Изучение структурной организации белка и надмолекулярных комплексов методов тритиевой планиграфии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ Р Г Б ОД РЕВОЛЮЦИИ 1 И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУ^АдС^^Н^ЗЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БАРАТОВА Людмила Алексеевна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ МЕТОДОМ ТРИТИЕВОЙ ПЛАНИГРАФИИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор

Н.Ф. Мясоедов

доктор химических наук, профессор

В.М. Липкин

доктор биологических наук

С.Ю. Морозов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН

Защита состоится 24 февраля 1998 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

Москва 119899, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана «•¿о» января 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

Актуальность проблемы. Последние достижения в изучении многих биологических процессов на молекулярном уровне стимулировали поиск и разработку новых подходов к исследованию структурной организации макромолекулярных комплексов, определению размера и состава поверхностей взаимодействующих компонентов системы. На первый взгляд, арсенал методов, используемых для целей изучения пространственной структуры белков и надмолекулярных комплексов, достаточно велик. Однако основным недостатком современной методологии, связанной с использованием традиционных подходов и заключающейся в определении доступности тех или иных функциональных групп или связей макромолекулы действию специфических агентов, является отрывочность получающейся информации, поскольку она позволяет охарактеризовать лишь локальные участки поверхности объекта или структуру ближайшего к реперной группе окружения. И только рентгеноструктурный анализ (РСА) и отчасти ЯМР высокого разрешения дают исчерпывающие данные о пространственной структуре объекта.

Ни в коей мере не умаляя круциальной значимости этих методов, следует однако отметить, что трудоемкость и ряд принципиальных ограничений в достаточной мере затрудняют их применение для изучения пространственной структуры макромолекул и особенно больших и лабильных макромолекулярных структур, а различные методы электронной микроскопии, при всей их значимости, имеют еще довольно низкую разрешающую способность, что недостаточно для деталировки трехмерной структуры. В этой связи представлялось актуальным развитие выдвинутой ранее концепции изучения пространственной структуры белка при помощи тотальной тритиевой метки, что привело к созданию принципиально нового подхода в изучении структурной организации макромолекул и их комплексов. Метод тритиевой планиграфии, по сути, стал первым прямым экспериментальным методом, позволившим на основе данных о доступности аминокислотных остатков для

включения метки, описать всю доступную поверхность объекта, будь то макромолекула, комплекс макромолекул, фрагмент клеточной поверхности или даже целая клетка.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было развитие метода тотальной тритиевой метки до уровня принципиально нового метода изучения доступной поверхности и пространственной организации макромолекул и надмолекулярных систем. Необходимые этапы этой работы включали:

-определение понятия "доступная поверхность" в рамках метода и ряда необходимых для трактовки результатов количественных параметров; -изучение возможности приложения метода тритиевой планиграфии к изучению структурной организации растительных и животных вирусов, целых клеток;

-разработку методологии анализа внутримолекулярного распределения метки по аминокислотным остаткам полипептидной цепи белка;

Самостоятельной задачей исследования было приложение метода тритиевой планиграфии к решению конкретных задач структурного плана на ряде объектов различной степени сложности. И наконец представлялось целесообразным показать возможность применения метода тритиевой планиграфии для целей практической вирусологии.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получила дальнейшее развитие выдвинутая ранее концепция изучения пространственной структуры белков методом тотальной тритиевой метки, что привело к созданию принципиально нового направления в изучении доступной поверхности и пространственной организации макромолекул и надмолекулярных комплексов. Метод не имеет аналогов на мировом уровне. В отличие от существующих экспериментальных подходов для определения доступной поверхности, метод не требует наличия в макромолекуле специфических для модификации групп,

применим к объектам в различных фазовых состояниях, различной степени сложности и масштабов и дает информацию о всей доступной поверхности.

Впервые на примере глобулярного белка парвальбумина щуки III из семейства Са+2-связывающих белков показано, что метод дает прямые экспериментальные данные, позволяющие смоделировать пространственную структуру белка. По сути, заложены основы и начата разработка принципиально новой концепции воссоздания трехмерной структуры белка с привлечением, наряду с традиционно используемыми алгоритмами предсказания элементов вторичной структуры, экспериментальных данных о доступности аминокислотных остатков для включения метки для минимизации числа возможных типов укладки а-слиралей и ß-структур в компактную трехмерную модель.

Продемонстрирована возможность применения метода к изучению структурной организации больших и достаточно сложных надмолекулярных комплексов, каковыми являются вирусы растительного и животного происхождения, субклеточные структуры и даже целые клетки, что, надо полагать, позволит теперь качественно и количественно изменить ситуацию в накоплении структурной информации по подобным объектам. В современной молекулярной биологии аналогичных подходов не существовало.

При исследовании модельного объекта - вируса табачной мозаики (ВТМ) впервые показано, что предполагавшийся до сих пор плотноупакованным белковый "чехол" вириона имеет "дыры" на стыках субъединиц, диаметр которых достаточен для проникновения атомов трития (3-5 Ä) во внутреннюю область вириона. В РСА вируса эти области проявлялись как места с пониженной электронной плотностью.

Использование метода тритиевой планиграфни для изучения топографии поверхности Х-вируса картофеля, одного из наиболее распространенных представителей потексвирусов, позволило получить исчерпывающую информацию о поверхности вириона и предложить модель укладки белка,

разрешив тем самым многолетнее противоречие иммунологических данных о локализации Ы- и С-концевых участков белка в вирионе.

Ярко проявились преимущества метода в применении к таким сложным объектам, каковыми являются оболочечные вирусы. Так в частности, данные о топографии поверхности матриксного М1 белка, одного из ключевых белков вируса гриппа, позволили предложить модель укладки белка в бислойной мембране вируса, что принципиально для дальнейшего изучения структурно-функциональных связей его с другими белками вириона и изучения функции его в зараженных клетках.

Решение ряда задач практической вирусологии требует детального знания антигенной структуры вириона, и в этой связи можно говорить о практическом аспекте приложения метода. На ряде объектов показана возможность использования данных о доступной поверхности для предсказания потенциально возможных антигенных детерминант, что резко сужает круг поиска пептидов- претендентов на подобную роль. Апробация работы . Материалы работы были доложены на IV, V и VII Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Минск, 1977; Баку, 1980; Таллинн, 1987), на I Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1982), на IV Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1987), на Международном симпозиуме по хроматографии в биологии и медицине (Москва, 1986), на 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984), на I Всесоюзном совещании по проблеме биологически- активных соединений, меченных радиоактивными изотопами (Ленинград, 1985), на Международном симпозиуме по молекулярной организации биологических структур (Москва, 1989), на Международном симпозиуме "Вирусология, иммунология и общество" (Киев, 1991), на I Международном конгрессе по биофизике и биотехнологии (Диуарбакир, Турция, 1991), на II Международной конференции по проблеме воды и ионов в биологических системах (Будапешт, Венгрия, 1985), на IX Международном конгрессе по вирусологии (Глазго,

Великобритания, 1993),' на 9 международной конференции по минус-цепочечным вирусам (Есторил, Португалия, 1994), на 15 Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, Израиль, 1991), на X Международном вирусологическом конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996), на 7 конгрессе РАОВМВ(Сидней, Австралия, 1995), на Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), на 21 Международном симпозиуме по ВЭЖХ (Бирмингам, Англия, 1997), на Ломоносовских чтениях (Москва, 1988), а также на научных семинарах НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ и ИХФ им. H.H. Семенова РАН.

Диссертация обобщает данные 30 основных публикаций. Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в настоящем докладе. Работа выполнена в 1977-1997 гг; на разных этапах в работе принимали участие студенты, аспиранты и соискатели МГУ и ИХФ им. H.H. Семенова РАН, работавшие под руководством автора.

1.Основные принципы метода и техника эксперимента

Основу метода тритиевой планиграфии составили результаты исследований химических реакций с участием быстрых частиц (так называемая химия горячих атомов), изучение которых было начато еще в 50- 60-годы в Институте химической физики РАН. Наиболее всесторонне были изучены реакции горячих атомов водорода, главная из которых - реакция замещения. При использовании вместо обычного водорода (!Н) его радиоактивного изотопа трития (3Н) продукт замещения оказывается меченым. Способность горячих атомов трития замещать водород в С-Н связях, использовалась для введения метки в органические соединения в условиях сохранения химической природы исходного вещества.

Образование меченой материнской молекулы возможно одностадийно, по механизму прямого замещения водорода, пороговая энергия которого составляет 1.5 эВ (реакция 1)

s

Т*+ 1Ш-> ИТ + Н (1)

или в две стадии, первая из которых (отрыв водорода от материнского соединения с образованием свободного радикала) характеризуется энергией активации 0.3- 0.4 эВ в зависимости от типа разрываемой связи (реакция 2),

Г + 11Н-> И" +НТ (2)

а вторая стадия- рекомбинация- имеет нулевую энергию активации и происходит при участии любых, в том числе и тепловых атомов трития (реакция 3).

Т+ 1Г-> ИТ (3)

Это означает, что если для частиц с энергией Е > 1.5 эВ возможно замещение по обоим механизмам, то для частиц с меньшей энергией образование продукта будет идти в две стадии (реакции 2 и 3). Для структурных исследований важно, чтобы образование меченого продукта происходило в результате однократного столкновения, для чего и используются атомы трития с энергией порядка 0.4 эВ. Источником атомов трития, энергия которых лежит в диапазоне 0.35<Е<1.5 эВ, служит установка, принцип которой был предложен еше в 1912 г. Лэнгмюром (рис.1). Источник горячих частиц -вольфрамовая нить, нагреваемая электрическим током, располагается в одном сосуде-реакторе с мишенью, охлажденной до температуры жидкого азота. Толщина пленки мишени обычно составляет 0.005 см, что необходимо для обеспечения быстрого отвода тепла, которое, выделяется в мишень за счет поглощения светового излучения вольфрамовой нити, в результате химических реакций и теплопередачи через молекулярный газ. При нагреве нити до 2000 К на ее поверхности происходит диссоциация молекулярного газа и образовавшиеся атомы в условиях свободного пробега до мишени бомбардируют стенки реактора.

Рис. 1. Установка для получения меченых

соединений с помощью термически активированных атомов трития. 1 - реактор; 2 - вольфрамовая нить; 3 -мишень; 4 - ампула с тритием, вскрываемая металлическим бойком; 5 -палладиевый натекатель для дозированного напуска трития; 6 и 7 - датчики для измерения давления

(термопарный и

ионизационный); 8 - сосуд Дьюара с жидким азотом; 9 -ловушка; 10 - насосы.

