Использование тритиевой планиграфии для изучения структуры оболочечных вирусов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

КОСК^вскея ордена ленина, ордьяа октябрьской революции

< 7 ордак трудового красного знамени

¡^ДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. 'М.В.ломоносова

ХЕЙИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ?

Ка красах рукописи УДК 577:621-.039.85:547.964

НШШОНТОВ , &лэ*"савдр Лоонвдович

ПСЙШЬЗОВАНЙВ УШШОЖ КШИГРАШ? ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ1 ОБОЛОЧЕЧЖЖ ВИРУСОВ

02.00.10 - бкооргаиичвская мсаир, химия природных

и физиологически акткты;; веществ

*

Автореферат

дассвртадаи на соискание» ученой сташшг кандидата химичесга... наук

Москва! -

Работа выполнена в А.Н.Белозерского МГУ.

Институте физико-химической биологии ил.

лучные руководители: - кандидат хишчоских наук,

с.н.с. Л.А. Баратова

- доктор биологических наук гл.н.с. Л.Б.Марголис

Официальные оппонента: ' - кандидат химических наук, ' с.н.с. Е.Н.Богачева

- доктор биологических неук, с.н.с. Б.С.Народащшй

Ведущая организация: - Институт белка РАН

Защита состоится I шля 1993 г. в _ часов на заседании

Специализированного Ученого совета Д 063.06.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. И.В. Ломоносова по адресу: ГСП 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 601.

С диссертацией мозшо ознакомиться в библитеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 30 апреля 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, ■>' /. кандидат химических наук Я.Г.Смирнова

' К

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Как известно, основным источнике s информации о пространственной структуре макромолекул и надмолекулярных систем является рентгеноструктурный анализ. Для изучения та тех объектов, которые не могут Сыть закристаллизовали, к сожалению, нэт до ста пор сравнимого по своим возможностям метода. ЯМР высокого разрешения, метод углового рассеяния нейтронов, различные гада трансмиссионной электронной и сканирующей туннельной микроскопии все еще не имеют достаточной степени разрешения. Метода же, связанные с использованием различного рода специфически модифицирующих, сшивающих или расщепляющих агентов, с введением фотореак-тивируемых или флюоресцентно меченых зондов, i. „изОежно внося в исследуемую систему возмущения, которые могут существенно исказить нвтивную структуру. Кроме того, получаемая информация, как правило, относится к какому-либо фрагменту системы и характеризует, а лучшем случае, структуру ближайшего к р юртеряой группе окружения. В етой связи очевидно, что любые усилия, направленные на создание новых и дальнейшее развитие уже имеющихся методов исследования пространственной структуры надмолекулярных систем - оправданы и, безусловно, актуальны.

Метод тритиэвой планиграфяя, как новый метод картирования ~ вэрхности объекта, имеет определенные преимущества при изучении таких надмолекулярных систем. К таким преимуществам мокно отнести неселективность мвчения, минимальное привнесение чужеродносги при замещении атома водорода на тритий, возможность работы с некристаллическими образцами (заморо-ендами растворами» лиофильно сухими пленками), недеструктивность и высокая чувствительность к изме-эняям структурных параметров макромолекул.

Ранее, этот метод с определенным успехом был использован при изучении топографии поверхности и пространственной организации рибосом и некоторых растительных вирусов. Выла показана возможность использования метода для изучения топографии мембран цели, клеток. Изучению возможности использования метода тритиэвой плани-графии для решения ряда структурных и молекулярно - биологических задач при исследовании оболочвчннх вирусов посвящена эта работа.

ЙШг настоящей работы - изучение возкокности приложения метода тритиэвой планиграфик к изучению оболочечных вир,job. В качестве объекта исследования был выбран вирус гриппа. ООолочечнью вирусы имеют два структурных комплюнтаг нерукнуя лшопротеиднугз оболочку н внутренний нуклеокапсид. Поэтому з качество первой задачи

■ - г -

требовалось подобрать оптимальные условия проведения эксперимента в приложении к конкретному объекту. Порад нами стояла также методическая зад/"-!а сохранения и последующего контроля целостности вирусной мембраны в условиях, необходимых для введения метки.

Потребовалась также отдельная постановка и решение задачи препаративного выделения основных вирусных белков, чего треоозалв разработанная ранее и использованная наш методология анализа включения метки в белки.

Необходимо было установить корреляционные соотношения в распре-дэлеа л тригиевой метки между молекулярными компонентами системы, а именно между глккозилированными поверхностными белками и внутренними, нуклвокапоидннми, не имеющими углеводную компоненту. Экспериментальное подтверздение адекватности метода объекту и изучаемой проблеме позволило бы использовать данный подход да получения информации о архитектуре вириона вируса гриппа, которая до настоящего яремени изучена недостаточно, для описания терминальной ковформации гемагглютишша после кислой инактивации вируса, для изучения активной фарш гемагглютинина при рК слияния.

