном введешш белш.1 мышам соответствовала дозам 0,3 -0,7 мкг; АДФ-рибозилтрансферазная активность варьировала в пределах 55-120 фемтомоль мин-1 мг-1. Полученные результаты свидетельствовали о том, что по своим свойствам полученный нами КТ не уступает аналогичным образцам токсина, которые выпускаются ведущими фирмами мира (например, "Sigma", США).

Совместно с НИИВС им. И.И.Мечникова было проведено изучение уровня продукции коклюшных антигенов (в первую очередь КТ и ФГА) разными штаммами и вариантами штаммов B.pertusals. В результате этих исследований был получен более эффективный серовариант производственного штамма - продуцент КТ.

На основе примененного нами метода выделения КТ совместно с нииво им. И.И.Мечникова был разработан производственный регламент и налажен выпуск коклюшного токсина, как коммерческого пре-

и

67 кДа -45 кДа -

i {

12,3 кДа -

• . .4

I

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 12 Электрофорез в ПААГ с ДСН образцов очищенного КГ. 1 - маркерные белки; 2 - 4 - образцы КГ без воста-: новления; 5-7 восстановленные образцы КГ. Количество белка в каждой пробе - 20 мкг.

Рис. 13 Электрофорез в ПААГ с ДСН А-протомерэ и В-олигомерс КТ. 1 - образец КТ; 2 - А-протомер (субъединица Б1), 3 - В-олигомер.

парата для научных исследований.

Благодаря функциональным особенностям строения КТ его акти-ваторную субъеданицу ( S1, А-протомер ) можно довольно легко отделить от В-олкгомера. Ранее било показано (Burns eí al., 1957), что нуклеотидфосфати значительно облегчают диссоциацию субъединицы S1 от В-олигомера в присутствии мочеЕкны. Мы брали фзтуин-

сефарозу (ФетС) как сорбент для В-олигомера и инкубировали ее в буферном растворе , содержащем 2,1 М мочевины и АТФ в концентрации 100 мкмоль/л. После 15 мин. инкубации этой суспензии при комнатной температуре отделяв раствор, который содержал А-протомер от ФетС путем центрифугирования. После злшрования В-оли-гомера с ФетС растворы, которые содержали А-протомер и В-олиго-мер подвергали диализу и лиофильно высуживали. Полученные образцы субъедишш si и В-олигомера анализировали электрофорезом в ПААГ с ДОН. Результаты электрофореза представлеш на рисунке 13. tía рисунке видно, что с помощью предложенного метода удается в значительной степени разделить А-протомер и В-олигомер

Выделение отдельных функциональных частей КТ имеет значение при проведении биохимических, иммунохимических исследований с помощью КГ и структурно-функционального изучения самого КТ. Кроме того, разделение КТ на отдельные субъединицы или функционально различные части тлеет важнее значение при разработке субъединичных вакцин с использованием КТ.

3.2. Выделение двух форм коклюшного токсина из одного производственного штамма В. pertusaía.

Из надосадочного раствора среды культивирования производственного штамма 475 В. репизз1з'; который был получен в НИИВС им. И.И.Мечникова, наш были получены две формы токсина.

После выделения формы КТ по^методу описанному выше, раствор который содержал белки не сорбированные на фетуин-сефарозе, высаживали сульфатом аммония. Форму - выделенную обычной процедурой ми обозначили б-КТ. Белки, высаженные сульфатом аммония, несколько раз экстрагировали из осадка буферным раствором и наносили но колошу, которая была наполнена сорбентом - аналогом фзнил-сефарозы: /)

-ш2-(сн2) -пи- (сн2 )5-с' сн2-<§> Чш7

В результате элюирования с этого сорбента мы получили вторую форму, обозначенную м-КТ. Количество м-КТ составляло приблизительно половину от количества полученного б-КТ.

Сормы КТ отличаются друг от друга разной электрофоретичсс-кой подвижностью субъедшицц S1 при электрофорезе в ПАЛГ с ДСН. Результаты анализа двух форм КТ электрофорезом представлены на рисунке 14. На фотографии геля видно, что субъединица si м-формы КТ двигается медленнее по отношении к 51 б-фюрмы КТ, причем наиболее заметна эта разница в образцах КТ с невосстановленными ди-сульфидными связями. При восстановлении внутрицепочечной -s-s-связи электрофоретическая подвижность субъединицы si м-КТ практически не изменяется, в то время как электрофоретическая подвижность S1 б-КТ значительно уменьшается и почти сравнивается с подвижностью субъединицы S1 м-КТ.

На основании полученных экспериментальных результатов и компьютерного анализа структурно-функциональных особенностей субъединицы S1 КТ, мы предположили, что две различные формы КТ соответствуют двум аминокислотным последовательностям, которые известны по литературным данным для субъединицы SI (Nicosia et al., 1986; Locht и Keith, 1986). Следует отметить, что в обоих

последовательностях в составе si есть только два остатка цистеи-

на , то есть дисульфидная связь может образоваться только между

ешми. Вероятно, форма б-КТ соответствует последовательности,

67 к№ .

45 *д» —•

25 «Дц '

12.3км

12 5 4 5

Рис. 14 Электрофорез в ПААГ с ДСН двух форм КТ.

1 - маркерные белки; 2 - б-КТ без восстановления; 3 -м-КТ без восстановления; 4 - б-КТ, восстановленная 2-меркаптоэтанолом; 5 - м-КТ, •. ■ восстановленная форма.

