Изучение антигенной структуры белка оболочки Х-вируса картофеля тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ

РГ6 од

. 9 |\ВГ 1953

На правах рукописи ТУРОВА Ирина Петровна

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев — 1993

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции белка Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Радавский Ю. Л.

Официальные оппоненты,:

доктор оиологических наук Козлов Э. А.

кандидат биологических наук, доцент Тайкова Н. В.

Ведущее учреждение:

Институт биохимии им. А. В. Палладина АН Украины.

Защита диссертации состоится »___ 1993 г. в 10 часов

на заседании специализированного ученого совета Д.016.65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии АН Украины (253094, г. Киев-94, ул. Мурманская, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины.

Автореферат разослан « »_ ________ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета хР^-"-Д. М.

Подписано в печать 25.05.93. 1,24 печ. л. Зак. 447 Типография Киевского института ВВС

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время . ведутся многочисленные исследования вирусов высших растения и их компонентов. 90$ вирусов высших растения имеят одноцепочечшгй РНК - гоном и интерес к'ним вызван, с одной стороны, значительным влиянием на экономику неродного хозяйства, о с другой - разнообразием структурно - функциональной организации белков и геномных РНК.

Последние годы ознаменовались значительными успехами в изучении антигенных свойств белков, в частности вирусных. Установлено, что антитела и рецепторы иммунокемпетентннх клеток узнают не всю молекулу белка, а определенный ее участок - антигенную детерминанту или эпитоп. Изучение тонкого химического строения антигенных детерминант - одна из ключевых проблем биоорганической химии и иммунологии. ' Знание антигенной структура капсилнкх белков дзет информация об их топографии•в кепсиде, что важно для установления молекулярной организации их вкрионов. изучения белок - белкового и белок - нуклеинового взаимодействия и понимания таких процессов, как самосборка вирусоз и освобождение РНК от белка.

Объектом наших исследований явился капсидный белок Х-вируоа картофеля. ХВК относится к группе штексвирусов, которая включает около 30 представителей. Нуклеотидная последовательность структурного ген?, белка оболочки ХВК была установлена в 1983 году.

Цель. _и задачи исследования. Целью работы являлось изучение антигенной структуры белка оболочки ХЕК и сравнение этого белка с капсидными белками других потексвирусов, первичная структура которых установлена. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить антигенные детерминанты, локализованные на поверхности вириона;

- охарактеризовать тонкое химическое, строение участка полипептидной цепи капсидного белка ХБК, включающего антигенные детерминанты;

- рассчитать потенциальные антигенные детерминанты капсидного белка ХВК и семи капсидных белков потексвирусов с известкой первичной структурой;

7 прогости сравнение первичной и высших структур капсидгах белков вирусов потоксгрупш.

Научная... новизна.

- Впервые, с помощью моноклональных антител проведано эпитошое картирование кэпсщцюго белка ХВК. С помощью методов киши белка выделен фрагмент капсидкого бежа, ' который взаимодействует с двумя моноклональнюли антителами, полученными на цельные вирусные частиш».

- Установлено, что в антигенные детерминанты, взаимодействующие с двумя МКА, входит остаток лизина в позиции 1.9 полипептидной, цепи белка. Яри модификации этого остатка лизина циграконовым ангидридом, узнавания MÍA не происходит.

- Показано, что н - концевой участок капсидного белка ХВК экспоьироваи на поверхности вириона. '

- Впервые про ".едено сравнение первичной, вторичной и антигенной структур б ce?, капсидных белков вирусов потексгруппы с: известной первичной структурой и высказано предположение об общности молекулярной организации их вирионов.

- С помощью расчетных методов доказана принадлекно^гь PAMV к потексгруггло, что ранее дискутировалось.

Практическое значение работы. Разработан способ задолетпия н-кснцевого фрагмента капсидного белка ХВК, включающего иммуно-дотнанткую область. Получение синтетических пептидов, входящих в ату область позволит усовершенствовать диагностические тест-системы идентификации ХВК в растениях.

Получены Г1КА к ХВК, которые являются важным инструментом для иммунодиагностики вируса в посадочном материале. Метод ИФА о использованием этих ПКА, который апробирован в данной диссертации монет быть внедрен в 9Ж и хозяйствах Украины, которые заинтересованы в диагностике ХВК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на v Украинском биохимическом съезде ( Квзно-Фран-койок, 1937 ); 711 Всесоюзном симпозиуме по химии белков к пептидов ( Теллвнн, 1987 ); vu съезде Украинского - икробиологического общества ( Черновцы, 1959,); I Всесоюзном симпозиуме по химии белков ( Тбилиси, 1990 1; II Международном симпозиуме "Шшс-иеяоч«чн!Я РНК вирусы" ( Австрия, Бена,. 1989 ); VII СССР - ФРГ симпозиум "Химис. пептидов и белков" ( Дилихан, 1989 ); Междуна-

родный симпозиум "Вирусология, иммунология !: существо" ( Киев, 1991 ).

Структура и объем диссертации. Дясеврт-вдя яглохет на 130 страницах машинописного текста и состоит из №>)Д»жия, лвуу. гляп обзора литературы. описания материалов и методов 'исследования, раздело результатов и обсуждения собственных исследовать, заводов а списка датированной литературы ( 179 иоточнтксв ). Диссертация содеркит 13 таблиц и 20 рисуiikoei.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовал^ ервдаевирулойтшй штамм ХВК ( pvx ). Вирус размножали на растениях дурмана я для выделения использовали листья на 12 сутки после заражении. Балок оболочки ьыделаш из очищенного вируса солоbum методом [ pranoki, 1968 ]. Критчриом опенки чистота и целостности белковых прдпаря-тов служили результата электрофореза в ПААГ с ДСК 1 Ьч^тмИ» 1970 ], N-концевой аминокислотный анализ ! Gray, 1972 J и амиио-кислотнпй состав.

Кроличью антискворотку к ХВК получали методом чередования ш«'тривеншх и внутримышечных инъекций, причем последние проведи-ли еггеыива» вчрус с полним адъювантам Фрейнди. Титр сыворотки определяли капблоннм методой. МКА к ХВК - ?21л1>2, 23ХА5 и 21XD4 оили любозно предоставлены М.Сачрма ( Институт химической и биологической физики .АН Эстонии ).

