Изучение антигенной структуры белков оболочки М- и Х-вирусов картофеля тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Р Г 8 й'дкенглыйя лкддзяи шк унраины

шсткгут биоои'аниче-гкся ш5ш шфтехкха

■ ".v т

На правах рукописи

ВИТЕР Сергей Спльввстрович

сттз ЛНТПГЕННОЯ СТРТШРЫ БЕЛКОВ ОЗОЛОЧЕН -

И- П К-ЕЗРУССВ КЙРГ^ЗЛЯ

C2.D0.I0 - биооргвшгееская химия, ыиня щяфодпх я физиологически активных встдзстз

Автореферат диссертации на соискание ученой степвш кандидата бкологотескгх наук

Киев - 1994

Дгосертоциэй является рукопись

Работа вшюлнша .в лаборатория структуры и функции Оадка Института биооргшшчаскоа химии и нефтехимии HAK Украины

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник , Радавский С.Л.

Официальные ошоненты:

доктор биологических наук, старший научнкй сотрудник ТарЕСсгкн Л.А.

кандидат биологических наук,'

доцент

Тайкова Н.В.

Ведущее учресшша:

Институт биохимии ем. A.B. Паллгднна HAH Украины

Эапшта диссертации состоится и2?< 1994 г,

в Ю часов на заседании специализированного ученого совета

Д.016.65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии НАЛ

Украины ( 253094, г. Киев-94, ул. (¿уланская, 1 ).

О.дассертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оторгаяической химии и нефтехимии HAH Украины.

Автореферат разослан --у^ллл. 1994 г.

ЗГчавна секретарь jj

er' хкализированнсго совета (ЩОРЯКД.М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

,'_ктуадьпосг'> проблемы. Фнтопатогешке вирусы представляют собой большую группу вирусов, поражающих широкий круг растений из различных семейств в том числе и сельскохозяйственные культуры, Вирусные болезни приводят к существенным потерям урожая и снижению качества продукции, а иногда к полной потере урожая и гибели большинства растений. Поэтому получение здорового посадочного материала важных сельскохозяйственных культур является одной из основных экономичеerara и научных задач. Эти вопросы могут быть решены не только путем изучения морфологических, серологических п симптоматических характеристик отдельного фхговируез, но и изучением тонкой структуры, организации и функциональных характеристик как целого вириона, так .и его составляющих компонентов - белков и нуклеиновых кислот. Наллчпэ у вирусов растений белковой оболочки определяет их еггоебб-ность индуцировать образование антител в организме иммунизируемых пивотних. Однако рецепторы юшунокомпетентных клеток, ksk было установлено ранее, узнают не всю молекулу оолка, а только определенные участки -.ентигенные детерминанты. Локализация антл-гешшх детерминант, их моделирование синтетическими пептидами, получение антител, специфичных к одному антигенному участку белковой молекулы (моноклональныэ антитела, МКА) - дает возможность ближе подойти к понимании молекулярных основ антигенности.

Гйбрядомная техника получения, моноклональных антител, направленных-против одной антигенной детерминанты, положила начала новому . этапу в изучении тонкой химической и .антигенной структура белков. Вирусы растений, в cbod очередь, характеризуется разнообразной "структурно-функциональной организацией белков и нуклеиновых кислот. Эти особенности дают возможность исследователям использовать вирусы растений в качестве безопасных в рз- ■ боте моделей при изучения основ структурной организации белков, белок-<5елкового и белок-нуклеинового взаимодействия, понимания процесса самосборки вириона, механизмов трансляции и транскрипции вирусной нуклеиновой кислоты в порагенном растеши, опредз- . леиия роли геном-коднруемых неструктурных белков в развитии инфекционного процесса. Моноклонвлььые антитела для этих исследований. являются одним из лучших инструментов.

— tj —

Объектом наших исследований били К - ( PVM ) и Х-( rvx ) вирусн картофеля к in кэиегдние белей, pym является представителем карлягруппн вирусов растений и единственным вирусом из этой группы, у которого определена полная пунлеотшшая последовательность геномной РНК ( 1991 г. ). рта -представитель группы' потексвирусов растений, пуклеотидная последовательность структурного гона Солка оболочки которого была установлена г 5983 г.

Цель н задача исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении антигенной структуры белков оболочек М- и Х-ви-русов картофеля, сравнения установленных на данный момент' первичны. структур белков оболочек вирусов карлагруппы и их характеристика с применением компьютерных' методов расчета. Для достижения это.й цели было необходимо решить следующие задачи;. -' наработать и выделить чистые препараты PYIJ, его белка оболочки и получить поликлональнне антитела ( ПКА ) иммунизацией животных цзлнм вирионом PYU;

- локализовать поверхностные антигенные детерминанты белка оболочки FVM с помощью поли- п моноклэнальных антител к PVH;

- провести анализ синтетических пеп.пдов, имитирующих антигенную детерминанту белка обо почки рул, с использованием голи- и моноклональных антител к PYX;

- провести иммунохшический анализ ряда карла- и потексвирусов и их структурных билков с помощью поли- и моноклональных антител;

- дать характеристику высших структур белков оболочек карлавйру-сов нескольким!: рассчетными методами;

- рассчитать потенциальные антигенные детерминанты белков оболочек карлавирусов с установленной первичной структурой;

- провести сравнение первичной структуры белков оболочек карла-вирусов и потексвирусов.

Научная новизна работа. Впервые проведено -эпитопное . картирование белка оболочки pvm с помощью -поли- и моноклональных антител. Методами фракционирования белков' и пвптидов выделен трштический пептид белка оболочки рта, который взаимодействует с одним мка m6d5 и ПКА, полученными к целому вирнону рун. Установлена аминокислотная последовательность этого участка: eahflptaadfegk. Данный пептид расположен в n-конце-вой области белка оболочки PYM в позиции 21-34 и экспонирован'

на поверхности белковой суоъедшшны и внриоаа.

Второе МКА М4С1 не реагировало ни с одним из пептидов, полученных после гидролиза белка оболочки PYM трипсином и протыша-зой Y.8, но-реагировало с одним пептидом после пиролиза бромциа-нон. » ■.