представленной в работе (Nicosia et al., 1986), поскольку токсин для свои исследований авторы получали путем очистки на фетуин-сефарозе, а взаимное расположение субъединиц при электрофорезе такое ке как у Формы б-КТ. Форма м-КТ, по нашим предположениям, соответствует сиквенсу представленному в работо (Locht и Keith,

1983). Это предположение, с учетом результатов компьютерного анализа сьойств аминокислотных последовательностей субъединицы si, позволяет объяснить разницу в электрофоретической подвижности ее в двух формах КГ. В субъединице Б1 б-КТ может образовывать ся внутрицепочечная дисульфндная связь, что подтверждается результатами электрофореза в ПААГ с ДОН образцов б-КТ без восстановления и восстановленных 2-меркаптоэтанолом. В субъединице S1 м-КТ внутрицепочечная дисульфндная связь, по-видимому, по той или иной причине не образуется, так как ее электрофоретическая подейжность без восстановления почти совпадает с электрофоретической подвижностью субъединицы si б-КГ после восстановления, а также не меняется при восстановлении 2-меркаптоэтанолом. Одной из причин этого может быть ß-поворот полипептидной цепи вблизи Oys 200 (201), который предсказывается компьютерной программой для сик~енса sla, но не для сиквенса S16. Если поворот полипептидной цепи в этом участке действительно происходит, -s-s- связь в м-КТ может не образовываться вследствие стерических препятствий. Не исключено, что различия меаду двумя формами КГ не огра-огракичиваются различиями в структуре активаторной субъединицы, а касаются также и В-олигомера, поскольку формы токсина го разному взаимодействуют с фетуин-сефарозой. Нам удавалось разделять на колонке с ФетС смесь двух форм KT. Хотя, возможно пространственное строение субъединицы S1 с незамкнутой дисульфидаой связью мешает взаимодействию В-олигомера с ФетС.

Две формы KT анализировали иммуноэлектроблоттингом с прим-менением ПКА, Если б-форму КГ брали в восстановленном виде, антитела реагировали с обоими формами токсина подобным образом.

3.3. Иммунохимический анализ коклюшного токсина с помощью поликлональных антител

Способность субъединиц КГ взаимодействовать с ПКА исследовали с помощью иммуноэлектроблоттинга. С антителами реагировали . главным образом первые три субгединады KT: si, S2 и бз,

Результаты реакции с антитела™ невосстановленного КГ показывают, что наиболее интенсивно с АТ реагирует субъединица 52, несколько слабее субъединица 53 и в незначительной степени субъединица 51. При восстановлении внутрицепочечных дисульфиднкх связей токсина картина меняется: способность субьединиц Б2 и 33 распознаваться АТ значительно уменьшается, в то время как субье-диницы 51 наоборот- значительно увеличивается.

Важным результатом этих экспериментов является то, что наибольшей иммуногенностью характеризуются функционально наиболее важные субъединицы - Б1, 52, и 33. Этот факт безусловно необходимо учитывать при разработке субъединичных вакцин против коклюша. Субъедипица 51 функционально активна только после восстановления дисульфядной связи и проявляет ферментативную, активность если -б-б- замкнута. Кроме того известно, что наиболее антигенные сайты субъединицы 81 расположены рядом или дане перекрываются с сайтами, которые отвечают за ферментативную активность этой субъедишщы. С этой точки зрения становится понятным значительное повышение способности активаторной субъедк-ниш КГ взаимодействовать с ПКА при восстановлении дисульфидноП-связи. Субьединицы Б2 и БЗ наоборот выполняют свои функции -связываются с углеводами мембран - в интактном состоянии, то есть с невосстановленными дисульфидными связями. Вполне вероятно, что их нативная конформация отвечает максимальной иммунсгенности и наоборот, при восстановлении -б-б- связей и нарушении конформа-ции способность второй и третьей субъединиц взаимодействовать с антителами уменьшается.

3.4. Иммунохимический анализ коклюшного токсина с помощью моноклоналышх антител.

Этот раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками отдела молекулярной иммунологии Института биохимии АН Украины.

Из многих гибридом, полученных после иммунизации мышей коклюшным анатоксином стабильно продуцировали МКА два клона: 1-5с и 11-5о.

Несмотря на то, что КТ свойственно значительное сродство к иммуноглобулинам, МКА другой специфичности, а тага:? г^ сыворотки крови неиммунизировашшх мышей с КТ взаимодействуют в незначительной степени. МКА 1-5с и н-5о в "непрямом" варианте ИФА не давали перекрестных реакций с контрольными белковыми ептигенами:

сывороточным альбумином человека (САЛ), цктохромом С и ФГА из В. реПизз1з. Высокая специфичность полученных антител подтзорзда-ется также данными конкурентного КФА: КТ эффективно тормозил связывание антител с сорбированным антигеном, тогда как БСА не влиял на взаимодействие МКА с КТ.

Для определения эпитопной специфичности аффикноочкщенные МКА были биотинклироЕаны по аминогруппам с помощью к-оксисукцин-имидного эфира биотина. Как показали результаты ИФА, биотинили-рование не задело активных центров антител и они сохранили свою активность. Было продемонстрировано, что биотишышрованные антитела успешно взаимодействуют с токсином только б том случае, когда они принадлежат разным клонам. Оба контроля дали отрица-цателышй результат. Таким образом применение МКА 1-5с и п-5с клонов позволяет создать систему детекции коклюшного токсина.

