Тритиевая планиграфия и пространственная организация некоторых надмолекулярных систем тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

9 О 3 9 в

академия наук ссср

ордена Ленина институт жздческой физики

На правах рукописи

КАШИРИН Игорь Анатольевич

уж 577:621.039.85

/

тритиевая пллнигрлфия и пространственная организация

некоторых }щштауляршх щсггш

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат

дассертащга на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1990

/

Работа выполнена в Ордена Ленина Институте химической физики'

АН СССР.

1

Научные руководители: доктор химических наук А,В.Шишков;

кандидат химических наук Л.А.Баратова

■ Официальные оппонента: доктор физико-математических наук,

профессор И.П.Суздалев;

кандидат химических наук Л.А.Нейман

Ведущая организация: Институт белка АН СССР

Зашита диссертации состоится " " С(цр€ЦЛ 1990 года в часов на заседании специализированного совета Д,002.26.04 при Институте химической физики АН СССР по адресу: 117977,' Москва, ул. Косыгина, дом 4, ИХФ АН СССР.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института химической физики АН СССр.

Автореферат разослан "„ ^0^^1990 года

Ученый секретарь специализированного совета Д.002.28.04 доктор химических наук

В.Я.Рочев

" * «

та!м Как известно,' основным источники: ия-

формшдли о пространственной структуре объектов молекулярного масв-таба является рентгеноструктурный анализ. В случае более "крупных" объектов, например, мвотных и растительных клеток, оргапелл, их отдельных фрагментов, получить данные о пространственной организации удаемся с псмозью и:дау.чной электронной микроскопия я ее различных модификаций. Так, например, при исследовании биологических объектов весьма плодотворное оказалась техника моноклонояьных антител. Ка-кдкй i/етод имеет ев*.и достоинства и ограничения кок методического, яаприг/ер, необходимое?ь получения есъектэ в форяе кркстзл'кп с чусоксй степень» упорядоченности, артефакты, привносимые способом приготовления обрзз-ja, так и принципиального характера. Последний приводят к та!у, что для целого класса объектов метод рентгеяо-структуряого анализа оказывается нерезультативным, так как их размеры слиззссм велики и расшифровать дифракционную картину окапывается невозможным, в то время как электронная микроскопия не позволяет определить с необходимой степенью разрешения тонкие детали структуры. 3 этеткласс попадает большинство систем, представлявших исключительный интерес, в том числе такие важные биологические объекты, как комплексы биополимеров, мембранные ксуплексы, вирусные часгипы и др. Знание структуры таких систем является необходимым условием как для развития чисто фундаментальных проблем, например, понимания структурно-функциональных связей в юшой материл, так и для решения ряда практических задач. Б этой связи очевидно, что лк>-бые усилия, направленные на создание методов исследования пространственной структуры надмолекулярных систем промежуточных масштабов, оправданы и, безусловно, актуальны.

В качества возмогшого претендента на роль такого метода представляется перспективны« метод тритиегой планпграфил, разработанной в ИХ® АН СССР и укэ дос-этогчо зарекшеядов.эвзкй себя в npuve-

нении к изучение структуры биологических макромолекул (белков).

Целью настоящей работы является разработка обшей методологии исследования пространственной организации биологически вашых надмолекулярных систем с помощью метода тритиевой планиграфии, выбор оптимальных условий проведения эксперимента в приложении к конкретным объектам - нуклеопротеидным комплексам, установление корреляции данных о распределении тритиевой метки мевду молекулярными комнонен

тами системы и внутримолекулярном распределении с пространственной <

структурой. Последнее проводилось на модельном объекте - вирусе табачной ыозаики (БТМ).

Разработанный подход был использован для получения информации о пространственной организации Х-вируса картофеля (Х-ВК), структура которого к настоящему времени исследована недостаточно.

практическая,ценность работы. Разработана новая общая методология изучения пространственной организации нук-леопротекдных комплексов с помощью метода тритиевой планиграфии, суть которой заключается в "тотальном" течении объекта в условиях бомбардировки заморокенних водных суспензий атомарным тритием, последующей "разборке" объекта на составные молекулярные компоненты и определении их экспонированности для атомов трития. Для какдого из компонентов, или для наиболее ваишх с точки зрения поникания стру] туры, определялось внутримолекулярное распределение метки. Полученные данные о структуре доступной поверхности использовались затем для воссоздания пространственной архитектуры комплекса в целом.

Применение этого подхода для анализа структурной организации ВШ привело к получению профиля доступности полппептидной цепи белка оболочки в составе вириона, то есть дало информацию о доступности индивидуальных аминокислотных остатков в последовательности. Сравнение с известной моделью пространственной структуры показало хорошую корреляцию вероятности включения метки и доступности для

сей полипептддной цепи, за исключением проксимального трилтичес-сго пептидэ Т8 (остатки 93-112). Последний согласно данным рент-еноструктурного анализа находится в глубине частицы и, следова-ельнс, fie должен Сыть доступным для атомов трития. Высокий уро-ень включения метки а этот пептид, э также наличие метки в лока-изоааннол s центральной области вирионэ РНК указывает на сушест-ование каналов, предположительно в местах контактов белковых субъ-диниц.

