Галектин-опосредованное связывание вируса гриппа с клетками-мишенями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и /O.A. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи 005052822

Черный Евгений Станиславович

Галектин-опосредованное связывание вируса гриппа с клеткой-

мишенью

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

о 4 ОКТ 2012

Москва 2012

005052822

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова (ИБХ РАН). Заведующий лабораторией - доктор химических наук, профессор, Н.В. Бовин.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией углеводов ИБХ РАН, Н.В. Бовин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1. Водовозова Елена Львовна, доктор химических наук, ИБХ РАН

2. Бурцева Елена Ивановна, доктор медицинских наук, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится 10 октября 2012 года в 10.00 на заседании диссертационного ученого совета Д.002.019.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117991 ГСП-1, Москва В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан 7 сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Вирус гриппа - один из наиболее изученных объектов среди возбудителей опасных заболеваний человека. Тем не менее, в начале 21 века человечество фактически не имеет ни надежного лекарства против него, ни системы вакцинации, способной гарантированно предотвратить заболевание. Поэтому расширение представлений о структурной организации, рецепторной специфичности и репликации вируса в организме хозяина, с целью разработки принципиально новых подходов к терапии предупреждению этого заболевания, является крайне актуальной задачей.

Стадии первичного связывания и проникновения вируса гриппа в клетку-мишень активно изучаются; в результате, устоявшиеся представления о том, что единственным и достаточным рецептором вируса гриппа являются сиалогликаны, регулярно подвергаются сомнению. Современные исследования говорят о возможном существовании дополнительных факторов, способствующих адгезии вирионов на поверхности клетки. Поэтому поиски в данной области являются актуальной задачей, решение которой может привести к разработке нового поколения блокаторов адгезии вируса гриппа. Кроме того, изучение иммунного ответа, прежде всего к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа, открывает возможности разработки новых иммунотерапевтических подходов.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлось обнаружение дополнительных факторов рецепции вируса гриппа на начальной стадии заражения клеток.

Предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить возможность связывания вируса гриппа с другими углеводами клетки человека, помимо классических лигандов - сиалогликанов.

2. Проверить экспериментально гипотезу о возможности связывания галектинов с вирусом гриппа и установить роль этих белков во взаимодействии вирусных частиц с клеткой-мишенью.

3. Изучить влияние галектинов на свойства поверхности вируса гриппа, в том числе -на связывание антител.

Научная нопнзпа.

В данной работе впервые показано, что в процессе взаимодействия вируса гриппа с клеткой-мишенью способны принимать участие углеводсвязывающие белки - галектины; их роль в инфекционном цикле сложна и неоднозначна:

- большинство (но не все) представителей семейства куриных и человеческих галектинов связываются с вирусом;

- галектины, не смотря на способность увеличивать адгезию вируса, выступают как

фактор препятствующий проникновению вируса гриппа в клетку;

- даже при отсутствии сиало-рецептора, гапектины могут обеспечивать высокий уровень адгезии вируса на клетке;

- связывание галектинов с вирусом гриппа не приводит к изменению функциональных свойств гемагглгатинина и нейраминидазы, но маскирует их антигенные детерминанты.

Практическая значимость.

• Обнаруженная компенсаторная роль галектинов при отсутствии сиалорецепторов на клетке заставляет по-новому относиться к терапевтическим методам, нацеленным на ингибирование спало-опосредованного заякоревания вируса гриппа.

• Галектин-опосредованную адгезию вируса гриппа на клетке необходимо учитывать в производстве живых вакцин, которые получают наращиванием вируса в клеточных культурах.

• Найденный эффект ингибнрования галектинами протективных антивирусных антител открывает новую возможную область для совершенствования антивирусной иммунотерапии.

Публикации н апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: Summer Course Glycosciences (Нидерланды, 2008), Annual Conference of the Society for Glycobiology (Сан-Диего, 2009).

Crpyicrvpa и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного структурной организации вируса гриппа и общей характеристике класса галектинов, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы; содержит 58 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ'

На поверхности вируса гриппа располагаются два гликопротеина - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ЫА). НА инициирует инфекцию, связываясь с сиалогликанами на клетке-мишени, ЫА отщепляет сиаловую кислоту с углеводных цепей глнкоконыогатов, причем не только клетки, но и с поверхности вирионов. Таким образом, ЫА препятствует агрегации вирусных частиц и обеспечивает их успешное высвобождение из зараженной клетки.

Согласно устоявшимся представлениям, только сиалогликаны являются молекулами-рецепторами для вируса гриппа. Однако, в литературе был описан факт заражения десиалилированных клеток и, таким образом, возникли экспериментальные предпосылки к тому, что возможно вирус гриппа использует альтернативные или дополнительные рецепторы при адгезии на клетках. В связи с этим, мы предположили три механизма рецепции вируса гриппа, не требующих сиалогликанов:

1) НА или ЫА имеют лектино-подобные, углеводсвязывающие сайты, «настроенные» на несналнлироваиные структуры.

2) В процессе отпочковывания вирионов, в составе вируса гриппа оказывается белок (или белки) клетки-хозяина, которые впоследствии взаимодействуют с собственными комплементарными молекулами (не обязательно углеводными) на поверхности клетки-мишени.

3) Так как оба поверхностных белка (НА и ЫА) вируса гриппа сильно гликозилнрованы, то дополнительную адгезию осуществляют углевод-связывающие белки клетки-хозяина - лектины.

Каждый из этих механизмов имел право на существование, благодаря наличию подтверждающих литературных фактов. Было известно, что ИА, кроме каталитического сайта связывания сиалогликанов, имеет так называемый НВ-сайт, специфичность и назначение которого до конца не установлены. Другой гликопротеин вируса гриппа - НА, также предположительно имеет потенциальный дополнительный сайт связывания, который изучен в еще меньшей степени, чем НВ-сайт. Белки клетки-хозяина, которые не кодируются геномом вируса, были действительно обнаружены в составе вирионов, и по-видимому захватываются с поверхности в процессе баддпнга. Согласно литературным данным, полученным с помощью протеомных методов, в вирионы гриппа может включаться до 36

'Автор выражает благодарность: А.С.Гамбарян (Институт полиомелита РАМН, Москва) за помощь в выращивании вирусов, Е.М.Рапопорт (ИБХ РАН, Москва) за предоставление реактивов и помощь в клеточной работе, Е.Ю.Корчагиной (ИБХ РАН, Москва), за синтез Ркю-ООРЕ и обсуждение работы, Л.В.Кордюковой (НИИ ФХБ, Москва), за рекомендации в проведении ряда экспериментов, Т.Гардеру (Институ Фрндриха-Леффлера, Грайфсвальд, Германия) за сотрудничество в проведении работы, М.Н.Матросовичу (Марбургский университет имени Филиппа, Марбург, Германия) за предоставление культуры МОСКбБ! АТ, Е.И.Бурцевой (НИИ Вирусологии, Москва) за предоставление вируса НШ1 Москва и человеческой сыворотки и Г.-И.Габиусу (Мюнхен, Германия) за предоставление галектинов.

5

различных белков. Вопрос, является ли такой захват специфическим и важен ли он для последующего распространения инфекции, остается открытым.

1. Проверка первых двух предположений. Прежде всего, необходимо было убедиться, что в составе вируса гриппа действительно присутствуют белки клетки-хозяина. В нашей работе, с помощью метода электрофореза было проведено разделение очищенных вирионов и идентифицированы все известные компоненты вируса, основываясь в том числе на литературных данных. Кроме основных структур вируса, как и описано в литературе, на электрофорезе было обнаружено наличие дополнительных белков. Эти компоненты соответствовали предполагаемым белкам клетки-хозяина, среди которых могли быть лектины, поэтому далее мы исследовали связывание вируса гриппа с рядом гликанов.