Чувствительность анализа обеспечивается сродством антител к антигену. Аффинность антител была определена по результатам титрования 'МКА на КТ в непрямом варианте ИФА. По расчетам она составила для 1-5с Коб = 1,2 х 10а моль-1, а для и-5с Коб = 1,1 х Ю8 моль"1. - - .

Для нахождения чувствительности определения КТ применяли сэндвич-анализ ИФА, в котором верхние и нижние МКА принадлежали к разным клонам. Раститровка антигена показала, что КТ может надежно определяться, начиная с концентрации 50 нг/мл. '

Таким образом, моноклональные антитела 1-5с и Н-5с, которым свойственна специфичность к различным эпитопам коклюшного токсина, могут применяться для его определения в биологических образцах или для получения токсина с помощью аффинной хроматографии.

3.5. Получение и иммуноанализ коныогатов синтетические пептиды - носитель Три синтетических пептида (участки 1-17, 4-17 и 7-17 51 КТ)

У.УЙУПЗЙРРЕО ( П7-17 ) РАТУУНУПБКРРЕС ( П4-17 ) DDPPAIYyRYDSRPP.EC ( П1-17 ), . 1 17

были конъюгировэиы с сывороточным альбумином лошади. Синтез пептидом начинали с С-концевого суз. Конъюгацию осуществляли с помощью МВС. Четвертый пептид (участок 11-17 31 КТ):

В 5 К Р ? Е В ( П11-17 ), И 17

и пятый пептид (участок 169-187 31 КГ):

а О П А Н ? Н Р У I 8 И Я Е Т А й (П169-187 ) 169 187

конъюгкровали с БСА глутаровым альдегидом.

Для всех конъюгатов был сделан аминокислотный анализ и,основываясь на его результатах,расчитана эпитанная плотность каждого конъюгата. Эпитопная плотность составляла для всех конъю-гатов в среднем от 15 до 30 молекул пептида на ода:/ молекулу белка носителя.

Конъюгатом П11-17 - БСА иммунизировали кроликов и получали ПХА. Методом твердофазного ИФА было определено, что минимальная концентрация антител, которые реагируют с конъюгатом пептид-БСА, составляет 20 мкг/мл. При рабочей концентрации антител 100 мкг/мл чуствительность метода составляла 8 нг конъюгата пептид-БСА.

ИФА и дот-блоттингом было показано, что АТ против этого конъюгата совсем не реагируют с БСА и очень слабо реагируют с нативным коклюшным токсином. Поскольку ПКА полученные к КТ не взаимодействовали также с конъюгатом П11-17 -• БСА ни в ИФА ни в дот-блоттинге, можно заключить, что участок 11 - 17 субъединицы Б1 КТ не является антигенной детерминантов.

Анализ конъюгатов синтетические пептиды - САЛ ( соответственно, П1-17 - САЛ, П4-17 - САЛ и П7-17 САЛ ) проводили с помощью ИФА в "непрямом" варианте. ПКА к КТ достаточно активно реагировали с конъюгатом П1-17 - САЛ, наоборот реакция ПКА с конъюгатом п4-17 - САЛ и особенно п7-17 - САЛ значительно слабее Этими результатами было подтверждено, что иммунодоминантной областью в Я-концевом участке субъединицы Б1 является сайт 1-17, в то время как более короткие участки не стимулируют выработку антител. Не исключено, что для выработки антител важными являются четыре ы-концевых аминокислотных остатка. Конъюгат п169-187 -БСА также взаимодействует с ПКА, полученными к КТ.

Участки КТ, которые были определены как антигенные з этих экспериментах, могут быть использованы в дальнейших исследованиях при разработке синтетических вакцин против коклюша.

4. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ФИЛАМЕНТОЗНОГО ГЕМАГГЛЮГИШНА ИЗ В. ротЧизз1в.

Вторим наиболее перспективном компонентом для создания бес-клеточшх и синтетических вакцин против коклюша является фила-ментозный гемагглютинин (ФГА).

Для выделения ФГА применяли сорСент - бензиламид-ди-е-ами-нокапрош: сефарозу. Структурно и функционально этот сорбент подобен известной фенил-сефарозе, однако имеет болео длинную углеводную цепочку за счет чего бензольное кольцо стерически более доступно для взаимодействия с большими по размеру молекулаш ФГ] •Достаточно прочное взаимодействие.белка с этим сорбентом позволило нам получить чистые препараты ФГА. С сорбентом связывалос1 от 60 до 90% ФГА. Максимальное количество белка, полученное эта» способом составляло 2 мг белка на литр супернатанта культураль-кой среды. Формула сорбента представлена в разделе 3.2.

Препараты ФГА, полученные указанным выше способом из разнш штаммов В. реПизвЬз , содержали несколько компонентов , которые мигрировали при электрофорезе в ПААГ с ДСН как гетерогенная фракция полипептидов с М.м. от 60 до 220 кДа. Степень деградацщ интактрого ФГА М.м. 220 кДа практически не зависила от времеш культивирования, однако в значительной степони зависила от условий культивирования и способов выделения белка.