Анализ вирусных частиц ?va и art, белка оболочки о Ш1А М4С1 показал, что это МКА взаимодействует ¡ак с белком оболечки PVU. так и с Селксм оболочки pvx, но не взаимодействует со структурным белком потексеируса эукуба мозаики картофеля ( РАЫУ ). Эти результаты говорят о гетеросшлшфачгости МКА М101 и ого спрсобности при определенных" .условиях эксперимента к перекрестному взаимодействию с ДСН-препзратсм белка оболочка PYX.

Впервые проведен расчет потенциальных антигенных детаркц-нант для белков оболочек вирусов карлагруппы и показано, что большинство антигенных детерминант локализуется в и- и С-конце-вых областях структурных белков и характеризуются высокой > степенью'гидрофильности и сегментной подвижности. 19

Показано, что синтетический нанопептид т & т т т к т А о, имитирущий ранее установленный ¡гаи антигенный участок балка оболочки pvx, перекрестно взаимодействует с одним 1.ША ¿ЗУль н ПКА, полученных к целому вириону pyx. Этот результат подтвердил данные об участии остатка лизина в позиции 19 аминокислотной последовательности балка оболочки vr£ в формировании антигенной детерминанты, взаимодействущей с МКА и его поверхностную .ориентацию на вирусной частице pyx.

Практичаскоа значешха работа. Разработан способ -выделения ы-концевого фрагмента белка оболочки рта, прэдетавлягаий поверхностный.эпитоп н включающий иш/подоминантную область.

Получение синтетического пептида, имитирувдего антигенную детерминанту pyx, дает возможность усовершенствования диагностических тест-систем идентификации pvx в растениях.

Получены поликлональные антитела к pvm, которые являются важным инструментом при идентификации вирусов в посадочном материале для получения безвирусных культур картофеля,- а. такке могут быть использованы для дальнейшего изучения антигенной структура карла- . и сотексвирусов. Методы иммуноферментного анализа, апробированные в данной диссертации, могут быть

внедрены в семеноводческие хозяйства Украины.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на V Украинском биохимическом съезде ( Ивано-Франковск, 1987 ); VII Всесоюзном симпозиуме но химии белков и пептидов ( Таллинн, 1987 ); Vir Съезде Украинского микробиологического общества ( Черновцы, 1989 ); I Всесоюзном симпозиуме по химии белков ( Тбилиси, 1990 ); II и III Международных симпозиумах "Плюс-цепочечные ИЖ вирусы" ( Бона, Австрия, 1969; Клируотер, США, 1992 ); VII CCvjP-ФРГ симпозиуме "Химия белков и пептидов" С Дшш-жан, 1989 ); Международном силдеозиуме "Вирусология, иммунология и общество" ( Киев. 1991 ): IX Международном конгрессе по вирусологии ( Глазго, Шотландия, 1993 ).

Структура н о&узп диссертации. Диссертация изложена на /33 , страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов исслздоьания, главы результата и обсуждение собственных исследований, выводов и списка цитированной литературы (/?3 источников ). Диссертация , содержит 9 таблиц, И рисунков и 3 приложений.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.

' СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ '■.'.. ^ V ' . - •

Материалы и методы. В работе использовали отечественные реактивы марок "ОСЧ" и "ХЧ" и зарубежного производства фирм "Sigma", -Serva", "Mlllipore", "Aldrioh", "FluJca" и "ЫегК". Объектами исследований были .средневарулентннй штамм PVX и русский пташ PVM. pyx и очищенный белок оболочки любезно предоставят Грама Д.II. ( Институт микробиологии и вирусологии HAH Украины, г.Киев. ). рун накапливали на растениях томатов Iycoperalcor. öaculentioi, и .выделяли из свеких листьев томатов на 4-й - 6-й неделе после заражения [Николаева и др., 1985]. Балок PVM выделя-■ гуанпдашюрвдшм методом в присутствие Ы01 [Wu и BruenJug, 1971]. Результаты очистки вируса и гомогенность белка оболочки югтраяироваля электрофорезом в ПААГе с додецилсульфатоы натрия ( ДСН ) (Laeinali, 1970,1973], Электрофорезом в агарозном геле ÍSoealns, 1967], спектральным анализом на спектрофотометрах TSpsoord* ( ГДР ) и ОФ-16, и анализом аминокислотного состава. ,

/отагакислотша состав белка оболочки ртм определяли стандартным методом' в 5,7я соляной кислоте в вакууме. Проба анализировали на ошшокислотпом анализаторе BlOTROiJiK-7000 (ФРГ).

Аминокислотную последовательность пептида Т-15 определяла на автоматическом аминокислотном сэквенаторе "Knauer" ( ФИ1 ).

¿нтатела к вириону рта ( rniApvu ) получали иммунизацией кроликов по одной -лене препаратами fym, смешанных с равным объемом полного адъиванта Фрейнда. Препараты вводили псдксзяо я внутримышечно в область спины выше задней лапы кролика. Реимму-иизацию проводили через месяц после иммунизации введением препарата рш внутрикожно без полного адъвванта Фрейнда. Антитела из сыворотки выделяли риванол-сульфатным методом [Horejei, 1956]. Титр антител определяли иммунсферментным анализом ( КФА ). M3D5 и М4С1 были любезно предоставлены М. Саарма ( Институт химической п биологической физики АН Эстонии, г.Таллинн ).

Пептиды П5, П7, П9 были синтезированы в ИнстнтуЪ биооргошгческой хйшш и нефтехимии HAH Украины А. Дыбенко .и В. Шилиным.

Белек; оболочки рун расщепляли брокцяансм [Ссрзбрявка, 1972], трипсином и протеиназой y.8 [Нипунин 'и Шевченко, 1985].

Разделение пептидов проводили па хром'атографичзской спстс:,:з "LKB-Pharmcia" на колонке "LlChrosorb RP-18", 25 X 0,46 см в обращенной фазе -в градиенте ацетокитрнла с 0,1% трифтсруксус-ной кислоты.

Иммуноэлёктроблоттилг проводила по тол-Мп et ai., 1.979.

КФА проводили на платах для микротитрации Dynateoh ( Швейцария ) и Plow Laboratories ( Великобритания ), и анализировала на 8-канальном "автоматическом спектрофотометре Titertek iiuitl-всап МО ( Flow laboratories, Великобритания ) [Clark, 19771.