Средняя энергия атомов составляет 0.17 эВ и в максвелловском спектре атомного пучка ~ 26% атомов трития имеют энергию, достаточную для отрыва водорода (Е > 0.3 эВ). Доля частиц с энергией 1.5 эВ, которые могут замешать водород по механизму прямого замещения (реакция I) мала (<3%), поэтому ее вкладом можно пренебречь. Таким образом, при соблюдении определенных условий: ограничении "верхней" границы энергий бомбардирующих атомов, исключении поступательной диффузии радикалов в матрице и при быстром замораживании водных растворов, позволяющем избежать адсорбции вещества на поверхности мишени и артефактов, связанных с кристаллизацией воды, включение метки будет отражать стерическую доступность соответствующего фрагмента объекта (химической связи, аминокислотного остатка, макромолекулы в сос^ве комплекса и т.д.) для атомов трития.

Возможность изучения структуры макромолекул по включению метки впервые была показана в 1982 г на примере миоглобина кашалота. Согласно данным РСА, 1^-кониевой участок белка представляет собой спираль А, включающую остатки 3-18 (рис.2) и ориентированную таким образом, что часть поверхности спирали

<

обращена наружу, а другая часть находится в "тени", образованной за счет контакта спирали Л со спиралями в и Н и соединяющим их участком цепи. Распределение метки в Ы-концевом участке белка (остатки 1-20) свидетельствовали о том, что метка включалась только в те остатки аминокислот, которые обращены- наружу, а не в остатки, расположенные в области контакта спиралей и недоступные для атомов трития. При сопоставлении величин включения метки с площадями доступной поверхности этих же остатков, рассчитанными Ли и Ричардсом по данным РСА, наблюдалась достаточно хорошая корреляция. Этот эксперимент подтвердил ранее наблюдавшуюся на пептидах зависимость включения метки от ' пространственной структуры и предопределил возможность создания нового экспериментального метода изучения структуры и топографии доступной поверхности макромолекул и надмолекулярных структур -метода тритиевой планиграфии.

Рис.2. Развертка спирального участка А (остатки 3-18) миоглобина. Область "тени", в которой остатки стерически недоступны для атомов трития, заштрихована.

Возможность изучения доступной поверхности и пространственной структуры макромолекул определялась малой величиной пробега реакиионноспособных атомов трития. Расчеты показывали, что при начальных энергиях горячих атомов трития близких к пороговой для реакции отрыва, уже одного нереакционного столкновения достаточно для перевода атома трития в область, в которой отрыв водорода уже невозможен. При прохождении

реакционноспособными атомами трития слоя толщиной в 6Ä, доля их уменьшается от начальной величины 26% до 0.4% (Шишков A.B., 1991).

Аналогичные значения величин пробега были получены и из экспериментов по введению тритиевой метки в адсорбционные слои поверхностно- активных веществ с разной длиной углеводородной цепи от Q до Ci6 (Волынская и др., 1982). Было показано, что изменение толщины слоя на одну метиленовую группу, т.е. на ЗА, существенно меняет выход меченого продукта. Данная величина рассматривалась нами далее как количественная характеристика толщины реакционного слоя. Это означает, что если в качестве мишени рассматривать макромолекулу, то распределение метки по ее фрагментам будет характеризовать их стерическую доступность для столкновения с первично бомбардирующей частицей и свидетельствовать о том, что меченый тритием фрагмент расположен в периферическом слое молекулы, толщина которого не превышает 3-5Ä.

2. Общая методология анализа распределения метки в исследуемом

объекте.

Специфической особенностью включения метки в мишень является отсутствие селективности. Метка включается во все стерически доступные для атаки группы белка: СН-, СН2- и СН3-стабильная (информативная ) метка и NH-, NH2-, SH-, OH-, СООН и COONH? - лабильная, легко обмениваемая с водой метка. И уже первая стадия - определение обшей метки, включенной в образец после удаления меченого растворителя (т.е. определение суммы стабильной и лабильной меток и метки, включенной в прочно связанную с поверхностью макромолекулы воду), позволяет

количественно определить общую площадь доступной поверхности объекта.

Для предварительных оценок, а также для решения довольно широкого круга задач, связанных с изучением обшей архитектуры надмолекулярных комплексов или оценки степени экспонированности его компонентов возможно определение величин удельной радиоактивности компонентов системы прямым сканированием полос геля после удаления лабильной метки из меченого комплекса и фракционирования его компонентов электрофорезом в полиакриламидном геле. Здесь следует, однако, заметить, что сравнение величин удельного мечения индивидуальных компонентов системы, получаемых отнесением значений радиоактивности к массе белка при прямом сканировании гелей, корректно, если химическая природа белков тождественна. При изучении молекулярной организации таких сложных надмолекулярных комплексов, каковым является, например, вирус гриппа, получение корректных данных о удельной радиоактивности вирусных белков прямым сканированием гелей невозможно, поскольку часть белков вириона гликозилирована, а введение метки в углеводную часть затруднено. Причина этого состоит не столько в сравнительно большой степени разрушения углеводов под действием атомарного трития, сколько в малых значениях удельной радиоактивности получающихся меченых препаратов, что обусловлено высоким содержанием в углеводах лабильных атомов водорода.

Для получения данных об обшем аминокислотном составе поверхности объекта и его изменениях при различного рода воздействиях (например, при изучении конформационных переходов под воздействием денатурантов) достаточно бывает определить включение метки в индивидуальные аминокислоты, проводя

аминокислотный анализ гидролизатов белка с одновременным измерением радиоактивности аминокислот в элюате. Кислотный гидролиз белка с последующим тщательным удалением кислоты приводят к полному удалению лабильной метки и получаемые данные величин удельного мечения аминокислот белка, как правило, хорошо воспроизводимы.

Для того, чтобы от величины включения метки перейти к определению стерической доступности или, что то же, к площади доступной поверхности, необходимо было оценить вероятность включения трития в остатки аминокислот разного типа в условиях их одинакового экспонирования. Для оценки относительных реакционных способностей аминокислотных остатков сравнивали включение метки в свободные аминокислоты, короткие пептиды (Гедрович и Бадун, 1992), определяли включение метки в аминокислотные остатки белков с известной пространственной структурой. Хотя результаты разных авторов несколько и разнятся, суммируя их, можно утверждать, что включение метки в остатки разных аминокислот происходит с приблизительно равньгми вероятностями в расчете на одну С-Н связь или на единицу площади доступной поверхности.

Для определения внутримолекулярного распределения метки по всей цепи белка необходимо фрагментирование исходного меченого белка на относительно короткие пептиды с минимальным числом аминокислотных повторов в каждом из них. При этом тактика фрагментации определяется индивидуально для каждого белка, исходя из его первичной структуры. После фракционирования пептидов, их подвергают кислотному гидролизу и анализу их состава с одновременным определением радиоактивности элюата для получения данных об удельном мечении каждого типа аминокислотного остатка в

пептиде. Крупные пептиды на втором этапе могут быть фрагментированы на более мелкие ферментом иной специфичности или специфическим химическим расщеплением. И, наконец, возможен сиквенс пептидов с анализом радиоактивности в каждой из отщепляемых ФТГ- аминокислот.

3.Исследование доступной поверхности белков.

3.1. Термин "доступная поверхность " в решках метода тритиевой

планиграфии.

Из всех имеющихся экспериментальных методов исследования структуры макромолекул лишь РСА высокого разрешения может дать исчерпывающую информацию о пространственной структуре объекта, а, значит, и о его поверхности. Предложены разные способы описания поверхности. Среди них определение поверхности макромолекулы, доступной для молекул воды, имеет особое значение, поскольку последняя играет определяющую роль в формировании, стабилизации и функционировании нативной структуры биополимера. Ли и Ричарде были первыми, когда в 1971 г. для количественного описания доступности аминокислотных остатков в белках для воды ввели специальных термин "доступная поверхность". Ими была разработана программа расчета доступных площадей аминокислотных остатков в белках, исходя из координат атомов, определяемых РСА, и обсчитаны площади доступной поверхности ряда глобулярных белков.

Развиваются и экспериментальные методы исследования доступной поверхности. Наибольшее распространение получили методы, основанные на определении доступности функциональных групп белка различным модифицирующим агентам, протеазам, а также методы, основанные на введении различных флуоресцентных и спиновых зондов. К сожалению, все эти методы позволяют определить только отдельные локальные участки доступной поверхности. Метод

тритиевой планиграфии, благодаря своей неспецифичности при введении метки, оказывается уникальным средством получения информации о всей доступной поверхности.

То, что включение метки коррелирует с доступной поверхностью, может быть проиллюстрировано результатами экспериментов, проведенных с рядом глобулярных белков с известной пространственной структурой, для которых был проведен расчет площади доступной поверхности по алгоритму Ли и Ричарде. Из рис.3 видно, что включение метки и площадь доступной поверхности белков связаны линейно. 1пр = к*5дост., где к - коэффициент пропорциональности, характеризующий вероятность процесса замещения водорода на тритий, нормированный на единицу площади доступной поверхности 18/

3

Т.'

3.7 3.8 3.9 4.0 lgi

Рис.3. Зависимость "приведенной" радиоактивности от площади доступной поверхности белков. 1 - лизоцим; 2 - рибонуклеаза S; 3 - миоглобин; 4 - папаин; 5 -субтилизин BNP; 6 - а-химотрипсин. Величина I включает метку в СН- связях, лабильных группах и в прочно связанной с белком воде, нормированную на поток атомов трития. S-площадь доступной поверхности (А2)

Приведенную зависимость можно рассматривать как калибровочную и с ее помощью определять доступную поверхность глобулярных белков с неизвестной структурой. Отклонения от линейности могут указывать на отличие формы глобулы белка от сферы или на аномально высокой коэффициент шероховатости поверхности и, соответственно, ажурность пространственной структуры. Есть и еще две причины, по

которым пропорциональность между введенной меткой и площадью доступной поверхности может нарушаться.

Первая из них связана с меньшими размерами атома трития по сравнению с молекулой воды (молекулу воды аппроксимируют сферой с радиусом 1.4 А), что приводило не только к количественным, но и качественным различиям характеристик доступной поверхности. Рис. 4а иллюстрирует влияние размера тестирующей пробы на доступность. Вторая причина нарушения пропорциональности связана с принципиальным различием между моделью, положенной в основу расчета площади доступной поверхности по алгоритму Ли и Ричардса и механизмом введения тритиевой метки (рис.4 б).

Рис.4 (а) Доступная поверхность, определяемая пробами разного радиуса, (б) Участки поверхности, недоступные для горячих атомов трития, но доступные для воды.