Были подобраны условия, при которых получали интактный ФГА В трехсуточной культуре штамма 305, который был культивировш на полусинтетической среде, ФГА накапливался в меньших количествах по-сравнении со штаммом 475. Препараты ФГА, которые были выделены с 3-х или 5-ти суточных культур этого штамма, показали при электрофорезе в ПААГ как и препараты, которые были получеш из штамма 475 ( п/с ) - одну основную полосу М.м. 220 кДа. Пр] культивировании штамма 305 в течение 5-ти суток на синтетическо! среде очищенные препараты ФГА были идентичны препаратам штамм; 475 ( с/с ), но выход по белку был в 2-3 раза ниже.

При хранении очищенных препаратов ФГА, которые были получены из штаммов 305 и 475, в течение трех месяцев в 0.01 М натрий фосфатном буфере рН 7,4, который содержал 0.14 М иаС1 при температуре 4°С наблюдалась типичная картина гидролиза белка. Зт< подтверждалось увеличением на электрофереграммах белковых полос что соответствовали фрагментам с М.м. 60, 75, 98 и 125 кДа. Хра-

яение ФГА при температуре -18°С или добавление в раствор PMSP в концентрации 1 пй предотвращало протеолиз.

Известно, что последовательность Arg-Oly-Asp участвует в адгезии целого ряда белков с рецепторами цитоплазматических мембраны. ФГА - адгезивный фактор, участвующий в прикреплении 3. pertussis к мембранам макрофагов и клеток эпителия трахеи. При этом он распознает на цитоплазматических мембранах макрофагов два класса молекул: спЗ-интегр;ш и галактозсодержащие гликолкпи-дц. Найдено, что ФГА взаимодействует с Сиз-интогрином через участок, содержащий характерный Arg-Gly-Asp-сайт, который находится в районе остатков 1097-1099 молекулы ФГА ( Relman et al. 1990 ). Мы анализировали антигенные свойства RGD-содержащего фрагмента ФГА с целью выяснения его перспективности в качестве компонента синтетической вакцины против коклкша

Кроме ФГА в качестве антигенов для иммунизации кроликов использовали синтетический пептид tvgrgdphq ( последовательность 1094 - 1102 ФГА ), а также его коныогаты с ВСА ( БСА-пФГА ) и ЧСА { ЧСА-пФГА).

Распознавание пептида, сорбированного на планшете, было менее эффективным, хотя в целом коррелировало с общим уровнем антител к ФГА. В сыворотках с более низким титром антител к ФГА антитела к БСА-пФГА не обнаруживались, что может быть связано с генетической рестрикцией по главному комплексу гистосовместимос-ти. Наиболее эффективно пептид в составе конъюгата с БСА распознавался антителами из антисывороток, которые лучше всего распознавали и целый ФГА. Антитела контрольной сыворотки неиммувизированных кроликов не распознавали вышеперечисленные антигены.

Известно, что сорбция молекул пептидов на твердой поверхности в ряде случаев затрудняет их распознавание антителами. Это связано с воздействием поверхности полистирола на конформацшо полипептидной цепи. Для усиления взаимодействия пептида с антителами мы получили два конъюгата. В первом случае пептид конъги-ровали с БСА, используя глутаровый альдегид, во втором для конъ-югирования пептида с ЧСА использовали гетеробифункциональный реагент - N-сукцинимидил-З-(2-пиридилдитиопропионат). С каждым из этих конъюгатов антитела из иммунной сыворотки взаимодействовали эффективнее, нежели с пептидом, сенсибилизированным на планшете (рис. 15.). В то ке время антитела из нормальной сыворотки с данными антигенами практически не взаимодействовали. Таким обра-

зом, в иммунных сыворотках кроликов присутствовали антитело, распознающие Р.ов-содержащий участок ФГА.

Для более падежного подтверждения образования антител к 1частку 1094 - 1102 полипептидной цепи ФГА наш был синтезирован аффинный сорбент с иммобилизованным на ВгСМ-агарозе ГЮБ-содержа-щим пептидом. Его применяли для выделения эпитопспецифических кроличьих антител. При получении таких антител нами была использована суммарная антисыворотка двух кроликов,.титр АТ в каждой из них к, штзктному белку в ИФА был не менее 1:364 000, а к пептиду достигал 1:40500. Специфичность антител по отношению к пептиду, его конъвгату с БОА, к нативному ФГА и к контрольному антигену (БСА) была проанализирована методом ИФА. Несмотря на то, что антитела были аффинно очищены на сорбенте с иммобилизованным пептидом, они распознавали нативный ФГА значительно эффективнее, нежели свободный пептид, перекрывающий его шо-содержащий участок, или его конъюгат с белком-носителем (рис. 16.). Это, по-видимому. является результатом конформационных различий р.ов-содер-жащей последовательности в составе интактного белка, в составе конъюгатэ пептид-белок и в свободной форме. Подобные отличия

Рис. 15 Взаимодействие АТ с нативным.ФГА (1), нсв-содержа-щим пептидом (2), его конъюгатами с БСА и'.ЧСА (3,4) Рис. 16 Сравнение эффективности распознавания нативного ФГА пептида туоноотно. конъюгата п-БСА антителами, выделенными на аффинном сорбенте агароза п-ФГА. По оси абсцисс - разведение раствора АТ снятых с сорбента.

между свободными пептидами и этими участками находящимися з целом белке, были показаны ранее и для других антигенов.

Таким образом, эффективное распознавание :питопспецифичес-кими антителами интактного антигена можно считать достаточным доказательством наличия антигенной детерминанты в районе 1094-1102 ФГА. Следовательно, локализация В-эпитопа в районе ФГА, отвечающего за связывание с СиЗ-янтегрином макрофагов, свидетельствует о возможности использования пФГА в качестве компонента синтетической вакцины против коклюша при условии, что антитела, направленные к пептиду, будут распознавать при этом и нативный антиген.

