Галектин-опосредованное связывание вируса гриппа с клетками-мишенями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ

им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Черный Евгений Станиславович

Галектнн-опосредованное связывание вируса гриппа с клетками-мишенями

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2013

Работа выполнена в лаборатории углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор химических наук, проф. Николай Владимирович Бовин ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Водовозова Елена Львовна, доктор химических наук, ИБХ РАН

Бурцева Елена Ивановна, доктор медицинских наук, ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава)цразвития России

Зашита состоится 19 июня 2013 года в 10.00 на заседании диссертационного ученого совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. по адресу: 117991 ГСП-1, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан 16 мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

В.А. Олейников

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

библиотека

2013

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Вирус гриппа - один из наиболее изученных объектов среди возбудителей опасных заболеваний человека. Тем не менее, в начале 21 века человечество фактически не имеет ни надежного лекарства против него, ни системы вакцинации, способной гарантированно предотвратить заболевание. Поэтому расширение представлений о структурной организации, рецегггорной специфичности и репликации вируса в организме хозяина, с целью разработки принципиально новых подходов к терапии и предупреждению этого заболевания, является крайне актуальной задачей.

Стадии первичного связывания и проникновения вируса гриппа в заражаемую клетку по-прежнему являются предметами активного изучения. На сегодняшний день, устоявшиеся представления о том, что единственным рецептором вируса гриппа являются сиалогликаны, регулярно подвергаются сомнению, и высказываются предположения о существовании дополнительных факторов, участвующих в адгезии вирионов на поверхности клетки (S.Stray et al„ Glycobiology, 10(7):649. 2000; E.Rapopott et al., Glycoconj J. 23: 115, 2006; Mei-Lin Yang et al., J. Virol., 85(19): 10010, 2011). В связи с этим, исследования в данном направлении являются актуальной задачей, решение которой может привести к разработке нового поколения лекарственных препаратов - блокзгоров адгезии вируса гриппа. Кроме того, детальное изучение комплексных процессов, протекающих в организме при иммунном ответе на вторжение вируса, и, прежде всего, реакция к поверхностным гликопротеинам вирионов как антигенам, открывает возможности для разработки новых иммунотерапевтических подходов.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлось обнаружение дополнительных факторов, участвующих в рецепции вируса гриппа на начальной стадии заражения клеток.

Предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить возможность связывания вируса гриппа с несиалилированными углеводными лигандами.

2. Экспериментально проверить гипотезу о возможности связывания галектинов с вирусом гриппа и установить роль этих белков во взаимодействии вирусных частиц с клеткой-мишенью.

3. Изучить влияние галектинов на связывание антител с вирусом гриппа.

Научная новизна.

• большая часть представителей семейства куриных и человеческих галектинов специфично связываются с вирусом гриппа;

• галектины, несмотря на способность увеличивать адгезию вируса гриппа на клетке-мишени, выступают как ингибиторы процесса заражения;

• при отсутствии основного снало-рецептора, галектины могут обеспечивать высокий уровень адгезии вируса на клетке;

• связывание галектанов с вирусом гриппа не приводит к изменению функциональных свойств гемагглютинина и нейраминидазы, но маскирует их антигенные детерминанты.

Практическая значимость.

S Обнаруженная компенсаторная роль галектанов при отсутствии сиалорецепторов на клетке заставляет по-новому относиться к терапевтическим методам, нацеленным на ингибирование сиало-опосредованного заякоревания вируса гриппа, а именно, учитывать этот фактор при испытании анта-адгезионных препаратов.

Галектин-опосредованную адгезию вируса гриппа на клетке необходимо учитывать в производстве живых вакцин, которые получают наращиванием вируса в клеточных культурах.

Найденный эффект ингибирования галектинами протективных антивирусных антител открывает новую возможную область для совершенствования антивирусной иммунотерапии.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: Summer Course Glycosciences (Нидерланды, 2008), Annual Conference of the Society for Glycobiology (Сан-Диего, 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного структурной организации вируса гриппа и общей характеристике класса галектинов, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 247 ссылок; содержит S8 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ На поверхности вируса гриппа располагаются два основных гликопротеина -гемагтлютинин (НА) и нейраминидаза (ЫА). НА инициирует инфекцию, связываясь с сиалогликанами на клетке-мишени, ЫА отщепляет сиаловую кислоту с углеводных цепей гликоконъюгаггов, причем не только клетки, но и вирионов. Таким образом, ЫА препятствует агрегации вирусных частиц и обеспечивает их успешное высвобождение из зараженной клеггки.