Для изучения неизвестных рецепторных свойств гликопротеинов вируса и возможной роли клеточных белков использовался твердофазный анализ, в котором вирусы гриппа взаимодействуют с биотинилированными полиакриламиднымн глнкоконъюгатами (Glyc-PAA-biot). Известно, что лигандами для вируса гриппа являются сиалилированные олигосахариды (6'SiaLacNAc (6'SLN) и 3'SiaLacNAc (3'SLN), поэтому их использовали как положительный контроль. Выбор гликанов, «нетипичных» для вируса, основывался на нескольких известных научных . Ранее было показано, что вирусы гриппа могут связываться с сульфатированным производным лактозы. Подобные структуры типичны для респираторных муцинов, поэтому в группу протестированных был включен гликоконъюгат, несущий б'ШОзЬасЫАс. Кроме того, имелись предпосылки к тому, что вирус связывается с aGalNAc, поэтому в эксперимент включили гликаны с терминальным остатком N-ацетилгалактозамина: GalNAcal-3GalNAcp (Fs-2), aGa!NAc-OSer, aGalNAc (Tn), и GalNAcal-4(Fucal-2)Gaipi-4GlcNAc и ряд контрольных конъюгатов. Эксперименты провели на четырех различных штаммах (A/NIB/26/90 (H3N2), А/СССР/90/77 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/FPV/Rostock/34 (H7N1), но ни один из тестированных гликанов, кроме сиалилнрованных, не связывался с образцами вирусов (Рис. 1, приведено для одного вируса).

Таким образом, с помощью твердофазного анализа не удалось обнаружить вирус-связывающих гликанов, отличных от сиалозидов, а гипотезы о том, что НА, NA или приобретенные белковые компоненты в составе вируса гриппа, могут играть роль в инициации адгезии без сиалогликанов не нашли экспериментального подтверждения.

1,4

1,2

? 1

S

м (1 X

С\

0,6

S

I 0,4

0,2

о

0

-0,2

-"»- 6'SLN

«»s»»*3'SLN

«**<*<s4jalN Аса l-4(Fuca 1 -2) GaipMGtcNAc

««яадвйжвю GalNAc-O-Ser

«—«»Tn

концентрация конъюгата, мкМ

Рисунок 1. Связывание вируса гриппа A/N1B/26/90 (Н1Ш) с глико-конъюгатами Glyc-PAA-biot в твердофазном анализе.

2. Гипотеза о взаимодействии вируса гриппа с галектинами. Вирус гриппа плотно покрыт НА и NA, которые занимают большую часть его поверхности. Оба белка обильно гликозилированы, и каждая субъединица может нести несколько углеводных цепей комплексного или олигоманнозного типа. Состав этих цепей варьирует между штаммами, но для преимущественного числа вирусов общим свойством является наличие большого числа комплексных цепей с терминальными остатками галактозы. В белках млекопитающих галактоза как правило маскирована сиаловой кислотой, тогда как в составе вируса гриппа, благодаря действию NA, те же цепи в составе вирионов всегда десиалилированны. Из-за этого поверхность вируса гриппа приобретает необычный, уникально плотный паттерн р-галактозидов. Мы предположили, что такая поверхность может служить высокоаффинной мишенью для галактозидсвязывающих белков - галектинов.

В данной работе был протестирован ряд куриных (chicken galectin (CG)-IA, CG-1B, CG-2, CG-3 и CG-8I) и человеческих (human galectin (hG)-l, hG-2, hG-3, hG-4, hG-7 и hG-8) галектинов. Большая часть экспериментов проводилась на куриных белках, что обусловлено несколькими причинами. Во-первых, птичьи вирусы гриппа изучены лучше всего, а образцы штаммов выращенные на куриных эмбрионах более доступны, и их значительно легче получать в чистом виде. Во-вторых, параллельное исследование человеческой и птичьей систем открывало возможность сравнения видозависимости изучаемых процессов.

На начальном этапе работы факт взаимодействия галектинов с вирусами гриппа был подтвержден с помощью твердофазного анализа, аналогичного методу изучения связывания с гликоконъюгатами. Для этого вирус сорбировали на 96-луночном планшете и далее детектировали связывание с галектинами меченными антителами к этим белкам (данные не показаны). Взаимодействие было продемонстрировано на четырех штаммах: A/NIB/23/90 (H1N1), A/Duck/France/46/82 (H1N1), A/PuertoRico/8/34 (H1N1) и A/FPV/Rostock/34 (H7N1), и это мотивировало дальнейшее, более детальное исследование галектинов.

3. Влияние галектинов па функции НА и NA вируса гриппа. Можно предположить, что связывание галектинов с поверхностью вируса гриппа приведет к изменению функциональной активности гемагглютинина и нейраминидазы, так как некоторые из их углеводных цепей находятся рядом с углеводсвязывающим сайтом. Твердофазным методом (см. выше) было проверено три вирусных штамма, два из которых были птичьи - A/FPV/Rostock/34 (H7N1), A/Duck/France/46/82 (H1N1), и один человеческий - A/NIB/23/89-MA (HIN 1), все выращены на куриных эмбрионах. В качестве функционального теста использовалось взаимодействие вирусного НА с его рецептором в виде конъюгата 3'SLN-PAA-biot, к которому все три штамма обладали высоким сродством. Было обнаружено, что при нагрузке на вирусы гапектина CG-1А уровень взаимодействия с 3'SLN несколько снижался, тогда как CG-1B, CG-2, CG-3, hG-8 и hG-1 влияния не оказывали (Рис. 2).

Ферментативную активность NA исследовали с помощью флуоресцентно меченых субстратов 3'SiaLac-BODIPY или 3'SiaLacNAc-BODIPY. Перед добавлением субстрата вирус инкубировали с галектинами (20 мкг/мл) в течение 1 часа, то есть времени, которого заведомо достаточно для нагрузки галектинов. CG-1A, -2 и -3 не оказывали существенного влияния на каталитические свойства вирусов гриппа (Рис. 3). По-видимому, на поверхности вириона галектины преимущественно присоединяются к углеводным цепям НА, либо связывание с NA стерически не затрагивает каталитический центр и не мешает отщеплению сиаповых кислот. Таким образом, в этой серии экспериментов было установлено, что влияние галектинов на функциональные свойства гликопротеинов поверхности вируса гриппа проявляется слабо, либо отсутствует вовсе.

Рисунок 2. Связывание вируса гриппа A/Duck/France/46/82 (H1N1) с гликоконъюгатом 3 'SLN-PAA-biot в присутствии галектинов.

fe Щ = оХ

0 2 4 6

концентрация глнкоконъюгатя, мкМ

б)

вирус

вирус

' У .4 '

BHpyc+CG-3

BHpyc+CG-2

вирус+CG-l А

вирус+СС-2

вирус+CG-l А

О

20

40

60

80

О 20 40 60 80

Рисунок 3. Расщепление (выражено в %) вирусами гриппа a) A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и 6) A/Duck/France/46/82 (H1N1) субстратов 3 'SL-BODIPY и 3 'SLN-BODIPY соответственно, в присутствии галектинов.

4. Ипгибнрование галектинами связывания антител с вирусом гриппа. Поскольку галектины не влияют на активность НА и NA, мы предположили, что их связывание с вирионами выполняет иную функцию, а именно - маскирует антигенные свойства вируса гриппа.

Из литературы известно, что гликозилирование НА и NA связано с адаптацией к организму хозяина. С одной стороны, существует направленное уменьшение числа сайтов гликозилирования, как например при адаптации к организму мышей. Наличие или отсутствие углеводных цепей в этом случае является частью регуляторного механизма и может приводить к изменению рецепторной специфичности вируса или к повышению его устойчивости к маннозо-связывающим белкам. С другой стороны, у человеческих штаммов вируса обнаружена тенденция к увеличению степени гликозилирования. Как результат -углеводные цепи НА и NA могут маскировать антигенные детерминанты и предотвращать связывание защитных антител с вирусом. Основываясь на этом, мы предположили, что связывание галектинов с гликанами НА и NA будет усиливать эффект маскировки антигенных детерминант, или давать этот эффект, даже когда сама по себе углеводная цепь не оказывает заметного влияния.