Впервые получен профиль доступности тритию полипептидной цепи ¡елка оболочки Х-ВК. Показано, что на поверхности вирионэ экспони-ювана /I-концевая область цепи. С-концовсй фрагмент недоступен в [нтактиом вирусе, но ста[!овится экспонированным после частичного фотеолиза. Установлена доступность внугрявирусной РНК. На основами полученных данных предложены возможные модели пространственной зрганизации вирионэ и белка оболочки.

Анализ данных о составе доступной поверхности позволил пред-юить использовать метод трИтиевой планиграфии для сужения круга юиска потенциальных антигенных детерминант, что шеет значение хля практической иммунологии.

В процессе работы получены меченные тритием препараты белков Ш и Х-ВК, а танке РНК с высокой удельной радиоактивностью. Пока-:анс, что введение метки в РНК не сопровождается деструкцией макромолекулы,и меченая РНК сохраняет свои биологические свойства. Раз-заботанный метод могет быть использован в лабораторной практике,а также при небольших масятэбзх производства как препэрзтивнчй метод получения меченых биологически активных соединений.

Апробэцм_щ(1о;га._и jiyбликэции, Основные результаты работа докладывались из:

I. И Международной конференции 'Вода и ионы в биологических системах", Бухарест, 1984 г.;

2. I Всесоюзном совещании по проблеме 'Биологически актив-fine соединения, меченные радиоактивными изотопагл/, Звенигород, 1985 г.

3. I Московской конференции молодых ученых по радиохимии, Москва, 1986 г.;

4. Кевдународном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине; Москва, 1936 г.; •

5. УП Всесоюзном симпозиуме ло химии белков и пептидов, Таллинн, 1987 г.

6. II Всесоюзном совеивнии по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами", Звенигород, 1988 г.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

01й1ЕЗХй^й_2ЁЬёМ-ДИс2ер.ТОЦИИ. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков, 7 таблиц и список литературы из 168 наименований.

Работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава I представляет собой обзор наиболее распространенных в настоящее время методов исследования доступной поверхности биологических объектов. ?о второй главе приводится описание экспериментальной техники и методик, использованных в работе для решения поставленной задачи. Глава Ш включает полученные результаты, описание использованных тестов сохранности меченых препаратов, методологи» анализа распределения метки по полипептидной цепи а интерпретации его в терминах доступности, а такке связь доступности с особенностями структурной организации вирусных частиц. Обсувдаююя возможности и ограничения, ыег" .ритиевой планиграфии для изучения пространственной архитектора надмолекулярных систем и локализации антигенных детерминант.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Еазр.а<3дткэ^метода введения тритиевой.метки в нуклеопроте-ЗЛЙЙ§^конплексы

Одним из основных критериев, определяющих применимость метода тритиевой планиграфии для исследования биологических объектов является сохранение их структуры в условиях бомбардировки атомарным тритием. Если для молекулярных объектов выполнение этого критерия было продемонстрировано на ряде различных объектов, то для сложных надмолекулярных систем отсутствие артефактов, связанных с нарушением структуры, предстояло доказать. До последнего времени отсутствовала ясность" в вопросе, сохраняется ли прл введении метки структура нуклеиновых кислот. Последние входят в состав вкрио-нов.и определение их доступности весьма существенно для построения модели пространственной структуры.

Удобными модельнкми объектами для решения такого рода вопросов представлялись рибоссмные 5£и I6S FHK. Бомбардировка атомами трития, нагретыми до SOCO К, замороженных (77 К) водных растворов ' РНК и последугапй анализ показали, что после плательного отделения лабильного (способного к обмену с водой) трития многократным пере-осаудением этанолом получаются электрофоретически гомогенные препараты, в Которых вся радиоактивность сосредоточена в УФ-поглошаю-ших зонах и относится к исходным 5S п 165 РЖ. Следует отметить, что удельная радиоактивность препаратов составляла 30-»120 КиУм.что позволяет их использовать в качестве меченых соединений при проведении широкого круга исследований,

В качестве теста сохранности биологической активности меченых PICK была использована реконструкция SOS рябосомяой субчастицн. Для этого меченая 16 £ РНК ипкубирозэяась в условиях реконструкции с поддан но борга ркбосомних Оелгся, зходялнх в состав малой субчзс-тяцк pncoccwH, после чего проводилось кеятрв&тирозение в градиен-

те концентрации сахарозы. Совпадение профиля радиоактивности и УФ-поглошения в зоне 30£ субчастицы свидетельствует о том, что меченые молекулы 16? РНК сохраняют способность к специфическому связыванию с рибосомальними белками, то есть процедура введения метки, равно как и приготовления мишени, не оказывает заметного влияния на структуру и свойства РНК.