Капсидный белок ХВК расцепляли орошш&ном [серебряной, 1972), трипсином (Desoaloi-Csneodda, 1934 ] и протеазой Y8 из St. atreu.з [ Aii-fen, 1964 Ь Для разделения полученных Фрагментов применяли гель-фильтрашю на сефадексе 0-50 (Pharmacia, Швеция), ионообменную хроматографию на колоше DEAfl-Toyopearl-650 (Toyo Sota. Япония) и ВЭЖХ в обращенной Фазе на колонке 'ЧП trasphera ontyl" с использованием хроматогр&фической система фирм "ВечИчап" (США).

Гомогенность выделенных пептидов определяли с помощью электрофореза б ПААГ с ДСП [ Laemmli, 1970 ], N-концевого анализа и аминокислотного состава. Аминокислотную последовательность пепти дов определяли вручную [ №ап, 1956. Gray, 1963 j и. на гжкросек-

-3-

венаторе 890 f«! (Becicnan. США).

йммунохимическое изучение ХВК, его капсидного белка и выделенных фрагментов проводили методом "непрямого" иммуноферментного анализа ( ИФА ) { Olark, 19*77 ]. иммуноэлектроблоттикга i Towbin, 1979 ) и радисиммуноанализа [ purcell, 1973 ] с помощью поли- и моноклональных антител к Х-шрусу. Для проведения "непрямого" ИФА иЬшльзовали платы из полистирола (Dynatech, Швейцария). Оптическое поглоаенио измеряли при длине волны 414 нм на фотометре Titertek Multiscan (Великобритания).

В радиоиммунологическом анализе использовали платы из полк-винилхлорида (Titertek Flow Laboratories. Голландия). Реакцию взаимодействия акткген-антитоло определяли количественно при помощи связывания белка Л меченного изотопом Результат радио-икмуноанализз измеряли на счетчике "Ракгамма" (1KB, Швеция).

Модификации остатков лизина, содержащихся в Ы-концевом Фрагмента капсидного бе.лка ХВК проводили с помощью цитракокового ангидрида [ HoypaUakkar, 1984 3.

Расчет вторичной структуры белков оболочек ХВК и вируса ау-куоа мозаики картофеля (ВАМК, PiW) проводили вручную по методу CUou п Fasrnan, 1978 г, а расчет ■ вторичных структур зткх и еще шести хаясидных белков потзкъьирусов с помощью компьютерной программы PCGene по методу Garnier, 1978.

Для теоретических расчетов по локализации антихчннух детерминант в бел<?х применяли школу акрофильности [ Норр, 1985 3, гидрофильностк [ Kopp к Woods, 1991 3 и гидропатии [ Kyte и Doolittle, 1962 3.

к

Резульчаты исследования и их обсуждение 1. Электрофорез и к-кояцевой анализ бело оболочки PVX

Анализ капсидного белка PVX электрофорезом я ПААГ в присутствии ЛСН показал наличие одной полосы, соответствующей Озлку с М. м. кДа ( рис. 1 ). Молекулярная масса белке " . • FVX, исходя из мрзнчкой структуры"гена, составляет 2Г .ю,

«то белок PVX при проведении электрофореза б денатурирудаих условиях ьедот оебл аномально.Такое поведение' белка связано с большим ооде-ржаниеч ссгзткоз серина и треонина в И-кощ-вом участке, что

-4-

ирягодят к йдшяему связыванию с ICH и опрелелепив зялтаетпюго значения U.M. белка, м-кекцего? ана-таз показал огсутстьио сво-бодйсй а - зхяксгруппы в ясслздускси болке.

. 2« Расяеплетв белка оболочки 17'/ броуцяаном, фракционирование полуденных фрагментов и if - ютшевоЯ анализ

С цвлыэ локализация антагбгошх детерминант в капсшюом белке Т77. последний расцепляли бромцяяпом.

Амжогятслотязя последовательность белка оболчки PvX пред-стзелбпз на рксуякз 1. Как бвдвд из рисунка, бедок F/X содержит всего семь остатков »ктиоякна и, таким образок, s результате рэс-г.еплештл его орсмциаяом кожпо 'получить ограниченно.; число крупных фрагментов, что крайяэ взгго для локализации в них антигенных . детерминант.

После растепления бромциг»ом в c:«cit получешшх фрагментов дансияхлоридннм методом были кдегп-ифигдеровзпн . еледупцие M -кенцевне ямкпскислотнке остатки: Leu, líe, /Ja, Abp, Lys и Pro, что соответствовало последовательностям We t - X нарвитаоЯ структур! гена балка оболочки F7X.

смесь бромцяановых фрагментов фракционировали на сефадекое <7-50 в ZC$ уксусной кислоте ( рис. 2 ), В'результате гелъ-фяль-трашга били полутени четыре Сракщга пептидной приролк, в-ксторнх были определены • следу изтз к-кепцевие аитокислотше остатки:

I фракция - Аер, leu, lie;

II фракция - Ala, leu. Ile;

III фракция - 7го;

Tf фракция - by s.

"¡ЬпрякоЙ" м^коф?рмонтннЯ анализ показал, что только Фракция i дает еяецкфпаскум реакцию с ПКА и ' МКА, и, следовательно, содержит антигенные детерминанты нетивного белка. Так как основная цель настоящей работы - изучение антигенной структуры сежа оболочки FvX. в дальнейшем исследовали именно эту францию.

Для дяльиойгей очистка фракции Г хроглатографирсваля исно-обиенникв В2ДЕ-Тоуореаг1-650 í ркс. 3 5. В' результате хромзтогрзфичеекого разделения были получены три фракции содержание пелтиднкй материал в гомогенном состоянии. Бс фракции

10 тЬо ' эо

А Р А Э Т 0. А Т О С 'Г I а Т г тППт А С А I Р АТ 18 о ---ВгСН-1 --~--.-

----7&-1---

40 I .50 ' V»! 60 I, ? I 1-Р 3 О !) ? Р 3 I А й Л 7 V А Б 'В А У.А 7 » В С Ь 3 Е ---ВгСМ-1-—----—-

-78-1-

¥б{ ]вгОн{ 70 ВгСл! 80 Т^ 90

I ЕЧ V I Е В « К V Р I П I « А Ч А А » С '(. УЯНОАНв

-ВгОМ~1-'

.—---78-2---^-

! ВгСН

761 Г ЮО 'Ю 120

е 3 А Ч Т К и I П Т С Р У 8 К О I Б 1сА И Ь А А. А1 I К I У О

—48-2-1

Вт-Ся! 130 ВгС^ 1-Ю 150

Т 1 К а Р С М К У А V У V V? К >7 М Ъ V И И Б Р Р А N V? О А О

¡60 170 ВгСЩ '180

О ? К Р В Н К I1 А А Р Ц Р Р N С v 1 N Р Л А X К Р К Е О Ь I

ЕгО№ 190 '¿00 210 Р. ? ? Б 3 А Е ;« N А А <3 Т к Л ? У К I 'Г К А й А О Б N Р Р А ,-----—--—---вгсн-г----—-----

220 230 ¿36

3 1 В А А У ? К а Я I I 3 ? Т '! А Е А 7 V Т I Р Р Р ------------ВгОГ;-?------■—-------

Рис, 1 Ашнокислогяая ноеледоветольшоть калсидаого Оелкс Х2К

( Морозов, 1933 ^ Стрелками пеказаш йтакуышз броадиешм, тршкажсм ( Т ) ч проте-эзой из . аигеия ( '<'8 ) пеита,щше связи. Пр.-..'-.ми жнияи отмочены екцэлчшшб пептигы. Б рамке остаток лизина. входязтЯ в антигенную детерминанту.

