Сравнение методом тритиевой планиграфии пространственной организации близких надмолекулярных объектов на примере вируса табачной мозаики и его мутанта тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Современные методы изучения структуры биологических систем

2.2. Получение меченых соединений методом термической активации трития

2.2.1. Радикальные реакции атомов водорода

2.2.2. Источник атомов трития и условия мечения

2.2.3. Примеры получения меченных тритием биологически активных соединений

2.3. Основы метода тритиевой планиграфии

2.4. Техника эксперимента и анализ данных в методе тритиевой планиграфии

2.5. Применение метода тритиевой планиграфии для исследования доступной поверхности макромолекул

2.6. Изучение различных биологических систем методом тритиевой планиграфии.

2.6.1. Исследование доступной поверхности белков

2.6.2. Исследование конформационных переходов и внутримолекулярной динамики белков

2.6.3. Моделирование пространственной структуры белков по данным тритиевой планиграфии

2.6.4. Изучение пространственной организации надмолекулярных систем

2.7. Вирус табачной мозаики

2.7.1. Изучение структуры вирионов дикого штамма

ВТМ методом тритиевой планиграфии

2.7.2. Современный взгляд на структуру ВТМ и агрегатов его белка оболочки

2.7.3. Температуро-чувствительные мутанты ВТМ по белку оболочки

2.7.4. Гиперчувствительный ответ при заражении растений тобамовирусами

3. Экспериментальная часть

3.1. Объекты исследования и реактивы

3.2. Накопление и выделение вирионов дикого и мутантного штаммов ВТМ

3.3. Выделение белка оболочки ВТМ

3.4. Схема проведения эксперимента

3.5. Введение тритиевой метки

3.6. Тонкослойная хроматография смесей аминокислот

3.7. Ультрацентрифугирование вирусных суспензий

3.8. Ферментативный гидролиз белков

3.9. Кислотный гидролиз пептидов и белков

3.10. Методы исследования

3.10.1. Стационарное измерение радиоактивности

3.10.2. УФ-спектроскопия

3.10.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе

3.10.4. Аминокислотный анализ с измерением радиоактивности элюата

3.11. Оптимизация условий проточного измерения радиоактивности

Результаты и их обсуждение

4.1. Разработка методики измерения радиоактивности элюата с аминокислотного анализатора с помощью проточного сцинтилляционного счетчика

4.1.1. Особенности измерения радиоактивности элюата

4.1.2. Подбор сцинтилляционных жидкостей

4.1.3. Сравнение результатов проточного измерения радиоактивности элюата и стационарного счета его фракций

4.1.4. Определение параметров регистрации при проточном измерении радиоактивности

4.2. Оптимизация условий введения тритиевой метки на модельной системе

4.2.1. Модельная система

4.2.2. Накопление суммарной радиоактивности смесей аминокислот

4.2.3. Включение тритиевой метки в индивидуальные аминокислоты

4.2.4. Экранирующее действие воды при введении метки

4.3. Исследование эффективности включения тритиевой метки в белок оболочки дикого штамма вируса табачной мозаики в зависимости от времени реакции

4.4. Сравнительное изучение пространственной организации дикого вируса табачной мозаики (U1) и его мутанта ts21

4.4.1. Введение метки и фрагментация белка оболочки

4.4.2. Сравнение результатов введения тритиевой метки в дикий и мутантный белок оболочки в различных агрегационных состояниях

4.4.3. Расчеты доступной поверхности для белка оболочки дикого ВТМ (U1)

4.4.4. Различия в пространственной организации дикого ВТМ (U1) и его мутанта ts21и их роль в индукции гиперчувствительного ответа

5. Выводы

Современные достижения в изучении многих биологических процессов на молекулярном уровне стимулировали поиск и разработку новых подходов к исследованию структурной организации многокомпонентных надмолекулярных объектов, определению размера и состава поверхностей взаимодействующих компонентов таких систем. Основным методом установления пространственной структуры молекул белков и нуклеиновых кислот, а также их специфических надмолекулярных комплексов, был и остается метод рентгеноструктурного анализа (PCА). В последнее время к нему добавилась и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Однако использование обоих этих методов не свободно от существенных ограничений. Методом ЯМР на сегодняшний день удается исследовать биологические молекулы и их комплексы с молекулярной массой не более -30 кДа. Использование же метода PC А, как правило, требует предварительного получения высокоупорядоченных кристаллов исследуемого объекта, что, во-первых, зачастую представляет собой трудноразрешимую задачу, и, во-вторых, может приводить к изменению структуры молекул по сравнению с той, которую они имели в растворе.

Одним из альтернативных методов исследования структуры биологических объектов является разработанный в нашей стране метод тритиевой планиграфии (от латинского planum - поверхность и греческого grapho - пишу). За работу "Химия горячих атомов трития как основа метода исследования поверхностных молекулярных слоев и структуры биополимеров" коллективу авторов, разработавших данный метод, была присуждена Государственная премия Российской Федерации в области науки и техники (2000 г.). Метод тритиевой планиграфии позволяет определить стерическую доступность углеводородных групп исследуемого биологического объекта (макромолекулы или надмолекулярного комплекса) при бомбардировке его атомарным тритием, образующимся при диссоциации молекулярного газа на нагретой до 2000 К вольфрамовой проволоке. Результатом бомбардировки, проводимой в специальной вакуумной установке, является химическое замещение водорода на его радиоактивный изотоп тритий, которое происходит во всех стерически доступных элементах объекта в тонком поверхностном слое мишени. Последующий анализ распределения метки по индивидуальным аминокислотным остаткам молекулы белка позволяет с достаточной точностью идентифицировать поверхностно-локализованные участки молекулы (или молекул в составе надмолекулярных комплексов). При этом высокая чувствительность метода тритиевой планиграфии позволяет регистрировать весьма малые изменения пространственной структуры, не обнаруживаемые другими традиционными методами.