Флуоровчмуноанализ временного разрешения ( ФИАВР ) проводили на полистнрольных платах ( 12 лунок на полосу, Eflab, Helsinki, Финляндия ) [Jarvekulg et al.,1989] с HKA кеченыки хелатом- европия. Флуоресценцию измеряли на приборе Агсизт*1230 Pluorometer ( Wallao OY, Финляндия ). Результаты представлялась в импульсах в секунду.

Рассчет профилей гадрофилъности [Норр и woods, 1931], Гйдронатии [Kyts и Doblittle, 1982], сегментной псдвккности (Ear-plus И Sohulz, 1985] И вторичной структуры (Garnier,1973] про-

юлили на базе рассчетных методов программы рсаепе (версия 6.0).

Выравнивание ешнокнслотшх последовательностей . белков оболочек проводшш с использованием программы ОепеЬее (Вговвку, 1992] и рс оеие.

Результаты и их обсуждение

1. Выделение, анализ чистоты Рта п гомогенности его бежа оболочки

рун выделяли из свекесобранных листьев томатов, охлажденных до +<1°с [Николаева и др., 1685]. Белок оболотж гадэляли инкубацией раствора рун в 6М гуаншшнхлоридо с £М Ы01 с охлаждением. до -40 С в течение ночи. Вирусную РНК огдолялш цзнтрвйутн-рованием. Раствор белка днализовалн против даеташшрованнрй 1^0. лпофализировали и хранили при +4°С.

Чистоту препарата Рги прсвэрьлз У&-екзгсгром в диапазоне 200-32СГНМ, электрофорезом в ПАДГо с ЛСН и агаров®»« геле. Кв рясунка 1 вкдко, что УФ-спзктр рте иыэет максимум поглощения при гбОпм и минимум - прк Е47км в характеризуется взличинама

Электрофорез рта и его белка оболочки в ПААГе с ДСП показал наличие одной полосы в районе молекулярной массы 36 кДа ( рис. 21 ), а электрофорез в' агарозном геле налетаю одцоЗ полосы 1ВК { рис. 2Б ). Незначительное увеличение молекулярной массы бежа оболочки по сравнению с его молекулярной массой, выведанной из первичной структуры гена ( 34 кДа ) [ниравот, 1989]. по-видимому, объясняется гликозилированием белка ободочки в процессе его синтеза и формирования пространствешюй структура кяпскдшх субъединиц.

А Б

Рис.2. А. Электрофорез в 12,5Я> IIAATe с ДСН белка оболочка РУМ с белковыми маркерами ( Ш? calibration Kit, Pharmacia ). Цифрами обозначены:

I-фосфорилаза б, Ы.м. 94 кДа; 2 -БОА, М.ы. 67 в£-и 3-овадьбумин, Ы.м. 43 кДа; 4 - белок оболочка PYttt Б-карбангидраза, М.н. 30 кДа; б - ингибитор трипсина, К.м. 20,1 кДа; 7 - а-лактальбумкн, Ы.м. 14,4 кДа. Б. Электрофорез PVM в 4* агарозном геле. Обозначенияt

1 - полоса РНК рун; а - неразрушенный препарат .¡>; рун; б - препарат рун, обработанный 10ы мэчввюю0| ■

- Г'- >-..' в - препарат Р7Н, обработанный 2М Lici. }

Результатами электрофореза в ПААГе и агарозном геле Оиво показано, что нами получен гомогенный в не деградированный в процессе выделения препарат рум и его белок оболочки.1

2. Определение амииотшслотного состава белка оболочки ртш

Аминокислотный состав белка оболочки рун определяли стандартным методом в 5,7н соляной кислоте в вакуума. Пробы инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов при 110°С и анализировали на аминокислотном анализаторе вютшк-7000 (ФРГ).

Таблица 1.

Аминокислотный состав белка оболочки рум и его сравне-

ние с амалокиилотныш! состава.« белков оболочек РЖ [Киразот еЪ а1., 1999] И Оеппап ытшлма РУН [бга^Па«;, 1990], выведенных из нуклеотидных последовательностей ах генов

Время гидролиза ( час ) Агйшокислотный ппг.тяй по;

Аминокислота 24 48 ( 72 Киразоу ег а1. (1989) Йгатз- tat (1990)

Количество аминокислот

Му 19 19 19 10' 18

Д1а 36 33 34 33 32

Рго 15 26 25 19 20

Бег 16 15 14 16 1Б

Уа1 15 17 17 18 19

ТЬт 23 22 21 20 20

Оув 2 3 3 3 3

Ке* 6 7 8 8 8

Ъеи гг -22 22 23 23 .

Не 11 12 12 10 10

Тут 6- 6 6 6 6

РЬе 12 12- 11 10 10

Н1з . 5 5 5 5 5

Ьуо 12 12 12 12 13

Ага 26 26 20 30 29

АЗР + АВП 35 34 34 го + 17 20 + 16

01и + 01а 34 34 34 24 + е 24 + а

Тер не определяли 3 э

Судаа - 295 зоз [ 305 зоз 303

¡й таблицы 1 ивдю, что аманоквслотша состав изучаемого

нами вируса незначительно отличается от аминокислотных составов рта по пиразоу ег а1.(1989) и Сгатз1<и (1990). Значительное увеличение пролпна в пробах с инкубацией 48 и 72 часа, по-видшо-му, можно объяснить частичным наложением пика выхода аммиака. Данные по аминокислотному анализу капсидного бел« рун свидетель-.ствугот о его значительном.сходстве с аминокислотными составами, выведенными из структурных генов двух штаммов РУМ, а такта о гомогенности изучаемого белка.

3. Гидролиз белка оболочки г та бромцианом, трипсином к протоинззой у.8

Для локализации вирусных эпитЬпов белок оболочки ГУМ расщеплял! бромцианом [Серебряный, 1972], трипсином и протетм-зой 7.8 [Мкпушт и Шевченко, 1985]. Участки пептидных связей, атакуемые этими реагентами показаны па рисунке 3. Пептидные связи между лизином и пролином, и' аргинином и проливом плохо гидролизуются трипсином, что было отмечено и другими авторами [ИевйХешап, 1975].