-6-

Ркс. 2 Фракционирование-смеси фрагментов бромцианового расщепления капспдкого бежа PvK на свфадексо G-50 в 2CW CHgCOOH Колонка 2,8x45 см, скорость элюции 30 мл/ч, Объем фракции - 3 мл

Рис, 3 Хроматогре&ш. фраяшш I ( рис. 2 ) на колонке с

DEA5-(royop<??.rl~650

Колонка 1,6x12 см. Линейны» градвдн? ( ) O.Oi-O.5 моль ШдНСО. pH 9.0, Объем фракции 3 мл. 1 - оптическая плотность при 220 им,' 2 - оптическая плотность' при 280 км

-7-

■ А в кзчзстБб н-концезой была вдзнггфщароваяа аспарзпщовая кислота, а во фракции Б ке быяо о-Энарувеко свободной а-1Шр-группы= Исходя из данвнх о нуклэоншзоЯ послэдовательнсстк гена"балка оболочка РУХ, С-концевой орищиавоБыЗ <*р=гм9нт долган гсгеть н-кояцевуа аспзраганову» кислоту. Таким образом. Фракция А, по-Еддиз,'оыу, содержит С-копцевой орсмциавонй йрагйенг бежа оболочке. РУХ, е фракция Б. с учетом даншх об отсутствии свободной а-и^-гругаш в белке * соответствует н-кснцевэку фраг-ыеяту, обозкачазюиу нами Бг-СН-1. СЬсяедуащий анализ показал правильность этого предположения. Фракция В - дагомогатз н в дальнейшей кб исследовалась,

3. Характеристика ряда СрошдааяоЕ!гх йрашентав

3.1. Электрофорез в ПАДГ с ЛОН

Смесь брсмцианоЕнх фрагментов в отдедъныг <^акцгй и пептидов, получепных после разгелйвкя аньлззярозалз адактрофорезом в ШЛГ с ДСН ( рас, 4 ).

; • • ; : . 7,0—- V—. ^ ' «23

'.$/}•—" ав®

а в 5 * *

Рис. 4. Электрофорез в ПААГ с ДСН и к.'мупоблоттшг копсидного Садка РУХ и его бромцкбцовзх ¿рагнентов а - копсясшй белок о - смесь брозгцзавовнх: фрагментов;

а - фракция I ( ряс. 2 ); г - Фракция А ( рис. 3 5; д - «фракция Б ( ркс-. 3 е - Е.'.«лунс0лотта1Р «¿вез броыциаяовцг фрзгаектсг и капского Сзлка Р?л..

Как видно х;з рисунка фракция 1 содержит, о основном, два крупных фрагмента М.м, около 7 и 5 кДа, соответственно. Это также свидетельствует о том, нто указанная Фракция содержит н- и С-концявие крупные фрагменты. Данные, представленные на рисунке 4 (гид), свидетельствуют такке о том, что в результате ионообменной хроматограф™ Сыти получены два гомогенных бромииановых пептида. .

3.2. Амшюяислотннй состав и первичная структура

Аминокислотный состав получешшх пептидов был близок к аминокислотному составу этих участков полипептидной цепи Оелкп. В пептиде ( фракция А ) ко обнаружен 0- концевой гомосерик, что говорит о С - концевом расположении данного фрагмента в белке.

Фракция ш ( рис 2 ) но данным дансилирования имеет {/-концевой пролин и представляет собой гомогенный пептид. Однако, сравнение его аминокислотного состава с отим же участком структурного гена белка оболочки рта ( рис. 1 ), свидетельствует о некотором различии. Это обстоятельство побудило нас снфеделить аминокислотную последовательность детого пептида. Нике приведена первичная структура, .установленная нами методом Эдмана з дансильнсй модификации и предсказанная по нуклеотидной последовательности этого участка структурного гена:

Р - К - Е - й Ь - I' - И - Р - А - 8 - В - ( А. Е ) - гср

Вместо остатка пролина ( позиция 9 ) бил идентифицирован алакин.

С- конпевой бромииановый фрагмент ( ВгСК-2 ) содержит 48 аминокислотных остатков. Нике приведена его и - коицеввя последовательность> "определенная нами на- автоматическом секвекаторе аминокислот:

М' - А - А - С. - Т - А - А - В» Р - 7 - К -

и - А - А - 0 - Т - А - А - Р - 7' - К

Эта первичная структура гомологична последовательности, выведенной из структурного гена капсидного белка ТУХ ( рис. 1 ).

I. Иммун< »химический анализ белке оболочм РУХ и его ■чромщтноннх фрагментов

Результата иммунохимического анализа РУХ, его белка "'•'•*)(ччочки, N - и С-концевых, фрагментов метолом: "непрямого" ИФА с ПК А и с Ш Я1ХВ<1. 51X1)?. и 23ХА5 прадстазленн- в тя*лацв 1. Как видно 1,з приведенных дашшх, к-конц«еой бромииановий фрагмент (X)держит антигенную детерминанту ( детерминанта >. Бее три МКА взаимодействуют с РУХ и ого капсиднш белком. Более того, МКА Г-'1ХП2 и 23ХА5 специфически взаимодействуют также с м-концевым брочциаиошм фрагментом к со смесью ы- и С-концевых Фрагментов. . МКА 21ХТМ узнает белок оболочки РУХ, но не дает специфической 3 «-акции со см-'сьи бромциатювих фрагментов. Возможно, что жигенмяп деторми- нанта узнаваемая МКА 21ХВ4 "локализована на ртгрядеином участке белка оболочки. '

Результаты ''непрямого" радиоиммуноянажза подтверждают тот ■фжт, что N - концевой бромцишювый Фрагмент белка оболочки РУХ ¿■знается МКА 21ХП2 ( Табл. ?, ). Таким образом, мокко утверждать, "по один или два зпитопп, узнаваемые этими ККА, локализована', в л-концевом участка белка обсло'-ти РуХ. Необходимо отметить» что -Г- концевой Сромцичноьый Фрагмент также- взаимодействует с ПКА, но чем м-концевой .фрагмент.