Установление молекулярных механизмов патогенеза является едва ли не центральной проблемой при изучении взаимодействия "патоген-хозяин" в самых разных системах. Необходимым условием для проведения исследований такого рода является наличие адекватных модельных систем, в которых изменения структуры патогена вызывают строго определенные изменения реакции организма-хозяина. В растительной вирусологии такие модели появились сравнительно недавно. Одна из наиболее изученных моделей этого типа - комбинация вируса табачной мозаики (ВТМ) и растений Nicotiana sylvestris, несущих ген устойчивости N'. Показано, что на этом хозяине дикий (U1) штамм ВТМ вызывает системную реакцию (мозаику - желто-зеленые пятна на листьях), а большинство других тобамовирусов и целый ряд мутантов штамма U1 - некротическую реакцию (формирование некрозов - маленьких точек - на инфицированных листьях). Считается, что формирование некрозов является защитной реакцией растения и происходит путем индукции соответствующей клеточной системы. Для комбинации 'W. sylvestris - ВТМ" было показано, что за включение (или не включение) системы некротической реакции ответственен белок оболочки, и даже одиночные аминокислотные замены в белке штамма U1 могут вызывать переход от системной реакции к некротической.

Сравнительно недавно на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова был выделен и охарактеризован новый мутант ВТМ по белку оболочки, вызывающий некротическую реакцию на растениях N. sylvestris. Было показано, что белок оболочки этого мутанта несет две аминокислотные замены (изолейцин-21 -» треонин и аспарагиновая кислота-66 -» глицин), и что эти замены приводят к уменьшению термостабильности изолированного белка оболочки данного мутанта, который получил название ts21-66. Можно предположить, что указанные замены вызывают изменения пространственной структуры белка оболочки ВТМ, которые являются причиной с одной стороны температурной чувствительности мутантного вируса (и препаратов его белка оболочки), а с другой - причиной некротической реакции на заражение этим вирусом растений-хозяев, несущих ген N'. Таким образом, этот мутант и его белок оболочки представляют собой удобную модель для идентификации конкретных элементов структуры, вовлеченных во взаимодействие с системой некротической реакции.

Пространственная организация вируса табачной мозаики достаточно хорошо изучена. Структура вируса дикого штамма U1 определена методом дифракции рентгеновских лучей на ориентированных нитях вирионов с разрешением 2.9 А. Кроме того, с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.4 А определена структура четырехслойного дискового агрегата белка оболочки ВТМ U1. Также ранее методом тритиевой илаииграфии была изучена топография доступной поверхности белка оболочки ВТМ U1 в составе вирионов, и полученные результаты хорошо согласовались с данными рентгеноструктурного анализа. Для мутанта ts21-66 данных рентгеноструктурного анализа нет, и их получение представляется пока малореальной задачей. Таким образом, при наличии данных рентгеноструктурного анализа для ВТМ U1 использование возможностей метода тритиевой планиграфии для структурных исследований может позволить выявить изменения структуры в белке оболочки мутанта ts21-66 по сравнению с диким штаммом ВТМ U1.

Цель настоящей работы - обнаружение методом тритиевой планиграфии различий в пространственной организации субъединиц белка оболочки дикого штамма вируса табачной мозаики U1, вызывающего системную инфекцию на растениях, несущих ген устойчивости N', и его температурно-чувствительного мутанта ts21-66, вызывающего на таких растениях некротическую реакцию.

Объекты исследования - белок оболочки и цельные вирионы дикого вируса табачной мозаики U1 и мутанта ts21-66. Белок оболочки и дикого, и мутантного штамма состоит из 158 аминокислотных остатков, при этом мутантный белок отличается от дикого двумя аминокислотными заменами: изолейцин-21 треонин и аспарагиновая кислота-66 -> глицин.

Для проведения структурных исследований вируса табачной мозаики методом тритиевой планиграфии нам потребовалось провести ряд модельных экспериментов с целью оптимизации условий введения тритиевой метки и параметров системы анализа меченых препаратов.

Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

1. Впервые для измерения радиоактивности меченных тритием аминокислот в элюате с аминокислотного анализатора Amino Acid Analyzer 835 (Hitachi, Япония) использован проточный сцинтилляционный счетчик Radiomatic 150TR Flow Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co, США). Разработана методика проточного измерения радиоактивности, определены оптимальные параметры системы анализа. Использование проточного счетчика позволило существенно повысить точность и воспроизводимость анализов.