Согласно устоявшимся представлениям, только сиалогликаны являются молекулами-рецепторами для вируса гриппа. Однако в литературе был описан факт заражения десиалнпированных клеток (З.Б&ау е1 а1., 01усоЫо1о$у, 10(7):649, 2000) и, таким образом, возникли экспериментальные предпосылки к тому, что возможно вирус гриппа использует альтернативные или дополнительные рецепторы при эаякоревании. В связи с этим, мы предположили три механизма рецепции вируса гриппа, которые не требуют участия сиалогликанов:

I. НА или КА имеют неизвестные лектино-подобные углеводсвязывающие сайты, «настроенные» на несиалилированные структуры.

II. В процессе отпочковывания (баддинга) вирусом гриппа захватываются белки клетки-хозяина, которые впоследствии взаимодействуют с собственными комплементарными молекулами на поверхности клетки-мишени и, таким образом, помогают дальнейшему распространению инфекции.

III. Так как оба поверхностных белка (НА и ЫА) вируса гриппа сильно гликознлированы, то дополнительную адгезию осуществляют углевод-свяэывающие белки клетки-хозяина - лектины.

Каждый из этих механизмов имел право на существование, так как основывался на литературных данных, в частности: 1) КА, кроме каталитического сайта связывания сиалогликанов, имеет так называемый НВ-сайт, специфичность и назначение которого до конца не установлены; 2) НА также предположительно имеет потенциальный дополнительный сайт связывания, который изучен в еще меньшей степени, чем НВ-сайт нейраминидазы; 3) белки клепси-хоэяина, которые не кодируются геномом вируса, были обнаружены в составе вирионов, и по-видимому захватываются с поверхности в процессе баддинга; с помощью протеомных методов было показано, что в вирус гриппа может включаться до 36 различных белков, хотя вопрос, является ли такой захват специфическим и важен ли он для последующего распространения инфекции, остался открытым.

1. Проверка первых двух предположение: связывание НА, ОД и белков клетки-хозяина в составе вируса с несиалилированными гликанами. Прежде всего, необходимо

было убедиться, что в составе имеющихся в нашем распоряжении вирусов, действительно присутствуют дополнительные компоненты, предположительно - белки клетки-хозяина, которые попали в вирус в процессе баддинга. Для этой цели было проведено электрофоретическое разделение тщательно очищенных вирионов, и сравнение полученных данных с литературными (J.Schwarzer et al., Electrophoresis, 29:4203, 2008). Кроме основных белков вируса гриппа, в составе вирионов обнаружились дополнительные компоненты, по-видимому, соответствующие белкам, захваченным из клетки при баддинге. Мы предположили, что среди этих белков могут присутствовать лектины, поэтому далее исследовали связывание вируса гриппа с рядом гликанов.

Для этого использовался твердофазный анализ, в котором вирусы гриппа взаимодействуют с биотинилированными полиакриламидными гликоконыогатами (Glyc-PAA-biot). Известно, что лигандами дня вируса гриппа являются сиалилированные олигосахариды 6'Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc (6'SLN) и 3'Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc (3'SLN), поэтому их использовали как положительный контроль. Выбор гликанов, «нетипичных» для вируса, основывался на нескольких известных фактах. Ранее было показано, что вирусы гриппа могут связываться с сульфатированным производным лактозы (E.Rapoport et al., Glycoconj J, 23:115, 2006): подобные структуры типичны для респираторных муцинов, поэтому в тестирование был включен гликоконъюгат, несущий 6'HSC>3-Gaipi-4GlcNAc. Кроме того, имелись предпосылки к тому, что вирус связывается с aGalNAc (S.Stray et al., Int. Congr. Ser, 1219:487, 2001), поэтому в эксперимент включили глнканы с терминальным остатком N-ацстилгалактозамина: GalNAcal-3GalNAc|3 (Fs-2), aGalNAc-OScr, aGalNAc (Tn), и GalNAcal-4(Fucal-2)Gaipi-4GlcNAc и ряд контрольных копъюгагов. Эксперименты провели на четырех различных штаммах (A/NIB/26/90 (H3N2), А/СССР/90/77 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/FPV/Rostock/34 (H7N1), но ни один из тестированных гликанов, кроме сиалилированных, не связывался с вирусами (Рис. 1, приведены данные для одного вируса и некоторых гликоконъюгагов).

1,8 1,6 1,4

Рисунок 1. Связывание вируса гриппа Ш1В/26/90 (Н1Ш) с гликоконьюгатами й1ус-РАА-Ыо/ в твердофазном анализе.

£ 1,2

(ЗаШЛса1-4(Риса1-2)Оаф1-

—С;аМАса1-С«ег

О

5

концентрация конъюгата, мк!

Таким образом, с помощью твердофазного анализа не удалось обнаружить вирус-связывающис гликаны, отличные от сиалозидов. Гипотезы о том, что НА, ЫА или приобретенные лектины в составе вируса гриппа могут играть роль в инициации адгезии без сиалогликанов, не нашли экспериментального подтверждения.