Для локализации антигенных детерминант ми применяла также яшушзлоктроблотткнг, в которой балл использовали только МКА 21ХБ2. Согласно данным по иммуноблоттингу ( рис. 4 ) три полосы с электрофореткческой подвижностью 27» 7, и 6,5 кДа дали реакцию с антителами. Известно, что помимо интактного бежа только N-концевой бремциановый фрагмент ( 68 аминокислотных остатков ) может находиться г этой зоне. Второй по величине, С-концевой бромциановый фрагмент ( 40 аминокислотных остатков ) обладает большей подвижностью ( рис. 4.5, г ).

Данные, полученные "непрямым" ИФА и иммуноблотткнгом с применением■ ПКА и МКА, свидетельствуют о наличии в М-концевом участке белка оболочки РУХ по крайней меро одного эпитопа. Этот участок содержит большое число гидрофильных аминокислотных остатков. Известно, что антигенные детерминанты белков очень часто содержат именно гидрофильные остатки [ Ъегпег, 1981 ].

Таблица 1

Сравнений актег&ишй ¡датиьнооти РУХ, белка оболочки 1"/Х. гг- и С-тониешх бромциааоных фрагментов «елка оболочки ¡методом ¿"Д

й 'Н т и г 6 ii

Антитело ---------------- ------------------------------------------------------- -

Р»Х Бмлик Смесь М- и С- я-кон- 0- кон-оболочки концевых цовой цею&

фрагментов , фрагмент Фрагмент

+■ +

21ХВ4 0,63 0,38

21X1)2 0,64 0,46 0,35 0,4?. 0,19

23Ш 0,75 0,45 0,3г. 0,42 0,21

ПКА 0,97 0,79 0,69 0,75 0,41

Результаты представлены в одиницах поглощения при длине волш 414 нм. ^'Взаимодействие МКА 21ХБ4 с* к- и С-концевыми фрагментами белка оболочки РУХ не являлось специфическим ( наблю-далесь лишь высокая фоновая, реакция, 0,2 ед. оптической плотное -та, при разных концетрьциях антигена ), поэтому цифровые шшчония этих данных в таблице ив npv.eeдшгы.

Таблица 2

Сравнение антигенной'активности РУХ, Оелка оболочки Р'/Х, . я- ;й С-кокцэьнх бромцияновнх фрагментов белка оболочки методом радиокммуноьнализв

А н т и г в н

Антитело -

РУХ Белок Смесь к- и С- ы- кон- с-кон-

' оболочка -концевых иавой цевой

фрагментов фрагмент фрагмент

2№ЙГ~ ~319Э 699 ~ 433 б47_ 2&Г~

23ХА5 3356 1106 304 863 139

ПКА 4820 1897 454 1254 392

Реакцию взаимодействия антиген - антитело определяли количественно при номе щи белса А. В лунки плат вносили по 3,75 нкюри ( 8000 имп/мин ) меченного иодом белка А. Результаты радиоинмуно-анализа прадотавлвнн в имп/мин с вычитанием фононого значения I 560 гот/мин ), полученного при взлвиодейстгш исследувшх И к РУХ с серологически не родственным вирусом - ВТМ.

-И-

5. Триптический гидролиз И НОДИфИКЗЦЯЛ й-концевогс бромцианового фрагмента

л-концовой оромциановий фрагмент ( ВгСН-1 ) • содержит два остатка лизина в позицях. 19 и вб и остаток аргинина в позиции 44 ( рис. 1 ). С целью получения пептидов, возможно включающих антигенные детерминанты, фрагмент расщепляли трипсином. Однако, при анализе смеси тритггкческих петидов дот - блоттингом и ИФА ( Тг-Ш. 3 ) с помощью МКА г:е было отмечено полохителььой реакции. Это свидетельствовало о том, что остатки лизина или аргинина входят в антигенную детерминнанту или детерминанта, для которых специфтчны используемые антитела. Для доказательства важности участия остатков лизина во Фрагменте ВгС«-1 при взаимодействии с МКА проводи™ его модификацию вдтраконовым ангидридом. Известно, что цитраконовнй ангидрид модифицирует а-нн^-группа лизина и остаток приобретает отрицательный заряд. Штракошълированний пептид ке давал специфической реакции с МКА ( Тебл. 3 ), однако, при снятии циграконовой защит« была отмечена положительная реакция. Полученные результаты свидетельствовали о том, что в антигенную детерминанту или детерминанты, взаимодействующие с обоими МКА ■ входит остаток лизина.

Гайлица -3

Сравнение антигенной активности белка оболочки РУХ и его Фрагментов методом ''непрямого" ¡ИФА

Анта-толо мка АЯТЛ! Г Е Н

Белок болоч-ки Триптичес-кий гидро-лизет ВгСЫ-1 Фрагмент Модифи-ВгСК-1' цкрован- |цый ВгСК-1 Пептид ^8-1 Пептид У8-2 ВТМ

21ХГ-2 <з;са5 0,47 0,46 '0,04 0,04 0,43 0,05 0,44 '0,06 0,62 0,50 0,04 0,03 0.02 0,03

Результаты представлена» в единицах поглощения при длине волны 414 "лк. Р качестве контроля использовался белок оболочки ВТМ.

-12-

3. йммунохимический аналиа 1к.птоды1, получ.;нвих. и результате расщепления белка Pvx протеглой Vü hi St. anretuз

Так как фрагмент ВгСН -1 содержит ль л о>лчтки лигиша, необходимо било устянствч-ь, кпк'.а из эти* и'тмткоь онмпифпчен для f*КА 21X1)2, а какой для СЗХАЬ, или оба МКЛ специфичны для оиного и того же остатка лизина. С эт.^М целью капсидкый белок PvX расщепляли ггротеазой V8 иг» Si. гшгаин. Известно, что данный фермент расщепляет пептидную связь, образованную карбоксильной группой глутаммчовой кислота. В результате расщепления протеьзой V8 можно било ожидать получения двух крупннх ¡Еригмвптоп, включающих остатки \ - Ев и 64-96 ( рис. 1 ). Первый из этих фрагментов включает остаток лизина а иоаьцт 19, а второй ■ н позиции 66 последовательности белка оболочки fvX .