5, ПРИМЕНЕНИЕ 2-КИТР0-4-СУЛБФ0ФЕШШВЫХ ЭФИРОВ КИСЛОТ ДЛЯ СИНТЕЗА ИММУНОКОНЪЮГАТОВ.

Для получения специфических антител на низкомолекулярные соединения (гаптены) и пептиды последние козалентно присоединяют к иммуногенним носителям - белкам или синтетическим полипептидам Для получния синтетических пептидных вакцин важным аспектом также является Еыбор бифункционального реагента и способа получения иммуногенного конъюгата. Поэтому выбор соответствующего реагента }i способа конъюгации может Слть использован для изменения иммунного ответа на пептид, что дает возможность получения антипептидной сыворотки с высоким титром к нативному белку. Бифункциональные реагенты также широко применяются для получения высокомолекулярных белковых конъюгатов, которые более иммуноген-ны чем мономерные белки.

В данном разделе работы иследована возможность применения-водорастворимых 2-нитро-4-сульфофениловых (Nsp) эфиров кислот для получения конъюгатов пептид-белок и белок-белок. Получение конъюгатов на основе пептидов и белков, являющихся объектами наших исследований позволило решить ряд задач поставленных в диссертации.

Впервые (Nap) эфиры были предложены для синтеза пептидов в водной средё Герщковичем и Серебряным и независимо Клауснером с соавт. в 1977. году. Мы получали конъюгата белок-белок и пептид-белок с помощью нового бифункционального сшващего реагент?. Nep-эфира адипшювой кислоты.

Реакция идет по схеме:

со-о-^о)-S03Na

1 .Eqjiok-whj хо-о-ш-Белок 2.Г1>л1тид-ша '

■» (СМ2)„

Vo-o-NH-Пептид

Для испытания этого реагента мы производили сшивку капсид-ного белка pyx ( М.м. 24,8 кДа ). Реакционную смесь разделят! на коленке с сефадексом G-200, предварительно калиброванной интакт-ним капсидным белком pyx, голубым декстраном (М.м. 2000 кДа ) и Dnp-глицином. Конъюгат выходил со свободным объемом. Следователь но, его М.м. не менее 600 кДа (предел эксклюзии у сефадекса G-200 для х'лобулярных белков). Белкового материала на месте выхода иктактного бежа не отмечалось. Гель-фильтрацию конъюгата прово-дкли такка в 0,1% водном аммиаке (рН 9,0) с добавкой 6 М моче-еины или 4 М гуанидишидрохлорида, что позволяло исключить наличие агрегатов после модификации бежа. Профиль элюции при этом не отличался от предыдущего

При изучении антигенной структуры капсидных бежов PVX и P7Y Gujul синтезированы два пептида, которые, исходя из теоретического расчета и на основании экспериментальных данных, могли представлять потенциальные антигенные детерминанты, экспонированные на поверхности бежа.

Один из пептидов ( П-1 ) последовательности IPDODFP занимает позицию 34-40 в нолипептидной цепи капсидного бежа pyx ( рис. 1 ). Второй пептид ( П-2 ) последовательности Y А Р D F Y Е v Т s R представляет собой участок полипептидной цепи ка-сидного бежа PYY позиции 198-203.

Указанные пептиды конъюгировали'с БСА с помощью Nsp-эфира адипиновой кислоты. Для сравнения проводили конъюгацию с применением глутароЕого альдегида. С целью установления оптимальных условий реакцию проводили в различные интервалы времени.

Соотношение пептид:белок в полученных конъюгатах определяли после сравнения аминокислотного состава модифицированного БСА с аминокислотным составом интактного бежа. При проведении реакции в течение 10 мин., 1 час. и 24 час.с использованием в качестве сшивающего реагента Ksp-эфира адишшовой кислоты к бежу-носите-

лв присоединяется 14-15 молей пептида. В случав испогкования

глутарового альдегида пришивается 12 молей пептида на 1 моль БСА. Молено утверждать, что по эффективности Изр-эфир здипиновой кислоты не уступает широко используемому в качестве сбивающего реагента глутаровому альдегиду. Преимущества этого реагента -хорошая растворимость в водных растворах и высокая реакционная ■ способность. Кроме того, Мэр-эфир адипиновой кислоты селективно взаимодействует с а- и Е-аминогруппами в белках и пептидах.

Таким образом, Изр-эфир адишшовой кислоты может быть использован в качестве сшивающего реагента для присоединения пептидов к белкам и получения коныогатов белок-белок. Этот реагент может найти применение для получения синтетических пептидных вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Проведен гидролиз капсидного белка РУХ бромцианск, трипсином и протеазой УЗ из St. аигеиз. С помошью методов гель-фильтрации, ионного обмена и ВЭЖХ в обращенной фазе выделены пептиды, входящие в антигенные детерминанты капсидного белка Рта.

2. С помощью двух МКА и ПКА к Р/Х проведен иммуноаналкз ?та, капсидного белка и пептидов, полученных з результате его фрагментации. Впервые установлено, что юлмунодоминантяая область локзлк-зована в к-концевом участке белка и этот участок расположен на поверхности вириона. В результате модификации Н-коицезого фрагмента установлено, что для взаимодействия с МКА важен остаток лизина в позиции 19 полипептидной цепи капсидного бежа рта. Эти результаты подтверждены иммуноанзлизом синтетических пептидов, входящих в антигонную детерминанту.