Научная новизна и практическая ценность работа. Впервые методом тритиевой планиграфии оыли изучены ннтактныэ препараты оболе-чвчных вирусов. Отработаны условия приготовления мишени из суспензии вирусных частиц вгфуса гриппа штаммы А/КРУ/йов^ок (Н7И1) и А/РЛ/а/34 (Н1Н1), описаны условия мэчэния и методика анализа включения тритиевой мотки в белковые компоненты вируса.

Экспериментальные данные о уровне мечения тритием основных вирусных белков использованы для оценки степени вкспонированпости их в составе вириона. Высказана рабочая гипотеза,' объясняющая експо-нированность мечению внутренних компонентов вириона: мембранного ЙЗ белка и нуклеокапсидного т- белка.

йзучены структурные аспекты конформациоштх изменений в гемаг-глззтинине при кислой инактивации вируса гриппа. Сравнение значений радиоактивности аминокислот в контрольных 1при нейтральном рН) и оштьых (проинкубированных при рК в,о) вирусных препаратах позволило описать терминальную конформацшз оелка, вызываемую низким рН. Это сохранение структуры головки шилп, формируемой большой суОъв-алницэй Ш.1, осльолсние макколекулярт-шх контактов в облаете ствола шла, формируемого малой суогвдиюздеЯ НАЛ, приводящее к ее существенной экспонированпости, ко при полной маскировке адсво«мкзак®их-

ся ^-концов (пзтпйдов слияния).

Прэдлокэке кг-дрль пля изучения молекулирш?.. механизмов яизкш

рН индуцпр?«л>гс здьгмлбос&тьия оодков слияние .(л-.лопв«ннх вкрусол

- J -

и КЛ9Т0Ч1 'X мембран. Модель содерккг больше моноламеллярннв ли-аосош, содержащие иояофор яигерицин в их мембране и зктодомег" гемагглютишта, белка слияния вируса гриппа, в их внутреннем пространстве. Процесс взаимодействия белка с липидным бислоем запускается закяслением липосомального содержимого до рН слияния с помощью нигерицина, добавлением лимошой кислоты во внешнюю среду. Для визуализации структурных перестроек был использован метод трити^вой шшкиграфии. Наблюдаемое нети yBt.memie удельной активности оелка и избирательное увеличение удельной активности гидрофобных аминокислот Ile,Ph.e,Tyr в экспериментальных образцах лило-сом (при рН слияния) по сравнению о контрольным« (при нейтральном рН) подтверждало общепринятую концепцию, соглаг*о которой гидрофобный N-конец НА2 субъединицы гемагглютшшна опосредует взаимодействие с липвдшм бкслоэм.

В процессе работы получены мэчэнныо тритием препараты вируса гриппа нескольких штаммов, различных белков с удельной радио ;тшз-ностыо 3-50-103 расп'мшг'мкг-1. Разработаны схемы выделения основных структурных балков вируса гриппа ряда штаммов' в препаративных количествах.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Первом международном биофизическом и Оиотехяологическом конгрессе (Турция, Диярбакир, 19ЭП, на семинаре Института химической физики РАИ. Диссэртация апробирована на заседании Ученого Совета Института физико-химической биологии игл. А.Н.Белозерского (ЛГУ.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

SlEXSIZM SI объем диссертации. Диссэртация состоит из введения, литературного -обзора (глава I), посвящэ1Шого использованию метода "витиэвой планиграфии для изучения доступной поверхности макромолекул (IЛ), и анализа подходов к изучению структуры и функции сливающих белков оболочечшх вирусов (1.2), экспериментальной части (глава 2), результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов, и списка литературы.

Диссертация изложена на стреа^щах машинописного текста,

содержи таблиц и рисунков. Список литературы включает наименований.

пгащяп гдееода тшейебоЯ шшттшв -

С>юность кзтоцз довольно п? "¡ста (Шинков а.В.,19^6). нуте« тха-дзгхчвахоЯ диссоцчащм молекулярного трктюя иг» раскатанной йСОЛ» noj'btf.ii'.zBun . получг.лл ;;otoi; aiuw'i трития п г-гегп'ли

0,3- 0,4 ЭВ:

2 Т

Получающие"я атомы трития, в условиях высокого вакуума, бомбардируют поверхность мишени, охлавдаемую до низкой (77*К) 'гештерату-а. При етех условиях атомы трития способны замещать водород в С-Н связях шине ни, через сгадат образования свооодного радикала: Т + И-Н —» Я' + нт Т + Н' —» н-т

Эксперимент показал, что практически вся метка включается при пэрво:,. же столкновении налетающего атома с эдекулой мишени. В результате метка сказывается преимукэственно локализованной в участках, стерически доступных для прямого взаимодействия. Если мишень - макромолекула с ярко выраженной пространственной структурой, то распределение метки по фрагментам Судет характеризовать их. стзрическую доступность ш "поверхность" макромолекулы.

Мечениз атомарным тритием вирусных частиц, свободного вирусного бэлкв и липосом проводили на установке,. принципиальная схема которой представлена на рис.1, основу установки составляет цилиндрический реактор, вдоль оси которого натянута вольфрамовая

Рис.I.