4. Разделение пептидных фракций ВЭНХ в обращенной фззз л й.гг;1уноХ1'й'йчесй1,гй анализ с помощью МКА. н ПКЛ протез рта

Для прэведепй'я ВЭЖХ использовали хро'матографяческую систем "ЬКВ-рплпмАСГА" ( Швеция ). На рисунке 4 показан профиль элвдяа тряптаческого гидролизата белка оболочки рум. в аналогичных гт.тт незначительно измененных условиях проводили разделение пептидного материала после расщепления бромцианом и протеиназой 7.8.

Для иммунохимического анализа пептидов из трех гидролизятоз Методами IШ и ФИАВР использовали два МКА: М6Е5 и М4С1» и одну полйклональнуто сыворотку, обогащенную в. Вся антитола бнга получены при иммунизации кивотных целыми вируснюта частицами рта. МКА М4С1 слабо взаимодействовало с' одним из пептидов бро?з-цианошго расщепления белка . оболочки Р7Я п не реагировало ни й одной из анализируемых фракций после гидролиза белка оболочки Р\М трипсином и протеиназой 7.8. По-видимому, ирн расщеплении бромцианом происходит частичное разрушение пнтп-гещюй - детерминанты белка оболочки рти, а во время гидро-

лнзе сорнновкми протеиназами - полная деградация вшггопа, в котором основной вклад во взаимодействие с паратопон антитело вносят пологительио и отрицательно заряженные остатки «гаюкислот.

ю го зо

QDSI К*К±А R,T A K*D 2»0 Т 5 Q BtR*R*M RPIÎTAiD

40 50 . 60

F eto k*d t в bfr i j 0 r*A i d i d g В^'З & dsi

70 80 90

r+bt 1 l r*etr*r+0 A i r*y t h p g l в»т q r p r*l q l A m

, 100 110 .120 b'r ÏDÎIHÎÏÏRÎBI efa l s r*i e f п. i s !•! П m'A

I , 130 140 150

Ч В EfD M'M'R*I YTHLEtObOYPTEtlIVQCVYIQAV

160 170 180

Ь I О K*D A S 8 S Y Г L D P R*0 8 ï M? P H*Q A I T A D A Y .

190 200 , 210

L A Y L K*K*D iltll R*R*Y 0 R*L Y À-Г Y T V В H й'Ь ï В H

i220 230 240

AFPAPBAA H'Q ?Q ï I'tD R?AAiDO?DYY E+JJ Г A

250 £60 270

1 T 1) î L 8,0 L I R+R P ï P R+B^K+Y A H H ï H E*D I A L R+Q

260 , 290 300

A N R+K Q Y ? S S L H A B*Y T (1 0 K«N О P R*D Y Y K+8

Я Я*К ' " " . ' '

рис. 3. Аминокислотная последовательность белка оболочка FY* [Rupaeov et al.. 1989]. | - место атаки пептидной связи Срсмцяаноы; 4 - место йтаки пептидной связи трипсином« >, /'.' ; \'

* - место атака пептидной связи протеиназой Y.8. '

Анализ в ИФА и фиавр пептидных фракций белка оболочки pyï с использованием Ш M6D5 показал, что это ЫКА дает сильную поре крестную реакцию с одним триптичвским пептидом Т-15

а значительно меньшув с трнптпчвскоа фракцией Т-13 ( гис. 4 ). На с одной из фракций от гидролиза протеиназой 7.8 НКД !'6в5 ео реагировало ( табл. 2 ). Определение аминокислотной последовательности фракции Т—16 проводили после рехроматографии в обращенной фазе и было установлено, что эта фракция содержат тетрадвкапептид, отвечающий позиции 21-34 ( см. рис. 3 ) в поля-пэптадной цепи белка оболочки рун: вак.рьртаасрвок .

О 10 20 30 АО 60 60

Время, мин.

Рис. 4. Профиль разделения пептидов БЭЖХ в обращенной фааэ, полученных в результате гидролиза белка оболочка PVH тряпсиноы.

Колонка "IilÇhrooorb RP-1S" (E|ira, 25 X 0,46 om)ï града • градиент ацетоаитрвла 2-50* о 0,1% ТФУ. Время разделения -60 ккн.1 скорость элюда - 1мл/мин. Детектирование - 208 вм.

и2а триптическнх пептидов с ш к pvh ( табл. 2 ) полагал, 'Т?о с ашптелаун взаимодействуй ' две фракции - Т-16 я Т-19 ( рис.4 ), а реакция антител с паптшш Т-13 практесха по наблшается. Таким образом, в результате эпитопнсго картирования белка оболочка ртм с использованием пка и ОД покяаано, что й-концевой участок белка оболочки рун в позиция 21 - 34

( пептид Т-15 ) экспонирован на поверхности Еириона и представляет собой иммунодоминантную область канешшого белкг.

Таблица 2.

Иммунохишческкй анализ триптических ВЗЮС-фракций белка оболочки РУй с помощью ЫКД и ГШ в непрямом ЮА и в ФИДВР

И Ф А (Е450> Ф И А В Р (имп./с)

Ат ПКАруы 1 :юоо + - ¡контроль МКЛ М6Р5 МИД М4С1-

Л Фракц. ПКАруц 1МА интакт. 1:10С0 + 1:2000 - * 1:2000

1 7 10 11 13 14 ч 16 17 18. 19 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31 32 33 т Белок руа 0,117 0,104 0,111 0,199 0,206 0,205 0,140 0.371 0,128 0.214 0.295 0,133 0,063 0.035 0,083 0,065 0,073 0,102 0,080 0,071 0,111 0,065 0.075 0,106 1.757 0.089 0,074 0,069 0,186 0.181 0,116 0,179 0.123 0.107 0.176 0,116 0,123 0,049 0.052 0.053 0,050 0.054 0.054 0,049 0,054 0,053 0.053 0,064 0,060 0,057 0.113 зооа 3302 3219 3247 3152 24626 4352 31688 5745 3752 3523 эгм 2982 3040 3720 8804 3040 3116 3194 3749 3753 3261 -3664 3122 109908 2090 2208 2319 2402 2446 2126 2058 2395 2192 2284 2377 2285 2020 2121 2166 3808 §113 2029 2181 1942 2693 2548 2150 2054 2453 5009 5349 5636 5401 5155 5746 5899 5308 5614 5261 5466 4560 4609 5103 4719 4711 4388 4809 4874 4951 ы 27944 1823 1988 1946 1926 2090 1935 2098 1897 1874 1940 1767 1801 <768 1991 1800 1849 1759 1834 88 2219 . 1872 • 1805 1861 2508.....