2. Оптимизированы условий введения тритиевой метки в препараты, исследуемые методом тритиевой планиграфии. Изучено влияние времени мечения и давления молекулярного трития в системе на эффективность включения трития в смеси аминокислот и в вирионы вируса табачной мозаики. Показано, что максимальная контрастность при определении поверхностных участков исследуемых данным методом мишеней в использовавшейся системе введения метки достигается при проведении атомизации трития в течение не более 1 мин и давлении молекулярного трития ~0.5 Па.

3. Впервые метод тритиевой планиграфии использован для сравнения структуры близких надмолекулярных объектов. Для дикого ВТМ (штамм U1) и его температуро-чувствительного мутанта (ts21-66), отличающегося по симптомам инфекции на определенных типах растений-хозяев, получены распределения тритиевой метки по полипептидной цепи белка оболочки, подвергнутого бомбардировке атомарным тритием как в свободном виде, так и в составе цельных вирионов.

4. При сравнительном анализе включения тритиевой метки в полипептидную цепь белка оболочки для свободного белка значимых различий между штаммом U1 и мутантом ts21-66 не обнаружено, а в вирионах наблюдалось двукратное уменьшение включения метки в N-концевую область белка оболочки мутанта ts21-66 по сравнению с соответствующей областью белка оболочки штамма U1.

5. Предложена модель механизма участия N-концевого сегмента молекулы белка оболочки ВТМ в определении симптомов вирусной инфекции, согласно которой этот сегмент отвечает за ингибирование вирионами (или спиральными агрегатами белка оболочки) штамма U1 N' защитной системы растений. Маскировка данного участка у мутанта ts21-66 приводит к развитию защитного ответа и подавлению вирусной инфекции.

Практическая значимость работы:

Результаты модельных экспериментов и апробации выбранных условий введения радиоактивной тритиевой метки и анализа ее внутримолекулярного распределения на исследованных в работе объектах могут быть широко использованы при решении ряда задач в физико-химической и молекулярной биологии для структурных исследований биологических систем методом тритиевой планиграфии.

Изучение действия различных патогенных организмов на их хозяев является одной из основных задач биологии. Результаты настоящей работы проливают свет на молекулярные механизмы защиты растений от вирусной инфекции и механизмы, используемые вирусами для преодоления этих защитных систем. Расшифровка таких механизмов необходима для разработки эффективных методов борьбы с вирусными инфекциями.

Результаты, полученные в настоящей работе, нашли отражение в курсах лекций "Методы получения меченых органических соединений", "Жидкостно-сцинтилляционный метод измерения радиоактивности", "Радиохимические методы исследования в биохимии и молекулярной биологии", читаемых на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Кроме того, результаты работы используются при постановке задач специализированного практикума "Физико-химические методы анализа белков и нуклеиновых кислот".

Апробация работы. Результаты работы доложены на 3-ей Международной конференции по изотопам (Ванкувер, Канада, 1999 г.), на 7-ом Международном симпозиуме по синтезу и применениям изотопов и изотопно-меченых соединений (Дрезден, Германия, 2000 г.), на 8-ой Международной конференции по проточному анализу (Варшава, Польша, 2000 г.), на 3-ей Российской конференции по радиохимии (Санкт-Петербург, Россия, 2000 г.), на 1-ой Всероссийской молодежной научной конференции по фундаментальным проблемам радиохимии и атомной энергетики (Нижний Новгород, Россия, 2001 г.), на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 98, 99, 2000, 2001, 2002", а так же на научной конференции МГУ "Ломоносовские чтения - 1999".

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 9 работах, в том числе в 3 статьях в российских научных журналах ("Радиохимия" и "Молекулярная биология") и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

Вклад автора в разработку проблемы. В основу диссертации положены результаты научных исследований, выполненных непосредственно автором в период 1998-2001 гг. Работа выполнялась в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова на Факультете наук о материалах, в лаборатории радионуклидов и меченых соединений кафедры радиохимии Химического факультета, на кафедре вирусологии Биологического факультета и в отделе хроматографии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Работа проведена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 99-04-48999а и 01-04-06555мас).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 4 таблицами. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов, списка цитируемой литературы, который содержит 142 ссылки, и приложения.

5. Выводы

1. Разработана методика проточного измерения радиоактивности меченных тритием аминокислот в элюате с аминокислотного анализатора, определены оптимальные параметры системы анализа. Использование проточного сцинтилляционного счетчика позволило существенно повысить точность и воспроизводимость анализов.

2. Для выбора оптимальных условий сравнения структуры близких объектов методом тритиевой планиграфии проведены модельные эксперименты по введению тритиевой метки в смеси аминокислот и в вирионы вируса табачной мозаики. Показано, что максимальная контрастность при определении поверхностных участков исследуемых данным методом мишеней в использовавшейся системе введения метки достигается при проведении атомизации трития в течение не более 1 мин и давлении молекулярного трития -0.5 Па.

3. Для дикого вируса табачной мозаики (штамм U1) и его температуро-чувствительного мутанта (ts21-66), отличающегося по симптомам инфекции на определенных типах растений-хозяев, получены распределения тритиевой метки по полипептидной цепи белка оболочки, подвергнутого бомбардировке атомарным тритием как в свободном виде, так и в составе цельных вирионов.