Роль галектинов в качестве ингибиторов на поверхности вирионов была изучена с помощью описанного выше твердофазного анализа. Нагруженные галектином птичий A/Duck/France/46/82 (H1N1) и человеческий A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) вирусы сорбировали на планшете, после чего наносили поликлональные противовирусные антитела к штамму H1N1 (коммерческие, Abeam, получены к штамму А/СССР/90/77 (H1N1)). Как и предполагалось, нагрузка галектинов на вирионы привела к ухудшению связывания антител (Рис. 3). Наибольший ингибирующий эффект для обоих вирусов проявлял CG-2 и, в меньшей степени - CG-1A. Один из галектинов - CG-3, влияния не оказывал. Между штаммами вируса также наблюдались различия, в частности, CG-1B выступал как ингибитор только для человеческого (Рис. 4а), но не птичьего вируса (Рис. 46).

Рисунок 4. Ингибирование галектинами связывания поликлональных антител с вирусами a) A/Puerto Rico/8/34 (HINI) и 6) A/Duck/France/46/82 (HINI) .

Углеводный состав цепей вируса, который влияет на связывание с галектином, целиком определяется аппаратом гликозилирования клетки-хозяина. Поэтому в следующем варианте эксперимента было проведено сравнение двух вариантов одного штамма вируса. Человеческий A/NIB/23/89-MA (H1N1) был одновременно выращен на куриных эмбрионах (вариант Е) и в культуре клеток MDCK. (вариант С). Как и ожидалось, наблюдались существенные различия. В то время как птичьи гапектины СО-1А и CG-2 оказывали ингибиторное действие в обоих случаях, человеческие галектины hG-1 и hG-8 выступали ингибиторами только для С-варианта вируса (Рис.5).

Рисунок 5. Ингибирование галектинами связывания поликлональных антител с алантоисньш - а) и культуральным - б) вариантами вируса АМ1В/23/89-МА (Н1И1).

Аналогично действовали полнклональные антитела в составе сыворотки крови, полученной от людей, переболевших гриппом. В этом случае, тестировали сезонный штамм вируса А/Москва/17/98 (НШ1), выращенный на культуре клеток МОСК. С куриными галектинами СО-1А и Св-2 наблюдалась высокая степень блокировки (Рис. 6а), а из человеческих гапектинов наибольшей активностью обладали ЬО-1 и 110-2 (Рис. 66). Специфичность эффектов, оказываемых галектинами, косвенно подтверждается тем, что

степень ингибировання для разных белков различалась, а один галектин, а именно Ьв-З, вообще не оказывал никакого действия (Рис. 66).

weGKacCG-lA CG-1B

«Mas«isfsCG-2

10 20 30 40 50 концентрация галектнна, мкг/мл

10 20 30 40 50 концентрация галектнна, мкг/мл

Рисунок 6. а) Ингибирование куриными и б) человеческими галектинами связывания человеческой сыворотки с вирусом А/Москва/17/98 (H1N1).

Следующим шагом было изучение препарата внутривенного иммуноглобулина (ИГВВ), который представляет собой суммарный набор антител из пула сывороток как минимум 1000 доноров. Такие пулы могут содержать антитела к вирусу гриппа, направленные против консервативных антигенных сайтов и, таким образом, потенциально способные защищать организм от всех штаммов вируса.

Для человеческих вирусов, а именно A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и А/Москва/17/98 (H1N1), было показано, что при концентрациях ИГВВ 25 и 50 мкг/мл соответственно наблюдается высокая степень ингибирования их связывания человеческими галектинами. Все без исключения галектины блокировали связывание ИГВВ с вирусом гриппа, а наиболее эффективное действие оказывали, как и в случае сыворотки, человеческие галектины hG-1 и hG-2, ингибирование которыми достигало 90% (Рис. 7).

Полученные данные представляют несомненный интерес для разработки терапевтических направлений, основанных на применении моноклональных и гетеротипических антител и вакцин, так как галектины, экскретируемые клетками при воспалении, могут в значительной степени ослаблять терапевтический эффект.

a) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и 6) А/Москва/] 7/98 (H1N1).

5. Роль галектинов на стадии адгезии вирионов на клетке. Дальнейшие эксперименты проводились на клеточной модели, где мы ожидали два возможных проявления действия галектинов - ингибиторное или, наоборот - способствующее развитию инфекции. Ингибиторный эффект от галектинов мог развиваться вследствие экранирования гапектином сиалолигаидов клетки, вовлеченных в адгезиию вируса. Кроме того, гапектины могли приводить к слипанию вирионов, и таким образом, снижать их инфекционность. С другой стороны, наличие галектинов могло напротив, повышать уровень адгезии вируса гриппа, если за счет мультивалентности, галектины одним из углеводсвязывающих доменов связываются с галактозидом на клетке, а другим - на вирусе. Следствием такого двух-сайтного взаимодействия предположительно может быть обеспечение полноценной адгезии, без участия сиаловых кислот. Оба эффекта от галектинов имели литературные предпосылки: галектин-опосредованное заякоревание вирионов на клетке известно для ВИЧ-1, а снижение уровня инфекции при введении галектина-1 invi'vo-для вируса гриппа.

5.1. Расположение галектинов и вируса на клетке изучали методом, разработанным ранее в лаборатории углеводов ИБХ РАН (Е.М.Рапопорт и др.) для исследования углеводной специфичности галектинов. Галектины нагружали на поверхность клеток, после чего проверяли их взаимодействие с вирусом гриппа. Сочетание данного метода с конфокальной микроскопией позволило установить, что на поверхности клеток вирус гриппа и галектин CG-2 колокапизуются, т.е. располагаются в одних и тех же кластерах (Рис. 8). В то же время, для CG-3 подобной колокализации не наблюдалось (данные не показаны).

Рисунок 8. Колокализация CG-2 и вируса гриппа A/NIB/23/89_MA (H1N1) на поверхности клеток MDCK. Вирус инкубировали с клетками (30 мин при 37 "С'), предварительно нагруженными галектинами (30 мин при 4 °С). а) Вирус, меченый флуоресцеином; б) галектин (детекция антителами, мечеными фикоэритрином); в)вирус и галектин вместе.

5.2. Изучение влияния галектинов на связывание вируса с клетками. Результаты конфокальной микроскопии, а именно - наличие колокализации, подтвердили возможное участие галектинов в процессе адгезии вирионов на поверхности клетки. Для количественного определения уровня связывания вирионов применялась проточная цитофлуориметрия, в которой преимущественно использовали вирус гриппа с флуоресцентной меткой2 (эти результаты на первом этапе дополнительно подтверждали экспериментами с нативным вирусом, который детектировали с помощью меченых антител). Степень адгезии вируса на клетках измеряли по изменению уровня флуоресценции.

Наличие галектинов на поверхности клеток приводило к возрастанию адгезии вируса гриппа. Из куриных галектинов подобное действие оказывали CG-1A и CG-2, тогда как нагрузка других галектинов не оказывала эффекта (Рис. 9). Литературные данные свидетельствуют, что физиологические концентрации галектинов в организме человека варьируют в диапазоне 0,5-300 мкг/мл, а при заражении патогенными микроорганизмами концентрация галектинов может локально возрастать и до 600 мкг/мл; мы использовали галектины в концентрации 400 мкг/мл и ниже. Оптимизация условий показала, что увеличение адгезии вируса гриппа под действием галектинов достигает максимума при концентрации 100-150 мкг/мл (Рис. 10а)

2 В рамках диссертации был разработан метод мечения вируса с помощью флуоресцентного липида Р1ио-ООРЕ, который изложен в разделе 7 данного автореферата.

Рисунок 9. Связывание вируса гриппа А/КкеМапс! Р/аЬ/14/07 (НШ1) с клетками МОСК в присутствии галектинов (400 мкг/мл). Прерывистая линия - контрольные клетки без вируса; серое заполнение - клетки со связанным вирусом без галектина; жирная - галектин-нагруженные клетки с вирусом. Цитофлуорограмма; по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции выбранной популяции клеток (в отн. ед.), по оси ординат - относительная частота встречаемости.