1,544 0,033 77910 5686 21495 2087

ЗД83 - - - 5219 2094 7550 . 2009

РАЙУ — — 1819 1800 , 1544 1416 :

(Ц^адэйш Ат - антитела; таг - фосфатный буфер для проб;

1«1000. 1:2000 ~ разведение антител; раыу --вирус аукуба моэшпш картофеля; шп./сек - импульсы в секунду; анти-гоа инкубировали с Ат; антиген не инкубировали с Ат. '

•5. Шлуномыаческиа анализ карла- и по тексвирусов картофеля

йлзунохимнческий анализ М- и з-( pvs ) харлавирусов, Х- и аукуба мозаики ( РАЫУ ) потаксварусов картофеля проводили методом непрямого ифа с mtA против pvm. в результате анализа было отмечено, что пкарум проявляют очень , сильную перекрестную реакцию с Х- и Б--вирусами картофеля, белком оболочки PVX и не взаимодействуй1! с pauy ( Табл. 3 ).

Таблица 3.

Антигещюе срастив вирусов картофеля карла- и потексгруш вирусов растений

Антитела Поликлонадьныэ антитела Интакт-

АнТОгеп ПКАрум(Киев) 1:1000 ПКАргх(Киев) 1:1000 нне кроличьи антитела

+ - + - 1 ;1СКЛ0

Карлзвнрусы: • 'FVU ( IteeB ) ' 1,767 0,057 1,122 0,071

FYS ( Кнев ) 1,539 0,704 Н-А* Н-А 0,085

PYS ( Эстония ) 0,021 0,084 Н-А Н-А

Потексвярусы! PYX ( ГДР ) г ; 1,495 0,069 Н-А Н-А

Белок оболочки ' PYX ( Киев ) 1,597 0.CS0 1.6С8 0,092 0,096

РАМУ ( Эстония ^ 0,077 0,059 Н-А Н-А

твз 0,113 0,140 ■ 0,075

f.- анализ не проводила! TBS - буфер для нанесения проб э ИМ.

Интенсивная перекрестная реакция наблюдалась такжа из аду ПКА против PYX и Ы-вирусом картофеля. Сходная перекрестная реак-

цзя меаду рун, балком оболочки рух ( Киев ) н антисызороткама к этим вирусам наблюдалась и в иммунодотблоттииге. Рескцця ыеиду руз ( Киев ) и пкаруы имела высокую интенсивность, но пра шшубащш без антител бил отмечен значительные уровень фона. В то во время руз ( Эстония ) перекрестно реагировал с шр^ без увеличения уровня фона при интенсивности реакции почти в два раза меньше наблвдвемой для рух и его белка оболочка. Таким образом, можно предположить, что вирусы рты е рух имеют близкое антигенное сходство, хотя представляют разные группы вирусов растений. Антигенное сравнение рун и рта показывает, что эта вирусы имеют сходство антигенной структура белков оболочек, однако являются отдаленно, родственными представителями одной группы [eagrikii, 1959]. раму не обнаружил никакого ентнгбнного родства с PY« ни при анализе методом непрямого ИФД, ни о шдуно-влектроблоттпкгб, что говорит об отсутствии серологического рокотав между 8tenh вирусами.

Анализ коноклоналышх антител Ы4С1, U6D5 с 21XD2 ( против PVX ) методом нммунозлектроблоттинга поел) разделения белков оболочек та, pvm и рану в ПАЛГе с ДОН а переноса аа нитроцеллюлозу показал, что ЫКА ?.1хв2, U4C1 12 M6D5 нз взаимодействуют о белкой оболочки pamv ( рис. б., I-Б, П-Б, Ш-В ).

■г-1-.. Я

W

А Б' А Б 'А -Б

Рис.б. Иммуноэлектроблоттинг белков оболочек РУХ, РУК . к

раку с ОД против рта и рта. - •. .. , I - ркубашш с ЫКА 21XD2» IX - инкубация с 1ША Ы4С1} Ш - : еакуйаагя с IKD5; t - белка оболочек рта ( i ) а рух ( 2 ). В - Савок оболочка рану. • - • ^

Нэ было отмочено реакции мекду белком оболочки pvx и мка m6d6 ( рис.5, III-A ). Нбоклдашша результат был получен при анализе МКА Ы4С1, которое перекрестно взаимодействовало с белком оболочки pyx ( рис.6, ii-A ).На основании результатов, полученных э имлуноферментном анализе и иммунодотблоттинге с пка, и иммуно-электроблоттинге с мка, можно предположить, что мка М401 и пкаруа| перекрестно взаимодействуют со сходным эпитопом белка оболочки FVX. Результаты иммуноэлектроблоттинга предполагают возможную гетероспвцифичность МКА М4С1 и склонность к перекрестной реакция с ДСН-препаратом белка оболочки pyx. •

6. Анализ первичной структуры белков оболочек карлавирусов

В-настоящее время установлена полная нуклеотидная последовательность структурного гена только для pvm [Zavriev, 1991]. а для пяти представителей этой группы проведен неполный З'-кон-цевой сиквенс РНК, который включает ген белка оболочки: fys -8-вярус картофеля [Mackenzie et al., 19891: Heivs - S-вирус геле-ниума [Poster et al., 1990]; IflY - бессимптомный вирус лилий tMeaalinlc et al., 1990]; OLY - латентный вирус гвоздики [Metf in, 1991li PopttY - вирус мозаики тополя [Henderson et al., 1992]. Показано сходство геномной организации этих вирусов в 3'-концевой области [Water, 1992] и отмечена значительная гомология зуклеотшшых и аминокислотных последовательностей их капсидных белков и 3' -концевого участка РНК [¡feaelink et al., 1990; flay lor, 1990j Henderson et al., 1992;].