2. Гипотеза о взаимодействии вируса гриппа с галсктннами. Гликопротенны НА и ЫА плотно покрывают большую часть поверхности вируса гриппа. Оба белка имеют высокую степень гликозилирования и могут нести от одного до десятка углеводных цепей комплексного, олигоманнозного или гибридного типа. Структура этих цепей варьирует, но общим свойством является наличие большого количества комплексных цепей с терминальными остатками галактозы. В составе гликоконъюгатов млекопитающих галактоза, как правило, маскирована сиаловой кислотой, тогда как в составе вируса гриппа, благодаря ферментативному отщеплению нейраминидазой, углеводные цепи всегда десиапилированны. Из-за этого поверхность вируса гриппа приобретает необычный, уникально плотный паттерн р-галактозидов. Мы предположили, что такая вирусная оболочка может служить высокоаффинной мишенью для галактозидсвязывающих белков -галектинов.

В данной работе был протестирован ряд куриных (СО-1А, СО-1В, СО-2, Сй-З и СО-81) и человеческих (ЬО-1, Ю-2, ЬО-З, 1Ю-4, 1Ю-7 и Ьв-8) галектинов. Эксперименты проводилась преимущественно с куриными белками, что обусловлено рядом причин. Во-первых, птичьи вирусы гриппа изучены лучше всего, а образцы штаммов, выращенные на куриных эмбрионах, более доступны, и их значительно легче получать в чистом виде. Поэтому выбрали белки этого организма. Во-вторых, параллельное исследование человеческой и птичьей систем открывало возможность для сравнения видозависимости (общности) изучаемых процессов.

На начальном этапе работы возможность связывания галсктинов с вирусами гриппа была проверена с помощью твердофазного анализа, аналогичного описанному выше методу связывания с С1ус-РАА-Ыо1. Для этого к вирусу, сорбированному на планшете, прибавляли галсктины и далее детектировали связывание с помощью меченых антител к этим белкам (данные не показаны). Взаимодействие наблюдали для четырех штаммов, а именно А/МВ/23/90 (НШ1), АЛ)ис№апсе/46/82 (Н1Ы1), АУРиеПоКюо/8/34 (Н1Ж) и А/РРУ/КхкЮскЛН (Н7Ш). Полученные предварительные результаты мотивировали дальнейшую работу в рамках данной гипотезы, в том числе более детальное исследование взаимодействия галсктинов с НА и ЫА вируса гриппа.

3. Влияние галсктинов на функцин НА и ХА вируса гриппа. Мы предположили, что связывание галектинов с поверхностью вируса гриппа приведет к изменению функциональной активности гемагглютинина и нейраминидазы, так как некоторые из их углеводных цепей находятся в непосредственной близости от углеводсвязывающих сайтов. Активность НА в присутствии галектинов проверяли твердофазным методом на трех вирусных штаммах, два из которых были птичьи - А/РРУЛ1о81оск/34 (Н7Ы1), АЛЭиск/Ргапсе/46/82 (Н1Ш), и один человеческий - А/К1В/23/89-МА (Н1Ы1); все они были выращены на куриных эмбрионах. В качестве рецептора для этих вирусов в тест-системе служил гликоконъюгат 3'5ЬМ-РАЛ-Ыо1. Было обнаружено, что только галектин СО-1А в небольшой степени ингибировал взаимодействие вирусов с 3'51,Ы, тогда как СО-1В, СО-2, Св-З, ЬС-8 и ЬО-1 вообще не оказывали влияния (Рис. 2, приведены данные для одного вируса).

-•вирус

2 -і

1,8 ^^-А^Р'Ф'^'ЧйГ-"^

1,6 ш" ' "Tirf вирус+ hG-8

вирус+CG-l А

і 1 )( вирус+CG-l В

§ 0,8 Ф

о () 6 —BKpyc+CG-2

в °.4 Z —» - вирус+СО-З

0,2 і

L

0 4...........—.............і........-.............,—......

0 2 4

концентрация гликоконъюгат а, мкМ

Рисунок 2. Связывание вируса гриппа A/Duck/France/46/82 (H1N1) с гликоконъюгатом 3 'SLN-PAA-biot в присутствии галектинов.