2. Доохупндст^.>1оле^хл_рщ-в составе нуклеопротеидного комп-

Введение метки в идентичных условиях в рибосог.шую 16$ РНК и 30S субчастицу позволяет оценить доступность молекулы нуклеиновой кислоты в составе нуклеопротеидного комплекса. Для этого после стандартных процедур - отделения лабильного трития из меченых 30 5 субчастиц выделяли 16 S РНК и определяли ее удельнур радиоактивное?! Полученные величины сравнивали с удельным включением метки е свобод ную 165 РНК, меченую в растворе. Если принять, что конформации 165 РНК в растворе и в составе субчастицы тождественны, что следует из данных по нейтронному рассеянию, то величина /)l6f РНК в 30S//¡I6i РНК свободная = 0,202+0,007 указывает на примерно 80 %-иую экранировку "поверхности" молекулы РНК рибосомными белками. Данные о доступности 165 РНК в составе 30$ субчастицы действию нуклеаз, химическим модификаторам и специфическим антителам указывают на большую степень экранировки, однако следует-иметь в виду, что в настоящей работе определяется поверхность, доступная для взаимодействия с атомами трития, существенно меньшими по своим геометрическим размерам, чем перечисленные выше реагенты. Обнаруженная в донной работе "акурность" белковой оболочки для атомов трития наблюдалась и в вирусных частицах, о чем будет сказано ниже.

3. Ц^ИН^ИДОСЕ^ЦJioaaasa

При разработке метода тритиевой планиграфии для исследования глобулярных белков корреляция распределения метки с доступностью

минокиолотнкх остатков устанавливалась На объектах, пространст-еннэя структура которых "была хорошо известна: миоглобин, лизоцим др. /З.И.Гольданский и соавт., 1982; А.В.Волынская и соавт., 985 /. В данном случае, очевидно, также было необходимо начать с )бъекта с известной структурной организацией. Однако, если в слу-iae белков выбор моделей был достаточно пирок, то подобрать надмо-екулярный комплекс, способный служить модельным объектом, оказа-юсь достаточно сложно. Единственным подходлшим кандидатом оказал-:я ВШ, о пространственной структуре которого, исследованной многими методами, включая рентгеноструктурный анализ, имеется достаточно полная информация. Немаловашое значение имеет и доступность этого объекта, что позволяет получить статистически достоверные результаты.

Условия введения метки, установленные в экспериментах с 5S ,

[6i РНК и 30$ субчастицами рибосом £ себе , были использованы в

> аботе с ВТМ. Так как эта вирусная частица имеет яоковыраженную ви

о о

'янутую форму (длина частицы ~ 3000 А при диаметре около 180 А ),

го следовало исключить возможность ее ориентации на поверхности за--морокенного раствора. С этой целью мишень приготовлялась напылением мелких капель раствора, содеркашего вирусные частицы, на предварительно охлажденную до 77 К кидким азотом внутреннюю поверхности реакционного сосуда. Как было показано, такой способ позволяет исключить ориентацию даже в случае малых дифильных молекул (например, дипептидов). •

Целостность меченых препаратов ВТм проверяли УФ-спектросколи-ей, электрофорезом в полиакриламидном геле белкового и нуклеинового компонентов, ультраце.чтрифугированпем в сахарозном градиенте. В последнем случае рассчитывали коэффициенты седиментации и проводили сопоставление профиля седиментации по У$-поглопению и радиоактивности. Совпадение зон максимума УФ-логл^иения и радиоактивно-

стп свидетельствовало о сохранности меченого препарата БТЫ Сркс.1) Для анализа внутримолекулярного распределения трития в белке оболочки ВТМ выделяли белок из предварительно освобокдешшх от лабильной метки вирусных частиц и подвергали гидролизу трипсином по стандартной методике.

Еайл-.!- Седиментация' ВТК в градиенте концентрации сахарозы (5+20 %)•. с а - контрольный препарат ВТК; £ о) - меченный тритием ВТМ

§ (_____ - поглощение при

254 нм; — - радиоактив-<5 ность)

Получаемые пептиду разделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией в обращенной фазе, собирали в отдельные фракции и гидроли-зовалп до аминокислот. Гидролизат анализировали с пом.ошью автоматического аминокислотного анализатора со сбором фракций и измерением их радиоактивности. Если в результате протеолиза первым ферментом получали крупные пептиды, содержащие много повторяющихся аминокислотных остатков, то дополнительно проводили гидролиз ферментом другой специфичности. Так, трилсинолиз ВТм дал 12 пептидов (Т1+Т12), Наиболее крупный пептид Т1 (остатки 1-41) выделяли и дополнительно обрабатывали хкиотриисдпсм. В результате были получены 6 более меда • ¡.лхтидов. Пептид 'Г8 (остатки 93-112) гидролизовалн стафилококковой протеазой в результате чего получали 3 коротких пептида (рис. 2). После гидролиза и аминокислотного аналина всех

индивидуальных пептидов определяли удельное включение метки путем отнесения радиоактивности к количеству аминокислоты по данным анализатора. Полученные данные в виде профиля доступности приведены на рисунке 2. Как видно, экспонированными для трития оказались 4 участка полппептидной цепи.