- Номибыл проведен сравнительный анализ первичных структур белков оболочек перечисленных карлавирусов и потексвирусов путем попарного и множественного выравнивания их аминокислотных последовательностей^ Попарное выравнивание проводили на базе программы РО Gene, а множественное - на базе программы оекевее. Результаты попарного выравнивания представлены в таблице 4.

Исходя из полученных результатой можно отметить, что некоторые пары вирусов: PYM-ISY, FYM-CLY, FYM-PYS, pyk-hilyb, ISY-HelYS, ObY-РУВ и PVS-HelYS - имеют достаточно высокую степень гомологии капсидных белков - от 10 до да процентов, а для пары ISY-PY8 отличена наивысшая степень гомологии - 66*. Немного низ» 40* гомология между cly с lsy и Hbivs, я чоино

Таблица 4.

Анализ попарного выравнивания аминокислотных последовательностей белков оболочек карлавирусов и Х-вируса картофеля

Белок оболочки Белок оболочки

PVM LSV CLV PVS HelYS РорК?

А.к % А.к % А.к * А.к % A.K % А.К %

LEV Идентич. 139 48

Сходные 37 13

CL7 Идентич. 135 47 109 38

Сходные 37 13 40 14

PVS Идентич. 130 45 192 66 115 40 •

Сходные 40 14 27 9 40 14

HelVS Идентич. 142 48 124 43 110 '37 133 46

Сходные - 31 10 41 14 45 15 41 14 ■

PopbíY Идентич. 95 32 95 33 97 32 88 30 80 27

Сходные 38 13 41 14 44 14 32 11 42 14

PYX Идентич. 79 34 75 32 76 33 70 30 67 29 71 31

Сходные 27 12 35 15 36 16 27 12 35 15 24 10

Обозначения: "Идентич."- одинаковые адаиокЕслойгг "Сходауе": Ala, Бег, Thr; Asp, Glu; Asn, Qlns Arg, lys; Ile, Lou, Met, Yals Phe, Тут» Тгр. ; А.к - количество акшкжислот; % - процент от общего количества айидокпслот

отметить очень низкую степень.гошлош ийпокислойюй последовательности белка оболочки popîâY со всеми белками оболочек карлавирусов - 27-33$. Возможно, что íopMY •является "крайним" представителем этой группы. Некоторые авторы отмечали слабое или' по;шое отсутствие серологического родства PoplíY с различными представителями карлагруоты [Adams, 1982; Poster, 1991]. что, по-видимому, может токке объясняться низкой степенью гомологии его срлка оболочки с другими кврдаивдсама. Еалок оболочки Pix

показал такую ке гомология с карлавирусамн, как и ТорШ - 29-342. Являясь представителем потексв1фусов, PYX, достаточно близок по степени родства с некоторыми представителями карлавирусов -pvii и CLV ( 34Я и 33% гомологии, соответственно ), что такгз подтверждается перекрестной реакцией с ПКАРУИ и с MKi М4С1.

Множественное выравнивание аминокислотных, последовательностей белков оболочек карлаьир*оов и потексвиругов показало, что и- и С-концеЕые области характеризуются высокой степенью вариабельности и отсутствием гомологичных участков. "Коровке" ( центральные ) участой этих вирусов, наоборот, имела ряд высокогомологичких районов. Можно отметить' следувдие консервативные мотивы для белков оболочек карлавирусов и pvx:

1) R/K P/Y А А 1 D - F D/n Y/ц р Y - N А А;

2) 1/у Q/H Р - - G L/I)V I/L*H - P T/s;

3) L/j^R - - 0 H/u - Y/p A P V/j Y/T W N - И L/,j ( кроме PopMY );

4) P P - I)/,, W 0/д A/s - G í/y ( кроме PopMV ).

Отмеченые внсококонсервативные участки белков оболочек карлавирусов, вероятно, играют важную роль в формировании трзтачной структуры капсидаой субъедаящы, в обеспечении взаимодействия белковых субъедшшц друг с другом цри оборке вирусных частиц и о вирусной РНК. В 1980 г. То11in at al. предположили, что пять положительно заряженных аминокислот белков оболочек PYI и PMY ( вирус мозаики папайя ) способны взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами РНК. В выше приведенных 1 консервативных мотивах звездочкой С ) отмечено три остатка аргинина, которые совпадают с атюкиелотныш. остатками PYX, предположительно взаимодействующими с вирусной []¡K. Возможно, что отмеченные аминокислотные остатки • белков оболочек карлавирусов играют такую же роль.

7. Анализ вторичной структуры белков оболочек вирусор нарлагрушы

Расчет вторичной структуры велкив оболочек корлопйрусов Проводили на базе программ» PC Gene по методу fiarnior( ), 13 таблице 5 показано количество предсказанных вминохисло'пшх остат-

в кх процентное отношение к общему количеству аминокислот для квкдого карлавируса.

Таблица б.

Предсказание вторичной структура 1г«атп1ег, 197&] для балкоа ооолочек шести карлавирусов

Релок 000- дочки а-спнраль Неупорядоченный вытянутый участок р-позорот Неупорядоченная клубок

Кол-во Кол-во Кол-во Кол-во

аминокислот % аминокислот « г» аминокислот * аминокислот »

рук 144 47.6)5 83 27.3)8 28 9.2» 48 15.7»

рта 110 37.5* 100 34.4» 12 4.0» 70 гз.а»

97 33.3» 93 34.0» 27 9.2» 68 23.3»

р!7 121 '39 «в» 104 33.9» 36 11.7» .44 14.3»

непга 77 25.7» 137 46.1» 43 14.3» 41 13.78

РорНУ 205 63.6« 61 18,9» 26 8,6» 27 Ь.6*

Проведевше-расчета показали, что преобладающи эдемен- . Ткда вторичной структуры белков оболочек карлавирусов являются Огслнраль и неупорядоченный вытянутый участок. . -

в. Предсказание антигенных детерюшат белков оболочек карлавирусов на основе расчета их индексов гидрофильностя а сошентной подвижности. Расчет профиля гидропатнз

, Достаточно эЭДективньы средством доя предсказания антиген-М5Й структура белков являются рассчетные метода. На основе елго--программа рс аеоае вами были предсказаны потенциальные аидаегане детерминанты для шести белков ооолочек х^рлаварусов, йда доотеташи стой цела были рассчитаны индексы гапрофальностк .'Ш&рр Е (¡ооЛя, 1981) в сегментной подвижности 1Кагр1ил а 5сЬи1а,' 1935), Еа оснозашш полученных результатов ( рас. б ) »эшо здадоя».. ышхлтвз предгюлсяиння; Во-первых, можно отметать

О-О 1

©-с>[

, $3-° 1

<ч?=>

Г О.о

(ез.о /■«-о /«•о

Г *.о

'/' а. -

Рис. 6. Распределение потенциальных линейных аитигвннш.