4. При сравнительном анализе включения метки в случае препаратов свободного белка оболочки значимых различий между штаммом U1 и мутантом ts21 -66 не обнаружено. В то же время при бомбардировке тритием цельных вирусов наблюдалось двукратное уменьшение включения метки в N-концевую область белка оболочки мутанта ts21-66 по сравнению с соответствующей областью белка оболочки штамма U1, что свидетельствует о различиях в пространственной организации этих белков в составе вирионов.

5. Предложена модель механизма участия N-концевого сегмента молекулы белка оболочки вируса табачной мозаики в определении симптомов вирусной инфекции.

1. Clore G.M., Robien М.А., Gronenborn A.M. Exploring the limits of precision and accuracy of protein structures determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy. // J. Mol. Biol. 1993. V.231. N.l. P.82-102.

2. Henderson R., Baldwin J.M., Ceska T.M., Zemlin F., Beckmann E., Downing K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. // J. Mol. Biol. 1990. V.213. N.4. 899-929.

3. Wang D.N., Kuhlbrandt W.J. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. // J. Mol. Biol. 1991. V.217. N.4. P.691-699.

4. Holzenburg A., Wilson F.H., Finlow M.E., Ford R.C. Structural investigations of membrane proteins: the versatility of electron microscopy. // Biochem. Soc. Trans. 1992. V.20.N.3. P.591-597.

5. Arakawa H., Umemura K., Ikai A. Protein images obtained by STM, AFM and ТЕМ. // Nature. 1992. V.358. P.171-173.

6. Colacicchi S., Ferrari M., Sotgin A. In vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy/imaging: First experiences, problems, and perspectives. // Int. J. Biochem. 1992. V.24. N.2. P.205-214.

7. Thompson J.A., Lau A.L., Cunningham D.D. Selective radiolabelling of cell surface proteins to a high specific activity. // Biochemistry. 1987. V.26. N.3. P.743-750.

8. Robertson B.H., Brown V.K., Holloway B.P., Khanna В., Chan E. Structure of the hepatitis A virion: identification of potential surface-exposed regions. // Arch. Virol. 1989. V.104. N.l-2. P.117-128.

9. Schimmel P.R., Schoemaker H.J.P. Mapping the structure of specific protein-transfer RNA complexes by a tritium labeling method. // Methods Ensymol. 1979. V.59. P.332-350.

10. Шишков A.B., Баратова Л.А. Тритиевая планиграфия биологических систем. // Успехи химии. 1994. Т.63. №.9. С.825-841.

11. Баратова Л.А., Богачева Е.Н., Гольданский В.И., Колб В.А., Спирин А.С., Шишков А.В. Тритиевая планиграфия биологических макромолекул. М.: Наука. 1999. 175 С.

12. Богачева Е.Н., Шишков А.В. Тритиевая планиграфия как инструмент исследования пространственной структуры белков и их комплексов. // Молекуляр. биол. 2000. Т.34. №.5. С.839-853.

13. Нейман Л.А., Смоляков B.C., Шишков А.В. Радиоизотопные методы в физико-химической биологии. Использование реакций атомарного трития. // Итоги науки итехники. Серия: Общие проблемы физико-химической биологии. М.: ВИНИТИ. 1985. Т.2. 208 С.

14. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. Физико-химические и ядерно-химические способы получения меченых органических соединений и их идентификация. М.: Энергоатомиздат. 1987. 144 С.

15. Bennett J.E., Mile В. Studies of radical-molecule reactions using a rotating cryostat. Reactions of hydrogen atoms with organic substrates at 77 K. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. I. 1973. V.69. N.8. P.1398-1414.

16. Дубинская A.M. Взаимодействие атомов водорода с твердыми органическими веществами. // Успехи химии. 1978. Т.47. №.7. С.1169-1199.

17. Пшежецкий С.Я., Котов А.Г., Милинчук В.К. ЭПР свободных радикалов в радиационной химии. М.: Химия. 1972. 480 С.

18. Tria J.J., Hoel D., Johnsen R.H. Kinetics of radical decay in crystalline amino acids. 7. Monohydrates. // J. Phys. Chem. 1979. V.83. N.24. P.3174-3179.

19. Каюшин Jl.П., Пулатова М.К., Кривенко В.Г. Свободные радикалы и их превращения в облученных белках. М.: Атомиздат. 1976. 268 С.

20. Smith С.J., Poole С.P., Farach Н.А. ESR kinetics study of the decay of low-temperature radicals in glycine and p-alanine. // J. Chem. Phys. 1981. Y.74. N.2. P.993-996.

21. Макаров B.A., Филатов Э.С., Несмеянов Ан.Н. Реакции атомов водорода с замороженными углеводородами при 77 К. I. Циклогексан. // Химия высоких энергий. 1969. Т.З. №.5. С.413-420.

22. Langmuir I., Mackey G.M.J. The dissociation of hydrogen into atoms. Part I. Experimental. //J. Am. Chem. Soc. 1914. V.36. P.1708-1722.

23. Langmuir I. The dissociation of hydrogen into atoms. Part II. Calculation of the degree of dissociation and the heat of formation. // J. Am. Chem. Soc. 1915. V.37. P.417-458.

24. Moore G., Unterwald F. Thermal dissociation of hydrogen. // J. Chem. Phys. 1964. V.40. N.9. P.2639-2652.

25. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф., Шишков A.B., Могильников В.П. Получение аоаланина- Н воздействием атомарного трития, нагретого до 2000 К, на твердую мишень аланина при 77 К. //Радиохимия. 1979. Т.21. №.6. С.909-913.