20 Ti

AI

t» »t , ,. -,

СИ CM cki Ch4 CkS C« tu

0 SO 8Э ¿00 lO

'ГЗ ,TüTf Tg TS , TO ,T10.TJi, Til t ,t t t 1 t t t

¿11 SU

Рис. 2. Внутримолекулярное распределение трнтиевсй метки вдоль г.олипептндной цепи белка оболочки БИЛ в составе вируса. Аминокислотная последовательность белка (ось ОУ) - согласно имеющимся данным У Tsusife А, ei. л1. , i960 HVTI2 - трипткческке пептида белка, ch I ch 6 - химо-триптические пептиды пептида TI, Sil + Si 3 — стафилококковые пептиды пептида Т8.

Перный участок вкютает /Л-кснцевой пептид Й, второй - состоит из пептидов ТЗ и Т4, третий - пептид т8 и четвертый - С-концевой пептид Т12. Недоступны для взаимодействия с атомами трития пептида Т2, Г5, То, Т9, ТЮ и ГИ, за исключением С-концсвсго остатка арггшшя-141. В пептиде Т1 доступны первые 15 аминокислотных остатков.

В соответствии с данными рентгеноструктурного анализа /Лом-Кче1.а1., 1986 / на внешней поверхности вириона долишы располагаться ЛГ- и С-концевые участки полипептидной цепи (соответствуют пептидам Т1 и Т12), а такие участок, образованный пептидами 13 и Т4, Как видно, именно эти фрагменты доступны и для включения три-тиевой метки. Общепринятой модели структуры противоречит высокая доступность для атомов трития пептида Т8, который согласно рентге-ноструктурпым данным расположен во внутренней части вириона и образует область контакта с РНК.

Количественные сценки показывают, что включение метки в пептид ТЗ через торцевые "отверстия" в поверхности вирусной частицы исключается. Сама белковая субчастица оболочки представляет собой плотноупакованную структуру из двух пар «¿^-спиралей с обширным гидрофобным ароматическим кластером между ними, л допустить проникновение через субъединицу атома трития без многократного рассеяния довольно трудно.

Мы предполоасили, что в белковой оболочке вируса имеются "каналы", расшлоизнше в местах контакта трех субъединиц - двух субъединиц одного ряда и одной - из соседнего витка (верхнего или ник-него). Пептид Т8 в интактном вирусе образует короткую спираль (так называемую У-колонку), ось которой по данным рентгеноструктурно-* го анализа совпадает с осью вириона. Эта "колонка" располагается в области ыексубъединичного контакта и образует как бы "дно канала". Попадавшие в "канал" атомы трития могут, таким образом, без рассеяния достигать "дна" и взаимодействовать с аминокислотными остатками пептида Т8.

Возыовшссть существования таких "каналов" по^тверкдается данными рентгеноструктурного анализа У Н.аЦ., 1977 ), согласно которым иетду соседними субъединицами верхнего и никнего

о

слоя находятся области диаметром около о А с пониженной электрон-

ной плотность». По всей видимости, через эти ке "каналы" происходит и включение метки в РНК, которая располагается на расстоянии о

35-45 А от аксиальной оси вирионэ; уровень радиоактивности РНК оказался эесы.'а высоким.

В случае глобулярных белков, которые использовались при раз-эаботке метода тритиевой планиграфки в качестве тестовых моделей, корреляция между включением метки и пространственной структурой уогла быть установлена на количественном уровне. Так как рентгено-

" о

структурный анализ этих белков был проведен с атомным ( ^ 1*1,5 А) эззрешением и были известны координаты всех атомов, то, используя алгоритм, предложенный Ли и Ричардсом / Lee. fi., /Uc/icmdg F.H. , 1971 ! , можно было рассчитать площади доступной поверхности аминокислотных остатков (точнее, составляющих их реакционноспособных 2-Н групп) и отнести к этим величинам включение метки.

В случае вирусных частиц, так ке как и других слокных надмо-1екулярных систем, такой возмоености, к сокалению, нет. Наиболее л счерпывающая структурная информация, полученная для ВТМ, позволяет говорить лишь о качественном соответствии данных о включении метки с архитектурой вириона. Получе ч.чые в настоящей работе результаты поззоляюг, с нашей точки зрения, достаточно обоснованно утверждать, что трнтневая планиграфия' дзет адекватное представление о пространственной организации надмолекулярного комплекса, о компонентах, составлявших его внутренние и периферические (поаерхносг-' ные) области, о также о весьма тонких особенностях структуры. Все это обусловливает ценность разработанного подхода дня изучения таких важных, но мало доступных для традиционных методов исследования биологических объектов.