Впоследствии был предложен иной алгоритм расчета площади доступной поверхности, более адекватно отражающий специфические условия химических реакций, протекающих на поверхности биологического объекта при бомбардировке атомарным тритием. Так, в доступную для включения метки поверхность белка не входят атомы, не связанные непосредственно с атомами водорода. Это атомы кислорода карбонильной группы, атомы серы в дисульфидных связях и метионине, а также группы атомов, из которых включившаяся метка легко удаляется в результате обмена с водой. Из доступной поверхности объекта при тритиевом мечении выпадают также участки

поверхности, стерически недоступные для реакций с падающими по прямолинейной траектории атомами трития. Таким образом, если определяемая по алгоритму Ли и Ричардса доступная поверхность является непрерывной, то в поверхности, доступной для взаимодействия с атомами трития, имеются разрывы, приходящиеся на участки, содержащие вышеуказанные атомы и атомные группы. В принципе, можно было бы ограничиться констатацией этого факта и считать, что метод тритиевой планиграфии дает свою информацию о доступной поверхности макромолекул. Однако, т.к. для понимания молекулярных механизмов многих процессов, протекающих в биологических системах, важно знать доступную поверхность в "классическом" ее определении, то необходимо было определить, в какой мере правомочно соотнесение данных тритиевой планиграфии с расчетом доступной поверхности по алгоритму Ли и Ричардса для "скользящей" пробы. Для этого следовало оценить: 1) значение радиуса сферы для аппроксимации атома трития, при котором расчет по алгоритму "обкатки" ван-дер-ваальсовой поверхности наилучшим образом описывал бы эксперимент по включению метки, 2) установить правомочность использования данных о доступности атомам трития углеводородных фрагментов (СН- связи, стабильная метка) для описания всей доступной поверхности и 3) оценить границы возможной экстраполяции доступности для атомов трития аминокислотных остатков и глобулы белка в целом на пробы с иным радиусом.

3.2. Границы применимости метода.

Для ответа на поставленные выше вопросы было проведено исследование с модельным объектом, белком лизоцимом. Были сравнены величины площадей доступной поверхности

аминокислотных остатков, приведенные в работе Ли и Ричарде с таковыми же, но полученными при расчете по алгоритму Богачевой, разработка которого была вызвана необходимостью: полная программа расчета по алгоритму Ли и Ричарде была нам недоступна. Не останавливаясь на его описании, позволю себе отметить лишь, что в данном алгоритме определяется доступность участков сферической поверхности - ячеек, заключенных между двумя ближайшими "параллелями" и "меридианами", по доступности для тестирующей пробы их узловых точек. В алгоритме же Ли и Ричарде суммируются длины дуг, образовавшихся при разбиении всей макромолекулы параллельными плоскостями и доступных для сферической пробы 1.4 А. Надо отметить, что оба алгоритма приводят к практически совпадающим результатам (рис. 5). Как и следовало ожидать, в области проб малых радиусов 5дост весьма резко снижается

£

02 0« Об 09 5 0 '

9 2 а« 08 9» 1 О Ч

Рис. 5. Зависимость площади доступной поверхности от радиуса тестирующей пробы Яр: а) для глобулы лизоцима; 1- общая площадь доступной поверхности (Эдост-); 2- площадь доступной поверхности углеводородных фрагментов (Здосгсн); б) и в) для аминокислотных остатков; за единицу принята БдостЛ рассчитанная для пробы 0.1А; 1- зависимость для остатка \/а1г с высокой степенью доступности (>70%); 2 и 3- кривые для остатков Х/а1гэ и ТИгбэ с низкой степенью доступности (< 20%); 4- кривая для остатка ТЬг8д со средней степенью доступности.

при увеличении радиуса пробы, что связано со сглаживанием рельефа поверхности глобулы. Начиная с радиуса пробы 1.0 А, значение

площади остается практически постоянным и лишь для очень больших проб (радиус пробы 10 А, данные не приведены) вновь увеличивается из-за увеличения радиуса траектории скольжения. Подобным образом зависит от радиуса пробы и площадь доступной поверхности глобулы, составленная только из углеводородных фрагментов (имитация доступности, определяемая методом тритиевой планиграфии). Для индивидуальных аминокислотных остатков зависимость их суммарной площади доступной поверхности от радиуса пробы оказалась более сложной, причем здесь определяющим фактором явилась их степень доступности в объеме всей глобулы (рис.5 б). Если принять в качестве меры доступности отношение площадей остатка в составе молекулы и в гипотетической развернутой полипептияной цепи, моделью которой может быть, например, транс-пептид А1а-Х-А1а, для пробы 1.4 А, то все остатки по виду зависимости их суммарной площади доступной поверхности от радиуса пробы можно условно разделить на три группы: остатки с высокой степенью доступности (> 70%), средней (20-50%) и малодоступные (<20%). Видно, что разница между доступными и малодоступными остатками остатками нивелируется при малых радиусах пробы. Для пробы 0.1 А плошали доступной поверхности аминокислотных остатков разного типа и разной степени доступности близки друг к другу. Это означает, что "чувствительность" к параметрам пространственной структуры является функцией размеров тестирующей частицы и, начиная с некоторого порогового значения ее радиуса, глобула становится как бы прозрачной для любых частиц с радиусом, меньшим этого порогового значения. И тот факт, что в эксперименте включение метки зависит от пространственной структуры белка, показывает, принимая во внимание сделанные расчетные выкладки, что эффективные размеры атома трития лежат в области значений, близких к 1 А.

Как и в случае глобулы белка, величины Б дост2 и 5Д0СТ сн для аминокислотного остатка, очевидно, должны быть связаны коэффициентами, которые для данного типа аминокислотного остатка должны быть постоянными, что, собственно, и определяло бы возможность перехода от частичной поверхности по данным метода тритиевой планиграфии к полной по данным РСА и наоборот. Однако оказалось, что функциональная связь площади и радиуса пробы имеет различный вид для остатков разной степени доступности и, естественно, коэффициенты пересчета также разнятся. Однако из-за взаимной компенсации ряда эффектов, а также в связи с тем, что вклад малодоступных остатков в общую площадь поверхности белковой глобулы мал, для молекулы в целом получаем, что отношение доступной поверхности СН-связей глобулы к площади всей доступной поверхности в интервале значений тестирующей пробы от 0.1 до 2.0 А практически не зависит от радиуса пробы и в случае лизоцима средняя величина отношения составляет 0.40±0.06. 3.3. Определение эффективной величины радиуса горячего атома трития.

В литературе приводится целый спектр радиусов атома водорода -от 0.5 до 1.2 А и более, что очевидно связано со способом их измерения и является отражением специфики используемого метода измерения. Наиболее корректным способом определения радиуса атома трития в применении к условиям тритиевой планиграфии является, безусловно, сам эксперимент по введению метки. Из сравнения наблюдаемого в эксперименте распределения метки с расчетом для проб различных радиусов можно определить значение радиуса пробы, при котором достигается наилучшее схождение этих двух распределений. В качестве модельного объекта был использован лизоцим (рис.6).

Рис.б. Профиль доступности полипептидной цепи лизоцима' а экспериментальное распределение

тритиевой метки; б - расчет для пробы с радиусом 0.9 А. А/К - удельная радиоактивность аминокислотных остатков, нормированная на вероятность включения метки; Э - площадь доступной поверхности, рассчитанная по алгоритму Богачевой (в А2). N - номер аминокислотного остатка в последовательности цепи.

Экспериментальный профиль доступности лизоцима атомам трития сопоставляли с расчетами для проб с радиусами 0.1- 2.0 А. При этом в качестве критерия сходимости использовали функцию "невязки", характеризующую расхождение расчета с экспериментом для различных радиусов тестирующей пробы. Функция имела четко выраженный минимум при радиусе пробы 0.9 А. Именно это значение и было принято за величину эффективного радиуса атома трития, используя который можно было с наименьшей погрешностью интерпретировать данные по включению метки в терминах доступной поверхности. Естественно, что полученные значения относятся к конкретным условиям эксперимента, а именно, к атомам трития с температурой 2000 К, при давлении молекулярного трития в реакторе 5» 10 -3 мм рт. ст. и расстоянии от нити до мишени 2.5 см (совокупность параметров, определяющих энергию атома трития в момент взаимодействия с мишенью). На рис.6 б приведен профиль доступности аминокислотных остатков в полипептидной цепи лизоцима, рассчитанный для пробы с радиусом 0.9 А. Как можно видеть, результаты расчета довольно хорошо коррелируют с экспериментальным профилем.

Резюмируя сказанное выше, можно констатировать, что тритиевая планиграфия дает образ доступной поверхности так, как ее "видит" атом трития, бомбардирующий мишень в условиях прямого пролета. Этот образ сам по себе достаточно информативен. Однако, данные тритиевой планиграфии могут быть интерпретированы и в терминах, принятых для описания доступной поверхности по Ли и Ричардсу, если ввести определенные коэффициенты пересчета. При этом наилучшее соответствие достигается при аппроксимации в расчетах атома трития сферой с радиусом 0.9 А.

4.Изучекие структурной организации белков с помощью метода тритиевой планиграфии.

Выше уже говорилось о причинах, обусловивших актуальность поиска и развития новых альтернативных путей получения информации с пространственной структуре белков, в том числе и многочисленные попытки теоретических предсказаний третичной структуры. Последние основываются на том очевидном факте, что структура белка, вторичная и третичная, "заложена" в аминокислотной последовательности полипептидной цепи. На существование такой связи экспериментально указали теперь уже ставшие классическими работы Анфинсена по ренатурации белков. И хотя экспериментально ренатурацию удалось наблюдать лишь для нескольких небольших глобулярных белков и для полного восстановления их нативной структуры требовались значительные времена (от нескольких минут до нескольких часов), тем не менее это не охладило пыл теоретиков. Однако с сожалением приходится констатировать, что в отличие от методов предсказания элементов вторичной структуры, теоретическое моделирование пространственной структуры даже на уровне предсказания общего хода полипептицной цепи все еще остается достаточно сложной задачей.

Один из подходов, интенсивно развивающихся в последнее время, основан на теоретическом предсказании областей контактов элементов вторичной структуры и последующей укладке этих элементов в компактную трехмерную структуру. Слабой стороной этого подхода является множественность получающихся гипотетически возможных пространственных структур. Наложение ряда ограничений, касающихся длины и стереохимии перетяжек между а-спиралями, запрета на пересечение перетяжек, учет таких свойств полипептидной цепи, как способность укладываться в уникальные структурные мотивы- все это существенно снижает число альтернативных структур, но выбор только одной корректной модели среди прочих остается, вообще говоря, волюнтаристским. И вполне очевидно, что наиболее перспективными будут подходы, в которых наряду с теоретическими предсказаниями будут использованы параметры, получаемые непосредственно из эксперимента.