Увеличение адсорбции вируса вызывал также ряд человеческих галектинов, а именно ЬО-1. Ьй-З и ЬС-8 (Рис. 106).

а) б) hG-8

hG-7 hG-3 hG-2 hG-1

CG-2 50

CG-2 25 CG-2 10 CG-2 5 вирус без галектина

50 Флуоресценция 100 вирус без галектина 10 20 30 Флуоресценция

Рисунок 10. а) Влияние CG-2 на связывание вируса гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) с клетками MDCK в различных концентрациях (мкг/мл). б) Действие человеческих галектинов при связывании A/FPV/Rostock/34 (H7N1) с клетками MDCK. Здесь и далее - данные цитофлуориметрии, по оси абсцисс - значения флуоресценции в отн. ед.

Возрастание адсорбции вирионов на поверхности клетки-мишени под действием галектинов обнаруживалось для всех изученных штаммов вируса гриппа: A/Mallard/NPV/41/04 (H7N1), A/Guinea fowl/Germany/DZ3/85 (H2N2), A/Lesserblack_backed gull/Finland/R2265/09 (H13N2), A/Rheinland Pfalz/14/07 (H1N1), A/FPV/Rostock/34/ (H7N1), A/NIB/23/89-MA (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1); величина эффекта отличалась, что объясняется различиями в их гликозилированнии. Так, согласно литературным данным, НА штамма A/FPV/Rostock/34/ (H7N1) несет существенное количество углеводных цепей (не менее 7 сайтов) и, в соответствии с этим, эффект от галектинов был значительно выше, чем для других вирусов. Некоторые из галектинов специфически способствовали заякореванию только определенных штаммов вируса, так, hG-1 действовал только на A/FPV/Rostock/34/ (H7N1) (Рис. 11), но не A/Puerto Rico/8/34 (H1N1); а на связывание последнего действовал галектин hG-8 (данные не показаны).

Рисунок 11. Влияние галектина hG-1 на взаимодействие вирусов гриппа a) A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и б) A/Puerto Rico/8/34 (HIN!) с клетками MDCK.

5.3. Ингибирование взаимодействия галектинов с вирусом. Для понимания механизмов действия галектинов на адгезию вирусов гриппа необходимо знать специфичность этих белков. В отличие от человеческих галектинов, специфичность куриных аналогов изучена мало. Поэтому два куриных галектина, один из которых (СО-2) увеличивал адгезию вируса на клетке, а другой (СО-З) - нет, была исследована с помощью гликочипа, в состав которого входило 205 гликанов, многие из которых являются потенциальными лигандами галектинов.

Анализ данных (не показаны) гликочипа выявил, что наиболее сильным лигандом для СО-2 являются сахариды А (тип 2) и А (тип 1), а также другие антигены групп крови системы АВН - В (тип 2) и Н (тип 2). По сравнению с этими гликанами, «классические» лиганды галектинов, такие как полилактозамины, показали низкий уровень связывания. Для СЄ-З предпочтительными лигандами, напротив, выступали типичные лактозаминовые гликаны - (ЬасЫАс)з и (ЬасЫАс)т. Таким образом, галектины имели существенные различия в углеводной специфичности, что, по-видимому, обусловило их разное действие в отношении вируса гриппа.

Опираясь на данные гликочипа, мы провели ингибирование действия галектинов на клеточной модели. Условия эксперимента оставались прежними; отличие состояло в том, что после нагрузки галектинов и перед нанесением вируса гриппа, клетки инкубировали с ингибиторами. Как и ожидалось, после добавления в систему лиганда для СС-2, а именно мультивалентного тетрасахарида А (тип 2), степень заякоривания вируса на поверхности клетки уменьшалась до уровня без галектина (Рис. 12). Контрольный конъюгат (LacNAc)з либо не влиял на связывание вируса, либо его действие проявлялось только при высокой концентрации (100 мкг/мл). Таким образом, высокоаффинный лиганд галектина действительно отменяет связывание вируса гриппа с клеткой.

Рисунок 12. Ингибирование действия Сй-2 на адгезию вируса А/РРУ/Яо$ЮскЛ4 (Н7Ы1) гликоконъюгатом А (тип 2) в разных концентрациях (мкг/мл).

СО-2+А(тип2) 100 СО-2+А{тип2) 25 ■■МИН

СО-2+А(тип 2) 5

СО-2

вирус без галектина

_ 50 100 Флуоресценция

5.4. Влияние на адгезшо особенностей гликома вируса и клеточной поверхности.

Сравнивали два варианта одного вируса A/NIB/23/89-MA (H1N1); один был выращен на куриных эмбрионах, а другой - на культуре MDCK, из-за чего вирусы различались составом углеводных цепей. Ожидалось, что изменение гликома вируса повлияет на гапектин-опосредованное заякоревание.

В целом, увеличение адгезии вирионов на клетках-мишенях наблюдалось в большей степени для культурального, С-варианта (данные не показаны). Наибольшее различие между вирусами проявлялось в отношении человеческих галектинов hO-1 и hG-8, эффект от которых для С-варианта был более явным. Опираясь на литературные данные, мы объясняем это тем, что углеводный состав вирусов, выращенных в организме млекопитающих, как правило отличается более высокой степенью гликозилирования и разветвленной структурой. Это обеспечивает более высокую аффинность галектинов к таким вирионам и, как следствие, галектин-опосредованное заякоривание проходит более интенсивно.

Углеводный состав поверхности клеток также важен при адгезии вируса, в том числе опосредованной галектином. Для подтверждения этого факта мы использовали трансфецированный вариант клеток MDCK, а именно - клетки MDCK6SIAT, которые в большей степени (чем исходная культура) синтезируют углеводные цепи с терминальным остатком сиаловой кислоты, присоединенной связью а2-6. Подобное изменение гликома поверхности, как и ожидалось, приводило к уменьшению связывания галектинов, так как известно, что ос2-6 сиалирование запрещает присоединение этих белков к углеводным цепям. Как следствие, галектины хоть и увеличивали связывание вируса гриппа с клеткам, но эффект был гораздо более слабым по сравнению с нормальными клетками, или не детектировался вовсе (данные не показаны).

5.5. Связывание вируса с десналилированпыми клетками в присутствии галектинов.

Десиапилирование привело к значительному снижению адгезии вируса, вплоть до ее отсутствия (Рис. 13). Нагрузка галектинов на десиалилированные клетки увеличивала адгезию до уровня равного (галектин CG-2), или даже превышающего (в случае CG-1A) уровень сиало-опосредованного процесса.

Большинство клеток млекопитающих, к которым относятся и клетки MDCK, секретируют галектины при стрессовых состояниях, к которым можно отнести и инфекцию вирусом гриппа. Таким образом, галектины могут служить не только в качестве дополнительного, но и достаточного фактора, обеспечивающего заякоривание вируса гриппа на поверхности клетки-мишени. Данный эксперимент имитирует ситуацию, когда вирус обладает высоко активной NA и низкоаффинным НА.

клетки+вирус клетки+в Hpyc+CG-2 клетки+вирус+CG-1А deSia клетки+вирус deSia клетки+в npyc+CG-2 deSia клетки+вирус+CG-1А ЩШШг-* .....................h—1

20 40 Флуоресценция

Рисунок 13. Компенсирующее действие галектинов СС-1А и Сй-2 при связывании вируса гриппа А/ШВ/23/89-МА (Н1Ы1) с нашивными и десиапилированными (с1е81а), с помощью нейраминидазы из V. сИо1егае клетками МОСК.

5.6. Действие галектинов при нагрузке на вириопы. Известно, что галектины обнаруживаются во внеклеточном пространстве, а также, что вирус гриппа необычно плотно галактозилирован. Эти факты говорят о реальности физиологического связывания галектина с вирусом до стадии адгезии на клетке, и мотивировали эксперименты, в которых вирус инкубировали с галектинами (1 ч) и затем наносили на клетки. Нагрузка галектина CG-1A на вирионы способствовала адгезии на клетках, причем эффект был сильнее, чем при нагрузке того же галектина на клетку. В то же время, для родственного галектина CG-2 был

Рисунок 14. Влияние куриных галектинов CG-1A и CG-2 на взаимодействие вируса гриппа A/NIB/26/90 (H1N1) с клетками MDCK при нагрузке на клетки/вирус. Детекция вируса с помощью флуоресцентных антител.