Продукт расщепления Оелка протеазой V8, '¡ракцкоиир-чш.™ BfiüCX в обращенной фасе ( рис 4 ) и полученные Фракции анализировали "непрямым" методом ША. Из всех пептидных Франций, представленных на рисунке, только матнриал фракции НЗ юмшдчйе! «ог»ал о обоими ША.

Ы-концавым анализом не было обнаружено свободной «■ аминогруппы в материале данной фракции. Анализируя Бшлаиз-юженноо, а также данные по аминокислотному составу полученного фрагмента, Mosa'о утверждать, что фракция i5 представляет собой гомогенный Я-йонцавой пептид ( 78 - 1 )' белка оболочки Р7Х, включающий 56 аминокислотных остатков. Результаты иммуноанализя этого пептида представлены в таблице 3. Пептид ve~2 не взаимодействует ни с одним из используемых ЖА ( табл. 8 ), следовательно, но входит в состав соответствующих детерминант.

Такид образом, МКА 21XD2 и 23XAR взаимодействуют о участком полипептидной цепи «апсидного белка PVX, включающим остаток лизина в позиций 19. Можно-предположитьа. что:

а) этим МКА соответствует одна общая детерминанта;

б) имеются две перекрывающиеся энтигенше детерминанты., а которые входит один и тот аj остаток лизина.

По-видимому, для взаимодействия с МКА помимо по.г дательного

заряда на оотаткэ лизина существенно также наличие большого

числа гадрокскамшкчсислотшх остатков в последовггельности 19

-•s-T-'i'-T-K-T-A-a-A-?-, -13-

которые могут образовывать водородные связи в активном кантри антител.

п

151,*/.

Í.4

Л

Jib

. ,L. I_L_

je Murt

Ряс. 4 Разделение пептидов, полученных в результате гидролиза белка оболочки PYX протеазой V8 m St. оureus с помощью ВЭЖХ в обращенной -фазе Состав подвишой фазы; А - 3J6 .иаопроимловкй 'сщрт., ОДй Я®УЧ О,líS Ы-эталшрфэлин; В - 60¡S изопропилоа&Я спирт, 0,18 ШТ., О,IX М-этилкорфолш, ( — ) - изменение (концентрации буфера'В.

14

M

i

г

7. Сравнение первичных и высших структур кепсидных белков восьми представителей потексвирусов

В настоящее время установлена полная иуклеотидаая последовательность структурных генов семи представителей потексвирусов: PVX» Рmv t Бундин, 1985 ), «ода - вируса мозаики белого клевера f Toieter, i S8S j, 01YKV -- вируса тптой мозеики клевера ( Afcou Baidar» ijej -PMV- вируса козгйкн ¡папайи í Abou Kaidar, 19SS }, NÏIY - ируса иоэаякк Шрщоеа '[ ¿u'idema, 198S ], '№. - Х- вирус ладам t Hameiink, 1990] ii suïgr-Birpyca ассоциированного со слабым шяхгдшт краев листьев земляника [ Jeltanari, 1991 1 расоматри-

-i 4-

нченого рано«, как лютеовирус, но, по-видалому, такие относящегося к потексвирусам. Кроме значительного сходства в организации геномя у данных потвкевирусов обнаруживается такко существенная гомология в аминокислотных последовательностях их кансидннх белков ( рис. 5 ). •

Используя компьютерную программу gknkbek, мн сравнили аминокислотные последовательности бел1сов оболочек восьми представителей потексвирусоэ и обнаружили, что м-концевнв области белков оболочек вариабельны по ллинз ( по отношению к висококонсерваткв-ной последовательности kfaafdffdgy ) и характеризуются отсутствием гомологичных участкоз аминокислот. Основная часть гомологичны* последовательностей аминокислот расположена в центральной часта белковых молекул. Сохранение шсококонсервативных юслодоьателъ-ностей аминокислот в белках оболочек -унизывает на их вакную роль в определении вторичной и третичной структуры и обеспечении белок - белковых и РНК - белковнх взаимодействий в процессе самосборки вирусных частиц.

С помощью компьютерной программы РСО-эпе, ми предсказали ( по методу Gamier ) и сравнили вторичные структуры восьми капекдннх белкоп потексшрусов ( рис. б ). Предсказанное число а-спиралей, р-поворотов, вытянутых участков и клубков- для белков оболочек составило следующие значения:

Белок а-егшроль неупорядоченный р-ГЮЕОрОТ неупорядоченный

оболочки вытйнутнй участок клубок

рта 48,3% Э167Я 5, ОН T4.SJ6

WC1MV 49, 4% 28,95? 11.5* 10,058

С ЮТ 31.13 - 41,5!« 8,4« 18,8% -

PMV 41,0« ■ 32,5% Э.?3 ■ 16,9% ■

РАМУ 57,2% 22,956 6,4« 13.38

LYX 47,7% ?5.8,55 12,9« 13.4*

NMV . зг, 4% 44,73« 9,г% " 13.5«

SMYEV - 45,435 14,4 12,3*

Расчеты , проведенные нами, свидетельствуют о том, что доминирующим элементом вторичной структуры капсиишх белков

-15-

„ с. H «1 "J « h. h f»

m О

•4 M*.

СУ ь _fe ь fe <г>

а «К + S'

w сП tr is »• i»

и w "Ñ" IT ,3 »J И < e tl M К в К и.

у |< •Щ a ш. К M *c «. M ft- О fi fee

M г; •к Ы

■4 V« Ir- и в.

к » to « г г. » CT w о is r» II в> «

«4 fe « a pS С? «I

»■ « и » * •ч a « m M « « M » M M

_ * »* и ^ о > V M ь » » ,-С- -ТГ "Ir "êl â

Я a * fe в

ff M п к с; ы « M < 1 в ►т m >4 ►*

г* и - и

« M •в о «в о É» e. Л, «1 к в» А. • » M fe

ta rt M « Вк i4 «N

« f 1 к. о h n M » M ■ « «5 м п a mi О fe ■4

l> It VI ■ч a» fe ta M ь * м а < n> H ai fe

■Jt fe fe

* 1" Í * a fe ♦« fe

M A «а д ш «t «г M •c а « M * -з « в V С fe fe

M в fe s fe е- fe и » r- •4 •J « >4 M * M в в

»> t< « f» р « Г® u в Т «

V а j. a» * ч » * » ЯЬ «■ I «. n О А »•

1- (Ь >-» »