3. Основываясь на результатах иммунохимического анализа, тритиевой планиграф1Ш и расчета вторичной структуры предложена трехмерная модель капсидного белка рта.

4. В результате ограниченного протеолиза трипсином интактнкх вирионов РУУ, выделен пептид, который взаимодействует с одним из МКА, получешшм 1с РУУ. Этот пептид является группоспецифическим эпитопом 17 вирусов потигруппы.

б. Впервые с помощью МКА локализована антигоннал детермпнан-та в капсидном белке рум. Она занимает позицию 21-34 полипептидной цепи белка. Установлена аминокислотная последовательность пептида входящего в эту детерминанту:Е айРЬРТаавреон.

Данный участок капсидного белка экспонирован на поверхности вирусной частицы.

6. С помощью аффинной хроматографии из среда культивирования Bordetella pertussis выделен в гомогенном виде коклюшный токсин. Впервые из производственного штамма В. pertussis выделены две ■формы токсина.

7. Установлено, что два МКА к интактному коклюшному токсину направлены к конформационнкм детерминантам белка.

8. Синтезированы иммуноконъюгаты на основе пяти синтетических пептидов, представляющих отдельные участки активаторной субъ-единиш (£1) коклюшного токсина. Показано, что наиболее активно антителами распознается участок 1-17 N-концевой области si KT.

9. Селекционным путем получен высокопродуктивный токсикоген-ный серовариант штамма В. pertussis.

10. Найдены закономерности, которые приводят к протеолизу интактной молекула филаментозного ге;,¡агглютинина из в. pertussis, зависящее от способов культивирования, сроков хранения препаратов, добавления ингибиторов протеаз и условий выделения.

11. Синтезирован пептид (TVGRGDPHQ), представляющий В-эпитои ФГА и изучены его антигенные свойства. Этот пептид, содержащий Arg-üly-Asp-сайт, представляет собой участок ФГА, отвечающий за связывание с Сиз-интегрином макрофагов и может быть потенциальным компонентом синтетической вакцины против коклюша.

12. Показана возможность применения нового бифункционального поперечносшивающего реагента - 2-нитро-4-сульфофонилового . эфира адипиноБой кислоты для получения иммуноконъюгатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ЖСЕРТАШ

1. Радавский Ю.Л., ГершкоЕИЧ A.A., Могирева Л.А., Манько Н.И.,

Серебряный С.Б. Псимененг.е водорастворимых 2-нитро-4-сульфофс-ниловых эфиров в иммунохимических исследованиях // Тез. докл.. v Всесоюз. симцоз. по химии и физике белков и пептидов.- Баку, 1У00.-С.¿25.

2. Радавский ю!л., Могирева Л.А., Манько Н.И.. Герщкович A.A. Применение водорастворимых 2-нитро-4-с.ульфофениловых эфиров к.Ьслот для синтеза их конъюгатов с белками // Биоорг. химия.--1982.■-Т. 8.'-№11.-С. 1486-1489. .

3. Гершкович A.A., Радавский Ю.Л., Серебряный С.Б. Водорастворимые ацилируште реагенты для синтеза пептидов и модификации белковых молекул // Тез. докл. VI Всесоюз. симпоз. по химии белков и пептидов.-Рига.-1983-С.229-230. ,

4. Радавский Ю.Л., Гавриш О.Г. Экзотоксин Bordetella pertussis // Тез. докл. 1 Всесоюз. конференции "Молекулярная структуоа бак-

-■»риальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза".-

Москва.-1985.-С.20-91.

5. Радавский Ю.Л.,'Гаврил 0.Г, Чечот В.А. и др. Фракционирование экзотоксина Bordetella pertussis. // Тез. докл. 1 Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза".-Москва.-1935.-С.91.

6. A.c. СССР .'«1369237 в соавт. Бовк М.В., Сомарай Л.Ii., Серебряный С.Б. и др. / ДСП.

7. Радавськкй ¡0. Л. . В!тер С. С., 'Гурова 1.П. и др. Вивчення анти-гекнс! структур;: СЬт.са оболснки Х- та М-ь1рус1в картопл! // Тез. доя. V Укр. öioxiM. зЧзду.-1вано-Франк1вськ.-1987.- ч. 1, С. 131-132.

8. 'Гурова 1.П., 31 тер С. С., РадавськиД Ю.Л. Анал1з CdomuIskoehx фрагмент!в б!лка обслонки Х-в!русу картопл! ( ХВК ) // Тез. доп. У Укр. dioxiM. з Чзду. -1ваН0-ФраНК1ЕСЬК. —1987. —ч. 2.-С.211

9. Радавский Ю.Л., Гавриш О.Г. Коклюшный токсин Bordetella vertuoeis. // в сб. научн. трудов "Бактериальные токсины". Москва.-1987.-С.125-136.

10.Антигенный анализ коклюшного токсина. / в соавт. Гаврил О.Г., Чечот В.А., Турова И.П. и др. // Тез. докл. VII Всесоюз. симпоз. по химии белков и пептидов.-Таллин.-1987.-с.40-41.