получен противоположный результат (Рис. 14).

галектин на » CG-2

клетке НШііШШШШіі—і

галектин на вирусе ЩЩЩЩ-н «CG-1A

вирус без галектина ИД—і

500 1000 Флуоресценция 1500

Совокупность полученных данных говорит о возможности нескольких сценариев взаимодействия между вирусом, клеткой и гапектином - взаимодействия, которое зависит от предпочтительной локализации галектинов и множества факторов, таких как паттерн гликозилирования клетки и вируса, активность вирусных белков, наличие гликопротеинов-конкурентов в межклеточном пространстве и т.д. Заякоревание вируса на клетке является лишь начальной стадией в процессе заражения, поэтому были проведены эксперименты, отражающие весь цикл заражения.

6. Исследование полного цикла заражения вируса в присутствии галектинов. Для качественкой/полуколичественной оценки действия галектинов использовали метод окрашивания монослоя. После инкубации с вирусом гриппа в течение ночи, зараженные

клетки инкубировали с конъюгатом фетуин-перокеидаза: НА на поверхности зараженных клеток и вирионов, не успевших отпочковаться, связывался с сиалилированными глнканами фетуина, а благодаря пероксидазе осуществлялось окрашивание клеток. Результат анализировали с помощью микроскопа, сравнивая заражение монослоя с галектииом и без него.

Для инфицирования клеток MDCK использовалась алантоисиая жидкость, полученная наращиванием вируса A/FPV/Rostock/34 (H7N1) в куриных эмбрионах. Важно было взять именно нативный, «живой» вирус, без каких либо стадий очистки. Галектины в различных концентрациях от 0,1 до 50мкг/мл добавляли к клеткам одновременно с алаитоисной жидкостью (разбавление 1:105).

В этих экспериментах (данные не показаны) галектины ингибировали инфицирование клеток вирусом гриппа, оба куриных галектина - CG-1A и CG-2, в концентрации 5 мкг/мл и выше полностью отменяли заражение. Уменьшение концентрации галектинов приводило к появлению окрашивания клеток лишь при концентрациях 1 мкг/мл и ниже. Предварительное десиалилированне монослоя MDCK также отменяло заражение клеток, а добавление галектинов не изменяло ситуации.

Таким образом, в полном инфекционном цикле галектины способны ннгибировать заражение клеток вирусом гриппа, что противоречит нашим результатам, полученным с помощью цитофлуориметрии (раздел 5.2), где галектины увеличивали адгезию вируса на клетке-мишени. Поэтому была проведена серия дополнительных исследований, где использовался количественный метод оценки заражения, и варьировались условия проведения эксперимента.

6.1. Действие галектинов на эффект заражения клеток вирусом гриппа, сравнение разных условий проведения эксперимента. В данной серии экспериментов использовался метод измерения ферментативной активности нейраминндазы вируса гриппа для количественного измерения степени заражения или связывания вируса с монослоем клеток MDCK: после нанесения вируса па клетки и инкубации в течение часа (этого достаточно для связывания вирионов) или ночи (полный цикл заражения), после чего вносили флуоресцентный субстрат для NA (MUF-глнкозид нейраминовой кислоты, MU-NANA).

Таблица I. Влияние галектинов при взаимодействии вируса гриппа с клетками. Сравнение

разных методов.

№ Метод Детекция Стадия, на которой добавлялся галектин Что фактически исследовалось Эффект от галектинов (Интенсивность)

1 Связывание вируса с клетками. Цитофлуориметрия. (суспензия клеток МОСК) меченый вирус Галектин предварительно нагружали на клетки Связывание Увеличение адгезии вируса(++)

Галектин предварительно нагружали на вирус

2 Окрашивание монослоя клеток МОСК фетуин-пероксидазой после заражения по субстату пероксидазы Галектин смешивался с вирусом Заражение Ингибирование (—)

3 (а,б) Количественная оценка заражения/связывания по ферментативной активности ЫА (монослой клеток МОСК) По реакции расщепления MU-NANA Галектин смешивался с вирусом а) Связывание Ингибирование (-)

б) Заражение Ингибирование (—)

4 Галектин предварительно нагружали на вирус Связывание Ингибирование

5 <а.б) Галектин предварительно нагружали на клетки а) Связывание Увеличение адгезии вируса(+)

б) Заражение Ингибирование (-)

Чтобы понять, какая стадия является ключевой для проявления ингибирующего действия галектинов на заражение, варьировали режим прибавления галектинов (Таблица 1, № 3-5):

- на монослой клеток наносили смесь галектинов с вирусом (№3)

- перед нанесением на клетки вирус инкубировали с галектинами (№4)

- галектины предварительно нагружали на клетки, и только после этого вносили вирус

(№5).

Метод №3а (Таблица 1) позволяет оценить влияние галектинов на стадию адгезии, а метод №36 - на полный цикл заражения. В обоих случаях наблюдалось ингибирующее действие галектинов. Однако, галектины в разной степени ингибировали процесс: в то время как СС-2 при концентрации 25 мкг/мл (Рис. 15а), Св-1 А - при концентрации всего лишь 1 мкг/мл (Рис. 156). Антивирусный эффект в большей степени выражен в условиях полного

цикла заражения клеток, нежели при оценке только стадии адгезии (Рис. 15аД черные и серые столбики).

а)

вирус

с0-2 юо мк/мл |ада[ии т '

СО-2 25 мкг/мл СО-2 5 мкг/мл СС-2 1 мкг/мл СО-2 500 нг/мл СО-2 200 нг/мл

« Связывание » Заражение

____________ - |

шишищяши0ияцшммицввавві-.................

О 50 100

Расщепление Mu-NANA

б)

Сб-ІА 100 мкг/мл Сй-ІА 25 мкг/мл СО-1А 5 мкг/мл Сй-ІА 1 мкг/мл Св-ІА 500 нг/мл СС-1А 200 нг/мл

к Связывание * Заражение

О 50 100 150

Расщепление М \ N Л

Рисунок 15. Влияние галектинов СО-2 (а) и СС-1А (б) в различных концентрациях на связывание и заражение клеток вирусом гриппа (Метод №3, см. Таблицу 1). Здесь и далее активность нейраминидазы без галектина принята за 100%.

Условия следующего варианта метода, где галектин предварительно нагружали на вирионы (Таблица 1, № 4), позволили наблюдать еще более сильное ингибирование со стороны галектинов, чем в условиях метода 3 (Рис. 16). По-видимому, при такой постановке эксперимента, происходит агрегация вирусных частиц, что значительно снижает заякоревание вируса на клетке.

Последний метод (Таблица 1, № 5) отличался тем, что галектины предварительно нагружали на монослой клеток, и только потом наносили вирус. При этом для адгезии вирионов (№5а) были получены результаты, противоположные тем, что были при рассмотрении полного цикла заражения (№56). Вирус гриппа лучше связывался с поверхностью клеток, на которую нагружены галектины, хотя эффекты были незначительны (Рис.17). Этот результат согласовался с данными метода №1. Таким образом, эксперименты на монослое клеток подтверждают факт увеличения сорбции вирусов на клетках за счет галектинов.

СО-ІА 100 мкг/мл СО-1А 25 мкг/мл СО-1Л 5 мкг/мл СО-ІА 1 мкг/мл Сб-ІА 0,5 нг/мл СО-ІА 0,2 нг/мл

• вирус+галсктин (№3)

» вирус+галсктин (инкубация, №4)

50 100 150

Расщепление Ми^АІЧА

Рисунок 16. Влияние галектина Сй-ІА на адгезию вируса гриппа в условиях предварительной их инкубации с вирусом (Метод N¡4) и без нее (Метод №3).