4• Цс!Уйдоаан2£_топографии,поверхности Д-вируса МЕгефеля У-виру с картофеля (Х-ВК) относится к группе PoiexvibuseS , имеющих важнее народнохозяйственное значение. Хотя история его пзу-

чения не менее продолжительна, чем BTiií, однако информация о е-го структуре в настоящее время существенно более ограничена, Рентге-ноструктурный анализ с низким разрешением позволил выявить лишь некоторые морфологические особенности вируса, предположить длину внут-ривирусной РНК и оценить число белковых субъединиц в составе вирио-

яа. Согласно современным представлениям, Х-ВК имеет форму гибкого

о о

стержня протякенность» ~ 5150 А и диаметром ~ 130 А. Как и в БИЛ,

вирусная РНК располагается внутри вириона. Сравнительно, недавно била определена первичная структура белка оболочки /. Морозов С.1С. и соавт., 1983 / и предсказаны элементы вторичной структуры для части полипептидной цепи / gftwveA -С. ei. ai. , I9&7 /. Проведаны первые работа по определению антигенных характеристик вируса / Кое -R., ei. aL., 1986 ; Радавский Ю.Л. а соавт., 193а /.

В настоящей работе использовали интактнье вирусные частицы, содержащие белок оболочки с молекулярной массой 26 кДа, а также частично деградированные ¿n i¿íu лротеазами клеточного сока частицы с белком 22 кДа. Методология исследования в принципе не отличалась от разработанной дня ВИЛ. Сохранность вирусных частиц тестировали по УФ-спектрам, электрофорезом в полиакриламидном геле белкового и нуклеинового компонентов, седиментацией на ультрацентрифуге со сканирующей оптической системой с последукшим расчетом коэффициентов седиментации. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что включение метки не сопрововдается какими-либо детектируемыми изменениями структуры объекта.

Для растепления белка Х-ВК на пептиды использовали гидролиз трипсином по стандартной методике. При зтом вместо 20 пептидов, теоретически возможных исходя из аминокислотной последовательности, найлэдали образование 18, так как связи аргинин-1Ы-пролин-182 и лизин-153-пролин-154 оказались недоступными для иротеолиза. Полученные пептиды (рис. 3) разделяй высогоэффективной ввдкоствой хро-

матографией в ображжной фазе, фракция индивидуальных пептидов собирали и гидро'лпозали до свободных аминокислот с последующим анализов к* изаер«ай1'>м раддог-ктивности. Не удалось выделить короткие гидрофильные дилептиды Т7 (остатки 110-Ш), Т15 (202-203) и Т17 (215-220), выходялш единым хролатогрчфическим пиком, а так«® идее-тчЛицирозять .юптидм Т4 (остатки 87—39) и Т14 (остатки 199-201), что, однако, ед<;а ли могло существенно сказаться на обшей картине цоступности поллчептидноп цепи (не идентифицировано 12 остатков ;!з 235). Сравнивались профили доступности белка оболочки Х-ВК в антактном (26 кДа) л частично деградированном ¿п (22 кДа)

зпрусе. В последнем отсутствует //"-концевой пептид Т1. Как видно 13 рисунка 3, в белке натизной вирусной частицы наиболее экспони-эсвана дм трития л/-концевая часть лолипептидной цепи (Т1); кроне того, метка обнаружена в пептиде Т2, части пептидов ТЗ и Т5, соторне тэкке следует отнести к разряду поверхностных фрагментов. I других пептидах метка обнаруживается лишь в отдельных остатках шинокислот,и ее включение, по всей видимости, обусловлено существованием в белковой оболочке вируса "каналов", подобно найденным в 1ТМ. Практически недоступна для включения метки в нативном вирусе —концевая область белка (пептиды Т16-Т18).

Профиль доступности белка из частично деградированного ¿л $1-:<- вируса отличается от профиля белка 26 ."Да, главным образом, до-¡тупносгыо С-концевого фрагмента. На наш взгляд, это мокет быть бъяснено тем, что в ннтактдои вирусе-белковые субьединицы улоке-, ы таким образом, что их //-концевые части (пептида Т1, Т2, часть 3 и Т5) как бы лежат над С-концевым фрагментом, делая последний едоступным для мечения тритием, либо //"-концевой фрагмент одной елковой субъедишэды находится в контакте с С-концевой область» оседней субьедишщы и, таким образом, экранирует за от атомов три-ия. Отщепление протеазами пептида XI, естественно, снимает эту эк-

ранировку. Возможно, однако, что отщепление /Л-концевого пептида приводит к изменению конфорыации всей субъедлницы, в результате чего и увеличивается доступность С-концевых пептидов. Второе объяснение представляется нам менее предпочтительны.:, так как изг/.ене-—ние конформации должно было бы существенно сказаться на характере распределения метки по всей полипептидной цепи, мы ке набл ода ем только измененне доступности С-концевого фрагмента. •

. Таким образом, полученные данные позволяет сделать аьгвод о том, что поверхность вириона образована //"-концевой частью полипептидной цепи, включашей пептиды TI, Т2 и частично ГЗ и То. С-концевой участок также находится либо на поверхности, либо вблизи от нее, но в сборке в натизном вирусе он экранирован //"-концевым-пептида,) TI.