Ферментативную активность ЫА исследовали с помощью флуоресцентно меченых субстратов Ыси5Аса2-ЗОаф1-401с-В001РУ (З'БЬ-ВСЮІРУ) или Ыеи5Аса2-30а1р1-4С1сЫАс-В001РУ (3'5ЬЫ-В001РУ). Перед добавлением субстрата вирус инкубировали с

галектинами в различных концентрациях (приведены данные для 20 мкг/мл) в течение 1 часа, то есть времени, заведомо достаточного для нагрузки галектинов. CG-1A. -2 и -3 не оказывали существенного влияния на каталитические свойства вирусов гриппа (Рис. 3). По-видимому, ira поверхности вириона галектины преимущественно присоединяются к углеводным цепям НА, либо связывание с NA стерически не затрагивает каталитический центр и, поэтому, не мешает отщеплению сиаповых кислот. Таким образом, влияние галектинов на функциональные свойства гликопротеинов поверхности вируса гриппа проявляется слабо, либо отсутствует вовсе.

Рисунок 3. Расщепление (выражено в %) субстрата а) 3 'SL-BODIPY вирусом гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и 6)3 'SLN-BODIPY вирусом A/Duck/France/46/82 (H1N1) в присутствии галектинов.

4. Ингмбирование галектинами связывания антител с вирусом гриппа. Поскольку галектины не влияли на активность НА и NA, мы предположили, что их связывание с вирионами выполняет иную функцию - маскирует антигенные свойства поверхности вируса гриппа.

Согласно литературным данным, изменение гликома вируса гриппа связано с адаптацией к организму хозяина (A.Gambaryan et al., Virology, 258:232, 1999) и является тонким механизмом реагирования на изменяющиеся условия. С одной стороны, существует направленное уменьшение числа сайтов гликозилирования, как, например, при адаптации к организму мышей. Наличие или отсутствие углеводных цепей может приводить к изменению рецепторной специфичности вируса или к повьгшению его устойчивости к маннозо-связывающим белкам (P.Reading et al., Respiratory Research, 10:117, 2009). С другой стороны, у человеческих штаммов вируса обнаружена тенденция к увеличению степени гликозилирования. Как результат - углеводные цепи НА и NA способны маскировать антигенные детерминагп-ы и предотвращать связывание защитных антител с вирусом. Мы предположили, что галектины, связываясь с критическими углеводными цепями, могут

усиливать эффект маскировки антигенных детерминант, более того - вызывать его появление, когда углеводные цени сами по себе не маскируют поверхность вируса.

Действие галектинов в этом качестве было изучено с помощью варианта твердофазного анализа, описанного выше. Предварительно нагруженный галектином птичий (A/Duck/France/46/82 HIN1) или человеческий (A/Puerto Rico/8/34 H1N1) вирусы сорбировали на планшете, после чего наносили поликлональные противовирусные антитела к штамму H1N1 (Abeam, получены к штамму А/СССР/90/77 H1N1, концентрация 0,5 мкг/мл). Как и предполагалось, нагрузка галектинов на вирионы привела к ухудшению связывания антител (Рис. 4). Наибольший ингибирующий эффект для обоих вирусов проявлял CG-2 и, в меньшей степени - CG-1A. Один из галектинов, CG-3, влияния не оказывал. Между штаммами вируса также наблюдались различия, в частности, CG-1B выступал как ингибитор только для человеческого (Рис. 4а), но не птичьего вируса (Рис. 46).

концентрации галектикя, мкг/мл

б)

о

л

•••♦•• CG-IA —W— CG-1B --A--CG-2 -О -CG-3

0 10 20 концентрация галектина, мкг/мл

Рисунок 4. Ингибирование галектинами связывания поликлоналъных антител с вирусами a) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и б) A/Duck/France/46/82 (H1N1).

Углеводный состав цепей вируса, целиком определяется аппаратом гликознлирования клетки-хозяина. Поэтому было проведено сравнение двух вариантов одного штамма вируса. Человеческий вирус A/NIB/23/89-MA (H1N1) был одновременно выращен на куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. Между двумя вариантами одного вируса наблюдались существенные различия. В то время как птичьи галектины CG-1A и CG-2 оказывали ингибиторное воздействие в обоих случаях (Рис. 5а), человеческие галектины hG-1 и hG-8 - только на культуральный вирус (Рис. 56).

Рисунок 5. Ингибирование галектинами связывания поликлопальных антител с а) алантоисным и б) кулътуральным вариантами вируса A/NIB/23/89-MA (H1N1).

Аналогично галектины воздействовали на вирус при постановке эксперимента с поликлональными антителами из сыворотки крови людей, переболевших гриппом. В этом случае, тестировали сезонный штамм вируса А/Москва/17/98 (НШ1), выращенный на культуре клеток М1ХХ. С куриными галектинами СО-1А и СО-2 наблюдалась высокая степень блокировки (Рис. 6а), а из человеческих галектинов наибольшей активностью обладали ЬС-1 и Ьй-2 (Рис. 66). Специфичность эффектов, оказываемых галектинами, косвенно подтверждается тем, что степень ингибирования различалась для разных белков, а один галектин - 1Ю-3, вообще не оказывал никакого действия (Рис. 66).