Принципиальная схема установки для мочения атомарным тритием, а - реакционный сосуд, б - вольфрамовая спираль, в - термостат с жидким, азотом, г - мишень.

спираль, установки

Вакуумная позволяла

система получать

остаточное давление в реакторе ¡0~4торр.

ооразец для мэчения наносили на внутреннюю поверхность реакционного сосуда. Во время экспериментов мишень термоста-тировели при температуре жидкого азота.

Реактор заполняли газообразным тритием до давления 'О'^торр, что обеспечивало свободный пробег атомов трития от спирали до мхшни. Для получения реакционно спосоошяс вт г мои трития спираль

нагревали в течении 16 секунд до 2000 К шроиегсшм током. Общее время ' экспозиции составляло 1,5 минута.

В результате (лечения получали препарат, содержащий как стабильную /т.е. инфоршщиопцув/ метку, представляюауи собой атомы трития, связанные с атомами углерода, так и лабильную /т.е. неннфор-мационную/, представляющую собой атомы трития, связанные) о другими атомами, как например, в группах -Ш, -зн, -он, -ооон. и легко обмен, вахщиося на водород. Поэтому общая ьъгодология анализа мече-ния белков при тритиевой бомбардировке, включала наряду с обычными методами удаления лабильных атомов трития путем .диализа, лиофяль-ного высушивания, электрофореза и хроматографии, такие еооткйэ метода, как гидролиз белка до аминокислот с пс ;одующим их кс л-Ч0СТВ01ПЖ4 анализом и одновременным счетом радиоактивности.

Данные условия меченяя позволяли получать препараты вируса гриппа с удельной активностью 3-50 расп-мшГ'мкг-1 балка.

содержанке работы

I. Шш^ЩЩ. мочошшх тритием препаратов. Ьл^ягош • бомбардировки на степень мачения и сохранность вирионоя.

Оказалось, что степень мочения шряонов зависит от спос ба приготовления мияепи. В работе использовали два способа подготовки образцов. В порвоя случав кидкие образцы наносила в вида тонкой шгеша на внутреннюю поверхность реактора, зсшрвживвля в ¡гадкск азоте к лиофнлизовалн. Снятый с реактора мечена® препарат вируса частично агрегирован. После "лътразвуковой обработки вирусный' препарат показывал близкую к контрольному гемолитическую активность, что говорило о сохранности структуры и функции гемагглвтя-шша (НА.) в вирусе. При этом, удельная радиоактивность лиочялкзо-венного препарата достигала 2-8-[04расп-мшГ11жг"'. Данный спосоо использовали при изучении структура НА вируса гриппа. В о бглород случае кидкие образцы рас чляли из пульверизатора не заранее охлажденную яадоад азотом внутреннюю стенку врвдащзгося реакционного сосуда, что обеспечивало равномерность нанесения мишени. Прг этом получал! препараты вируса с удельной радиоактивностью 1-7-1 Окраса• шш~' мкг~' белка.

Сохранность меченых вирионов проверяли центрифугированием этих вири'нов в градиенте сахарозы. На рис.2 приведен профиль распределения вирусных частиц в градиенте сахарозы послэ седиментации контрольного 7 меченого препарата вирусе, видна идентичность про-фллз:; сэдгштош а совпадет« пгаш радиоактивности с ыексетумо*

УФ-поглащамцэй: зоны вируса. В верхней часта градиента сахарозы (фракции 16-20) присутствует только обмениваемая метка, нэ связанная с белком. Морфологическую целостность з однородность частиц после мечения оценивали методами светорассеяния (рис.З) и элект-■хзнной микроскопии (не приведено к Частицы оказались идентичными с

______ _____ .. ______ _ Рис.2.

Садшэнтоциоашй -анализ вируса гриппа, меченного атомарным ттатием; а - исходный препарат, б - меченый препарат; градиент сахарозы 10-40Я (п/ч) 30 шш при 30,000 об/мин (ротор Зй40.1); . а - УФ-поглащенво Фракций при длине волны 260 нм,

обгая радиоактивность в пробе.

а ' й ' и

контрольными препаратами к не показали изменений, означают явную структурную дезорганкзацив. Для оценки условий мочения на биологические свойства вируса гриппа, проверяли сохранение инфекционности и гомагглютинирующей активности препаратов после мочения (табл.!). йз данных табл.1 видно, что условии мсчешш но оказывают заметного воздействия на структурную целостность вируса и функции IIA. к ЮЛ6КУ л.

г»р

Рис-3.

Размер частиц в мзчэном препарате вируса' гриппа по данным светорассеяния.

> Vf 4Ш ЯС0

^ücrivuix

Таблица I.

Биологические активности меченых вирусных частиц.