ы г- и f ы Or м-

fe » ь * »- •V tí M- M К tor « o> a «Г. О t» O

<*• «t V^r ■Ч i * ч> M M

и м - «• « •ч N )»• S л ** n p. f tí

ч « в в H M i V -f К. - я [ i ► M ^ p >4

и er « о » fe о «я í" » « I ц i я et z « «4 a M

г s О о »3 » fe * ¿ ■га s л s t н tr* « в « в fe fe S! n

к fe fe M к fe Г г ÏÎ « f V «M í Í Л <a M t» »

fe < •Я « ft. m — w u M « «fe * ы. » А fe A

IS » f « M V ге rt M

» m- вг a, И fe Я fe •4 О < » и К M и M и о «i

6* Л а № а M * »1 M « «* <г fe «

и> л f ^ V> О fe й

M « «К V« « ■в » »* ъ. V M M M! « f ж. о Ч »»

V» К <4 0 ** a *» f H « o

и *> « » п V M <r ч f «t »3 о m о И M «

л Î f 1Я *

fe о fe kJ *> J ►s ^ * 1. !-£ %л >> Jfcl

* « « »• * " ►f О M ь ■( ч -Tí-ai < Z ч »

W 9 и a m ai m о fe в

«•» Sí * * »• « » в» f « JZ. л. JL

•fe И fe H M M a О щ I1- •c К "Т" "w" -ir

» ь (h »1 •> « «H «« X 's о -3" о» 'W

« « K« « « S * я и

M fe ГТ «» ri « H tt -J- — W -

в «а 00 ». M •> « ■4 » 0>

* fe fe ►J о b. «г ». « л я «e <* м w

о »• « » » « * <4 »» ftl С» м «i ав к M >

fe ! M fa W й ч а

X а M •í 4 r> я M fe л а M a

M н >4 f* * F* f' ■fr >- 0

о * « 9 ï» Щ и IP в 1ц fe в, л

« « » »• 'i. и fe t?

и я «Д W a « «1 «

•ч ь. O M M «t « ■с * S V V"

и M •4 а u В" a <4 в «i >4 w •4 •4 ri и

ш (Л «

U « о i» 9 e» о в (в Л « о

» «а M » et » ^ M fe <n Р- Q ■4J "¿1

« « гг Ь J ^ pi V

* К *• « »• « « « M о И Л я

* * t» о о h О И «1 ь <4 и kl м ^ Г"

р. К W OS К

<Ц fe 4 m et to M. « M и U Ч ^ ■1 ^ M

fe fe * ^ * ► > «< ч 1» 1» fe fe fe fe fe fe

Я M •4 в « V *е

* 9 A А в ч » в а* я ti «i •e

- .4 * fe ^ ». Ъ К Э

К i S ï 5 es В s E Вï S ES

6Ï

0

a к: a> чэ

1 g

о e os

к «

ф s* и о le

<li

я m о

»4 о о с

3

S с

ь о &

ч

о

s о

К К

о а>

м

й о

у. К

«

«

Û) о

о

К >1

ф я g-

в IS

's н E i £ H i

« p<

о ю

о к

О,

I

S3

, ишншигашиш! isttmnrPi .¡riiiwii

ti9iiiiiit««<«eiiititia)i.tiit»«<|ciiiiii:t3ä.iitiiitin iitiilllMlinilllltlllllll lltt>lti>liiti<i«(tllllli<ailli*l:)it»>«!ttii>tlllli<|l«>i<<>itli

lltllMlillHIltllllllinnillllltlAlllllllllillllltl!)

HSII1l>t<«l»t3«ltllll>1ltlll1llllltilt|l|lll>««k«t1«4<(l

iiitiiiiiiiiiiiiiiitiMtiiiniiiiiniiinuiiimmtiiiij.iiiiiiiti

& wiiiti<iititaiiiiiiii>tiiitiii!nii«(n:i)nii)i)iiHtiiimiii!iHiii.it!iiitiintiiiiiii

HSV II w ram m un

ia> tm t

«ML*

Iiuigiijjt тнишшишпшшш.шши «'îiTlTii

» » ь » s it 11 шшш

шнпршнпшшптштлнп.шшкЦишп

jjt в ( t » « » » » » « « « « « « к « * » и ii а а 1 » 1 » 111 » » ■ а » « м » » » ц » i t 11,1 i

m *Тай «il »fiTis* »«s t » g«ti31 .«••.•«•>i»*itanilii>iltttcftll»il «un mji tu m ппшнипшшшшшпплпифпш) ¿u tutu mi[îjiiiii;rbitiiiiiiii)tliiliiiiiii«iiiiiiiii.ltiitii<în!i>it » ij * > s я t > »rti^>t»6>llll(llllfll4lll3lyli>l>li(iiiiaiiil<liii>t «Jiii 11 »|i*> t > 11 « 11

t IUI d IHIIIHl »Tîîïî > в

taiiiiat

tiiiKiittiiiitiiH,,! tiiiiiiiii.itti) >fn >>Mi|< » i « » » j i it|mi

« va » a « i * с I » в • ciii 111 я « » « « ii|u j » t ï s »

...... I.lttiicttll81tl«ttl«mi

DIMI niHtllll|ltlltM «MCI Illtllltll<»ll)l!l

t n • * it t1 il «i e » «T» I к

miinii »[«jj.U>l

niîTï * t t^î

mitist autle

rua ill 119 >o

мг i l ; »ce 9 С

nanti it tt Il £

m К Ii tt» 9 II

Mrttl ll< P «

■«и: oc Jt

¡типiiuirattffîîiBTfffn^iitiimiiiiini(u>m»i... .«ao|» iixntmliiiliitiiliiiDtiin '¡ilL' >i»'iiii)tiiiiiintiii)iiiHiin'i iiiiiifi.2iii<t>9l:i!iiiti)<iii^iiii>i<<ii<>ii)iitittii<i|iiiii..iM

ПОЛИ) tajlHIHIItmilllIfr ItJiïTi ttlll)llillltlin)lllll>ilttll..lll>l

iitmiot iiki>«(fI ■ шиш

»«НИ. .

iniiitigiHtmiiiitMt

шкиншшшшщшшии!

lllHIlIrilUIIIIIIIItllllllllllllllHllllintlLllllllllllltilllMHnllllt

fi)» » t » »)« i iftit I я il » m t » »¡t a I a ri t «и к » n « 11 * j 11. n a « » a в.. » » «

Рис, б Сравнение яуоричшх crpynvyp каясидних белков потексвирусов. H - е6-сякраль{ Т - ^-поворот; Е » кэупорядоченшй еотйнушй учестек,* С - неупорядоченный клубок.

потековирусов является а-сшраль.