Рисунок 6. Ингибирование а) куриными и б) человеческими галектинами связывания антител из человеческой сыворотки с вирусом А/Москва/17/98 (H1N1).

Следующим шагом было изучение препарата внутривенного иммуноглобулина (ИГВВ), который представляет собой суммарный набор антител из пула сывороток как минимум 1000 здоровых доноров. Такие пулы содержат антитела к вирусу гриппа, направленные против консервативных антигенных сайтов и, таким образом, являются

универсальными, то есть потенциально способны защищать организм от всех штаммов вируса.

Для человеческих вирусов, а именно A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и А/Москва/17/98 (H1N1), была показана высокая степень ингибирования ИГВВ (25-50 мкг/мл) человеческими галектинами. Все без исключения галектины блокировали связывание ИГВВ с вирусом гриппа, а наиболее эффективное действие оказывали, как и в случае сыворотки, человеческие галектины hG-1 и hG-2, ингибирование которыми достигало 90% (Рис. 7).

a) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и 6) А/Москва/17/98 (H1N1).

Полученные данные представляют несомненный интерес для разработки терапевтических направлений, основанных на применении моноклональных и гегеротипических антител и вакцин. Можно ожидать, что галектины, секрстирусмые клетками при воспалении, как участники иммунного ответа, в значительной степени ослабляюг терапевтический эффект. Поэтому, сочетанная терапия, с участием ингибиторов галектинов, может стать новым направлением борьбы с вирусом гриппа.

5. Роль галектинов на стадии адгезии вирионов на клетке. Дальнейшие эксперименты проводились па клеточной модели, где мы ожидали два проявления действия галектинов - ингибиторное или, наоборот - способствующее развитию инфекции. Ингибиторный эффект от галектинов мог развивапъся вследствие экранирования галектином сиалолигандов клетки, использующихся вирусом для адгезии. Кроме того, галектины могли приводить к слипанию вирионов, и, таким образом, снижать их инфскционность. Подобный эффект снижения уровня инфекции при введении галектина-1 in vivo ранее наблюдался авторами (Mei-Lin Yang et al., J. Virol., 85(19): 10010, 2011). С другой стороны, наличие галектинов могло, напротив, повышать уровень адгезии вируса гриппа, если за счет мультивалентности, галектины одним из углсводсвязывающих доменов связываются с

галактозидом на клетке, а другим - на вирусе. Следствием такого двух-сайтного взаимодействия предположительно может быть обеспечение полноценной адгезии, без участия сиаловых кислот.

5.1. Расположение галектинов и вируса гриппа на поверхности клетки. Для исследования углеводной специфичности галектинов в условиях, приближенных к физиологическим, ранее в лаборатории углеводов ИБХ РАН (Рапопорт Е.М. и др.) был разработан метод, в котором гапектины нагружали на поверхность клеток и далее исследовали их взаимодействие с внешним лигандом. В нашей работе мы модифицировали этот подход для изучения связывания галектинов с вирусом гриппа, который выступал в качестве внешнего лиганда.

На первом этапе было исследовано распределение вирионов по поверхности клеток, на которые предварительно нагружены галектины. Для этого выбрали два куриных галектина С0-2 и СО-З, первый из которых согласно нашим данным связывался с вирусом, а другой -нет. Вирус и галектины окрашивали соответствующими антителами, и далее с помощью конфокальной микроскопии наблюдали их расположение на клетках. Как и ожидалось, было обнаружено, что галектин СО-2 и вирус гриппа колокализуются, т.е. располагаются в одних и тех же кластерах (Рис. 8). Для СО-З подобной колокализации не наблюдалось (данные не показаны).

а) •

б) в)

Рисунок 8. Колокализация CG-2 и вируса гриппа A/NIB/23/89_MA (H1N1) на поверхности клеток MDCK. Клетки нагружали галектином (30 мин при 4 °С), а затем инкубировали с вирусом (30мин при 37 °С). а) Вирус, меченый флуоресцеином; б) галектин (детекция антителами, мечеными фикоэритрином); в) наложение сигналов вируса и галектина.

5.2. Изучение влияния галектинов на связывание вируса гриппа с клетками.

Результаты конфокальной микроскопии, а именно - наличие колокализации, подтвердили возможное участие галектинов в заякоревании вирионов на поверхности клетки. Далее для клеток, нагруженных галектинами, количественно определяли уровень связывания вирионов с помощью проточной цитофлуориметрии (сравнение всех экспериментов, проведенных на клеточной системе, приведено в Таблице 1. Цитофлуориметрия - №1). Вирионы

предварительно флуоресцентно метили с помощью ПТС или РІио-ООРЕ1; параллельно, для контроля проводили такой же эксперимент с нативным вирусом, который детектировали с помощью меченых антител.