• .детерминант по длине аминокислотных последователь-. ' ностей белков оболочек карлвЕирусов.

А - расчет по индексу гидрсфильности? .V Б - расчет по индексу сегментной подвижности;

- 2U

характерную для китовидных и палочковидных, вирусов эгс:тош!ут> плотность в н-конаевнх участках белков оболочек [Коеп1£, 1986]. Во-вторах, расчет по индексу гидрофяльности показал, что длл белков оболочек 18V, съч к руб характерна низкая степень гидро-фнльности и, как следствие, невозможность предсказания большого количества эпитопов. В-третьих, расчет антигенных, детерминант по сегментной подшганости показал хорошую корреляцию с расчетами но индексу гидрофильностк и расширил рамки предполагаемых антигенных детерминант у вышеупомянутых вирусов. В-четвертых, махаю отметить, что часть локализованной нами антигенной дйтер-мипанты ( пептид Т-15, ряс. 3 ) входит в предсказанный и-конце-вой участок белка оболочки рте ( табл. 6 ).

Таблица 6.

Расчет потенциальных линейных антигенных детерминант -для белка оболочки М-шруса картофоля

Гидрофильность Сегментная подвижность \

позиция Индекс позиция индекс -я

абсолют. средний сегментной подвижности

4-12 12,209 1,357 2-8 1,087 .

14-23 15.389 1,540 14-20 1.125

33-39 8.983 1.283 35-41 1.103

РТЫ 36-42 8.783 1,255 79-85 1,067

44-50 7,397 1.057 94-100 1,066

54-60 8,152 1.165 120-126 1,057

65-70 - . 8.311 1.385 155-161 1.069

91-96 4.668 0,670 163-169 , 1.057 '

186-192 7,839 1,120 185-191 1,053

253-259 8,126 1,161 252-258 1,061

Этот участок в позиции 14-23 характеризуется наивысшим , кодексом гидрефышнооти как в абсолютном, так и в усредненном значении. В то кэ время позиция 21-34 пептида Т-15 расположена меаду двумя участками с наивысшей сегментной подвижностью, что одновременно показывает на его относительно высокую мобильность я жесткость структуры, которые обеспечивают взаимодействие с пара-топом антитела. В-пятых, расчет сегмента .Л подвижности для

балка оболочки РорМУ покаьал высокую сегментную подвижность его "коровой" области, что значительно отличает его от белков оболочек кврлавирусов.

Таким образом, комбинированный подход к предсказанию антигенных детерминант рассчетпыш методами дает возможность более точно локализовать положение таких линейных участков в полинеп-тидной цепи белков.

Расчет профиля гидропатии проводили на основе алгоритма да Ку^е и СооПШе ( 1982 ). При сравнении профилей гидронатии белков оболочек керлавирусов показано, .что высокая степень гидрофобности характерна для консервативных участков "коровых" областей аминокислотных последовательностей этих белков.

9. Анализ синтетически* пептидов - аналогов антигенной детерминанты белка оболочки PYX

Для подтверждения результатов, полученных при анализе при- , родных фрагментов капсидного белка pyx, были синтезированы три пептида, включащие остаток лизина в позиции 19;

т я т а с (115) :' Т Т Т К Т А О (П7)

1STTTKTAC (ПО)

Остаток глицина в позиции ?2 был зькенен на остаток цистеина для возможности присоединения синтезированных пентодов через SH-группу цистеина к белку-носителю, принимая во внимание факт, что боковые радикалы остатков глицина обычно вносят незначительный вклад в паратоп-епитопное взаимодействие. Для присоединения пептидов к белку-носителю использовала малеин-имадобензоил-и-гидроксисукцинимидзй эфир ( МБО ), а в качестве носителя использовали БСА. В результате был получен конъюгат БСА-П9. Анализ свободных пептидов П5, П7, П9 и конъвгата БСА-П9 ш то дом флюороиммуноанализа временного разрешения показал, что .свободные пептиды и конъюгат БСА-П9 не взаимодействуют .с ЫКА 21XD2, a MKA 23ХА5 реагирует только со свободным пептидом П9 ( Табл.7, стр. 22 ). ;

Отсутствие реакции с коньюгатом БСА-И9 объясняется розмоя-' ними конформацаонтмя изменениями при конъюгации пептаца к носителю, или влиянием поверхностных структур носителя на

Таблица 7.

Антигенная активность (ими./сек)с пептидов П5, П7, Г'9 и коныогата БСА-Гй в методе флюороиммуношшлиза временного разрешения с моноклоналышми антителами к Р7Х

Антиген Уоноклональные антитела

23ХА5- 21X1)2

р МКА без МКА с МКА баз МКА

П5 2351 2144 1979 1849

П7 2095 2093 1909 1734

П9 35533 10740 5082 4675

БСА-П9 2161 ' 2239 3075 2836

Белок рух 20099 2498 22566 2236

Буфер 2131 2390 2276 1898

{информационное состояние пришитого пептида. Мо:ло такхс предположить, что во время конъюгации была экра1Шроваиа е-КНз-группа лизина, который вносит значительный вк^ад во взаимодействие с антителами. Бозмохаю также, что оксигрушш К-концевых треошша к серина пептида П9, которые отсутствуют 8 пептиде П7, участвуют в образовании дополнительных водородных связей с паратопон антитела, и/шш стабилизируют пространственную структуру пептида 119, обеспечивая узнавание этой структуры антителами.