Вирусные препарата ГАЕ* 15 ЗЗД5д*

контроль 1024 9,75 ± 0.25

после процедуры приготовления мишени 256 9,50 ± 0.25

после введения тритие- • вой матки. 256 8,50 ± 0.25

» - РАЕ титрование прово¡дали с \% суспензией эритроцитов кур. ** - Титрование по инфекционности прово. ли путем заракени« 10-кратшми разведениями (по 0,2 мл) вируса гриппа штамма А/РК/8/34 (0,5 мг/мл по белку) 10-дневных куриных эмбрионов.

2. Общая схема анализа мечэния вирусных белков.

Для определения степени мвчания вирусных балков и составляющих их аюпюкнслотных остатков использовали схему эксперимента, предс-тавлеиную на рис.4. Выделение индивидуальных вирусных белков посла мэчешя опытного ш контрольного вирусного препарата проводили по пути I или 2 в зависимости от задачи исследования. В качестве контроля использовали препарат интактного вируса гриппа в ЮОмМ «а01, 10тМ трис-Н01, 1гаИ ЭДТА, рК 7,4 (буфер ТНЭ). При изучении степени мочения вирусных белков в интактном вирионе (контроль) по сравнении с денатурированными вирусными полшептидаш (огш.\п использовали путь I, позволяющий отделять неИрамшшдазу (гхл.> от нуюмопротеида (НР). Для анализа удоль. ;го мочения ¡Ш и идя полипептидов V. их аминокислотных остатков в кислотой инактшшровапном вирусе (о!шт) в сравнешш с контролем применяли путь 2.

В прэдвь. ДТ9ЛЫЯ1Г. экспериментах. балн оятвкооарэввнг; условия ЭЛЗКТрОЭЛЮЦИИ БХШУШШХ ОЭЛКОВ из геля К ДОПОЛНИ"*» ЛЬЩЮ стада? очистки (внетоновое иля иэтанолыюэ осаидтеие, элзктрсдиалга; дл.\-полг ия индивидуальны?: варуганг Сэлкоз, гл еодеркакк: зынеожс-лотннх примесей.

Величии'.: : ольшх радиоактивностей б-щхо-л '.7 ,.) иэлуЧ"}"-. з.^гг'.с-ун удодыдо «главносги аиичсжкслс-г чакдогс тп:; (.\

ошг

ватина препарат (ИА1,ид2,и,нр)

коигрсш.

« I

бомбардировка шпата главны 1

1Енти®5тировлкя5 в грддааэшз ошрози

экстракция НА с НА 2% окгилглйвозвдои

I

ЭЛЕКТКИОРЮ белков

на и ВА нуняеокапсид-Сеякоз нах Валков

элиориорез

Н белков

НА-К?

электрофорез НА

с 25иИ дат

— ш - , 1

НА — ир - нд1

- и - нд2

ашотозашия °н болкоб из ттж

гидролиз белков и раздувшее д]£м01сксл01

I 1

сравнение удельной радиоактивности белков к ИХ лмянокейдот

Рис.4, оощая схема эксперимента.

получаешх из данных аминоюта. тного анализа:

X - 2 АЧ*И.,, где и,-число аминокислот 1-го т.ла в белке.

УЛ 11 1

3. Изучение вируса грунта. Анализ степеш мвчоцяя

ботов в го.1.тактном и денатурированном вирусе,

основной экспериментальный подход данного исследования 'состоял в определении уровня меченая вирусных оелков после бомбардировки ; лешальным ооразоы приготовленной шшени из вирусных частиц потоком атомов трития. На основа этих измерений, сделаны вывода о доступности ослков такому закощэняв, т.е. о их акспо'.гаровшшостк в составе ририона

Рарусше чссг.чцц сели шд&.чени дцумя ттоъ&иан иакоалэс аяпдак из йм&юоихся т гсирь кпн;;<<н?р!фэ»пк<«1 вируса и.» «ляпнтоизирй »1Д-

дости - адсорбцией на эритроцитах цкплегаса и методом, используюмм дифференциальное центрифугирование в условиях выделения неагреги-рованных частиц, относительные до"тупнос..1 мечению основных вирусных белков вируса гриппа, следующие из уровней их удельных радиоактивностей, онпи получены двумя путями: прямым просчетом гелей и суммированием радиоактивностей отдельных аминокислот после аминокислотного анализа гидролизата белка.

В тасл.2 представлены величины удельного мечения основных вирусных. белков из моченых препаратов интпкткого и денатурированного вируса и величины /степень/ их условной окспонированности мечению тритием, получаемые из сравнения этих величин. Из табл. 2 следует, что М1 белок в интактном вирусе в три раза более экспонирован, чем внутретий ш> белок. В денатурированном Еирусе, где, надо полагать, структура вирисна частично дезинтегрирована, удельное мече-ние этих те белков практически одинаково. Величины удельного мочения поверхностного белка НА из штактного и денатурированного вируса составляют'0.3 и 0,6 соответственно,' от величины удельного качения Ш белка. Это вполне объяснимо, т,н. НА гликозилирован • (углеводная часть составляет "17%'массы/. -Если меченый белок являет собой гликоболок, то при гидролизе содержащая метку углеводная часть, расположенная на периферии молекулы белка и частично экранирующая от мечения голипептидную часть белка, отгидролизовывается и при последующем аминокислотном анализе нэ регистрируется. Белковая часть гликооелка будет содержать меньше информативной метки по сравнению с той, какая была бы, если бы белок не был гликозилирован.