11.Радавский Ю.Л., Витер С.е., Турова И.П. и др. Изучение антигенной структуры белка оболочки Х-вируса картофеля // Тез. докл. VII Весоюз. симпоз. по химии белков и пептидов.-Таллин.-

90—91

12.Радавский Ю.л!, Витер С.С., Саарма М.Ю. и др. Антигенная структура белка оболочки Х-вируса картофеля. I. Иммунологический анализ бромциановых фрагментов // Биоорг. химия.-1988.-Т.14.-И.-С.20-26.

13.Турова И.П., Витер С.С., Радавский Ю.Л. Сравнение вторичной структуры, гидрофильности и гидрофобности белков оболочек X-вируса картофеля и вируса аукуба мозаики картофеля // Докл. АН УССР. -1988. -Ю. -С .80-83.

14.Экспериментальная специфическая иммунотерапия острых отравлений диштрофенильшми соединениями / в соавт. Лукъянчук В.Д.. Луйк А.И., Войтенко Н.С. и др. // Вестн. Акад. Мед. наук СССР. -1988.-Ji5.-С.38-42.

15.Радавский Ю.Л., Витер С.С., Турова И.П. и др Антигенная структура белка оболочки Х-вируса картофеля. II. Локализация анти.. генной(ных) детерминант в N-концевом участке белка // Bhood-

ган. химия.-1989.-Т.15.-№5.-С.615-619.

16.Изучение антигонной структуры белков оболочек Х-вируса картофеля и вируса аукуба мозаики картофеля/в соавт. с Туровой И.П. Витер С.С., Зашсшшм A.A. и др. // Тез. докл. VII Съезда Укр. микробиол. общества.-Черновцы.-1989.-ч.2.-С.183-184.

17.Антигенний анал1з субодиниць коклюшного токсина. / в соавт. с Гавриш О.Г., Чечот В.О., Эа1к1н O.A. и др. // Доп. АН УРСР.

„ СерГ Б. -1989. -С. 61-64.

18.Изучение двух Форм коклюшного токсина.. выделенных из одного штамма Bordetella pertua3ia. / в соавт. с Гавриш О.Г., Чечот В.А.. Заикин A.A. и др. // Тез. 2 Всесоюз. конференции "Бакте-

• риалыше токсины".-Юрмала, Латвия.-1989.-С.26.

19.Характеристика высоксочищенного токсина Bordetella pertussis в экспериментах In vivo и In vitro. / в соавт. Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С. и др.// Тез. 2 Всесоюз. коифер. "Бактериальные токешаг.-Юрмала, Латвия.-1989.-С.152.

20.Иммупохимичссш1й анализ коклюшного токсина и его субъедкниц / в соавт. Гавриш О.Г., Чечот В.А., Заикин A.A. и др. // Тез.

I Всесоюз, иммунол. съезда.-Сочи.-1939.-Т.1.-С.207.

21.Изучение антигенной структуры коклюшного токсина. / в соав. ГаЬсиш О.Г., Чечот В.А.. Зажин A.A. и др. // Тез. докл. VII съезда Украинок, микробиьл. общ.-Черновцы.-1989.-4.2.-С.13Ь.

22.Бис(2-ш1тро-4-сульфофениловые) эфары дикарбоновых кислот как водорастворимые бифункциональные реагенты для сшивки Оелков / в созвт. Гершкович A.A., Партешко A.B., Гончаренко B.C. // Ёиовган. химия.-1989.-Т. 15.-Jà3.-С. 1056-1069.

23.Радавский Ю.л.. Битер С.е., Саарма М.Ю. и др. Антигенная стэуктура кансидных Оелков трех вирусов картофеля // Тез. Все союз, симпоз. химия белков.-Тбилиси.-1990.-С.147.

24.Радавский Ю.Л., Зайцева Л.С., Партешко A.B. и др. Использование водорастворимого 2-нитро-4-сульфофенилового оф;фа адипи-новой кислоты в иммунологических исследованиях белков // Тез. докл. Бсесоюз. симпоз. химия белков.-Тбилиси.-1990.-С.148.

25.FasDa60TKa вакцин нового поколения: некоторые итоги и перс-язктиеы /в соавт. Захарова Н.С., Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У. и др. .'■' Тез. докл. vi Всеросийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов.- Нижшй Новгород.-1991.-T.II. -С.174-175.

26.Патофизиологическая и протективная активность коклюшных бактерий, /в соавт. Е.И. Шмелева, Н.У. Мерцалова, Е.Е. Сухинова Е. и др.//Тезисы докладов XII Украинского республиканского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов.-Харьков.-1991. -4.1.-с.179.

27.Экзотоксин"и антитоксин Bordetella pertussis: технология получения, иммунобиологические характеристики, исследование в составе вакцин и диагностических препаратов. / в соавт. Шмелева Е.И., Захарова Н.С.. Мерцалова Н.У. и др. // в сб. "Актуальные bout <сы иедаинской биотехнологии".-Материалы научной конферен-ц&шосвященной 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток.-Томск -1991.-С.120-121.

28.Антигенная характеристика капсидных белков штаммов У-вируса кавтофеля / в соавт. Гнутова Р.В., Сибирякова И.И., Ярвекюльг Л.В. и др. // Биологические науки.-1991.-Ml.-С.35-46.

29.А.с. СССР М761795 Штамм бактерий Bordetella pertussis -продуцент коклюшного токсина / в соавт. Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У Сухинова Е.Е. и др.