вирус СС-2 1 мкг/мл СС-2 5 мкг/мл СО-2 25 мкг/мл СС-2 100 мкг/мл СЄ-ІА 1 мкг/мл СЄ-ІА 5 мкг/мл Св-1А 25 мкг/мл Сб-ІА 100 мкг/мл

50 100 150 200 Расщепление Mu-NANA

Рисунок 17. Влияние галектинов Сй-1А и Сй-2 на адгезию вируса гриппа на клетках МОСК в условиях метода №5а (см. Таблиі/у 1).

Результаты, полученные с помощью метода №5а, позволяли предположить, что возрастание адгезии повлечет за собой увеличение заражения (Метод №56). Однако, в действительности, в полном цикле заражения СО-1А по прежнему выступал как ингибитор (Рис. 18а), аналогично результатам, полученным в условиях методов №2-4. Интересно отметить, что предварительная нагрузка Св-2 на клетки в условиях метода №5 не сказывается на заражении клеток (Рис. 186).

а) ' вирус СО-1А 0,5 мкг/мл СО-1А 1 мкг/мл Сй-ІА 2 мкг/мл Св-ІА 5 мкг/мл СЄ-ІА 10 мкг/мл СО-1А 25 мкг/мл б) вирус СС-2 0,5 мкг/мл СС-2 1 мкг/мл СС-2 2 мкг/мл СО-2 5 мкг/мл СО-2 10 мкг/мл СО-2 25 мкг/мл

рал---а---1

СС-1А50 мкг/мл СЄ-ІА 100 мкг/мл СС-2 50 мкг/мл СС-2 100 мкг/мл

.......................

0 50 100 Расщепление Mu-NANA 50 100 Расщепление Mu-NANA

Рисунок 18. Влияние галектинов а) Сй-1А и б) Сй-2 на заражение клеток МйСК вирусом гриппа в условиях метода N956.

Таким образом, как в случае суспензионной культуры, так и в случае монослоя клеток, независимо от того, на какой из двух компонентов нагружались гапектины, и независимо от того, промотировалась или ингибировалась стадия адгезии, итогом действия галектинов на заражение клеток всегда было его торможение.

7. Введение флуоресцентной метки в состав вириона. Мечение вируса гриппа с помощью флуоресцеинизотиоционата (РІТС) проводится в щелочных условиях (рН 9.5), что может вызывать изменения ЫА и НА. Чтобы избежать влияния процедуры мечения и ковалентного присоединения самой метки на связывание вируса гриппа с галектинами, мы разработали альтернативный подход, где флуоресцентная метка вводилась с помощью синтетического липида (РІио-ООРЕ).

о

Л -

N11

ОН и

о

и

^о' (СН3) 7СНСН (СН3) ,сн3

X А

' О (CII,)7CI1CI1(CH3)7CH3

о

он

Рисунок 19. Структура Fluo-DOPE. Остаток флуоргсцеина (FIuo) связан с остатком диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) 15-атомным спейсером.

Дизайн метки Fluo-DOPE (Рис. 19) был сделан в лаборатории углеводов ИБХ РАН к.х.н Е.Ю. Корчагиной. Структура каждого фрагмента в молекуле Fluo-DOPE критична для встраивания в мембрану; в частности, ненасыщенные олеоильные цепи обеспечивают высокую степень и скорость встраивания, а спейсер делает всю конструкцию растворимой (точнее, диспергируемой) в водной среде. Флуоресцентная метка в виде липидного производного вводится в физиологических условиях, что в отличие от химической модификации белков, позволяет максимально сохранять натнвность поверхности. Мы сравнили мечение четырех штаммов вируса гриппа с помощью FITC и флуоресцентным липидом по следующим параметрам: изменение рецепторных свойств НА, влияние на ферментативную активность NA, способность меченых вирионов связываться с клетками. Было показано, что Fluo-DOPE является более «мягким» агентом для введения в состав вируса флуоресцентной метки и не оказывает влияния на активность NA и НА.

выводы

1. Обнаружена способность галектинов взаимодействовать с вирусом гриппа. Нагрузка галектинов на поверхность вируса не изменяет активность гемагглютинина и нейраминидазы.

2. Связывание с галектинами маскирует антигенные детерминанты поверхности вируса гриппа, предохраняя его от присоединения антител.

3. Галектины способствуют адгезии вируса гриппа на клетке. Показано, что на гапектин-опосредованное заякоревание влияет углеводный состав как вируса, так и клетки.

4. Галектины способны восстанавливать адгезию вируса гриппа к десиалилированным клеткам до уровня, типичного для нативных клеток.

5. Несмотря на то, что галектины способствуют стадии адгезии вируса на клетке, этот эффект не является ключевым для процесса инфицирования, который галектинами ингибируется.

6. Предложен новый метод мечения вируса гриппа с помощью введения липидной флуоресцентной метки в состав мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи

1. Черный Е.С., Рапопорт Е.М. Андрэ С., Калтнер Г. Габиус Г.-И, Бовин Н.В., Галектины способствуют взаимодействию вируса гриппа с клеткой // Биохимия 2011. Т. 76. С. 23-24.

2. Hadac Е.М., Federspiel M.J., Chernyy E.S., Tuzikov A.B., Korchagina E.U., Bovin N.V., Russell S., Henry S.M., Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions //J. Virol. Methods. 2011 V. 176. P. 78-84;I76(l-2):78-84.

Тезисы докладов на конференциях

1. Chernyy E.S., Bovin N.V., Study of Additional Influenza Virus to Cell Interaction // Program and abstracts for the 2009 meeting of the society for Glycobiology - San Diego, USA. Glycobiology 2009 V. 19. №11. P. 1259-1379.

2. Chernyy E.S., Bovin N.V., Study of binding of influenza virus with human tracheobronchial mucins // Summer Course Glycosciences 2008, Netherlands; http://www.vlaggraduateschool.nl

Подписано в печать:

06.09.2012

Заказ № 7557 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

04201357999

На правах рукописи

Черный Евгений Станиславович

ГАЛЕКТИН-ОПОСРЕДОВАННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ВИРУСА ГРИППА

С КЛЕТКАМИ-МИШЕНЯМИ

02.00.10 — биоорганическая химия

ГЛ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., проф. Бовин Н.В.

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр

Список использованных сокращений 4

1 ВВЕДЕНИЕ 5

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 Структурные компоненты вируса гриппа 7

1 1 Структура нейраминидазы 1 2 Гликозилирование нейраминидазы 1 3 Структура гемагглютинина

1 4 Гликозилирование гемагглютинина

Глава 2 Сборка и отпочковывание (баддинг) вируса гриппа 24

2 1 Липидный состав вируса гриппа

2 2 Роль НА и ИА в сборке и баддинге вирионов

2 3 Роль М1 и М2 в сборке и баддинге вирионов

Глава 3 Структурная организация вируса гриппа 33

3 1 Современные методы изучения морфологии вируса гриппа 3 2 Размеры и форма вирионов

3 3 Поверхность вируса гриппа

Глава 4 Галектины 50

4 1 Структура галектинов

4 2 Биологическая роль галектинов 4 3 Куриные галектины

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 76

1 Проверка первых двух гипотез Роль белков в составе вириона 78

1 1 Поиски белков клетки-хозяина

1 2 Поиск «неклассических» углеводных рецепторов

для вируса гриппа

2 Взаимодействие вируса гриппа с галектинами 85

2 1 Изучение связывания вируса гриппа с галектинами

с помощью твердофазного анализа 2 2 Влияние галектинов на функционирование НА и

КА вируса гриппа 3 Ингибирование галектинами связывания антител с вирусом

3 1 Ингибирование связывания поликлональных

антител с вирусом гриппа 3 2 Ингибирование галектинами связывания сыворотки больных гриппом с вирусом гриппа

3 3 Ингибирование галектинами связывания

внутривенного иммуноглобулина с вирусом гриппа 4 Роль галектинов на стадии адгезии вирионов на клетке 101

4 1 Расположение галектинов и вируса гриппа на поверхности клетки 4 2 Изучение влияния галектинов на связывание вируса гриппа