Как было уже выше сказано, существование прямой связи между пространственной структурой макромолекулы и ее поверхностью давно показано. Однако из-за ограниченности возможностей экспериментальных методов в получении исчерпывающей информации о поверхности даже постановка задачи воссоздания трехмерной структуры по данным о ее поверхности до недавнего времени казалась невозможной. Метод тритиевой планиграфии, вследствие неселективности при включении метки в объект и универсальности "посадочного" места (т.к. нет более распространенного и при этом относительно равномерно распределенного компонента любой биологической системы, чем атом водорода), а также благодаря отсутствию фактора "чужеродности", связанному с включением метки, дает полную и адекватную информацию о всей поверхности объекта и делает возможным

постановку подобной задачи. Определяемое в эксперименте распределение метки по аминокислотным остаткам белка характеризует их стерическую доступность в составе третичной структуры объекта. Очевидно, что если рассматривать полипептидную цепь как гибкую цепочку и для упрощения не ввести в нее элементов вторичной структуры, как это обычно делается, то, даже используя данные тритиевой планиграфии, попытки уложить ее в трехмерном пространстве с учетом доступности того или иного остатка для включения метки едва ли могут привести к успеху из-за многовариантности способов укладки. Если же предсказанные элементы вторичной структуры рассматривать как жесткие фрагменты, соединенные гибкими перетяжками, и учитывать ряд ограничений, касающихся длины и стереохимии перетяжек и пр., то, в наиболее простом виде, процесс моделирования сведется к поиску такого их размещения в пространстве, при котором все меченые фрагменты белка находились бы на поверхности конструкции, а немеченные составляли бы ее внутреннюю область. При этом, естественно, моделирование существенно облегчает любая дополнительная информация о структуре белка, например, данные о числе и локализации дисульфидных связей, о местах связывания лигандов, субстратов, металлов, о локализации отдельных функциональных групп, данные антигенного картирования.

Впервые такой подход был использован при построении модели пространственной структуры белка, парвальбумина III щуки, относящегося к семейству Ca "^-связывающих белков. Это сравнительно небольшой белок в L08 аминокислот. Для предсказания элементов вторичной структуры белка были использованы два широко распространенных метода: Чоу и Фасмана и Лима. Предсказанные шесть а-спиралей включали 69 аминокислот. Довольно длинные

перетяжки между спиралями (от 6 до 11 остатков) позволяли рассмотреть разные варианты относительного расположения спиральных элементов. Для анализа данных о внутримолекулярном распределении метки использовате фрагментацию белка протеазой У8, что приводило к получению достаточно крупных фрагментов (рис.7). Мы, однако, ограничились одним типом фрагментации из-за наличия ряда факторов, облегчающих задачу моделирования: высокого процента спиральных участков и знания мест связывания кальция.

30 -

ао - !

?о I-

£ 60 л 50 "

^ (О-

I

,----vi----v2 ---~f—-УЗ----vt--4—vs—

Рис.7. Внутримолекулярное распределения тритиевой метки в парвальбумине щуки III. (S/S,,n)%- отношение площади доступной поверхности аминокислотного остатка (СН-связи) в белке к таковой з пептиде Gly-X-Gly (модель 100% доступности остатка. Shrake and Ruplex, 1973). На рисунке указаны также предсказанные 6 спиральных областей белка (A-F), места щепления ферментом и Са*г- связывающие сайты.

Можно видеть, что практически все аминокислоты белка в той

или иной степени доступны для включения трития (здесь, конечно,

следует иметь в виду высокую степень усреднения результатов

вследствие того, что фрагменты белка были достаточно велики). При

построении модели трехмерной структуры белка нами был

использован метод Птицина и Рашина (Ptizyn and Rashin, 1975),

который включает как наиболее существенную часть поиск контактов

между соседними а-спиралями. При этом спирали должны быть

уложены так, чтобы остатки аминокислот с минимальным включением

метки были в области контакта этих спиралей, а не на поверхности. В

данной работе был рассмотрен лишь один порядок сборки, от комплекса, образованного парой наиболее экранированных спиралей как начала образования ядра глобулы. Средняя степень доступности остатка в разных спиральных участках парвальбумина щуки III варьируется, составляя 35.1% в А спирали, 11.0% в В спирали, 8.4% в С спирали, 17.8% в О спирали, 23.4 в Е спирали и 15.6 в Е спирали. В спиралях В и С включение метки ниже всего. Кроме того, на поверхности С и О спиралей имеются кластеры гидрофобных аминокислот и, можно было ожидать, что они вовлечены в формирование гидрофобного ядра молекулы. Укладку полипептидной цепи белка проводили путем последовательного поиска контактов сначала между спиралями С и О, а затем последовательно присоединяли к образовавшемуся комплексу спиралей С и В спирали Е,Е, В и А (рис.8). При выборе относительной ориентации спиралей помогало знание участков связывания калыхия, накладывающее определенные ограничения на расположение друг относительно друга остатков, координирующих ионы кальция.

а б

Рис. 8. Схема последовательной укладки а- спиралей белка в компактную структуру в соответствии с наиболее вероятными зонами контакта, а комплекс спиралей С и 6

(С+О); 6 - присоединение спирали Е (СО+Е); в - присоединение спирали Р (СОЕ+Р); г - присоединение спиралей А и В (СОЕР+В+А).

Для сравнения из аналогичных цилиндров по данным РСА была построена модель парвальбумина карпа, белка, имеющего 62% гомологию по первичной структуре. Модели пространственной структуры обеих белков во многом оказались сходными, но были и различия. "Гак, в частности, угол между осями спиралей С и Б у карпа 90°. а у щуки 30°. Отмечены и различия в наборе остатков, образующих контактные области между различными спиральными участками. Впоследствии алгоритм моделирования был модифицирован, что позволяло определять области контакта спиралей из сравнения их доступностей для трития в изолированном виде и в составе глобулы. Существенным оказалась и сама последовательность сборки: одни и те же исходные данные в зависимости от выбранной последовательности укладки элементов вторичной структуры приводили к существенно отличающимся структурным моделям, однако это направление исследований имеет самостоятельное значение и выходит за пределы данной работы.

5.Изучение надмолекулярных структур. Многокомпонентные макро молекулярные комплексы являются наиболее интересными объектами для приложения метода тритиевой планиграфии. Их трудно получить в кристаллической форме для РСА, а разрешающая способность таких методов, как электронная микроспопия, не позволяют установить тонких деталей структуры.

5.1 Топография доступной поверхности и структура вируса табачной

мозаики.

Данные РСА с разрешением 3.6 А для вируса табачной мозаики (ВТМ) и детальная антигенная характеристика вирусного капсида делали данный объект идеальной модельной системой при отработке

методологии применения метода тритиевой планиграфии для исследования структуры макромолекулярных нуклеопротеидных комплексов. Бомбардировке тритием подвергались целые вирусные частицы в условиях, исключающих возможность селективной ориентации вирионов на поверхности замороженных растворов. Тактика анализа внутримолекулярного распределения трития вдоль полипептидной цепи белка включала ферментативный гидролиз белка трипсином для получения основного набора пептидов белка оболочки ВТМ. Для дополнительного расщепления крупных пептидов использовали ферменты иной специфичности. Из рис. 9 видно, что для включения трития доступны четыре фрагмента белка: остатки 1-15 пептида Т1, остатки 49-68 пептидов ТЗ и Т4, остатки 1-15 Рю2

"WL

f

Рис.9 Внутримолекулярное распределения метки в белке ВТМ. А - удельная радиоактивность аминокислотного остатка, расп.«с'1«мкмаль'1 .Стрелками обозначены антигенные детерминанты белка в составе вируса.

и один или оба треонина (Т]0з и Тцц) пептида Т8 и остатки 141-158, включающие С-концевую аминокислоту пептида Т11 и весь пептид Т12.

По данным РСА ВТМ имеет форму кукурузного початка длиной 3000 А и радиусом 90 А с центральным каналом радиусом 20 А.

Ш

S1

Идентичные белковые субъединицы располагаются по спирали и на один ее шаг приходится 16.33 молекул белка. Вследствие тесного контакта между субъединицами белка на периферии вириона находятся лишь К- и С-концевые участки полипептидной цепи, соответствующие пептидам Т1 и Т12, а также участок, соответствующий пептидам ТЗ и Т4. Остатки аминокислот в этих пептидах должны быть доступны атомам трития, что и было показано экспериментально. Довольно неожиданным оказалось включение метки в некоторые остатки пептида Т8, который по РСА наиболее удален от внешней поверхности вириона и образует так называемую V-колонку длиной 1.5 витка ос-спирали (от Р102 Д° &п2)> расположенную вертикально вдоль оси вируса. Этот пептид образует внутреннюю поверхность центрального канала вируса в котором, согласно данным РСА, располагается вирусная РНК. Основная часть петли 90-113 не видна на карте электронных плотностей дисков белка, но хорошо узнаваема в вирусе. По данным РСА цепь лежит глубоко внутри и начинается от конца Е1К спирали, идет наверх, образует V спираль и далее от 97 до 100 остатка идет Р-складка, соединяющаяся у Тш с ЬК спиралью. Объяснение факта доступности этих аминокислот атомам трития представлялось нам принципиальным для понимания возможностей применения и о граничений метода тритиевой планиграфии для различного рода структурно-биологических исследований.

Количественные оценки показывали, что включение метки в пептид Т8 только через "торцевые отверстия" вириона не могло объяснить всю радиоактивность пептида. Поскольку включение метки обусловлено реакциями нерассеянных (горячих) атомов трития, то отношение удельных активностей аминокислот пептида Т8 к удельным активностям аминокислот того же типа в поверхностных пептидах

должно отвечать распределению потоков атомов, падающих на соответствующие поверхности, а значит не должно превышать величину нескольких процентов. Экспериментально же наблюдалось приблизительно одинаковое включение метки. Сама же белковая субъединица представляет собой плотно упакованную структуру из двух пар а-спиралей, образованных 65 аминокислотными остатками, с обширным гидрофобным ароматическим кластером между ними и допустить проникновение атомов трития через субъединицу довольно трудно. Оставалось предположить, что проникновение трития внутрь вириона происходит через межсубъединичные пространства, в местах контакта трех субъединиц (двух субъединиц из одного ряда и одной из соседнего витка; в вирионе 2130 субъединиц белка). Как следует из данных РСА между соседними белковыми субъединицами имеются области с пониженной электронной плотностью диаметром до 5а, что вполне достаточно для проникновения через них атомов трития с радиусом 0.9 А.