Величина относительной степени мечения НА может быть получена при прямом счете радиоактивности гэля после электрофоретического разделения белков меченого вируса. Отпсшешю уделышх радиоактивностей М1 и НА белков в этом случае равно I к "3, что подтверждает' нашу точку арония о значительном мечелии углеводных зЕеньев НА. Данные носят лишь качественный характер, посколько мы специально не занимались определением вероятности мечения моносахаридов, компонентов углеводных цепей.

Таким образом, из наших данных может быть выведена следующая, довольно условная, конечно, степень экспонированпости основных вирусных белков (распределение по этапам;: ир/ш/на 1/3/10.

Если доступность меченкгс атома,»,ш трития Ш белка мы можем объяснить частичной зкспошросакшстко его на внешней стороне мяморены вируса, то в отношении доступности мечению и? оелка паи: рас-с»«д«Н1Я таковы, йо-порвих, нельзя исключить иячеше оежа НР

через канала в мембране, образуемые белком М2, а также и взаимо- • действие о лишдным бислоем и, как следствие, экспонирование некоторых его участков атомам трития. Кроме того, бислой сам по

Таблица 2.

Удельные радиоактивности белков вируса гриппа (А/Р11/8/34).

БЕЛОК Мол. ? масса Денатурир.вирус1 Интактный вирус

I ™ ТМ1 I ™ ТМ1 Относительная экспон -ровен ность-3

Гемагглютишш Ш-белок Ш>-белок 60849 27883 56393 405 ± 40 0,5 881 ± 9 1,0 780 ±20 С,9 123 ± 7 0,3 493 ±36 1,0 164 ± 95 0,3 10 3 1

Миоглоб л4 16214 1220 ±40 1,3 1500 ±360 3,0 10

Удельная радиоактивность (1уД) белка определялась из данных ами-нокисл :ного анализа гидролизата белка со сбором фракций по формуле 1уД= ]>А1*Н1' где г^ число остатков 1-го типа в белке, А^-удельная радиоактивность 1-ой а .лнокислоти. Величины активностей даш в расп'ыин~1мкг~1белка. Результат есть среднее трех отдельных экспериментов.

1 Препарат вируса прогревали 5 мин при 1Ш°С в 6М мочевине с 1$'ДОН. Молекулярная масса белка по данным последовательности гена. 3Степень условной экспонированности мечению тритием гемагглюгшшна взята из данных просчета радиоактивности геля (см.текст). ^Бомбардировке атомарным тритием подвергали вирусную суспензию в смеси со свободам миоглобином (в качестве независимо о контроля).

себе лишь частично защищает свое внутрв! эе содержимое от штока атомов трития. Это и неудивительно, т.к. ослабление интенсивности потока любых частиц, проходящих через слой вещества с плотностью п и длиной X определяется согласно общей формуле Р=Ро * ехр 1-пвХ), где 1' интенсивность потока, з?о - интенсивность на поверхности абсорбирующего слоя, в - Сс лши захвата. Значения п и X - характеристики ОС \ОЛЯЮЦ9ГО поток слоя и зависят ОТ ТОЛЩИН!! бИСЛОЙНОл мембраны и типа . патов. 'Гак, величина удельного мечения шогло&х-на, белка - стандарта, добавленного к интактному вирус;;, был? практачвсь- одинаковы для интпктного и денатурированного Егруса

составляли ~ 1500 opm/nmol. Сравнение величин удельного мечения rfP в составе интактного вируса и миоглобина дает величину F/Fo= 164/1500= 0,11.что близко к величине .¿слабления потока атомов трития мембраной лгагосомы: F/Po= 0,1 (см. ниже). Бислойная мембрана эритроцита отличается большей толщиной (Х) и плотностью (п), и для нее ослабляющий эффект выше и составляет приблизительно 0,01 (Гордеева,1539). Таким образом липидная мембранг. вириона , по всей видимости, по своим характеристикам блике к моноламелярной мембране липосош, что, в общем-то, и следовало ожидать. Отношение соответствующих величин в системо, содержащей денатурированные вирусные частицы, дает величину Р/Ро= 780/1220= 0,64, что указывает на неполную деградацию вирусной частицы в используемых условиях денатурации.

Во всяком сл.учао, полученная в наших экспериментах схема композиции ("укладки") белков в вирионы в целом подтверждает общепринятую точку зрения.

£ТШШ2'ШМ§ аспекты конформации НЕЙ ШИ5Шй •

инактивации Ейруса гриппа.

Для ортсмиксовирусов, з частности вируса гриппа, было показано, что кислая предобработка без мембраны мишени, ипактивирует их, лишая сливающей активности (Stegmann,87),при этом НА-молекула приобретает "терминальную" конформацгоо, структура которой не ясна.