с клетками

4 3 Проверка влияния флуоресцентной метки на связывание

вируса с галектинами 4 4 Действие галектинов при нагрузке на вирионы 4 5 Ингибирование взаимодействия галектинов с вирусом 4 6 Влияние на адгезию гликома вируса и клеточной поверхности

4 7 Связывание вируса с десиалилированными клетками

в присутствии галектинов

5 Мечение вирусов гриппа с помощью флуоресцентного липида

127

6 Исследование полного цикла заражения вируса в присутствии галектинов 6 1 Влияние галектинов на заражение монослоя клеток вирусом 6 2 Действие галектинов на эффект заражения клеток вирусом гриппа,

132

сравнение разных условий проведения эксперимента

7 О возможности участия галектинов в инфекционном процессе вируса гриппа

142

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7 Благодарности

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

146

147

148

Список использованных сокращений

АЭК - аминоэтилкарбазол FITC - флуоресцеинизотиоционат ДСН - додецилсульфат натрия Fluo-DOPE - флуоресцентный липид ГАЕ - гемагглютинирующая единица М - матриксный белок НА - гемагглютинин

НВ-сайт - гемоадсорбционный сайт нейраминидазы РГА - реакция гемагглютинации ТФА - твердофазный анализ РНП - рибонуклеопротеин

MDCK - линия клеток Madin-Darby Canine Kidney

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеин

NS - неструктурный белок

CG - Куриные галектины

hG - Человеческие галектины

УСД - углевод связывающий домен

Сахариды, конъюгаты и субстраты NA:

Glyc-PAA-biot - биотинилированный гликоконъюгат конъюгат на основе полиакриламида

Neu5Ac - N-ацетилнейраминовая кислота

3'SL - Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc

3'SLN - Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAc

6'SLN - Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc

Lex - Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp

B,ri- Galal-3(Fucal-2)Galp

Fs-2 - GalNAcal-3GalNAcp

Tn - aGalNAc

LacNAc - Gaipi-4GlcNAc

А тип 1 -GalNAcal-3(Fucal-2)Galpl-3GlcNAc

А тип 2 - GalNAcal -3(Fuca 1 -2)Gaip 1 -4GlcNAc

В тип 1 - Gala 1 -3 (Fuca 1 -2)Gaip 1 -3 GlcNAc

В тип 2 - Galal-3(Fucal -2)Gaipi -4GlcNAc

H тип 1 -Fucal-2Gaipi-3GlcNAc

H тип 2 - Fucal-2Gaipi-4GlcNAc

MU-NANA - метилумбеллиферил N-ацетилнейраминовая кислота BODIPY - 6-((4,4-дифторо-5,7-диметил-4-бора-За,4а-даиза-5-индацин-3-пропионил)амино)гексаноилвая кислота сукцинимидный эфир

1. ВВЕДЕНИЕ

Вирус гриппа - один из наиболее изученных объектов среди возбудителей опасных заболеваний человека. Тем не менее, в начале 21 века человечество фактически не имеет ни надежного лекарства против него, ни системы вакцинации, способной гарантированно предотвратить заболевание. Поэтому расширение представлений о структурной организации, рецепторной специфичности и репликации вируса в организме хозяина, с целью разработки принципиально новых подходов к терапии и предупреждению этого заболевания, является крайне актуальной задачей.

Стадии первичного связывания и проникновения вируса гриппа в заражаемую клетку по-прежнему являются предметами активного изучения. На сегодняшний день, устоявшиеся представления о том, что единственным рецептором вируса гриппа являются сиалогликаны, регулярно подвергаются сомнению, и высказываются предположения о существовании дополнительных факторов, участвующих в адгезии вирионов на поверхности клетки (Stray and others 2000; Rapoport and others 2006; M L Yang and others 2011). В связи с этим, исследования в данном направлении являются актуальной задачей, решение которой может привести к разработке нового поколения лекарственных препаратов - блокаторов адгезии вируса гриппа. Кроме того, детальное изучение комплексных процессов, протекающих в организме при иммунном ответе на вторжение вируса, и, прежде всего, реакция к поверхностным гликопротеинам вирионов как антигенам, открывает возможности для разработки новых иммунотерапевтических подходов.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлось обнаружение дополнительных факторов, участвующих в рецепции вируса гриппа на начальной стадии заражения клеток.

Предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить возможность связывания вируса гриппа с несиалилированными углеводными лигандами.

2. Экспериментально проверить гипотезу о возможности связывания галектинов с вирусом гриппа и установить роль этих белков во взаимодействии вирусных частиц с клеткой-мишенью.

3. Изучить влияние галектинов на связывание антител с вирусом гриппа.

Научная новизна.

• большая часть представителей семейства куриных и человеческих галектинов специфично связываются с вирусом гриппа;

• галектины, несмотря на способность увеличивать адгезию вируса

5

гриппа на клетке-мишени, выступают как ингибиторы процесса заражения;

• при отсутствии основного сиало-рецептора, галектины могут обеспечивать высокий уровень адгезии вируса на клетке;

• связывание галектинов с вирусом гриппа не приводит к изменению функциональных свойств гемагглютинина и нейраминидазы, но маскирует их антигенные детерминанты.

Практическая значимость.

^ Обнаруженная компенсаторная роль галектинов при отсутствии сиалорецепторов на клетке заставляет по-новому относиться к терапевтическим методам, нацеленным на ингибирование сиало-опосредованного заякоревания вируса гриппа, а именно, учитывать этот фактор при испытании антиадгезионных препаратов.

^ Галектин-опосредованную адгезию вируса гриппа на клетке необходимо учитывать в производстве живых вакцин, которые получают наращиванием вируса в клеточных культурах.

^ Найденный эффект ингибирования галектинами протективных антивирусных антител открывает новую возможную область для совершенствования анти-вирусной иммунотерапии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурные компоненты вируса гриппа.

Вирус гриппа является одним из самых опасных возбудителей болезни в мире. Заражение новыми штаммами вируса во время сезонных вспышек ежегодно уносит до 50 тыс людских жизней (William W Thompson and others 2003). Кроме того, опасность пандемии вируса, подобная массовым заражениям вирусами «испанка» 1918, «азиатским гриппом» 1957 и «гонг конгским вирусом» 1968 вызвавшими смерть более 50 млн людей в разных странах, по прежнему сохраняется, так как все еще идет поиск причин и механизмов возникновения пандемических штаммов и способов борьбы с ними. Высокая генетическая лабильность вируса гриппа обеспечивается его способностью к образованию реассортантов и высокой степенью мутаций, приводящих к возникновению новых, более приспособленных вирионов.

В общей таксономии вирусов, грипп относится к семейству Orthomyxoviridae, которое включает три рода, относящихся к вирусу гриппа - А, В и С соответственно. Наиболее детально изучена структура вируса гриппа Ä. Как и все представители этого семейства, вирус гриппа имеет сегментарную структуру генома. 8 (-) цепей РНК (в случае вируса гриппа С - 7 цепей) кодируют 11 белков, 8 из которых включаются в состав отпочковывающегося вириона (Fields 2007). Геном вируса представляет из себя рибонуклеопротеин (РНП) (Nöda and others 2006а), в котором каждый генный сегмент имеет собственный полимеразный комплекс, состоящий из трех белков - РВ1, РВ2 и PA (Braam and others 1983), а нуклеокапсидный белок NP обеспечивает упаковку генома. Также внутри самого вириона в большом количестве находится белок Ml, являющийся основным структурообразующим компонентом. Посредством Ml обеспечивается контакт РНП с поверхностью вириона, образованной липидным бислоем с заякоренными в нем гликопротеинами.