Как и в ВТМ, белковая оболочка Х-ВК, по всей видимости, имеет "каналы", через которые атомы трития.могут проникать во внутренние области вириона, что проявляется во включении метки в отдельные аминокислотные остатки, а такие во вну тривирусную РНК .Можно предположить, что такая ажурность белковой оболочки является обшим свойством нуклеопротеидных комплексов. 3 пользу такого обобщения говорят данные работы УНейман JI.A. и соавт., I96S /, в которой было обнаружено включение трития в РНК в составе фага Л52.

Тек как первичная структура белка оболочки Х-ВК изаестна.можно попытаться, используя данные о распределении тритиевой метки, предлокить возможную модель третичной структуры белка.

Расчет элементов вторичной структуры по методу Чоу и Фасмана } ¿heu P. V. , PfiSMAM <у. Ь. , 1974 ) предсказал наличие 8 «¿-спи-ральных участков: 43-53 (А), 59-69 (В), 75-87 (С), 93-9S (Д), 108118 (Е), 152-154 (F), 185-205 (j ) и 210-213 (К), а также 7 j5-ртруктурированных областей: 6-8, 13-18, 32-34, II9-I27, 132-137, 221-226 и 229-233. Исходя из размеров предсказанных «¿-спиргчьннх

участков, можно предположить, что молекула балка представляет ао~ бой вытянутый эллипсоид вращения, большая ось которого совпадает со спираль» j . Исходя из первичной структуры, был рассчитан по ¡.«етоду 'Ките и Дулиттла / /у/е J, , edco&U€e KF. , 1982 j такие профиль гидрафобности белка.

^го too

т м

Рис. 3. Профили доступности тритию полипептидной цепи белка оболочки Х-вируса картофеля; а - нативннй вирус (м.в. ^* 26 кДа); б - ¿л- ¡Ни деградированный Х-БК (м.з.белка ~ 22 кДа); Т1+ТГ8- триптические пептиды белка. Аминокислотная последовательность бежа Х-ЗК (ось ОУ) - согласно ике-ВВЙМОЯ данным /Мсоозов С.Ю. и соавт.,1983/, за исключением позиций 43 и 64, где вместо-предсказанных авторами остатков валяна паход'ттся опрод.зл-энше химическим снкзелсом пеп~ тляа ГЗ остатки изолс-йцина.

На рисунке 4 приведены данные о вторичной структуре белка, профиль гидрсфобности' и профиль доступности для трития, совокупность которых и была использована при поиске пространственной модели.

Рис. 4. Профили гидрофобное га (а), распределения трптииво,; метки (б) к элементов вторичной структуры (с) белка интакт-, ного Х-ВК. Ось ОУ - аминокислотная последовательность Х-ВК

Началом сборки явился поиск участка первого излома полипептидной цепи, который, вероятнее всего, составлен остатками аминокислот 144-153. Именно в этой области предсказывается реверсионннй поворот, креме того, эта область является своеобразным центром симметрии вто ричной структуры. Низкий уровень включения мотки в эти остатки указывает но нахокдение места излома во внутренней сфере белковой глс-

1Л Ы.

Анализ распределения метки в спиральных фрагментах указывает i то, что спираль А долана быть расположена на поверхности субъ-шницы, спирали В, С, Р и J характеризуются закономерным измене-гем доступности от jf- к С-концу (повышение или понижение), спили Д, Е и К - образуют внутреннюю область глобулы. Спираль Д, од-ко, по всей видимости, располагается на поверхности меасубъеди-чного контакта, что следует из профиля гидрофобности. В принци-, возмоаны два способа укладки полипептидной цепи. Согласно пер-му варианту первый контакт образуется мезду спиралями Е и Р с об-зованием дамера с гидрофобным кластером на поверхности (остатки 3, 113, 114, 160, 161, 164 ). Присоединение спирали j к ? обра-ет комплекс ¡-pj с гидрофобным кластером на поверхности из сстат1-з НО, 113, 114, 160, 164, 190, 191, 104, 195, 168. Соединение ара лей С и Д образует гидрофобный кластер из остатков 79, 87, 80, . Контакт этого димера со спиралью Е образует комплекс из 5 спи-ïbHux участков СДЕР7 к которому затем присоединяется спираль В, !рали А и К такке образуют димер за счет контактов J)6t-AQ- Val -i и fat-52- кгц-212. Последняя стадия - присоединение димера АК инее образованному комплексу дает конечную пространственную сбор-белка АКСДЕШВ.