30.1мунох1м1чний анал!з <11лка оболонки М-в1русу картопп1 /у сп!в-

• агт. В1тер С.С., Раудсепп P.A., Гавриш О.Г. // Тез. доп. VI Укр. öioxiM. з ' 1зду. -Ки1В. -1992. -С. 90.

31. Пол1клональн1 антит1ла крол1ь розп1знають сайт ф1ламентозного гемагхЕютин1ну В. pertussis, mo в1япов1дае за ьэаснодш з CR-з рецептором / у спгвавт. Пхакадзе 0. Г., Кавун е. Ы., Чечот В. 0. та 1н. //Тез. доп. YI Укр. öioxiv.. э ' 1эду. -Ки1в. -1992. -С. 107.

32.Применение водорастворимого 2-штро-4-сульфофенилового эфира адипиковой кислоты для получения конъюгатов пептид-белок / в соавт. Зайцева л.С., Гершкович A.A., Абакумов В.Ю. // Укр. биохим. ж.-1992.-.№3.-С. 101-103.

33.1мунох1м1чний анал1з синтетичних пептид1в, но входять до анти-генно! детерм!нанти сЯлка оболонки X-Bipycy картопл1 / у сп!в-авт. ВХтер С. С., Либенко О.Г., Шилин В. В. та // Укр. öio-Х1К. s.-1992.-*4.-С. 94-97.

34.Получение и анализ моноклональных антител к коклюшному токсину Bordetella pertussis, / в соавт. Пхакадзе Е.Г., Кавун Э.М,, Комиссаренко C.B. и др. // Биотехнология.-1992.-*6,-С.33-36.

35.Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментоз-ного гемагглютинина В. péri usa1а . отвечавшего за связывание с

скз-интегрином макрофагов./в соавт. Пхакадзэ Б.Г., Кавун Э.М.,

Комиссаренко С.В. и да. // Биополимеры и клетка.-1993.-JM.-С. 39-44.

36.Радавский Ю.Л., Зайцева Л.С.. Кухарь В.П. / Бифункциональные поперечкосшивавдие реагенты и методы получения кокъюгзтоз пептид -носитель // Биополимеры и клетка.-19УЗ.-Я4.-0.3-21.

37.Antigenic characterization of potato virus X with monoclonal antibodies / co-auth. Sober J., Jarvclralg L. Toots I. et al. // J. gen. Yirol.-1938.-Yol.-69.-Я10.-Р.1799-1807.

3S.Radavsky Yu.L., Viter S.S., Turova I.P. et aI. Antigenic structure of the coat proteins of potato virus X (PYX) and of potato aucuba mosaic virus (PAMV) // Abstr. 2-d Intern. Sympos on "Positive strand RITA viruses". -Vienna, Austria. -1989.-P.43

39.?.adavsky Yu.L., VitorS.S.. Turova I.P. et al. Immunochemical analysis of the coat proteins of potato virus X (PVX) and of potato aucuba mosaic virus (PAMV) // Abstr. 7-th USSR-FP.G Sym-pos. on "Chemistry of peptides and proteins".-Dilizhan. USSR. -1989.-P.43.

40.Antigenic structure of potato viruses studied with monoclonal antibodies / co-auth. Jarvekulg L., Rabenstein P., Saarma M // Abstr. Syrapos. on "Recent results in plant virology".-Ebera-v/alde, Germany.-1989.-P.34-35.

41.Localization of the group-specific epitope of potyviruse3 with monoclonal antibodies / co-auth. Jarvekulg L.,- Saarma !J., Zai-tseva L. // Abstr. YHI-th Intern. Congress Virology.-Berlin, Germany.-1990.-P.84.

42.Radavsky Yu.L., Viter S.S., Turova I.P. et al. Immunochemical analysis, tritium planigraphy and 3truotural features of the potato virus X and its coat protein // Intern. Sympos."Yirolo-logy. Immunology and Sooiety".R0STE/UNESC0.-Techn. Reports .'<6.

1991.-P.254-272.

43.Localization of epitope on potato virus M coat proteins / co-auth. .Viter S.S., Raudsepp R.A., Gavri3h u.G. //Докл. АН Уква-ины.-1992.-J69.-С. 162-164.

44.The RGD-containing peptide of filamentous haerr,agglutinin (FHA) is a potential component of the peptide vaccine against vvoo-ping cough / co-auth. Kavoon E.M., Pckhakadze H.G., Komissa-renko S.V. et al. // Ab3tr. II Russian-Israel Sympos. on "Peptides and proteins".-Moscow.-1992.-P.19.

45.The topography of the surface of potato virus X: tritium planigraphy and immunological analysis / co-auth. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Shishkov A.V. et al. // J. Gen. Virol.

1992.-Vol.73•-Feb.-P.229-235•

46.Radavsky Yu.L., Viter S.S., Gavrish O.G. / Immunochemical analysis of the coat protein potato virus M // Abstr. 3-th Intern Sympo3. on "Positive etrand RNA viruses".-Florida, USA.-1992.-P.59.

47.The organization of potato virus X coat proteins in virus particles studied by trlti um planigraphy and model building / co-auth. Baratova L.A., Grebenshcikov N.I., Dobrov E.H. et al. // Virology.-1992.-Vol.188.-JSl.-P. 175-180.

48.Immunochemical analysis and model building of the potato virus M and its coat proteins / co-auth. Viter S., Gavrish 0., Baratova L.et al. // Abstr. IX-th Intern. Congress Yirology.-Glasgow, Scotland.-1993.-P.263.

СОИСКАТЕЛЕ