26. Макаров В.А., Филатов Э.С., Несмеянов Ан.Н. Реакции атомов водорода с замороженными углеводородами при 77 К. II. Циклогексен. // Химия высоких энергий. 1969. Т.З. №.5. С.463.

27. Шишков А.В., Филатов Э.С., Симонов Е.Ф., Унукович М.С., Гольданский В.И., Несмеянов Ан.Н. Получение меченых тритием биологически активных соединений. //Докл. АН СССР. 1976. Т.228. №.5. С.1237-1239.

28. Асатрян Р.С., Герман К.Э., Филатов Э.С., Несмеянов Ан.Н. Механизм взаимодействия атомарного трития с функциональными группами аминокислот. Квантовохимические расчеты и эксперимент. // Радиохимия. 1982. Т.24. №.5. С.567-569.

29. Баратова Л.А., Румянцев Ю.М., Симонов Е.Ф., Унукович М.С., Цыряпкин В.А., Шишков А.В. Реакции атомарного трития с аминокислотами. Рацемизация L-аланина. //Химия высоких энергий. 1981. Т.15. №.4. С.370-373.

30. Орлова М.А., Симонов Е.Ф., Филатов Э.С. Исследование реакций атомарного трития с аминокислотами. III. Низкотемпературные реакции атомов трития с фенилаланином и тирозином. // Химия высоких энергий. 1979. Т.13. №.5. С.468-473.

31. Шишков А.В., Нейман JI.A., Смоляков B.C. Получение меченых органических соединений действием атомарного трития. // Успехи химии. 1984. Т.53. №.7. С.1125-1151.

32. Гедрович А.В., Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Унукович М.С., Шишков А.В. Получение меченых полипептидов и белков с использованием термически активированных атомов трития. // Радиохимия. 1984. Т.26. №.4. С.483-494.

33. Коваленко В. А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Молекулярная организация электровозбудимой мембраны. I. Выделение фракций плазматической мембраны из нервов камчатского краба и их характеристика. // Биоорг. химия. 1981. Т.7. №.12. С.1813-1827.

34. Волынская А.В., Скрипкин А.Ю., Шишков А.В., Гольданский В.И. Исследование структуры адсорбционных слоев поверхностно-активных веществ методом тритиевой метки. //Докл. АН СССР. 1982. Т.266. С.871-874.

35. Бадун Г.А., Федосеев В.М. Проницаемость липидных мембран для атомарного трития, или эффект «соскальзывания» атомов и его роль в методе тритиевой планиграфии. //Радиохимия. 2001. Т.43. №.3. С.267-271.

36. Ксенофонтов А.Л., Бадун Г.А., Кордюкова Л.В. Исследование липидных мембран с помощью атомарного трития. // Молекуляр. биол. 1998. Т.32. №.2. С.370.

37. Yusupov M.M., Spirin A.S. Hot tritium bombardment technique for ribosome surface topography. // Methods Enzymol. 1988. V.164. P.426-439.

38. Гедрович А.В., Бадун Г.А. Исследование пространственной структуры глобулярных белков методом тритиевой планиграфии. Короткие пептиды как модель полностью развернутой полипептидной цепи. // Молекуляр. биол. 1992. Т.26. №.3. С.558-563.

39. Volynskaya A.V., Kasumov Е.А., Bogacheva E.N., Shishkov A.V., Goldanskii V.I. Determination of the accessible surface of globular proteins by means of tritium planigraphy. //Eur. Biophys. J. 1994. V.23. N.2. P.139-143.

40. Lee B.K., Richards F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. // J. Mol. Biol. 1971. V.55. N.3. P.379-400.

41. Stellwagen E., Wilgus H. Relationship of protein thermostability to accessible surface area. //Nature. 1978. V.275. P.342-343.

42. Janin J., Miller S., Chothia C. Surface, subunit interfaces and interior of oligomeric proteins. // J. Mol. Biol. 1988. V.204. N.l. P. 155-164.

43. Богачева Е.Н., Шишков А.А., Шишков А.В., Баратова Л.А. Понятие "доступная поверхность" белка в рамках метода тритиевой планиграфии. Эксперимент и расчет. //Молекуляр. биол. 1994. Т.28. №.5. С.1035-1043.

44. Гедрович А.В., Баратова Л.А., Богачева Е.Н., Медведкин В.Н., Шишков А.В. Количественное определение доступной поверхности глобулярных белков методом тритиевой планиграфии. //Молекуляр. биол. 1993. Т.27. №.2. С.309-315.

45. Miller S., Janin J., Lesk A.M., Chothia C. Interior and surface of monomeric proteins. // J. Mol. Biol. 1987. V.196. N.3. P.641-656.

46. Бобкова К.Е., Гедрович А.В., Анкилова В.Н., Лаврик О.И., Баратова JI.A., Шишков А.В. Сравнительное исследование фенилаланин-тРНК-синтетаз из Е. coli и Thermus thermophilus методом тритиевой планиграфии. // Биохимия. 1990. Т.55. №.9. С. 15701577.