Бомбардировке атомарным тритием подвергали препараты вируса гриппа, термостатированные при pH 5,0 в течении 10 минут при 37 С и затем нейтрализованных (ошт> в сравнении с контрольным интакт-ным вирусом. Суоъединшш гемтгглютишша НА! и НА2 из меченого вируса выделяли как показано на схеме фис.4) по пути 2. Разлитая в меченки субъедишщ НА из контрольных и опытных препаратов вируса были следувышо (см. табл.3):

(а) приведенная удельная радиоактивность НА2 из опытных препаратов вируса (1Б,6) была в ~1,Э раза больше, чем таковая ке из контрольных (8,1);

(О) при этом, в НА2 из опытных препаратов вируса в 1,6 раза были выше удельные активности всех аминокислот; у аминокислот авх, Игг, Не, Туг, Phe и Arg удельше активности были выше з 2 и более раз; удельная радиоактивность Uly не изменилась;

(В! доля включенной метки в сушу гидрофобных аминокислот в НА2 из опытных препаратов вируса (58,-1$) не изменилась по сравнению с туковой из контрольных препаратов (55,Е£);

т! дзстор«рнн?. отличий в мочении аминокислот в HAI из опытных и

Таблица 3.

Сравнение значения удельных радиоактивносгей аминокислот hai и на2 из меченого препарата Еируса гриппа ;штамм A/PPT/p.oßtook).

aMiüio-к-та*

HAI

контроль (РН7.2)

Ii

ошт (РН5.0)

Ч "Т..

КА2

контроль (РИ7.2)

опыт (рН5,0)

Т„

отношение h

Y пыта к контроле

"л

AsX Thr Ser ülx Pro Gly Ala Yal lie Ьеи Туг Phe His Arg

ЗИЭ 5.97 0.89 0.40 2.02 0.28 1.00 4.83

5.31 3.90 1 .<17 1

1.32 2.07

(9.2«) (17-5®) (2.b&) (1 .2%) (5.9£) (0,8%) i2.9%) (14.2,?) (15.6%) (11.5%) (4.9«) (3.7я) (3.9«) (6.1«)

3.35 6. 31 0.99 0.54 •2.39 0.39 1.0 ö 3.31 5.31 4.64 1 .02 1.48 1 .45 4.50

(9.1®) (17.:""?) (£.,,„) (1.5%) (6.5®) (1.1«) (2.7«) (9.02) (14.5«) И2.6Ж) (2.3ж) (4.0«) 0.9%) (12.32)

0.43 0.39 0.25 0.20 0.03 0.38 1 .00 0.81 1 .23 1 .81 0.17 0.45 0.64 0.22

(5-32) U 3%) 0.0%) (3-5ж) (0-9«) (4.7%) (12.3«) (10.0«) (15.1«) (22.2«) (2.1«) (5.5%) (7.8«) (2.7й)

1.35 0.87 0.40 0.50 0.14 0.43 1 .00 1.58 (10. 3.00 (19. 2.83 0.41 1.26 1.18 0.60

(8. (5. (Я, (3. (0. (2. (6

(18 (2 (8 (7 (3

ПОТ v I I")

б»)

6Ä)

г%)

9%)

8S)

4s)

Z%)

3%) ■¿%)

6%) \%) 6%)

3.1

2.2 1.6 1.8 1.8 1.1

2.8 1 .8 ?.7

2347ÜIT7Ö ТЖ/Ш^Л

TB.15±1,0

Ж5.5510.1

UT

* - резуль аты есть среднее значение 2-х независимых опытов;.для ниве-

лировки различий в потоках трития на мишень в разных опытах удельная радиоактивность аминокислот каждого тшш s^) была нормирована на

'а Ла «а*

удельную радиоактивность аланина (Ia)s у^-д^г» УДалыюя ак-

тивности ¿-аминокислоты - (расп/ныоль), rf,-число остатков этой га аминокислоты в полипепшде, а„ и и - тока

•*■ ci <л

для аланина; данные для Trp, Met, cys не представлена из-за частичного разрушения и Невозможности количественной оценки в гидролизатад, Lye - из-за перекрывания пиков радиоактивности Lys и аммиака.

контрольных препаратов вируса не обнаружено.

Для прямого определения включения матки г ы-концевой пептид НА2 субъединицы -"пептид слияния"- был проведан сиквенс 3Н-НА2 из инакгивированяых вирусных препаратов с одновременным анализом радиоактивности во фракциях ФТГ-амшокислот 06 и 23 цикла отщепления ).' Б качестве иллюстрации приведены результаты анализа трех циклов отщепления ФТГ-А1а и < 'Г--¿у (рис.6). Во всех проведенных цшслах отщепления элюати соответствующих ФТГ-ашнокислот не содержали метки. При эт"'М эффективность расщеплен»!« была достаточно высока ^относительный выход для ФТГ-Пе - 2,6 к 10 циклы - составлял 35,4,1).

рис.6.