Рис.10 Схематическое представление укладки белковых субъединиц в вирионе ВТМ,

демонстрирующее возможность проникновения атомов трития во внутренние области вириона (БШЬЬз е1 а!.,1977). Я - радиус вирусной частицы, ¿-ее "высота" по центральной оси (А).

Однако трудно представить себе геометрию частицы, чтобы с одинаковой эффективностью метились поверхностные участки и участки на "дне колодцев", т.к. прореагировать способны только те атомы трития, которые подлетают, образно говоря, перпендикулярно к

а, А

60

40

20

КБ]

20

40

60

80 Я, А

входу в колодец (аналогия со светом). В качестве фактора, уменьшающего диспропорцию потоков, может быть рассмотрена шероховатость поверхности белка, играющая определенную роль в некотором рассеивании реакционноспособных атомов трития. Кроме того, не все углы атаки приводят к реакции замещения даже на поверхности молекулы. Следует учесть и возможную "передержку", как в фотографии, когда поверхностные участки уже пометались и идет как бы насыщение тритием фрагментов цепи, расположенных внутри вириона. Через эти каналы происходит и включение метки в РНК. Препараты РНК, выделенные из меченных тритием образцов вируса, содержали значительную радиоактивность даже после 15-кратного переосаждения этиловым спиртом.

Полученные нами результаты разрушают привычный образ ВТМ, представляемого как кукурузный початок с плотно пригнанными одна к другой субъединицами белка, и поддерживаемый в нашем сознании, в частности, тем фактом, что вирусная РНК недоступна для действия различных нуклеаз и модифицирующих агентов, а белковые субъединицы - гидролизу протеолитическими ферментами. Однако здесь еще раз уместно отметить, что оценка доступности зависит от способа ее определения. Малый радиус трития позволяет ему ''видеть" неровности рельефа поверхности изучаемого объекта, "дыры", фиксировать участки, недоступные для контакта с более крупными молекулами. Подобная информация чрезвычайно важна как для получения точных представлений о пространственной архитектуре надмолекулярного комплекса, так и для выявления мест с пониженной, по сравнению с другими участками структуры, плотностью упаковки.

Сопоставление полученной информации о поверхности вириона ВТМ с известной картой антигенных детерминант белка оболочки в

составе вируса позволило говорить о еще одном важном аспекте приложения метода тритиевой планиграфии. Антигенные детерминанты белка в составе ВТМ представлены тремя участками белка. Это 1-10 остатки пептида Т1, 62-68 остатки пептида Т4 и 153158 остатки пептида Т12 (Altschuh et al., 1983). Все эти участки поверхностно локализованы и содержат тритиевую метку. Таким образом, определение доступной поверхности методом тритиевой планиграфии может существенно облегчить работу по выяснению детальной антигенной характеристики объекта, сужая круг поиска пептидов - претендентов на эту роль. Это представляется принципиально важным, поскольку подобная задача является весьма сложной и многотрудной.

5.2. Топография доступной поверхности вируса X картофеля. Модель пространственной укладки белка оболочки в вирусе.

Результаты, полученные на ВТМ, инициировали работу с вирусом X картофеля (ХВК), одним из наиболее распространенных представителей группы потексвирусов, поражающих растения картофеля и наносящих огромный ущерб картофельному хозяйству. Хотя история его изучения не менее продолжительна, чем ВТМ, информация о его структуре и прежде всего о конформации субъединиц белка оболочки и их упаковке в вирионе была существенно более ограничена. РСА с низким разрешением позволял выявить лишь некоторые морфологические особенности вириона, оценить длину вирусной РНК и число белковых субъединиц в составе вириона. Так было известно, что ХВК имеет форму гибкого стержня длиной 5150 А и диаметром 130 А. Как и в ВТМ, вирусная РНК расположена внутри вириона, а капсид вириона образован идентичными субъединицами белка из 236 аминокислот. Данные по антигенному картированию поверхности вирионов потексвирусов к

моменту начала работ были весьма немногочисленны и до некоторой степени противоречивы. Биохимические и иммунологические исследования одних авторов свидетельствовали о локализации на внешней поверхности вирионов только N-концевой части белка оболочки, по другим данным поверхностно экспонированными были и N-, и С-концевые части белка оболочки. На основе предсказаний элементов вторичной структуры для белка оболочки X вируса картофеля Сауером было предположено сходство формирования пространственной структуры белков оболочки вирионов ХВК и ВТМ. Позже результаты мягкого протеолиза трипсином шести штаммов потивирусов, показавшие, что N- и С-концевые области белков оболочки экспонированы на поверхности вирусных частиц, и изучение влияния удаления 30-67 (в зависимости от штамма вируса) N-концевых аминокислот и 18-20 С-концевых аминокислот на инфекционность и серологические свойства вирусов позволили Шукла и др. сформулировать гипотезу о подобии сворачивания полипептилной цепи белка для всех стержнеобразны.х растительных вирусов.

Бомбардировке пучком атомов трития подвергались интактные вирусные частицы, содержащие белок оболочки с молекулярной массой 26кДа, а также вирионы, частично in situ деградированные протеазами клеточного сока с белком оболочки 22 кДа. До облучения препараты вирионов охарактеризовывали по белку (по N- и С-концам и профилям их триптических пептидов) и РНК. Для получения фрагментов меченого белка были использованы два фермента: трипсин и S. aureus протеаза V8. При сравнении профилей доступности атомам трития аминокислотных остатков белка оболочки ХВК из интактных вирионов (рис. 11а) и белка оболочки ВТМ (рис.9) бросается в глаза их резкое отличие. Прежде всего, это отсутствие резких границ между

доступными и недоступными для атомов трития участками, что указывает на более "рыхлую" структуру вирионов ХВК по сравнению с ВТМ. что полностью согласуется с обшей характеристикой вирионов. Резко отличается и распределение метки в белке оболочки из интактных вирусных частиц и in situ частично деградированных (без 19-членного пептида Т1) (рис.11а и 116). В интактном вирионе на первые 19 N-концевых аминокислот белка оболочки приходится -62% от суммарной метки, включенной в белок, что говорит о поверхностной экспонированности этого участка. Полностью недоступен для введения метки С-концевой участок белка. Остатки 204- 236 включают всего -2.3% от суммарной радиоактивности белка. При отщеплении первых 19-ти аминокислот (в препаратах in situ частично деградированного белка) доступность С-концевого участка для введения метки резко возрастает. Те же 204-236 аминокислотные остатки содержат в этом случае -17.5% суммарной радиоактивной метки. Эти результаты подтвердили данные Собер и др. по картированию поверхности интактных вирионов моноклонадьными антителами, в соответствии с которыми только N-концевой пептид экспонирован на поверхности вириона и образует высокоиммуногенную антигенную детерминанту, и позволили локализовать С-концевой фрагмента в вирионе, который располагается как бы под N-концевым участком белка, "обнажаясь" при отщеплении последнего для мечения потоком атомов трития.

Для построения модели укладки белка оболочки ХВК в интактном вирионе наряду с экспериментальными данными о топографии поверхности белка нами были использованы также и теоретические предсказания элементов вторичной структуры.

JLjLlij_UJ

»/J_

ill

1...... „.. I a.

з I-

i .J

AJl

iJJuU-LLii.

i«p остатка

Рис.11. Экспериментальный профиль доступности аминокислот белка оболочки ХВК в а. интактных вирионах и в б. частично in situ деградированных (без 19-членного пептида Т1) лротеазами клеточного сока. По оси ординат отложена удельная активность аминокислотного остатка, отнесенная к сумме удельных активностей всех аминокислот белка (%).

Используя алгоритм Лима, предсказываются как а-спиральные шесть участков: 37-52, 55-70, 72-102. 109-131, 132-139 и 160-170. Две а-спиральные области 55-70 и 72-102 образуют супервторичную структуру а-а-уголок. Эти две а-спиральные области связаны перетяжкой и упакованы крестообразно. В данной структуре, как и практически во всех подобных структурах, в последовательности 55102 белка строго определенное расположение гидрофобных и гидрофильных аминокислот и остатков глицина. Обнаруженный в структуре белка оболочки вируса а-а-уголок резко сокращает число

возможных упаковок остальных а-спиралей, облегчая моделирование пространственной структуры. В белке предсказываются также две протяженные р-структурные области, включающие остатки 1-12, 14-22, 24-33. 145-153, 187-200, 205-217 и 222-234. Последовательные (3-тяжи 1-12. ¡4-22 и 24-33, соединенные перетяжками, образуют (3-слой, который как б:.: "прикрывает" молекулу белка, образуя внешнюю поверхность частицы ХВК. Другой (3-слой, образованный р-тяжами 145-153, 187-200, 205-217 и 222-234, располагается на а-спиральном слое и спрятан в вирусной частице (см. рис.12). В соответствии с этой моделью сопутствующими протеазами клеточного сока может быть удалено до 35 остатков с М-конца полипептидной цепи белка и (3~ слой, образованный остатками 145-217. В наших экспериментах только 19 N-концевых аминокислотных остатков отщепляется. протеазами, однако при хранении препаратов изолированного белка оболочки действительно наблюдается его дальнейшая ступенчатая деградация с образованием минимум трех дополнительных дискретных форм с еще более низкой молекулярной массой, как результат отщепления 19-27 аминокислот с М-конца и 16-30 остатков с С-конца.

Рис.12. Модель укладки белка оболочки ХВК. а-спирали представлены цилиндрами, р-тяжи -плоскими стрелами. Буквами N и С обозначены N1- и С-концевые аминокислоты белка. Положения некоторых аминокислотных остатков пронумерованы.

// ду 1уу1 / На модели укладки белка в вирионе I I М-концевая (3-структурная область,

—_ V- образующая (3-слой, поверхностно

экспонирована, что согласуется с фактом наличия в Ы-концевой области белка

оболочки вирус-специфической антигенной детерминанты.

5.3. Изучение структурной организации вируса гриппа.

Оболочечные вирусы составляют обширный класс, к которому относятся большинство патогенных вирусов животных и человека. Они отличаются от рассмотренных выше ВТМ и ХВК существенно более сложной пространственной структурой, включающей липвдную мембрану, поверхностные и внутренние белки, нуклеиновую кислоту. Весьма сложен и многообразен и механизм их функционирования, включающий этапы проникновение в клетку, высвобождение РНП, репродукцию и др., каждый из которых сопряжен с определенными изменениями конформации и структуры как целого вириона, так и отдельных его компонентов.