47. Волынская A.B., Мурашова C.A., Скрипкин А.Ю., Шишков А.В., Гольданский В.И. Использование тритиевой метки для исследования конформационных изменений белков в растворах. // Молекуляр. биол. 1989. Т.23. С.356-364.

48. Скрипкин А.Ю., Волынская А.В., Шишков А.В., Гольданский В.И. Комплексообразование лизоцима с ионогенными детергентами. I. Механизмы связывания додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. // Молекуляр. биол. 1989. Т.23. С.365-371.

49. Hoekstra D., Kok J.W. Entry mechanisms of enveloped viruses. Implications for fusion of intracellular membranes. // Biosci. Rep. 1989. V.9. N.3. P.273-305.

50. Ксенофонтов A.JI., Жирнов О.П., Данилов А.В., Баратова Л.А. Изучение поверхностной локализации аминокислот в гемагглютинине вируса гриппа при функциональной трансформации вирионов кислым рН. // Молекуляр. биол. 1995. Т.29. №.3. С.635-644.

51. Богачева Е.Н., Жуков Н.Д., Шишков А.В. Доступная поверхность и внутримолекулярная динамика белков: изучение методом тритиевой планиграфии. // Молекуляр. биол. 1993. Т.27. №.5. С. 1044-1050.

52. Snow М.Е. A novel parameterization scheme for energy equations and its use to calculate the structure of protein molecules. // Proteins: Structure, Function and Genetics. 1993. V.15. N.2. P.183-190.

53. Unger R., Moult J. Genetic algorithms for protein folding simulations. // J. Mol. Biol. 1993. V.231. N.l. P.75-81.

54. Saitoh S., Nakai Т., Nishikawa K. A geometrical constraint approach for reproducing the native backbone conformation of a protein. // Proteins: Structure, Function and Genetics. 1993. V.15. N.2. P.191-204.

55. Богачева E.H., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью тритиевой планиграфии. // Молекуляр. биол. 1996. Т.30. №.3. С.637-646.

56. Богачева Е.Н., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова JI.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью тритиевой планиграфии. II. Порядок укладки определяет структуру. // Молекуляр. биол. 1996. Т.30. №.4. С.885-892.

57. Богачева E.FI., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью метода тритиевой планиграфии. III. Лизоцим как модель а/р-белка. // Молекуляр. биол. 1997. Т.31. №.3. С.500-505.

58. Bogacheva E.N., Gol'danskii V.I., Shishkov A.V., Galkin A.V., Baratova L.A. Tritium planigraphy: from the accessible surface to the spatial structure of a protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Y.95. N.6. P.2790-2794.

59. Гедрович А.В., Юсупов M.M., Шишков A.B., Гольданский В.И., Спирин А.С. Мечение белков 308-субъединицы рибосом Escherichia coli in situ атомарным тритием. //Докл. АН СССР. 1982. Т.267. С. 1255-1257.

60. Юсупов М.М., Спирин А.С. Исследование поверхности рибосом и рибосомных субчастиц Escherichia coli методом тритиевой бомбардировки. // Биохимия. 1986. Т.51. №.11. С. 1858-1867.

61. Yusupov М.М., Spirin A.S. Are there proteins between the ribosomal subunits? Hot tritium bombardment experiments. // FEBS Lett. 1986. V.197. P.229-233.

62. Спирин А.С, Агафонов Д.Е., Колб B.A., Коммер А. Топография рибосомных белков: пересмотр карты распределения белков на малой рибосомной субъединице. // Биохимия. 1996. Т.61.Ж11. С.1928-1930.

63. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. Proteins on ribosome surface: Measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. N.24. P.12892-12897.

64. Каширин И.А., Гедрович А.В., Шишков А.В., Каграманова В.К., Баратова J1.A. Использование метода термической активации трития для введения радиоактивной метки в РНК. // Биоорг. химия. 1983. Т.9. С. 1531-1534.

65. Колб В.А., Коммер А.А., Спирин А.С. Существует ли канал для синтезируемого на рибосоме пептида? Мечение транслирующих рибосом атомарным тритием. // Докл. АН СССР. 1987. Т.296. С.1497-1501.

66. Филатов И.А., Кулиш М.А., Миронов А.Ф., Ножевникова Е.В., Нейман JI.A. Исследование взаимодействия цитохрома С с цитохромоксидазой методом тритиевой планиграфии. // Биоорг. химия. 1987. Т.13. №.5. С.623-627.

67. Котлова Н.Г. Рубцов К.С., Бадун Г.А., Кулиш М.А., Миронов А.Ф. Пространственная организация II субъединицы цитохромоксидазы. // Биоорг. химия. 1991. Т.17. №.8. С.1013-1020.

68. Гордеева Jl.В., Баратова Л.А., Марголис Л.Б., Шишков А.В. О возможности изучения топографии мембран клеток методом тритиевой планиграфии. // Биофизика. 1989. Т.34. С.971-975.

69. Аленычева Т.Н., Курятов А.Б., Антропова Л.П., Шемякин В.В., Нейман Л.А., Цетлин В.И., Иванов В.Т. Исследование топографии бактериородопсина методом тритиевой планиграфии. // Биоорг. химия. 1987. Т.13. №.7. С.898-907.