Анализ ФТГ-аминокислот при сиквенсе меченой НА2 из ош1..эго препарата вируса. Д-В - 5-Й, 7-Й И . 12-Й циклы отщепления. В анализ Орали "0,5 кмоль НА2 ивтф верхней части рис.2 приведены времена выхода ФТГ-аминокислот - стандартов, + - побочных продуктов при сиквенсе. Сбор фракций каждые 20 сек.

1.6 11 16 21 . отаАХАагшгойТмакзгата-н-концевая последовательность КА2 вируса гриппа а/РЯ/8/34 в однобуквенном коде аминокислот.

5,о ю,о 15,о го,о гг.о Время, мин.

Сравнение гистограмм радиоактивности гидролизатов НА2 и укороченного НД2 (после проведения 16-ти циклов отщепления, см.рис.7) говорит об их идентичности и подтверждает тем самым отсутствие метки в н-концевой части IIA2, полученное прямым анализом радиоактивности в отщепляемых аминокислотах.

Таким образом, с позиций структурных перестроек НА явление кислой инактивации вируса гриппа может быть описано следующим образом: сохранение структуры головки шипа, формируемой большой субъедшпщей HAI, ослабление меимолокулярншс контактов в области ствола шипа, формируемого малой субьедишщой НА2, приводящее к ее существенной экспонировпшооти, но при полней маскировке высвобож-дащихся "пептидов слияния".

4GOO-Va Ь-jO-

S

« 3000-.!2500-

8 2000

03 •

mm, мш

Рис.7.

Гистограмма радиоактивности гидролнзатов НА2 и укороченного Н&2 из меченого препарата вируса (штамм A/PR/8/34). ФГК-акинокиолоты хроиа-тографированы со сбором фракций каздые 10 сек.

[] - исходный НД2;

| - укороченный (баз 16-ти N-концевых аминокислот) НА2; для анализа в обоих случаях взято О.Пб нмоль белка (2,8 мкг).

5 Модель для изучения структуры НА в сливающем состоянии.

Для фиксирования структуры М в активном сливающем состоянии, его "вынуждали" взаимодейстг зать с мембраной бислойннх липосом "изнутри". Процесс взаимодействия белка с липидным бислоем запускался закислением липосомального содержимого до рН слияния с помощью ионофора нигерищша, способного обменивать через мембрану ионы Н+ по градиенту на ионы ,К+. Нигерицин встроен в мембрану липосомы. 'Гритиевая бомбардировка поверхности опытных и контрольных липосом и сравнение величии удельного меченая НА при 2-х рК состояниях; а также анализ внутримолекулярного распределения метки в белке позволил несколько детализировать картину происшедших с белком превращений.

В предварительных экспериментах было показано отсутствие сорбции белка на поверхности липосом и сохранение гемолитической .активности гемагглютинина в течении процедур приготовления липосом и »лечения. Структурную целостность липосом в условиях приготовления »шпени для бомбардировки (расшлениз, заморозка - разк0р9зка> показа-л на липосомах, г гр .конных 1ло-Ьуе ¡ик: фииорсфороь: кальцегаом.

Данные, полученные о нашей работе суммировании в таблиц? 4. Обращает на себя внимание 2.факта:

I. большая доступность качению аратиок ВИД в опытны;, лиаосоаех по

сравнению с контролем в "1,7 раза,

2. различия в удельном мечении некоторых аминокислот в ВНА из опытных и контрольных липосом, Л ля трихин, включенного в остатки Не, Туг a Plia в 2-3 раза выше в ВНА из опытных липосом.

Эти факты, безусловно, говорят о гидрофобизацга поверхности ВНА в опытных липосомах. Можно предположить, что в опытных липосомах ВНА, претерпевая конформационноэ превращение ч взамодействуя с мембраной своими гидрофобными участками ставшими иоиорхиостннми как-бы дезорганизует поверхность биелоя, делая его более проницаемым для трития.

Таблица 4.

Сравнение величин удельных активностей ВНА из меченных тритием липосом.

амгою Контроль (рН 7,2) Эксперимент (рН 5.0)

к-та*

I. =AXli±A относительное I=fcdf±A относительное

распределение распределение

метки (J6J четки <51

Asp 8 66 2 28 4.3 1392 + 154 3.9

Thr 3652 ± 122 17-8 3015 ± 1213 8.7

Ser 425 ± 75 2.1 869 + 28 2.5

Glu 1Ьб ± 99 0.9 455 71 1.3

Рго 1280 ± 220 Ь.2 2061 + 189 5.9

ûly 1140 ± 109 5.7 1300 + 663 3.6

Ala 1128 ± 481 . 5-3 320 * 94 0.9

Val ' 1774 ± аз 8.8 2345 ± 708 6.5

Ile 1787 ± 535 3.6 7633 + 1919 21.3

Leu 1218 ± 152 Ь.1 1842 ± 315 5.3

Tyr 1733 ± 275 8.7 5795 + 2503 ' 16.0

Phe 1073 ± ЗЬ2 5.1 5220 + 1870 15.1

His 1776 ± 16 8.я 1202 ± 643 3.5

Arg 2393 ±1041 11 .4 1940 1440 5.4

20375 £1922 I 35387 + 2105

л представленные результаты есть средние величины й-х отдельных

экспериментов. Удельная радиоактивность аминокислотных остатков Бцри::ена в расп-гашГ1 'Ныоль"1 ;11-уорвдаоное количество вклгачен-ноЯ метки в i-ашшоккслотше остатка; относительное распределение катки (55)- зсть it отнесенное kJ ï} и умнонэнное на 100.