Типичным представителем семейства оболочечных вирусов является вирус гриппа А. К настоящему времени накоплен обширный материал о молекулярной структуре вириона вируса гриппа. К сожалению, вирусы гриппа не образуют кристаллов и детальное знание о молекулярной организации вириона ограничивается данными РСА для В НА, растворимого эктодомсна НА, освобождаемого при гидролизе НА с поверхности вирионов бромелаином (ВНА) при нейтральном и кислом рН, нейраминидазы и кристаллической структуры НА в комплексе с высокоаффинными аналогами рецептора. В этом году стали доступными данные РСА для фрагмента матриксного М1 белка. Однако, каким образом структурные белки ориентированы в вирионе и посредством каких сайтов они регулируют свой внутриклеточный маршрут, взаимодействуя с определенными клеточными структурами, определяют узнавание вирусных макромолекул, необходимое для сборки зрелых вирусных частиц, вопросы детальной антигенной характеристики поверхности вирусного капсида и многие другие- все это открытые вопросы.

5.3.1. Модель для изучения молекулярных механизмов мембран-белкового

взаимодействия.

Данные РСЛ для ВНА при нейтральном и кислом рН и последующие работы прояснили в общих чертах перестройку вторичной и третичной структуры гемагглютининовых шипов, происходящую при кислотной трансформации вирионов.

Для сравнительного изучения поверхностной локализации аминокислот в НА вируса гриппа при этом процессе очень заманчивым казалось применить метод тритиевой планиграфии. Для тритиевой бомбардировки использовали суспензии вируса гриппа A/Aichi при нейтральном (рН7.2) и кислом рН (5.0).

Прямое сравнение результатов бомбардировки атомарным тритием нативных и трансформированных кислым рН вирионов вируса гриппа показало, что степень доступности атомам трития аминокислотных остатков в обеих субъединицах НА1 и НА2 ниже после обработки кислым рН и притом в большей степени в НА1, и что в этих трансформированных кислым рН препаратах вируса N-концевой пептид слияния не содержит тритиевой метки, т.е. не становится поверхностно экспонированным. Последний вывод следовал из прямого анализа N-концевой последовательности НА2 и из сравнения значений удельного мечения НА2 до и после сиквенса. К сожалению полученные данные не могли быть однозначно интерпретированы. Гидрофобизация поверхности белка в результате выдерживания вирионов при рН 5.0 приводила к дальнейшим структурным изменениям поверхности всего вириона и, как результат, к частичной агрегации вирионов друт с другом. В связи с этим, экранированность пептида слияния при кислом рН в отсутствие мембраны-мишени также могла быть следствием взаимодействия его с другими гидрофобными участками молекулы НА или результатом

расположения его внутри ствола шипа. Для изучения мембран-белковых взаимодействий, инициируемых кислым рН, необходимо было найти модель, адекватную вирусу гриппа, что сделало бы возможным проведение подобных исследований.

Нами была предложена экспериментальная модель, которая, как мы полагали, адекватно имитировала события, происходящие в эндосомс клеток. В модели, состоящей из липосом, способных выравнивать трансмембранный градиент протонов за счет встроенного нонофора нигерицина, находящийся внутри белок претерпевает структурные изменения после закисления среды и взаимодействует с мембраной липосом "изнутри". Тритиевая бомбардировка внешней поверхности контрольных и опытных липосом и последующий анализ распределения метки в белке позволяют визуализовать характер взаимодействия белка с липидным бислоем, а также выявить конкретные участки белка, задействованные в этом процессе. В качестве белка, взаимодействующего с липидным бислоем, были использован В НА при рН 7.2. т.е. в функционально неактивной конформаиии (контрольные липосомы)- Закисление внешней среды до рН 5.0 и последующее, осуществляемое нигерицином закисление внутреннего содержимого липосом приводило к конформационной перестройке В НА внутри липосом, т.е. к переводу его в функционально активное состояние (опытные липосомы).

При сравнении значений удельной радиоактивности В НА из контрольных и опытных липосом были отмечены большая (в ~ 2 раза) доступность атомам трития ВНА в опытных липосомах по сравнению с контрольными и различие в распределении метки по отдельным аминокислотам. Относительное включение метки в аминокислоты изолейцин, тирозин и фенилаланин в 2-3 раза выше для ВНА из опытных липосом. На данном этапе исследования эти результаты не

могут быть однозначно интерпретированы, хотя в совокупности с уже имеющимися данными других авторов можно сделать некоторые предварительные выводы. Во-первых, большая доступность для включения метки в В НА из опытных липосом по сравнению с контрольными не может быть объяснена, как мы полагаем, экспонированием на поверхности опытных липосом только И-концевой части НА2. По всей видимости, это связано с проникновением вглубь мембраны всей или значительной части макромолекулы ВНА и тем самым приближением ее к "внешней" поверхности бислоя, доступной для атомов трития. Во-вторых, увеличение доступности для включения трития таких аминокислот, как изолейцин, тирозин и фекиладанин, безусловно, говорит о гидрофобизации поверхности ВНА в опытных липосомах. Принадлежат ли все эти меченые гидрофобные аминокислоты только Ы-кониевой части НА2 или же это отражает некий суммарный эффект включения метки в ставшие экспонированными в результате конформационной перестройки ВНА другие части молекулы белка, пока сказать трудно.

Липидный бислой липосом для трития частично проницаем. Сравнение включения метки в свободный ВНА и в ВНА из контрольных липосом показывает, что прохождение липидной мембраны уменьшает поток горячих атомов трития в -10 раз (для мембран эритроцитов нами было показано -100-кратное уменьшение потока). Важно, что при этом не изменяется внутримолекулярное распределение трития, которое отражает конформацию белка и его экспонированность на поверхности мембраны. В самом деле, распределение метки в находившемся вне и внутри липосомы ВНА при одном и том же значении рН 7.2 практически тождественно, но

отличалось от распределения трития в В НА внутри лилосом при рН 5.0.

5.3.2. Изучение топографии поверхности матриксного М1 белка в составе

вируса.

Исключительная функциональная значимость матриксного М1 белка в поддержании структуры вириона, репликации вируса, его функции в зараженных клетках сделали его объектом детального изучения. К настоящему времени накоплена достаточно обширная информация по антигенному и функциональному картированию белка, его внутриклеточной локализации, а данные РСАдля фрагмента М1 белка (остатки аминокислот 2-158) позволили авторам работы предложить модель его укладки в вирусе.

Согласно данным криоэлектронной микроскопии высокого разрешения (-20 Â) в вирусе гриппа А М1 белок проникает лишь во внутренний лист бислоя мембраны, т.е. не имеет в вирионе поверхностно экспонированных участков. Отдельные же публикации о

Л

том, что моноклональные антитела детектируют эпитопы Ml на поверхности вирионоз, считаются, в общем-то, артефактами. Однако уже первые эксперименты по получению меченных тритием препаратов вируса гриппа показали включение метки в М1 белок. Для корректной интерпретации результатов необходимо было ответить на вопрос, сохраняется ли целостность вирусной мембраны в условиях приготовления мишени и ее бомбардировки атомарным тритием, и оценить степень ослабления потока бислойной мембраной. Для получения меченых тритием вирусных частиц с сохранением их интактной структуры и биологической активности был тестирован ряд методов как приготовления мишени, так и выделения меченых препаратов. Оказалось, что для вируса гриппа, куда более лабильного и сложного по сравнению с растительными вирусами, более

приемлимым бьшо не разбрызгивание суспензии вируса на заранее охлажденную до температуры жидкого азота внутреннюю поверхность реакционного сосуда, а намораживание аллантоизной жидкости быстрым вращением реакционного сосуда в жидком азоте. Для выделения вирусных частиц из аллантоизной жидкости использовали наиболее мягкий из имеющихся методов, а именно концентрирование вируса адсорбцией на эритроцитах цыпленка, и метод дифференциального центрифугирования с некоторыми модификациями, обеспечивающими выделение неагрегированных частиц. В отдельных контрольных экспериментах было показано, что процедуры подготовки мишени для введения метки без разрыва даже внешнего листа бислоя выдерживали такие искусственные структуры, как большие моноламеллярные липосомы из смеси фосфатидилхолина и холестерина, лицитина и фосфоэтаноламина и маленькие лецитиновые липосомы, нагруженные флюороформ кальцеином и |4С-ли'зином. Были проведены также контрольные эксперименты, позволившие оценить степень проницаемости бислойной мембраны липосомы. Относительную доступность белков вируса гриппа для включения метки оценивали сканированием гелей.

«Г з 2 1 а 3 2 I

Рис.13. Электрофоретический анализ белков из меченного тритием вируса гриппа А/А:'сМ2/68 (Н3№). а) на радиоавтограф геля; б)сканирование геля, прокрашенного Кумасси Я-250. 1- белки из исходного препарата вируса; 2- белки из меченого препарата вируса; 3- белки вирусного нуклеоида после удаления поверхностных белков вириона из меченого препарата вируса.

Как видно из рис.13, НА и М1 содержат практически всю включенную в вирусные белки

НР'М

метку. Слабая радиоактивная метка наблюдается и в зоне элюции суммы ИР и ]МА белков и, по всей видимости, обусловлена включением трития в белок НА (НА, как и НА, является гликопротеидом и локализован на поверхности вириона, составляя всего ~ 5% от суммы всех белков). Следует иметь в виду, что вирион вируса гриппа имеет 3000 копий белка М1 против 500 копий НА, но даже с учетом этого факта включение метки в М1 белок было достаточным, что позволяло думать о его частичной экспонированности. Однако для М1 белка, анализ внутримолекулярного распределения метки оказался затруднителен. Высокая гидрофобность белка затрудняла его растворение в воде и проведение гидролиза протеолитическими ферментами. Заметим, что с подобными трудностями сопряжен анализ всех мембранных белков. Для МI белка была использована специальная техника анализа, включающая иммобилизацию его на нерастворимом активированном носителе тнопропил-сефарозе 6В. Будучи ковалентно связанным с носителем, белок становится чувствительным к гидролизу трипсином, что делает возможным его фрагментацию и выделение цистеин-соясржаших и цистеин-несодержаших пептидов. Всего, используя высокоэффективную хроматографию, было выделено 24 индивидуальных пептида и определено удельное включение метки в каждом из них. Приняв доступность аминокислот в пептиде Т16, как содержащем максимальную метку, за 100% (т.е. считая его лежащим на поверхности бислойной мембраны вириона) и проведя оценочные расчеты, позволяющие связать включенную в пептид метку с глубиной его погружения в мембрану, был получен "приведенный" профиль доступности.