70. Dumont М.Е., Trewhella J., Engelman D.M., Richards F.M. Stability of transmembrane regions in bacteriorhodopsin studied by progressive proteolysis. // J. Membr. Biol. 1985. V.88. N.3. P.233-247.

71. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.-J.E. Virus maturation by budding. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V.62. N.4. P.l 171-1190.

72. Sha В., Luo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml. // Nat. Struct. Biol. 1997. V.4. N.3. P.239-244.

73. Fujiyoshi Y., Kume N.P., Sakata K., Sato S. Fine structure of influenza A virus observed by electron cryo-microscopy. // EMBO J. 1994. V.13. N.2. P.318-326.

74. Ксенофонтов А.Л., Федорова H.B., Бадун Г.А., Тимофеева Т.А., Григорьев В.Б., Баратова Л.А., Жирнов О.П. Локализация матриксного белка Ml вируса гриппа в вирионе. // Молекуляр. биол. 1999. Т.ЗЗ. №.5. С.881-886.

75. Stubbs G., Warren S., Holmes K. Structure of RNA and RNA binding site in tobacco mosaic virus from 4-A map calculated from X-ray fibre diagrams. // Nature. 1977. V.267. P.216-221.

76. Namba K., Stubbs G. Structure of tobacco mosaic virus at 3.6 A resolution. Implication for assembly. // Science. 1986. V.231. P.1401-1406.

77. Lim V.I. Structural principles of the globular organization of protein chains. A stereochemical theory of globular protein secondary structure. // J. Mol. Biol. 1974. V.88. N.4. P.857-872.

78. Efimov A.V. Structural similarity between two-layer alpha/beta and beta-proteins. // J. Mol. Biol. 1995. V.245. N.4. P.402-415.

79. Efimov A.V. Complementary packing of alpha-helices in proteins. // FEBS Lett. 1999. V.463. N.l-2. P.3-6.

80. Каширин И.А. Тритиевая планиграфия и пространственная организация некоторых надмолекулярных систем. // Канд. дисс. Институт химической физики им. Н.Н. Семенова АН СССР. 1989. 155 С.

81. Нейман JI.A., Антропова Л.П., Залесская М.А., Будовский Э.И. Введение тритиевой метки в РНК и белок бактериофага MS2. // Биоорг. химия. 1986. Т. 12. №.8. С. 10701072.

82. Plant viruses, v.l. Structure and replication. Ed. Mandahar C.L. CRC Press. Inc. Boca Raton. Florida. 1989. 366 P.

83. Wittmann-Liebold В., Wittmann H.G. Coat proteins of strains of two RNA viruses: comparison of their amino acid sequences. // Mol. Gen. Genet. 1967. V.100. N.4. P.358-363.

84. Goelet P., Lomonosoff G.P., Butler P.J.G., Akam M.E., Gait M.J., Karn J. Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P.5818-5822.

85. Klug A. The assembly of tobacco mosaic virus: structure and specificity. // Harvey Lect. 1979. V.74. P.141-172.

86. Namba K., Pattanayek R., Stubbs G. Visualization of protein-nucleic acid interactions in a virus. Refined structure of intact tobacco mosaic virus at 2.9 A resolution by X-ray fiber diffraction. Hi. Mol. Biol. 1989. V.208. P.307-325.

87. Champness J.N., Bloomer A.C., Bricogne G., Butler P.J.G., Klug A. The structure of the protein disk of tobacco mosaic virus to 5 A resolution. // Nature. 1976. V.259. P.20-24.

88. Bhyravbhatla В., Watowich S.J., Caspar D.L.D. Refined atomic model of the four-layer aggregate of the tobacco mosaic virus coat protein at 2.4 A resolution. // Biophys. J. 1998. V.74. P.604-615.

89. Bloomer A.C., Champness J.N., Bricogne G., Staden R., Klug A. Protein disk of tobacco mosaic virus at 2.8 A resolution showing the interactions within and between subunits. // Nature. 1978. V.276. P.362-368.

90. Holmes К.С. Protein-RNA interaction during the tobacco mosaic virus assembly. // J. Supramol. Struct. 1979. V.12. P.305-320.

91. Вирусология, T.l. Ред. Филдс Б., Найп Д. М.: Мир. 1989. 492 С.

92. Lu В., Stubbs G., Culver J.N. Carboxylate interactions involved in the disassembly of tobacco mosaic tobamovirus. // Virology. 1996. V.225. P. 11-20.

93. Lu В., Taraporewala Z.F., Stubbs G., Culver J.N. Intersubunit interactions allowing a carboxylate mutant coat protein to inhibit tobamovirus disassembly. // Virology. 1998. V.244. P.13-19.

94. Lu В., Stubbs G., Culver J.N. Coat protein interactions involved in tobacco mosaic tobamovirus cross-protection. //Virology. 1998. V.248. P.188-198.

95. Wittmann H.G. Proteinuntersuchungen an mutanten des tabakmosaikvirus als beitrag zum problem des genetischen codes. // Z. Vererbungsl. 1962. V.93. P.491-530.

96. Wittmann H.G. Proteinanalysen von chemisch induzierten mutanten des tabakmosaikvirus. IIZ. Vererbungsl. 1964. V.95. P.333-344.