Сравнение велютны удельного мечешя свободного ВНА ¡раствор ЗНА при нейтральном рН бил мкшоныо для атомов трития ! равней i97,4« 10- г.лсп-1.мн"1 •кисль~1и ВНА, включенного внутрь липосом (При нейтральном рН, такж>) равной 20,4-l03 pscn-млн"1 •пмоль-1 дао? величину эслбблония аотока Р/г'о равную 0.1. Разница удельной радиоактивности Cîtt, включшлого р лттосому при рН слияния и при к»«т~

ралыюм рН, деленная на удельную радиоактивность свободного ВНА равна 0,07, т.е. примерно 7% поверхности ВНА, включенного внутрь липосом, становится доступной для %-мечения при снижении рН.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность использования метода тритиевой ~ланиг-рафил для изучения молекулярной организации оболочечных вирусов. Описаны условия приготовления мишени из суспензии вируса, введения метки и анализа мечения белковых компонентов.

г. Получены меченные -питием препараты вируса гриппа штаммов ¿./FPV/Rostoolc (H7N1) и A/PR/8/34 (H1N1) с удельной активностью основных вирусных белков, позволяшей их после дующее использование в структурно - биологических экспериментах.

3. Разработаны схемы выделения препаративных количеств основных структурных белков вируса гриппа с использованием препаративного электрофореза в ПААГ.

4. Ылучены дополнительные данные о архитектуре вириона вируса-гриппа. На основе измерений удельного мечения белков сделаны вывода о степени их зкспонированности. Предложена рабочая гипотеза, объясняющая доступность качению внутренних областей вириона.

5. Изучены структурные аспекты изменения конформации гемагглю-тшшна при кислой инактивации вируса. 10-ти минутная инкубация вирусных препаратов при рН 5,0 и 37°С' приводит к существенной экспониров шости малой субъединицц НА2 гем'агглютишша для. меченая. При этом показано, что fi-концевая часть НА2 (пептид слияния) недоступна мечению, т.е. каким-то образом маскирована. Предложена рабочая модель, описывающая терминальную конформацню гемагглктшш-на в неактивном состоянии вируса.

ь. Предложена модель для изучения механизма индуцируемого низким рН взаимодействия вирусных "сливающих белкоь и клеточных мембран. Для визуализации структурных перестроек "белка слияния" использован метод тритиевой планигрь*-®. Используя бромелаином отцепляемый эктодоыен гемагглютанина вируса гриппа в качестве ■бежа, взаимодействующего с липидшм оислоем, получены первые результаты, подтверждающие общую концепцию, согласно которой гид-pcxjc шй м-конец малой cv6irwmtH ответственен за взаимодействие с липидной мембраной.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах^

1. Глушакова С.Е., Вотяков В.И., йсенофонтов А.Л. Выделение гемаг-глютинина вируса гршша и разделение его на субъединицы поэтапной схемой фракционирования.//Вопросы вирусологии. 1988. ЯЗ. C.28S-289.

2. Glushakova Б.В., Keenofontov А.Ь., Pedoro vs. N.7., MazhulL.A., Ageeva O.IJ., HargoHa L.B., Baratova I.A., Shiehkov A.7. A model for the study of the tneohanism of a low pH-induoed interact ion of the virus fusion proteins and cell membranes. // Biosoienoa Reports. 1991. 7.11. N 3. P.131-137.

3. Baratova L.A., Olushakova S.E., Kaenofontov A.L., Fedorova tl.V., Kazhul L.A., Ageeva O.K., iiargolie L.B., Shiehkov A.7. A model for the study .of the meohaniem of a low pfl-induced interaotion of proteins and oell membranes. // I International Biophie. and Biotechnology Kongrsse at GAP,Diyarbakir,Turkey,1991, p.99.

4. Ксенофонтов А.Л., Федорова H.B., Глушакова О.Ё. Препаративное выделение основных структурных белков вируса гр гаа.//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1992.$3-4. С.3-6.

5. Ксенофонтов А.Л., Данилов А.В., Глушакова С.Е., Марголис Л.В., Баратова Л.А., Шишкоз А.В. Структурные аспекты кокформации гомагглютннина при кислой инактивации вируса гршша. Молекулярная биология, 1993, в печати.

Подписано в печать 23.04.1993 г. Зак. 754 Оормат 60x84/16. Гир. 100 ■

Москва. Типография РДСШ