Рисунок 9. Связывание вируса гриппа A/Rheinland Pfalz/14/07 (ИINI) с клетками MDCK в присутствии галектинов (400 мкг/мл). Здесь и далее - прерывистая линия - контрольные клетки без вируса; серое заполнение - клетки со связанным вирусом без галектина; жирная

- галектин-нагруженные клетки с вирусом. Цитофлуорограмма; по оси абсцисс -интенсивность флуоресценции выбранной популяции клеток (в отн. ед.), по оси ординат -относительная частота встречаемости.

Наличие галектинов на поверхности клеток приводило к возрастанию адгезии вируса гриппа. Из куриных галектинов подобное действие оказывали CG-IA и CG-2, тогда как нагрузка CG-1B, CG-3 и CG-8I не оказывала эффекта (Рис. 9). Литературные данные свидетельствуют, что физиологические концентрации галектинов в организме человека варьируют в диапазоне 0,5-300 мкг/мл, а при заражении патогенными микроорганизмами концентрация галектинов может локально возрастать и до 600 мкг/мл. Оптимизация условий показала, что увеличение адгезии вируса гриппа под действием галектинов достигает максимума при концентрации 100-150 мкг/мл (Рис. 10а).

1 В рамках данной работы был разработан метод мечения вируса с помощью липида, содержащего флуоресцирующий фрагмент (Иио-1ЮРЕ). Метод изложен в разделе 7 данного автореферата.

Увеличение адгезии вируса вызывал также ряд человеческих галектинов, а именно РЮ-1, (Ю-З и ЬО-8 (Рис. 106).

а)

CG-2 200 мкг/мл CG-2 100 мкг/мл CG-2 50 мкг/мл CG-2 25 мкг/мл CG-2 10 мкг/мл CG-2 5 мкг/мл вирус без галектина

0 20 40 60 80 100 120 Флуоресценция

10 20 Флуоресценция

30

Рисунок 10. а) Влияние CG-2 на связывание вируса гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7NI) с клетками MDCK; эффект концентрации, б) Действие человеческих галектинов (100 мкг/мл) при связывании A/FPV/Rostock/34 (H7N1) с клетками MDCK. Здесь и далее - данные цитофлуориметрии, по оси абсцисс - значения флуоресценции в отн. ед.

Подобный эффект от галектинов обнаруживался для всех изученных штаммов вируса гриппа: A/Mallard/NPV/41/04 (H7N1), A/Guinea fowl/Germany/DZ3/85 (H2N2), A/Lesserblack_backed gull/Finland/R2265/09 (H13N2), A/Rheinland Pfalz/14/07 (H1N1), A/FPV/Rostock/34/ (H7N1), A/NIB/23/89-MA (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Степень влияния галектинов отличалась для разных штаммов, что объясняется различиями в их гликозилировании. Так, согласно литературным данным, НА штамма A/FPV/Rostock/34/ (H7N1) несет большое количество углеводных цепей (не менее 7 сайтов), что соответствует наблюдаемому эффекту, который был значительно выше, чем для других вирусов гриппа. Некоторые из галектинов специфически способствовали адгезии только определенных штаммов. Так, hG-1 действовал только на A/FPV/Rostock/34/ (H7N1), но не A/Puerto Rico/8/34 (Н INI) (Рис. 11); а на связывание последнего действовал галектин hG-8 (данные не показаны).

Рисунок II. Связывание вируса гриппа a) A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и 6) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с клетками MDCK в присутствии галектина hG-1 (100мкг/мл). Объяснения -

см. Рис. 9.

5.3. Эксперименты но ингибированию действия галектинов на адгезию вируса .пи антами галектинов. Для понимания описанного в данной работе действия галектинов, необходимо знать специфичность этих белков по отношению к гликанам известной структуры. В отличие от человеческих галектинов, специфичность куриных аналогов изучена мало. Поэтому два куриных галектина, один из которых (CG-2) увеличивал адгезию вируса на клетке, а другой (CG-3) - нет, были исследованы с помощью гликочипа. В его состав входило 205 гликанов, многие из которых являются потенциальными лигандами галектинов.

Анализ данных гликочипа (Шилова Н.В. и др., лаборатория углеводов ИБХ РАН) выявил, что наибольшим сродством к CG-2 обладали тетрасахариды А (тип 1) и А (тип 2), а также другие антигены групп крови системы АВН, такие как В (тип 2) и Н (тип 2)1 . По сравнению с этими гликанами, «классические» лиганды галектинов полилактозамины, показали низкий уровень связывания с CG-2. Для CG-3 предпочтительными лигандами, напротив, выступали типичные лактозаминовые гликаны - (3Gaipi~4GlcNAc)3 и (3Gaipi-4GIcNAc)2. Таким образом, гапектины продемонстрировали существенные различия в углеводной специфичности, что, по-видимому, обусловило их разное действие в отношении вируса гриппа.