97. Wittmann H.G., Wittmann-Liebold В., Jauregui-Adell J. Primary protein structure of temperature sensitive mutants of tobacco mosaic virus. I. Spontaneous mutants. // Z. Naturforsch. B. 1965. V.20. P.1224-1234.

98. Wittmann-Liebold В., Jauregui-Adell J., Wittmann H.G. Primary protein structure of temperature sensitive mutants of tobacco mosaic virus. II. Chemically induced mutants. // Z. Naturforsch. B. 1965. V.20. P.1235-1249.

99. Funatsu G., Fraenkel-Conrat H. Location of amino acid exchanges in chemically evoked mutants of tobacco mosaic virus. // Biochemistry. 1964. V.3. P.1356-1362.

100. Jockusch H. Temperatursensitive mutanten des tabakmosaikvirus. I. In vivo-verhalten. // Z. Vererbungsl. 1966. V.98. P.320-343.

101. Jockusch H. Temperatursensitive mutanten des tabakmosaikvirus. II. In vitro-verhalten. // Z. Vererbungsl. 1966. V.98. P.344-362.

102. Jockusch H., Koberstein R., Jaenicke R. Thermal denaturation equilibria of TMV coat proteins with chemically defined differences in their primary structure. // Z. Naturforsch. B. 1969. V.24. P.613-617.

103. Dobrov E.N., Abu-Eid M.M., Solovyev A.G., Kust S.V., Novikov V.K. Properties of the coat protein of a new tobacco mosaic virus coat protein ts-mutant. // J. Prot. Chem. 1997. V.16. N.l. P.27-36.

104. Orlov V.N., Kust S.V., Kalmykov P.V., Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A. A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. // FEBS Letters. 1998. V.433. P.307-311.

105. Erickson F.L., Dinesh-Kumar S.P., Holzberg S., Ustach C.V., Dutton M., Handley V., Corr C., Baker B.J. Interactions between tobacco mosaic virus and the tobacco N gene. // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1999. V.354. P.653-658.

106. Saito Т., Meshi Т., Takamatsu N., Okada Y. Coat protein gene sequence of tobacco mosaic virus encodes a host response determinant. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.84. N.17. P.6074-6077.

107. Knorr D.A., Dawson W.O. A point mutation in the tobacco mosaic virus capsid protein gene induces hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. P.170-174.

108. Fraser R.S.S. Recognition and response in plant-virus interactions: some underlying concepts. // Recognition and response in plant-virus interactions, v.41. Ed. Fraser R.S.S. Berlin/Heidelberg: Springer-Verlag. 1990. 467 P. P.l-16.

109. Flor H. Current status of the gene-for-gene concept. // Annu. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296.

110. Gabriel D.W., Rolfe B.G. Working models of specific recognition in plant-microbe interactions. //Annu. Rev. Phytopathol. 1990. V.28. P.365-391.

111. Culver J.N., Lindbeck A.G.C., Dawson W.O. Virus-host interactions: induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobamoviruses. // Annu. Rev. Phytopathol. 1991. V.29. P.193-217.

112. Culver J.N., Stubbs G., Dawson W.O. Structure-function relationship between tobacco mosaic virus coat protein and hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. // J. Mol. Biol. 1994. V.242. P.130-138.

113. Taraporewala Z.F., Culver J.N. Identification of an elicitor active site within the three-dimensional structure of the tobacco mosaic tobamovirus coat protein. // The Plant Cell. 1996. V.8. P.169-178.

114. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. 544 С.

115. Практикум по общей вирусологии. Ред. Атабеков И.Г. М.: МГУ. 1981. 192 С.

116. Fraenkel-Conrat Н. Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. // Virology. 1957. V.4. P.1-4.

117. Dobrov E.N., Kust S.V., Yakovleva O.A., Tikchonenko T.I. Structure of single-stranded virus RNA in situ. II. Optical activity of five tobacco mosaic-like viruses and their components. //Biochem. Biophys. Acta. 1977. V.475. P.623-637.

118. Tsugita A., Scheffler J.J. A rapid method for acid hydrolysis of protein with a mixture of trifluoroacetic acid and hydrochloric acid. // Eur. J. Biochem. 1982. Y.124. P.585-588.

119. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. // Anal. Chem. 1958. V.30. N.7. P.l 190-1206.

120. Бадун Г.А., Филатов Э.С. О возможности получения Н-пантетина методом термической активации трития. // Радиохимия. 1991. Т.33. №.1. С.75-77.

121. Бадун Г.А., Филатов Э.С. Характеристики источника атомарного трития, используемого для получения меченых соединений. // Атомная энергия. 1987. Т.63. №.1. С.123-124.

122. Гедрович А.В., Бадун Г.А. Исследование ориентации пептидов в адсорбционных слоях методом термической активации трития. // Коллоидный журнал. 1992. Т.54. №.3. С.24-29.

123. Mandelkow Е., Stubbs G., Warren S. Structures of the helical aggregates of tobacco mosaic virus protein. // J. Mol. Biol. 1981. V.152. P.375-386.

124. Koyama A.H., Irie H., Ueno F., Ogawa M., Nomoto A., Adachi A. Suppression of apoptotic and necrotic cell death by poliovirus. // J. Gen. Virol. 2001. V.82. N.12. P.2965-2972.