-80

.-100 1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241

Рис.14. Приведенный профиль доступности пептидов М1белка, выделенного из меченого вируса гриппа A/Aíchi/2/68 (H3N2). При проведении расчетов использован закон Ламберта-Бера, по которому поток, проходя через слой ослабевает по экспоненциальному закону l/l0 = е'"0" , где h- толщина мембраны вируса, равная -50Á. При отношемии потоков равном 0.1, что следовало из контрольных экспериментов с яилосомами, коэффициент ослабления был равен 0.046. h по оси абсцисс (в А)- глубина погружения в мембрану, h равное нулю соответствует поверхности бислойной мембраны.

При этом, мы считали доступными для включения метки пептиды, средняя доступность аминокислот в которых была £ 80% от средней доступности аминокислот в пептиде TI6. И тогда, если считать пептид Т16 лежащем на поверхности бислойной мембраны, то пептиды ТЗ, Т5, TS, Т9, Т12, Т18, T2L и Т22 будут располагаться в ее внешнем листе.

Если принять, что обнаруженные РСА Н1-Н9 а-спиральные участки в кристаллической структуре фрагмента М1 белка сохраняются, когда он находится в вирусе, то при нанесении на карту топологии фрагмента М1 белка данных о доступности тритию, получается картина, представленная на рис.15.

Рис.15. Топология фрагмента (остатки 2- 158) М1 белка с отмеченными участками

включения метки.

Местоположение а- спиралей (Н1-Н9) и петель (L1- L8) и их длины взяты из работы Шао и Луо.

Из рис.15 видно, что классическая упаковка а-спиралей как столбов, пересекающих мембрану, невозможна, с тем чтобы, такую упаковку совместить с данными тритиевой планиграфии. Единственно возможный способ укладки - расположение пучков а-спиралей в плоскости мембраны на разной глубине. При этом спирали должны быть ориентированы не строго параллельно плоскости мембраны, а под углами друг к другу. Так С-конец Н2 спирали и часть петли L2 должны быть ориентированы к поверхности вириона, чтобы быть помеченными, как и N-конец спирали Н4 и петля L3 и т.д. В целом схема укладки этого куска Ml белка в мембране представлена на рис.16. При такой схеме укладки в интерьере вириона находятся остатки, несущие положительный заряд.

Рис.16. Схема укладки части (остатки 1-158) М1 белка в мембране вириона. На рисунке, для простоты изображения, цилиндры, имитирующие спирали, специально разнесены.

Остатки К2Ц Я27, К47, К104 в спиралях и 1172, И76, 1177 и Ш34 в петлях, в принципе, могут взаимодействовать с отрицательными группами фосфатов в РНК.

Особый вопрос - укладка С-концевого домена (остатки 159- 252), для которого нет данных РСА. В отличие от глобулярных белков, для которых методы предсказания элементов вторичной структуры базируются на данных РСА более чем 100 белков, для мембранных белков нет надежных методов предсказания даже спиральных трансмембранных элементов. Располагая данными тритиевого мечения М1 белка в вирусе, нами сделана попытка укладки и этого фрагмента. Используя тот же критерий оценки доступности, что описан выше, показано, что в данном участке последовательности белка имеются две доступные для трития области, включающие остатки 164-187 (пептиды Т16-Т18) и остатки 211-230 (пептиды Т20-Т21). Если предположить, что как и в доменах М и М, спирали формируются аминокислотами, образующими протяженные гидрофобные кластеры, то в "развертке" последовательности 159-252, представленной как единая а-спираль, можно выделить четыре гидрофобных протяженных кластера 165-173, 179-193, 199-219 и 223-251. Далее, используя принцип "ломки" этой большой спирали по Лиму, удается выделить 4 а-спирали, обозначенные как Н10-Н13 и, соответственно, 4 петли Ь9-1Л2. Топология 4-спирального комплекса с обозначением доступных для трития фрагментов и схема укладки его представлены на рис. 17

Предложенная нами модель укладки М1 белка в составе вируса, построенная на основании данных тритиевой планиграфии, знания топологии фрагмента (остатки 2-158) М1 белка из данных РСА и предсказания элементов вторичной структуры для фрагмента 159-252 отличается от модели, предложенной Шао и Луо.

а

НЮ

б

¿7

Щ

Ж

¿ГХ I

хсаг ни

4«

N

С

<-0

Рис. 17. Модель укладки С- концевого домена М1 белка.

Мы полагаем, что уважаемые коллеги несколько спешат, предлагая модель укладки в мембране всего белка на основании знания структуры лишь его фрагмента. Более того, нет особых оснований считать, что в кристалле и в нативном вирусе структуры М1 белка идентичны. Чтобы адаптировать кристаллическую структуру фрагмента М1 (остатки 2-158) к условиям мембранного бислоя вируса, авторы сами вынуждены постулировать некую конформационную перестройку, которая необходима, чтобы экспонировать к мембране высоко гидрофобную поверхность N домена, пригодную для вставки в липидныи бислой, но находящуюся на интерфейсе N и М доменов в кристалле фрагмента. При таком же расположении спиралей, как на нашей модели, бифункциональные свойства М1 белка могут быть легко им реализованы без дополнительных перегруппировок. Дальнейшая детализация картины распределения метки по отдельным аминокислотам М1 белка, безусловно, позволит дать более точную картину его укладки в вирионе.

IV. Трнтиевая планиграфия как экспериментальный метод исследования поверхности целых клеток.

Знание топографии поверхности мембранных структур имеет принципиальное значение для понимания широкого круга вопросов

современной молекулярной биологии клетки. Между тем имеющиеся экспериментальные методы далеко не всегда позволяют получить данные с необходимой степенью деталировки и, как правило, заставляют ограничиться полуколичественными выводами об экспонированности отдельных белковых компонентов, о составе липидного бислоя и т.п. Так например, определить ход полипептидной цепи в мембране с точностью до нескольких остатков аминокислот удалось лишь в отдельных немногочисленных случаях. Возможность применения метода тритиевой планиграфии для изучения топографии бактериородопсина в мембране была показана в 1987г в работе Аленычевой и др., однако перенесение этих результатов, полученных на лиофильно высушенных мембранах, на живую клетку без контрольных экспериментов было бы неправомерно. Это определило выбор в качестве тест-системы для исследования наиболее изученный тип клеток - эритроциты человека. Эритроциты исследовались в виде водных суспензий. Из опробованных буферных систем наиболее пригодным с точки зрения сохранности эритроцитов оказался буферный раствор, содержащий ~15% глицерина. В качестве контроля использовали раствор гемоглобина в воде.

Сопоставление данных удельной радиоактивности индивидуальных аминокислот гемоглобина, меченного тритием в свободном состоянии, с результатами, полученными для гемоглобина, помеченного в составе эритроцита, показало, что значения включенной метки различаются более чем на два порядка. Практически включение трития в гемоглобин внутри эритроцита приближалось к уровню фона сцинтиллятора, т.е. к нулевому. При этом была обнаружена высокая удельная активность мембраны эритроцита. Таким образом на примере клеток крови - эритроцитов -было показано, что при соблюдении определенных условий

целостность клеток сохраняется и плазматическая мембрана является экраном, препятствующим проникновению атомов трития во внутренние сферы клеток, т.е. метод тритиевой планиграфии может быть применен к исследованию клеточной поверхности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, развитие выдвинутой ранее концепции изучения пространственной структуры белков методом тотальной тритиевой метки привело к созданию принципиально нового подхода для исследования пространственной организации макромолекул и надмолекулярных структур. Совокупность данных, полученных для вируса табачной мозаики, подтверждает, что внутримолекулярное распределение трития . в белке оболочки отражает его пространственную организацию в составе сложного нуклеопротеидного комплекса, каковым является вирус, и свидетельствует о том, что такого рода информация может быть использована как для построения пространственной модели, так и для изучения поверхности биологических объектов, структура и состав которой важны для понимания широкого круга вопросов современной биологии.

Получены принципиально новые научные результаты в области исследования структуры ряда белков и надмолекулярных комплексов. Существование однозначной связи между пространственной структурой объекта и доступной для атомов трития поверхностью, впервые продемонстрированное на миоглобине, позволило поставить задачу воссоздания пространственной структуры белка по экспериментальным данным о топографии его доступной поверхности. Достаточно интересны первые результаты, полученные на модели, предложенной для изучения молекулярных механизмов

взаимодействия сливающих белков оболочечных вирусов и клеточных мембран и позволяющей изучать различные стадии в структурной реорганизации сливающих белков в процессе слияния. На примере клеток крови - эритроцитов - показана возможность применения метода тритиевой планиграфии к исследованию клеточной поверхности, что имеет принципиальное значение для понимания широкого круга вопросов современной молекулярной биологии клетки.

Решение ряда задач практической вирусологии требует детального знания антигенной структуры вириона и в этой связи можно говорить еще об одном важном аспекте приложения метода тритиевой планиграфии. Знание меченных тритием участков белка, без сомнения, облегчит работу по выяснению антигенной характеристики объекта, резко сузив круг поиска. Это тем более важно, что подобная задача является достаточно сложной и многотрудной. И наконец, пожалуй, лишь сравнительный анализ данных топографии поверхности изолированного белка оболочки вируса, белка оболочки в составе вируса и в комплексе с моноклональными антителами позволит подойти к решению проблемы определения конформационных детерминант. Пока же это реализуется лишь на уровне возможностей РСА комплексов антиген-антитело в сочетании с сайт-направленным мутагенезом.

В автореферате использованы ссылки на работы

1.Волынская A.B., Скрипкин А.Ю., Шишков A.B. и Гольданский В.И. Докл. АН СССР. 266, 871-874 (1982).

2.Шишков A.B. Химическая физика. 30, 878-900 (1991).

3.Lee В.& Richards F.M., J.Mol.BioI. 55, 379-400 (1971).

4.Гелрович A.B., Бадун Г.А. Мол. Биол., 79, 558-564 (1992). S.Shrake А.& Rupley J.A J.Mol.Biol. 79, 351-371 (1977).

6.Ptizyn 0.B.& Rashin A.A. Biophys. Chem., 3, 1-20 (1975).

7.Altschuh C.. Lesk A.M., Bloomer A.S. & Klug. A. J. Mol. Biol., 193, 693- 707. (1987)

S.Egorov T A. J.Protein Chem., 9, 281 (1990).

9 Lim V.l. J. Mol. Biol., 88, 273- 294 (1974).

10 Namba K. & Stubbs G.Science, 231, 1401-1406 (1986).

11.Sawyer L„ Tollin P. & Wilson H R. J. Gen. ViroL, 68, 1229-1232 (1987).

12. Sliukla D.D., Strike P.M., Tracy S.L., Gough K.H. & Ward, C.W. J.Gen. Virol., 69,

1497- 1508 (1988).

13.Sober J.. Jarvekulg L. Toots I.E.. Radavsky Yu.L., Lillems R.& Saarma, M.J.