С учетом данных о специфичности, далее был проведен ингибиторный эксперимент, который отличался тем, что после нагрузки галектинов клетки инкубировали с гликоконъюгатом, обладающим сродством к этим белкам, и только после этого наносили вирус гриппа. Как и ожидалось, после добавления наиболее аффинного лиганда для CG-2, а

2 А (тип 1) - GalNAcal-3(Fucol-2)Gaipi-3GlcNAc, А (тип 2) - GalNAcal-3(Fucal-2)Gaipi-4GlcNAc, В (тип 2) -Gala 1 -3(Fucal-2)Gaip 1 -4GlcNAc, H (тип 2) - Fucal-2Gaipi-4GlcNAc.

именно мультивалентного тетрасахарида А (тип 2), степень адгезии вируса на поверхности клетки уменьшалась до уровня без галектина (Рис. 12). Контрольный конъюгат (ЗСаф!-401сКАс)3 либо не влиял на связывание вируса, либо его действие проявлялось только при высокой концентрации (100 мкг/мл, данные не показаны). Таким образом, было показано, что высокоаффинный углеводный лиганд галектина действительно отменяет эффект увеличения связывание вируса гриппа с клеткой, а взаимодействие гапектинов с поверхностью вируса имеет углевод-белковую природу.

Рисунок 12. Ингибирование действия СО-2 (100 мкг/мл) на адгезию вируса А/ГРУ/Ро.иоск/34 (Н7т) гликоконъюгатам А (тип 2) в разных концентрациях.

CG-2+A(nm 2) 100 мкг/мл ■нши-<

CG-2+A(nm 2) 25 мкг/мл ШИШИШН

CG-2+A(ran 2) 5 мкг/мл ■■■■Ен

CG-2 без конъюгата

вирус без галектина ннивн

50 100 Флуоресценция

5.4. Влияние гликома вируса и клетки-мишени на действие галектинов.

Углеводный состав вируса определяет способность связываться с галектином, и зависит от происхождения вирионов. В данной работе проведено сравнение двух вариантов одного и того же, но по-разному гликозилированного, вируса A/NIB/23/89-MA (H1N1); один глико-вариант был выращен на куриных эмбрионах, другой - на культуре MDCK. В целом, увеличение адгезии вирионов на клетках наблюдалось в большей степени для культурального варианта (данные не показаны). Наибольшее различие между вирусами проявлялось в отношении человеческих галектинов hG-1 и hG-8, эффект от которых для культурального варианта был более явным. Опираясь на литературные данные о структуре углеводных цепей (S.Mir-Shekari ct al., J. Biol. Chem., 272(7):4027, 1997) мы объясняем это тем, что углеводный состав вирусов, выращенных в организме млекопитающих, как правило, отличается более высокой степенью гликозилирования и разветвленной структурой. Это обеспечивает более высокую аффинность галектинов к таким вирионам и, как следствие, галектин-опосредованная адгезия проходит более интенсивно.

Еще один пример влияния гликозилирования - это клетки MDCK6SIAT, которые в большей степени, чем исходная культура, синтезируют углеводные цепи с а2-6-терминальным остатком сиаловой кислоты. Как и ожидалось, увеличение степени сиалилирования приводило к уменьшению связывания галектинов, так как известно, что а2-

15

6 сиалилированис запрещает взаимодействие этих белков с углеводными цепями. Как следствие, эффект галектинов на связывание вируса с гипер-сиалированными клетками был гораздо слабее, или не детектировался вовсе (данные не показаны).

5.5. Связывание вируса с десиалилированнмми клетками в присутствии галектинов. Искусственное десиалилирование поверхности закономерно привело к значительному снижению адгезии вируса, вплоть до сс отсутствия (Рис. 13). Однако, нагрузка галектинов на десиалилированныс клетки увеличивала адгезию до уровня равного (галектин CG-2), или даже превышающею (в случае CG-1A) уровень сиало-опосредованного процесса.

Рисунок 13. Действие галектинов Сй-Ы и СС-2 при связывании вируса гриппа АМВ/23/89-МА (НШ1) с а) нашивными и б)

десиалилированными клетками \iDCK (<1е51а проводилось с помощью нейраминидазы из V. сЬокгае).