Распределение предсказанных а-спирвльных участков вдоль яолипептидной цепк _белкоз оболочек потексвкрусов указывает на существование некоей двойной симметрии мевду N-. и о-концевами областями. Такое распределение свидетельствует о том, что а-схшралк могут взаимодействовать друг с другом., образуя "третичную структуру. Аналогичная .упаковка кансяцного бедка.преет место в ВТМ, где вторичная структура к- и :о-концевых-- ^явбчфз' подобна к распределение элементов вторкчной.структуры* ^вдоль;-;:дадш$гаидкоа цепи довольно симметрично Г 900' ]v

Tollin с сбавт. в 1980- году ' шсказади' предположений, что положительно заряженные группы ам^нюгайлотнух" остатков 'белков оболочек pvx и pmv способны • взаимодействовать- с отрицательно заряженными фосфатными группами РНК, л пять - иуклеотидов ассощюрэваш с каждой белковой ' -Л>ри срйвнэнки

сиквэасов белков оболочек изучаемых-'': вкусов-," '*Ь;: Основном, идентичны пять положительно заряженных бш^кислоттех' остатков ( рИО. 5 ): . , - . " " "" '".:)'

?vx' - К(70), R(124), K(i?#), В(1вёК я(199>:" LYX - . R(94), R(<26L R(152). KO06) PAKV - U(SO), R(133), K072), .R095), K(209) 01YMV - K(42), R(93), R(132), R(156), K(170) PMV - К (50), R(103). КС1Э6), R(160), KC174)

' ViClKV - K<45), 3(93), K(133). R('157>, K(171) HMV - K($7), R(114). К(14Э), R(172), K(166) SOT- - R(133), K(167), R(199). K(2-I3)

8. Расчет и сравиевда_профилей гидрофильности, екрофильнос-ти и.гйдропатаи белков оболочек потековирусов

Из литературных источников известно [Van Re^eranortel, 1933], что весьма полезными для изучения антигенной структуры"белков являются теоретические предсказательные метода. Для расчета"степени гвдрофельноЬта изучаемых белков мы использовали алгоритм, предложенный Корр и Woods и соответствующую компъютерау» программу FOGeiio, где используется этот алгоритм.

При сравнении _ профилей тадрсфшъностк всех белков можно отметать следующие особенности. 3 подавляющем большинство каясид-

>18-

ныо белки имеют гидрофильную природу и- и С-концевых участков. Однако, наиболее внсокококсервитивная область всех восьми белков имеет гидрофобную природу.

Как отмечалось выше, в кэпсидных белках потексвирусов присутствуют пять аминокислотных остатков с положительным зарядом, которые, по-видимому, взаимодействуют с фосфатными группами РНК. Анализ профилей гидрофильиости восьми белков показал, что участки полипептидной цепи, включающие эти пять остатков, имеют гидрофильную природу.

Так как объектом нагаих исследований является белок оболочки FVX, а принадлежность РАМУ к потекструппа до настоящего времени дискутируется в литературе, то нам было 'интересно сравнить различные, наиболее широко используемые методы предсказания и расчета антигенных, детерминант применительно . к- Pvx и, одновременно, более детально сравнить вторичные' структуры и некоторые другие характеристики двух указанных вирусов.

Вторичную структуру определяли по методу Chou и Pasman, акрофильность. и гидрофилыюсть рассчитывали по Норр, гидропатию -по Kyto и Dnoiíttio. Предсказанное число а-спирелэй, р-складок и (З-повиротов для белка оболочки Р7Х составляет соответственно' 37, 10 и 1655, а для -белка оболочки PAW'/ - 34', 14 и 20;;.

Расчете гкяро- к «крофяльности двух" белков показали, что гомологичный участок наибольшей ляш, '.для двух белков, вмещающий 8 аминокислот®« -остатков ( пояицкя 15е - 164 белка оболочки pvx а позиция 173 - 180 белке оболочки PAí.ív ), имеэт отрицательное значение вкро- и гздрофилмсстз. 3 основной профиля акро- и пугроТмльноети в какдом бедке совпадает, хотя есть и некоторое несоответствие. Тыс, в позиции 1 - йЯ белка оболочки I-VX отмечено положительное значение якрофильчооти, э значение гидрофильноегп отрицательное. н-кояцявоЯ.участок РуХ отличается заметно сольют* индексом акрефилькогти по сравнений с индексом ■ гидрофильноел:, что говорит скорее о тенденция этой области располагаться 'на поверхности белковой молоку.:и, чек о скоплении в данном районе большого числа зэрчзшнах охчясйасжгсных остатков. Что касается N-KowwBoro участка РШ, то для него характерен как високчЛ индекс акрофильиостя, так и гклрс^илыюста.

Прогнили , гшю1Я13",яи ,звуг исследуемых белков текло характеризуют тенденцию ''-'"конкеьнх участков обоих беков

-19- -

?ягт.\ябгзтьо» m iK-РАрзЕЯзста белкою? юдоездаг.

;)тк и одаздфквздезян* рйчультага Бзказквавт» чю белка огоазч-пс PAKT к FVX ogsg« структурна* оссОаяао^т и, как »»Д'т'и-, <**5?ку»»г o6s»ß бргяягз»до£ eaproac-s, w иозьсшвт. ■>тнчети fc'AM* кчуушй котекевкрусоь.

ffcoMCTp» its tu, что катода paciere «издгеяввг детершкант икагалксэ весьма долезшие: ври ср&вяеиаи структур кккзгжнах белков. ьосшд кведстбаетел^а верусов котексгрукш, на одка из йсш.'Льзо&&наагг. бячдопеэв не указал кз юедеюяоиаяаетвдю область, эксшршштаЕДО> К&Д&гКаУ** 1- бёЛКд OÖOftOHKK ¥*Z.

Б S Р О ü й

1. В результате ршазшкасю белгй оболочка M фошш в гкаролитяатв определена сда-дуккке акдепзюгчяз* act&mss &Ы,

leu, Пе, Pro. Т;/:' и Аур. ЧТО eoorbeïSTb>4-; НОададгтелйКЗетяМ

Sfet - X, усгтЕовдедош ижме емьнияр/уьтн структурном» гева данного 6.>лчй.

?,. к кодалго шдыаш .ь

гомогчшь« f.iujj vp'.ï шптзд.-г 'ñjika tts: fi - ç 63

шшоккзагсзд: остыла С KOÍÍÍ^^JÍ Í 45 ъвюшв/гятвве.

O'.nair't > ti виутр-ssifít3' í. ts 'ЛППК>КВ«*/П1Ь«Х i»CTä.mä ).