Таким образом, иммунэхимический анализ синтетического пептида П9 подтвердил результаты об участии остатка лизина в позиции 19 белка оболочки рух в формировании антигенной детерминанта и показал, что . данный к-концеиой участок экспонирован на ' Поверхности вирионв.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено эпитоокое картирование капсшшого белка рта с помощью ШСА. Выделен пептид, щвдставляпщий яммукодомннантнуЕ область изучаемого белка, и установлена его первичная структура. Показана, что этот участок экспонирован но поверхности вирусной частица

2. Получены ИКА против Рта, которое использовались для кзучегия антигенной структуры рун.

3 На базе компьютерных методов прогеден расчет и сравне-нко высших структур и потенциальных линейных антигешшх детерминант белков оболочек шести карлавирусов. Показано, что я-концевые области белков оболочек этих вирусов характеризуются высокой эпитопной плотностью.

4. Синтезирован пептид, имитирутакЯ антигенную детерминанту белка оболочки РУХ и взаимодействующий с МКА против ин-тактного Х-вируса картофеля.

5. На основании множественного выравнивания первичных структур белков оболочек карла- и потоке вирусов сделано предположение о сходстве молекулярной организации л упаковки капсигашх белков вирусов этих групп.

6. Методам! ИФА, иммунодотблоттинга и иммуноэлектроблоттин-га с использованием ГША и ПКА показано, что М- и Х-виру-сы картофеля имеют сходные антигенные детерминанты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАНТ:

1. РадаЕський Ю.Л. , В1тер С.С., Турова 1.П. Вивчення антигенно! структур:! б1лка оболонки Х- та Н-в1рус1в картопл1 // Тез.доп. Y Укр. öloxlM. з'1зду.-1вано-Франк1вськ.-1937.-ч. 1.-С. 131-132.

2. Турова 1.П.. В1тер С. С., Радавський Ю.Л. Анал1з брокц1анових фрагмент1в 01лка оболонки X-Elpycv картопл1 ( ХВК ) // Тез. доп. V Укр. 61 ох 1м.. з' 1зду. -IsaHO^paHKlECbK. 1S87. -ч. 2. -С. 211.

3. Радавский Ю.Л., Витер С.С., Турова И.П. и др. Изучение антигенной структуры бежа оболочки х-вируса картофеля // Тез. дскл. Yii Всесоюз. симпоз. по химии белков и пептидов. -Таллинн. -1987.-С.90-91.

• 4. Радавский Ю.Л.-. Витер С.С., Саарма М.Ю. и др. Антигенная структура белка оболочки Х-вируса картофеля. I. Иммунологический анализ бромциановых фрагментов // Биоорг. химия.-1988. -Т.14.-М.-С.20-26.

5. Турова ИЛ., Витер С.С., Радавский Ю.Л. Сравнение вторичной структупы, глдрофильности и гидрофобности белков оболочек Х-втуса картофеля и вируса аукуба мозаики картофеля // Докл. АН УССР.-1988.-Й9.-0.8СР-83.

6. Радавский Ъ.Л., Витер С.е., Турова И.П. и др. Антигенная структура белка оболочки Х-вируса картофеля. II. Локализация антигенной (-пых) детерминант в N-концевом участке белка // Биоорг. химия.-1989.-Т.15.-Ä5.-С.615-619.

7. Изучение антигенной структуры белков оболочек Х-вируса картофеля и вируса аукуба мозаики картофеля / в соавт. с Турэ-вой И.П., Радявским Ю.Л., Заининым A.A. и др. // Тез. докл. YII Съезда Укр.. микребиол. общества*-Черновцы.-1989.-ч.2 -0.183-184.

8. Радавский Ю.Л., Витер С.С., Саарма М.Ю. л ' др. Антигенная

структура капсидных белков трех вирусов картофеля // Тез. Всесоюз*. сямпоз. химия белков.-Тбилиси.-1990.-С.148.

9. В1тер С. С. г Раудсопп Р. А., Гаьриш 0. Г., Радавський Ю.Л. 1муног.1м1чни£! анал1з 61 юса оболонкп М-гЛрусу картопл1 //Тез. доп. VI Укр. dioxiu. эЧзду. -Kkib. -1992. -С.83.

10. В1тер С. С. Радссвський D. Л., Дибеико А. Г. та 1 нш 1. 1муко~ х1ы1чний анал1з синтетичних пептид!.в, до входять до антиген-но1 детерм1нанти б1лка оболонки Х-в1русу картопл1 // Укр. ОЮхИЛч. 2 -ig02.-K.-C. 94-07.

11. Radavsky Yu.L., ViterS.S., Turova I.P. et al. Antigenic structure or the coat proteins or potato virus X (PYX) and of potato aucuba mosaic virus (PAHY) // AbBtr. 2-nd Intern. Б.утпроз. on "Positive strand RNA viruses".-Yienna, Austria. -1939.-P.43.

12. Radavsky Yu.b., Titer S.S., Turova I.P. et al. Irammo-ohemical analysis of the coat proteins of potato virus X (FYX) and of potato aucuba mosaic virus (PAHY) // Abstr. 7-th USSR-FRG Syrapoo. on "Chemistry oi peptides and proteins".-Miizhan, USSR.-1989.-P.43.

13- RadavsKy Yu.L., Yiter S.S., Turova I.P. et al. Imnrunochemical analysis, tritium planigraphy and features of the potato virus X' and its ooat protein // Intern. Бутшэов. "Virolo/nr, Immunology and Society".'ROSTE/UHISCO.-Tochn. Reports £5. -1991.-P.254-272.

14. Yiter S.S., Raudsepp R.A., Gavrish O.G. Radavsky YU.b. localization of epitope on potato virus E coat protein // Докл. АН Украины.-1992.-£9.-0.162-164. ■

15. Radavslcy Yu.L., Yiter S.S., Raudsepp R.A. et al. / Innnuuo— chemical analysis of the coat proteinjof potato virus К // ibatr. 3-th Intern. Бутпров. on "Positive strand RHA viruses". -Florida, OS A..-1992.-P. 59.

16. Immunochemical analysis and nodal building of the potato virus II and its ooat protein/ oo-auth. ' Radavskjr Yu., Gavrish 0., Baratova L. et al. // Abstr. IX-th Intern. Congress Yirology.-Glasgow, Scotland.-!993.-P.263.

Битер 0.0.