J.Gen.Virol., 69, 1799-1807 (1988).

14.Stubbs G.. Warren S. & Holmes K. Nature (London), 267, 216-221 (1977).

15.Sha В. & Luo M. Nature Structural Biology, 4, 239-244 (1997).

ВЫВОДЫ

1. В развитие выдвинутой ранее концепции изучения пространственной структуры белков методом тотальной тритиевой метки разработан принципиально новый подход для изучения пространственной организации макромолекул и надмолекулярных структур.

2. Показана возможность изучения доступной поверхности методом тритиевой планиграфии. Определены условия и границы правомочности экстраполяции данных о включении метки на доступность для тестирующих проб разных радиусов.

3. Предложен алгоритм моделирования пространственной структуры глобулярных белков, включающий в себя использование экспериментальных данных о топографии доступной для мечения тритием поверхности для сужения числа возможных типов укладки предсказанных элементов вторичной структуры в компактную глобулу. Алгоритм использован при моделировании пространственной структуры парвальбумина щуки III.

4. На примере модельногоДобъекта, вируса табачной мозаики, показана перспективность применения метода для изучения надмолекулярных структур.

5. Изучена топография поверхности белка оболочки X вируса картофеля в составе интактных и in situ деградированных вирусных частиц. Предложена модель пространственной укладки белка в вирионе на основе экспериментальных данных, знания биохимических и иммунологических характеристик белка и общих принципов укладки предсказанных элементов вторичной структуры белка в трехмерную модель.

6. Предложена экспериментальная модель для изучения механизма индуцируемого низким рН взаимодействия вирусных "сливающих" белков и клеточных мембран. Для визуализации структурных перестроек белка слияния использован метод тритиевой планиграфии.

7. Изучена доступность основных белков вируса гриппа А для включения тритиевой метки. Изучена топография поверхности матриксного Ml белка в вирионе вируса гриппа А и предложена модель его укладки в бислойной мембране вируса.

8. На примере клеток крови - эритроцитах - показана возможность применения метода тритиевой планиграфии к исследованию клеточной поверхности.

9. Показана возможность использования экспериментальных данных о топографии поверхности индивидуальных белков и белков в составе надмолекулярных структур для сужения круга поиска пептидов, могущих претендовать на роль антигенных детерминант.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Баратова Л.А., Дзантиев Б.Г., Шимчук О.С., Шишков A.B. Образование меченых ФТГ-производных аминокислот при реакциях ускоренных атомов трития с энергией 0.4- 5 кэВ.// Радиохимия, 1974, Т. 16. С. 131- 133.

2. Шишков A.B.. Унукович М.С., Румянцев Ю.М., Баратова Л.А., Белянова Л.П.. Леднева Р.К.., Гольданский В.И. Тотальная тритиевая метка полипептидов и белков как основа высокочувствительного микрометода исследования первичной структуры. // Докл. АН СССР,

1980, Т. 25. С. 751- 754.

3. Баратова Л.А., Гуляев H.H., Филатов Э.С., Нестерова М.В., Северин Е.С., Унукович М.С., Шишков A.B. Получение и идентификация некоторых меченных тритием нуклеотидов-аналогов АТФ и аденозин-3,5- цикломонофосфата. // Радиохимия, 1980, Т. 22, С. 886- 889.

4. Баратова Л.А., Румянцев Ю.М., Симонов Е.Ф., Унукович М.С., Цыряпклн В.А., Шишков A.B. Реакции атомарного трития с аминокислотами. Рацемизация L- аланина. // Химия высоких энергий,

1981, Т. 15, С. 370- 373.

5. Баратова Л.А., Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Унукович М.С., Шишков A.B. Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. I. Свободные аминокислоты как модель остатков в развернутой полипептидной цепи. // Молекулярн. биология, 1982, Т. 16, С. 117-122.

6. Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Шишков A.B., Баратова Л.А., Белянова Л.П. Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. II. Внутримолекулярное распределение трития в N- концевой части миоглобина и третичная структура белка. // Молекулярн. биология, 1982, Т. 16, С. 528- 534.

7. Каширин И.А., Гедрович А.В., Каграманова В.К., Баратова J1.A., Шишков А.В. Использование метода термической активации трития для введения радиоактивной метки в РНК. // Биоорган, химия, 1983, Т. 9, С. 1531- 1534.

8. Джафаров Э.С., Алиев JI.A., Скрипкин А.Ю., Волынская А.В., Баратова J1.A., Шишков А.В. Исследование пространственной структуры сывороточного альбумина человека методом тотальной тритиевой метки. // Изв. АН АзССР, сер. биол. науки, 1985, С. 102110.

9. Каширин И.А., Гребенщиков Н.И., Баратова Л.А., Шишков А.В., Гольданский В.И. Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. III. Использование метода термической активации трития для определения доступной поверхности белка вируса табачной мозаики в составе вируса.//Молекулярн. биология, 1986,Т. 20, С. 1264-1272.

10. Каширин И.А., Гребенщиков Н.И., Баратова JI.A., Шишков А.В., Гольданский В.И. Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. IV. К вопросу о экспонированности для трития проксимального триптического пептида Т8 белка вируса табачной мозаики в составе вируса.// Молекулярн. биология, 1987, Т. 21, С.456-461.

11. Goldanskii V.I., Kashirin I.A., Shishkov A.V., Baratova L.A., Grebenchshikov N.I. The use of thermally activated tritium atoms for structural-biological invastigations: the topography of the TMV protein-accessible surface of the virus. //J.Mol.Biol., 1988, V. 201, P. 567-574.

12. Гордеева JT.В., Баратова JI.A., Марголис Л.Б., Шишков А.В. О возможности изучения топографии мембран клеток методом тритиевой планиграфии. // Биофизика, 1990, Т. XXXIV, С.971- 975.

13. Радавский Ю.Л., Битер С.С., Турова И.П., Зайцева Л.С., Ярвеюольг Л., Саарма М.М., Гребенщиков Н.И., Баратова Л.А. Антигенная структура белка оболочки Х- вируса картофеля. II. Локализация антигенной(ных) детерминант в N- концевом участке белка. //Биоорган, химия, 1989, Т. 15, С. 615-619.

14. Глушакова С.Е., Лукашевич И.С., Баратова Л.А. Выявление предполагаемого пептида слияния в составе поверхностных гликопротеидов аренавирусов. // Вопросы вирусологии, 1990, Т. 13, вып. 5, С.405- 408.

15. Glushakova S.E., Lukashevich I.S., Baratova L.A. Prediction of arenavirus fusion peptides on the basis of computer analysis of envelope protein sequences. // FEBS Letters, 1990, V.269, P. 145- 147.

16. Бобкова E.B;, Гедрович A.B., Анкилова B.H., Лаврик О.И., Баратова Л.А., Шишков А. В. Сравнительное исследование фенилаланин- т. РНК- синтетаз из Е. coli и Thermus thermophilis методом тритиевой планиграфии. // Биохимия, 1990, Т. 55, С. 15701577.

17. Glushakova S.E., Ksenofontov A.L., Fedorova N.V., Mazhul L.A., Ageeva O.N., Margolis L.B., Baratova L.A., Shishkov A.V. A model for the study of the mechanism of a low pH- induced interaction of the virus fusion proteins and cell membranes.// Bioscience Reports, 1991, V. 11, P. 131137.

18. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Shishkov A.V., Kashirin I.A., Radavsky J.L., Jarvakuig L., Saarma M. The topography of the surface of potato virus X: tritium planigraphy and immunological analysis. // J.Gen.Virol., 1992, V.73, P. 229-235.

19. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Dobrov E.N., Gedrovich A.V., Shishkov A.V., Kashirin I.A., Efimov A.V., Jarvekulg L., Radavsky Yu..L., Saarma M. The organization of potato virus X coat proteins in virus particles

studied by tritium planigraphy and model building. // Virology, 1992, V. 188, P. 175-180.

20. Bobkova E.V., Gedrovich A.V., Ankilova V.N., Lavrik O.I., Baratova L.A., Shishkov A.V. Comparative study of the Phe- t-RNA- synthetases from E. coli and Thermus thermophylus by tritium planigraphy methods. // Biochem. Intern., 1990, V.20, P. 1001- 1009.

21. Gedrovich A.V., Shishkov A.V., Goldanskii V.I., Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Eflmov A.V. Modelling protein three-dimensional structure using tritium planigraphy.//Eur. Biophys. J.,1991,V.19, P. 283-286.

22. Шишков A.B., Баратова JI .А. Тритиевая планиграфия биологических систем.// Успехи химии, 1994, Т. 63, С. 825- 841.

23. Ксенофонтов А.Л., Жирное О.П., Данилов А.В., Баратова Л.А. Изучение поверхностной локализации аминокислот в гемагглютинине вируса гриппа при функциональной трансформации вирионов кислым рН. // Молекулярн. биология, 1995, Т. 29, С. 635- 643.

24. Гедрович А.В., Баратова Л.А., Богачева Е.Н., Медведкин В.Н., Шишков А.В. Количественное определение доступной поверхности глобулярных белков методом тритиевой планиграфии. // Молекурярн. биология, 1993, Т.27, вып. 2, С. 309- 315.

25. Богачева Е.Н., Шишков А.В., Шишков А.А., Баратова Л.А. Понятие "доступная поверхность" белка в рамках метода тритиевой планиграфии. Эксперимент и расчет. // Молекулярн. биология, 1993, Т. 28, С. 1035- 1043.

26. Fedorova N.V., Ksenofontov A.L., Viryasov М.В., Baratova L.A., Timofeeva T.A., Zhirnov O.P. Covalent chromatography of influenza virus membrane Ml protein on activated thiopropyl sepharose 6B. // J. Chromatogr. B, 1998 in press

27. Богачева E.H., Мороз А.П., Шишков A.B., Баратова Л.А. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры

белков с помощью тритиевой планиграфии. // Молекулярн. биология, 1996, Т. 30, вып. 3, С. 637- 646.

28. Богачева E.H., Мороз А.П., Шишков A.B., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помошыо тритиевой планиграфии. II. Порядок укладки определяет структуру.// Молекулярн. биология, 1996, Т. 30, вып. 4, С. 885- 892.

29. Богачева E.H., Мороз А.П., Шишков A.B., Баратова Л.А. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью метода тритиевой планиграфии. III. Лизоцим как модель a/ß-белка. // Молекулярн. биология, 1997, Т. 31, N 4, С. 500505.

30. Bogacheva E.N., Goldanskii V.l., Shishkov A.V., Baratova L.A. Tritium planigraphy: From accessible surface to protein spatial structure. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, in press