3. yctrkcsj&fhís ■здкйокясгд'.ткзя педадаейт-лк^ость внутреннего пептида обжуцм P*Ä Едоладоггэ ib aob'EaejDTiStt остатков. Нсказаяо различие в одной зшнокислотко» остатке по сравыеш-ш • с данкнм участком структурного гена hïmî'O бегла,

4. с, ПОИГЩЬВ ДВУ* НКА И ПКА к F'VX ККМуНОЯдГЭТвСОДЗ анализ капсагного бедка и «го броишнаю&зх и тфетшчачких фрагментов, а также юдггкцов, водчккиюс в результат* гкдраявз» ггротеаяой vs из Sí. airean. Вперьыеустш^&лгж», что кздуеддош-нантная облаять локализована к к - кздагьои учбезк« (fcjsta.

Е- При ес«.'Щ! БЭ2л ь обрчдккной БыДвл-н пеягт «з

[".грели'-та гв^лтл а^игдаи pvX гтрог»-'ï^î'-îT V& и;< Sí. «»<гсде. Который bsaiTM-Wi-BsHС .»ICffiV«

pK'i\?>?«»T- KPJÏC-'ÎV* й - ЬЦсЬОГО iÇStfcKïa

Цй гръкой-.-.ИМ -Д£«ДрИДУК JfeV№fcíBJwfcO, ЧГО SM с КНЛ

сс raros. ¿v.t¿-¿m ъ к^гиаи Ш шшкзгацюЧ ifeua С&лка

Сг-'.' ОЧКК i- V.» .

-¿О-

7. Проведен . теоретк еский анализ знтси^нних детерминант, капсидных белков PVX и PAMv и расчет вторичной структуры ь белков иболочек вирусов потвксгругаш. Показано, что распределение гидрофильных и гидрофобных участков этих белков сходно. На основании этого мокно утверждать нринадежиооть PAMV к потоке-группе .

3. Проведено сравнение аминокислотных последовательностей восьми белков оболочек вирусов «отексгруппы и установлено их значительное структурное подобие, что свидетельствует о сходстве молекулярной организации их вирионов.

02 I£Mi диссертации опубликешанм следШ'Шй работы: 1. Радабськяй Ю. Л,, Birep С. С., Гурова i.II. . Эа!к1н A.A.. Грама Д. П. Вивчення антигенно! структур« dlnsia оболонки Х- та M-BipyclE картешп. // Тез. доп. v Укр. öloxiM. эЧзду. - 1вамо-Фраак!есыс. -1987. -ч. i, с. 131-132

г. Гурова 1,11., В1тер G, с., Радаьський ¡0. Л. Анг.л)з <5рсмц1анових фрагменг1в оо'олокки Х-в1русу картопл1 ( ХЬК ) // Тез. доп.

V Укр. öloxiM. з '1зду. - 1Еано--Фралк1вськ. -1Н87. -ч. '¿, с. 211

3. РедавскиЯ Ю.Л., Витер С.С., Турова ИЛЬ, Герчкович A.A., Заикин A.A., Ярвекюль? Л., Саарма МЛ). Изучение антигенной структуры бежа оболочки Х-вируса картофеля // Тез. докл. vrr Весоюз. сишоз. по. химии белков и пептидов.-Таллинн.-1Э87.-с.90 - S1

4. Р&давсккй DJ.., Витер С.С., Турова И,П., Грама Л.П., Бобклиа А.Ф., Гогльдитойн М.И., Ярвекмьг Л.8., Оаарма М.Ю, Антигенная структура белка оболочки I-вируса картофеля. I. Иммунологический анализ бромциавовых фрагментов // Биоорганическая химия. -1988.-Т.14,N1.-с.20-2G

5. Турова VI.U., Битер С.С., Радавский Ю,Л. Сравнение вторичной структуры, гздрофильности и гидрофобности оелков оболочек Х-вируса картофеля и вируса' аукуба мозаики кэртсф*ля // Докл. АН УССР.-1388.-N9.-с.80-83

6. Радавский Ю.Л., Витер С.О., Турова ИЛ., Зайцева Л,С., Нрее-кюльг Л.В.. Саарма М.Ю., Гребенщиков Н.й., Б'аратова Л.А. Антигенная структура белка оболочки Х-вируса картофеля. Л. Локализация аятнгепной(нах) детерминант ь N-концевом участке белка // Неорганическая химия.-1989.-Т.15,N5.-с.615-319

Турова И.П., Витер С.С., Заикин А.Д., Зайцева JT.C.. Грама Д.Т1-, Радазский Ю.Л. Изучение антигенной структуры белков оболочек К вируса картофля и виру'.-а аукубо мозаики картофеля // Тез. докл. VII Съезда .Укр, микробиол. общества.-Черновцы.-1S89.-4.2, 0,183184

8. Радавсккй Ю.Л., Битер С.С., ТуроЕа И.П., Зайцева Л.С.. Дцбенко А.Г., Шилин В.В., Ярвекмьг Л.В.. Саарма M.D. Антигенная структуре капсидтгх белков трех вирусов картофеля'// Тез. докл. Псосовд. симпоз. химия белков.-Тбилиси.-1930.-с. 14?

9. Radaveky Yu.Ii. , Yitor S.S., Turova Т.P., Bybwnlco A.G. , Ocr^hkovioh A. A,; Sh.il in V.V., Jarvekulg L.V.. Saarma M.J. Antigen.!о structure of the ooat proteins of potato virus X' (PVX) and of potato auouba mosaic virus (PAMV-) // Abstr. 2-d Intern. Syropos on "Positive strand RHA viruses".-Vienna (Austria).-1989.-p.43 ■

10. nadavuky Yu,7„ , Viler* S.S., Turova I.P., Dybenko A.G., Gfrrtikovioh A.A., Sb'Uin V.Y., Jarvekulg L.V.. 8z&mv>. H.J. Iianacoirtiumleal analysis of the cvat proteins of potato vir-из X (PVX) and of potato sucuba mosaic virua (PAKV) // Abstr. 7-th USER ~'?RG йутароя. on . "Ciiemioiry of peptides and proteins".-Diiiahan (USSR).-1939.-p.43

11. Radaveky Yu.I.., Viter Б.Б., Turova I.P., Baratova L., Greben-ahohtk-w H., Sfcishkov A., Efiir.ov A,.. Jarvekulg L., Saarma 15. Immunochemical amlyai«, trl fciua planigraphy and structural featureв of the potato virus X and its oo«t protein // Intern. Syinpos. "Virology, Inrcunology and Society" Techn. Reports M6,~ 1991--p.254-272

vv.k-катгль ' , Туроьа И.О.

f