В составе липопротеиновой оболочки находятся две основные антигенные детерминанты вируса гриппа - шипообразные гликопротеины гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). НА обеспечивает проникновение вирионов в клетку-мишень, обладая рецепторной и фузионной активностью, тогда как NA является ферментом, который отщепляет вирусный рецептор и, таким образом, способствует отпочковыванию (баддингу) вирусных частиц с поверхности клетки на поздних стадиях инфекции. Штаммы вируса гриппа А классифицируют на основе структуры поверхностных гликопротеинов и, на сегодняшний день, определено 16 подтипов НА (Bao and others 2008) (Fouchier and others 2005) и 9 подтипов NA (Webby and Webster 2001). Третий интегральный белок мембраны -М2 представлен в существенно меньшем количестве и является мультифункциональным протон-селективным ионным каналом. Он принимает участие не только в процессе проникновения вируса, но и, как показали недавние исследования, (Benjamin J Chen and others 2008; Iwatsuki-Horimoto and others 2006; McCown and Pekosz 2006; McCown and Pekosz 2005; Rossman and others 2010b; Rossman and others 2010a) в сборке и высвобождении вирионов.

Во время репликации вируса экспрессируются еще три дополнительных белка, два из которых однако не входят в состав зрелых вирионов. Мультифункциональный неструктурный белок NS1 (Nemeroff and others 1995; Hatada and Fukuda 1992) преимущественно помогает вирусу обходить защиту клетки-хозяина (García-Sastre and others 1998). NS2 (NEP), как показали авторы (Richardson and Akkina 1991), включается в вирионы и играет ключевую роль в репликации вируса так как обеспечивает транспорт вирусных РНП из ядра в цитоплазму. У некоторых штаммов вируса гриппа также обнаруживается экспрессия белка PB1-F2. Как видно из его названия, этот белок транскрибируется со второй рамки считывания белка РВ1 и участвует в индуцировании процесса апоптоза зараженной клетки.

По своей структуре вирус гриппа В сходен с вирусом гриппа А. В его мембрану встроены четыре белка: НА, NA, NB (ионный канал) и дополнительный олигомерный белок ВМ2 (Betakova and others 1996; Brassard and others 1996; Odagiri and others 1999; Zebedee and Lamb 1988). Внутри вирионов находятся РНП комплекс и структурный белок Ml. Также возможно включение в состав вирионов белка NEP (Fields 2007). Из особенностей вируса гриппа С стоит отметить наличие белка HEF, объединяющего в себе функции НА и NA, а также гликозилированного аналога белка М2 - СМ2 (Strasser and others 2003).

1.1. Структура нейраминидазы

Нейраминидаза вируса гриппа является ферментом, который расщепляет а-кетозидную связь между терминальным остатком сиаловой кислоты и следующим моносахаридом цепи. В процессе размножения вируса, нейраминидаза удаляет сиаловую кислоту с гликопротеинов и гликолипидов поверхности вирионов. В результате, вновь сформированные вирусные частицы не аггрегируют за счет НА-опосредованной рецепции и благополучно отпочковываются с поверхности зараженной клетки.

Для вирусов гриппа выделяют 11 подтипов нейраминидаз - 9 для гриппа А и по одному подтипу для грипа В и С. Гомология внутри одного подтипа составляет 90%, тогда как между подтипами - 50%, и менее, как, например, между вирусами гриппа А и В (30%). В настоящее время известны пространственные структуры нейраминидаз N1, N2, N4, N8, N9 и В (Varghese and Colman 1991b; Bossart-Whitaker and others 1993; Janakiraman and others 1994; Russell and others 2006; Varghese and others 1983; Varghese and others 1997). Между подтипами наблюдаются отличия в числе аминокислотных остатков в тяжах и межтяжевых петлях, однако, общая схема укладки полипептидной цепи сохраняется.

На поверхности вириона NA представляет из себя гомотетрамер грибовидной формы с молекулярной массой порядка 240 кДа (Рис. 1). Каждая субъединица содержит порядка 470 а.к. остатков, имеет молекулярную массу -60 кДа и несет один каталитический сайт. NA

заякорена в мембране вируса своим гидрофобным N-концом, а вся полипептидная цепь формирует несколько структурно-функциональных доменов: цитоплазматический участок, трансмембранный домен, стебель и голову. Цитоплазматический участок состоит из шести высоко-консервативных аминокислот и, как и трансмембранный домен, играет важную роль в процессе сборки вирионов.

Стебель является наиболее вариабельным участком NA вируса гриппа, а количество а.к. остатков варьирует в пределах 25 до 57. Диаметр стебля составляет порядка 10 А, а длина - 100 А. Полипептидная последовательность стебля может включать от двух до четырех сайтов гликозилирования в районе а.к. 45 - 90. Голова нейраминидазы формируется участком полипетидной цепи ~ 74 - 390 а.к. с высококонсервативным остатком Asn 146, формирующим сайт гликозилирования. Размеры головы составляют 80x80x40 А. В сумме, голова и стебель NA вируса гриппа имеют общую ысоту над мембраной вириона порядка 1618 нм (Calder and others 2010; Harris and others 2006; Yamaguchi and others 2008).

У нейраминидазы N9 был найден второй сайт связывания нейраминовой кислоты (так называемый НВ-сайт). Он расположен на периферии NA, на расстоянии 14 А от основного центра связывания в направлении к Arg371. Последовательность, соответствующая этому сайту, высоко-консервативна у птичьих вирусов, но вырождена у NA вирусов человека. Функция НВ-сайта остается до конца не выясненной, по-видимому наличие НВ-сайта облегчает процесс отщепления сиаловых кислот нейраминидазой (Uhlendorff and others 2009). Замечена корреляция между рецепторной специфичностью НА и наличием НВ-сайта у вирусной NA (Matrosovich 2001).

1.2. Гликозилирование нейраминидазы.

Данные о структуре углеводных цепей вируса гриппа в основном относятся к НА, покрывающем большую часть поверхности вирионов, тогда как гликозилирование NA изучено менее детально. Известно, что нейраминидаза вируса гриппа может нести до 7 сайтов гликозилирования. Углеводные цепи могут находиться как на участке стебля, так и головы NA. Гликозилирование NA достаточно разнообразно и может содержать N-цепи комплексного, олигоманнозного и гибридного типа.

Большинство исследований гликозилирования нейраминидазы вируса проводится с целью установления влияния углеводной цепи на функционирование фермента. На сегодняшний день известно несколько примеров гликозилирования этого гликопротеина. Так, NA пандемического штамма 1918 содержит 7 потенциальных сайтов гликозилирования, 5 из которых расположены на участке стебля. Высокое гликозилирование этого домена защищает наиболее уязвимый для протеаз участок NA (Zhengliang L Wu and others 2009). Птичий вирус A/FPV/Rostock/34 (H7N1) содержит три сайта гликозилирования и все они расположены на голове фермента. Два из них, в позиции 124 и 66 а.к. остатков, несут цепи комплексного типа, тогда как к Asn-213 присоединены цепи олигоманнозного типа (Hausmann and others 1997).

Нейраминидаза N2 вируса A/Tokyo/3/67 содержит пять потенциальных сайтов гликозилирования, расположенных в голове фермента, однако только четыре из них - 86, 146, 200 и 234 а.к. остатков, несут углеводные структуры (Рис. 1) (Varghese and Colman 1991b). Остатки 86 и 234, находящиеся в нижней части мономера, относятся к высокоманнозному типу и содержат два остатка GlcNAc

Рисунок 1. Трехмерная структура «головного» домена тетрамера нейраминидазы вируса гриппа A/Tokyo/3/67 (H2N2). Фиолетовым цветом выделены углеводные цепи при а.к. остатках 86, 146, 200, 234.

и пять остатков Man. Сайт 146 расположен на вершине мономера, а 200 - с боку головы, оба сайта несут цепи комплексного типа. Углеводная цепь при 146 остатке отличается наличием N-ацетилгалактозамина, который сульфатирован по 04 (Varghese and Colman 1991а). При этом, данный сайт наиболее консервативен среди всех штаммов вируса гриппа и отсутствует исключительно у A/WSN/33 (H1N1), что обуславливает его нейровирулентность (Li and others 1993). В кристаллах NA углеводные цепи при остатке Asnl46 образуют "шипы" на поверхности мономера, которые затем вступают в углевод-углеводное взаимодействие в составе тетрамера.

1.3. Структура гемагглютинина

Оба пове