Второй вариант укладки полипептидной цепи отличается от перво-только на этапе ассоциации двухспирального комплекса СД с трех-ральным комплексом EPJ . Спираль В на следущем этапе образует такт со спиралью С с образованием комплекса ВСДЕЗУ. Следующие пы сборки аналогичны этапам первого варианта. На рис. 5 преде-лени модели пространственной организации структурированных, уча-ов белка оболочки Х-ВК в составе вируса, ооответстзушие дзум аантам построения. Обе полученные модели достаточно хорошо со-зтетвуют да иным о доступности остатка аминокислот атомам три-

тия. В модели, полученной по первому варианту сборки, /Г- и С-кон-цевые участки полипептидной цепи обличены на поверхности, в то время как во второй модели они пространственно удалены. Если предположение о контакте /Г- к С-концевых фрагментов соседних белковых субъединиц справедливо, то вторая модель представляется более правомочной. Обе модели, безусловно, требуют дополнительной проверки, но могут слукить отправной точкой дискуссии относительно пространственной архитектуры Х-Епруса картофеля.

Рис. 5. Модели структурной организации белка Х-ВК в составе вируса; а - первый вариант построения, б - второй вариант.

5. Экспериментальное., определение доступной поверхности как Й£3£ЙШШЭ.Ц 1

В настоящее время мовдо считать установленным, что антиген-ность является специфически/: свойством поверхности макромолекул ■' или их комплекса. В этой связи метод тритиевой планиграфии как единственный на сегодняшний день прямой экспериментальный метод определения поверхности может оказаться вааннм для сукения круга поиска пептидов - возможикх кандидатов на роль антигенных дотерто-

нант. Б самом деле, известно, что антигенными детерминантами BT.'vI являются участки полипептидной цепи 1-ГО (пептид TI), 62-53 (пептид Т4) и 153-158 (пептид TI2). По данным тритиевой планиграфии все эти участки находятся на поверхности вирусной частицы и, следовательно, их антигенные свойства могли бить предсказаны ct'pßiCfl'i (см.рис. 2). В белке оболочки Х-ВК доступным для трития является ¿/-коленей фрагмент (пептиды TI, Т2, частично ТЗ и Т5). Опубликованные в настоящее время данные говорят о том, что антигенные детерминанты Х-ВК локализованы в .//"-кощевой области или вблизи ее (рис. 3).

ВЫВОДЫ

1. Разработана общая методология исследования поверхности надмолекулярных нуклеопротеидных комплексов с помощью тритиевой планиграфии.

2. Определены экспериментальные условия введения метки, обеспечивающие сохранность структуры и функциональных свойств объектов. Показано, что введение метки зз препараты РНК не сказывается на структуре макромолекулы и ее способности к специфическому взаимодействию с белками (на примере самосборки 30$ субчастицы рибосомы из меченной тритием 165 РНК и рибосомных белков).

3. Разработанный метод введения тритиевой метки моаат быть рекомендован как препаративный способ получения биологически активных меченых препаратов с высокой удельной радиоактивностью.

4. На примерах 30S субчастицы рибосом £ tcCi , вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля показано, что белковые оболочки нуклеопротеидных комплексов обладают достаточно ааурной (для атсмов трития) структурой. Сделаны оценки степени экранировки 165 РНК в составе малой субчастицы рибосомы S. uZi ( 80 7>).

5. Получено распределение метки по аминокислотным остаткам

полипептиднсй цепи белка ВТ!/' (профиль доступности). Сопоставление с данными рентге неструктурного анализа показало хорошую корреляцп включения метки и пространственной структуры вириона. Обнаружены "каналы" в белковой оболочке 1Ж, образованные контакте.1.: субьеди-виц белка двух посчедователымх витков спирали, которое делает во мо«.ним вклкяснне метки в остатки аминокислот, расположенные "на дне канала" и во внутривируонув РНК.

6. Получен профиль доступности полипептидпоп цепи белка оболочки Х-ВК в составе интактных п частично деградированных вирусны; частиц. Показано, что поверхность белковой субъедшшды в интактно? вирусе образована У-концевол частью полипептиднсй цепи. 0тисплс-нп( //-концевого пептида протеазами клеточного сока приводит к экспо-нирсзэнности для атомов трития С-концевой области. Высказано предположение о ток, что в интактном вирусе ./Г-концевсК" участок как 61 лежит над С-концевым фрагментом, либо/-концевой фрагмент одной белковой субъединицы контактирует с С-концевой областью соседний субъединицы и, таким образом, экранирует ее ст атомов трития.

-7. На основании .данных о первичной структуре проведен рэсчс: элементов вторичной структуры г,'профиля гидрофобное?]; белка. В сочетании с информацией о распределении метки (профиль доступности) предложены две модели пространственной упаковки полипептиднсй цепи, удовлетворяющие всей совокупности известных данных.

8. Продемонстрирована на при/.ере ВТМ и Х-ВК возможность использования метода тритиевой планиграфии для суке над круга поиска пептидов - потенциально возможных антигенных детерминант.

I. Каакрлн-И.А., Гедрэзкч А.В., Видков А.З., Кэграг/анэза В.К., Бг ратова Л.А. Использование метода термической активации трития для введения радиоактивно/, мотки в РНК // Ьиоорган .ггкя, 1883

- Т. 9. - 11 П. - С. 1531-1534. >. Gedcovich fiX,ShühKOV fi-t, PttlpXlH AVu., IЫмШ/<г fl.V., ZzfifflMV F.?., Kashmhi 1Я, Bafwtova i.fi.^cLdwSKii V.l. Jlsh/dy <?f ihe topoy-üaphy of tjtoiuCüH pnoieifJS нем? j-eWt/M Са$еС&.лу.1.ч:'Шей (Md. ¡C*>Z ¿n (tiotopcol sy:ieM2"(edl>>. PuUhm A^aiifeiU/V., Pecze41\ 1925, &цскчпЫ, p. Каширин H.A., Гедрович A.B., Шишков A.B. Использование метода термической активация трития для получения меченых нуклеиновых кислот П В сб.: Тез.докл. I Всес. совет, по проблеме: "Биологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами" (Звенигород, 7-9 октября 1985 г.). - М., 1985. -С. 46-47.

. Каширин И.А., Гробеншяков Н.И., Баратоза Л.А., Шишков A.B., Гольдзнекий В.И. Исследование пространственной структуры белков при пемоди тритиевой метки. Ш. Использование метода термической активации трития для определения доступной поверхности белка вируса табачной мосэики в составе вируса // Молекулярная биология, IS86. - Т. 20. - Л 5. - С. 1264-1272.' , Каширин И.А., Гедрович A.B. Получение меченных тритием биологически активных соединений //В сб.: Тез.докл. I Моск. конф. молодых ученых по радиохимии. - М., 1985. - С. 43-44. Каширин И.А., Гедрович A.B., Гребенщиков Н.И. Использование метода термической активации трития для определения доступной поверхности глобулярных белков и надмолекулярных комплексов /} В сб.: Тез.докл. I Моск.конф. молодых ученых по радиохимии. -М., 1985. - С. 47-48,

Гребэншвков Н.И., Каиирин И.А., Гедрович A.B., Баратова Л.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография для анализа доступной поверхности белков П В сб.: Тез.докл. Мекд.симп. "Хроматография в биологии и медицине". -Ы., 1983. - С. 178.

8. Каширин И,А., Гребенщиков Н.И., Барзтоза Л.А., Шиоков А.В.,-Гольдзнский В .И. Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. 1У. К вопросу об зкспони-рованности для трития проксимального триптического пептида Т8 белка вируса табачной мозаики в составе вируса У/Молекулярная биология, IS87. - Т. 21. - ft 2. - С. 456-451.

9. Шишков А.З., Кащирин И.А., Гребенников К.15., Ьаратонэ Л.А. Изу-

чение молекулярной организации сложных биологических систем с помошыо термически активированных атомов трития У/ В сб.: Тез. докл. УП Всес. сими, по химии белков и пептидов, 1987, Таллинн, С. 136.

10. Каширин И.А., Гребенпкков Н.И., Баратова Л.А., Шпиков А.В. Введение тоитиевой метки в сложные биологические комплексы .

и анализ структуры их поверхности У/ В со.: Тез.докл." П Всес. совей, по проблеме "Физиологически активные соединения, мечен-_ные радиоактивными'изотопами" (Звенигород, 22-24 апреля). -М., 1988. -'С. 61.

11. (reieiaA/SKLi V.l.f Kasktiv Т.П., S/iishtcM ft.V^ BatafovQ iJ.t ёиевсл/-ikhiKOV N.J. The Kit cf ihetMalLy QcftVQ-kd ieiturAf о/ем! fee SlP-utjuHctk-Clcfo^itQk weiHgci-iLOv?: fhe. -¿ofiofpAfAy cfMe TflV pecte/W- pccea/f& sue-fsce of Me vieut.f/ j. McC. £itC.r iSS8, M.Z0it p.ser-si^i.

12. Bqtafavct L ¿nefersshchitcov V.l.t fashipj*] J,A, SAisbnov fi v., katf.b\!sey u.L, l.V.t SaetM* m.J, TAe ■hptyeixpAj' of Me luRface of /he poMo vinui X : inihi/ч pCan^t-Af/iy or>c€ UiNuvotc^ afJofyiLi./( J. бел,. VitoL., i*pxess.