Большинство клеток млекопитающих, к которым относятся и клетки МВСК, секретируют галекгины при стрессовых состояниях, к которым можно отнести и инфекцию вирусом гриппа. Таким образом, можно предположить, что галектаны способны служить не только в качестве дополнительного, но и самодостаточного фактора, обеспечивающего первую стадию заражения - адгезию вируса гриппа на поверхности клетки-мишени. Данный эксперимент имитирует ситуацию, когда вирус обладает высокоактивной ЫА и низкоаффинным ПА.

5.6. Действие галектинов при нагрузке на вирионы. Известно, что галсктины обнаруживаются во внеклеточном пространстве, а также, что вирус гриппа необычно плотно галактозилирован. Эти факты говорят о реальной возможности физиологического связывания галектина с вирусом до стадии адгезии на клетке, и мотивировали эксперименты, в которых вирус инкубировался с галектинами (1 ч) и, только после этого, наносился на клетки. Нагрузка галектина СО-1А на вирионы приводила к возрастанию адгезии на клетках, причем эффект был сильнее, чем при нагрузке того же галектина на поверхность клетки. В то

я)

клетки+вирус клетки+вирус+СО-2 клетки+вирус+CG-1А

deSia клетки+вирус ^ deSia клетки+вирус+СС-2 dcSia клстки+вирус+CG-lA

20

Флуоресценция

40

же время, для родственного галектина СО-2 был получен противоположный результат (Рис. 14).

вирус без галектина

галектин на вирусе

галектин на клетке

1

■ CG-1A

Рисунок 14. Увеличение адгезии вируса гриппа A/NIB/26/90 (H1N1) на клетках MDCK при нагрузке куриных галектинов CG-1A и CG-2 на поверхность клетки или вируса (детекция вируса с помощью флуоресцентных антител).

О

500 1000

Флуоресценция

1500

Совокупность полученных данных говорит о возможности нескольких сценариев взаимодействия между вирусом, клеткой и галектином - взаимодействия, которое зависит от предпочтительной локализации галектинов и множества факторов, таких как паттерн гликозилирования клетки и вируса, активность вирусных белков, наличие гликопротеинов-конкурентов в межклеточном пространстве и т.д.

6. Исследование полного цикла заражения вируса в присутствии галектинов. Связывание вируса с поверхностью клетки-мишени является лишь начальной стадией в процессе заражения. Поэтому далее, для полноценного ответа па вопрос, какую роль играют галектины в инфекции вируса гриппа, были проведены эксперименты по рассмотрению полного цикла заражения, а не только стадии адгезии. Для качественной/иолуколичествснной оценки действия галектинов использовался метод специфического окрашивания монослоя после заражения вирусом гриппа (Таблица 1, №2), а именно: клетки инфицировали вирусом в течение ночи и затем вносили конъюгат фетуип-пероксидаза (для НА в составе мембраны зараженных клеток и вирионов, не успевших отпочковался, сиалилированныс гликаны фетуина являются высокоаффинным лигандом). Далее, благодаря наличию пероксидазы, монослой окрашивали и с помощью микроскопа анализировали и сравнивали уровень заражения в присутствии галектинов и без них.

Для инфицирования клеток МОСК использовалась апантоиспая жидкость, полученная нарашиванием вируса А/РРУ/ЯоБЮскШ (Н7Ы1) в куриных эмбрионах. Важно было взять именно нативный, «живой» вирус, без каких-либо стадий очистки. Галектины в различных концентрациях от 0,1 до 50 мкг/мл добавляли к клеткам одновременно с апантоисной жидкостью (брали разведение порядка 1:10*, чтобы получить средний уровень заражения). Результаты показали, что куриные галектины СС-1А и СО-2 в концентрации 5 мкг/мл полностью ингибировали инфицирование клеток МЕХЖ (данные не показаны). Уменьшение

концентрации галектинов приводило к появлению окрашивания клеток лишь при концентрациях I мкг/мл и ниже. Предварительное десиалилирование монослоя MDCK также отменяло заражение клеток, а добавление галектинов к десиалилировапным клеткам не изменяло ситуации.

Таким образом, в полном инфекционном цикле галектины способны ингибировать заражение клеток вирусом гриппа, что противоречит нашим результатам, полученным с помощью цитофлуориметрии (Раздел 5.2, Таблица 1, №1), где галектины увеличивали адгезию вируса на клетке-мишени. Необходимо упомянуть, что в условиях цитофлуориметрии происходило взаимодействие вируса с суспензией клеток, тогда как ингибирование проявлялось на монослое, что ближе к физиологическим условиям (Таблица 1, №2). Мы предположили, что от пространственного расположения галектинов может зависеть проявляемый ими эффект. Для более детального изучения этого вопроса была проведена серия дополнительных исследований, где использовался количественный метод оценки заражения, и варьировались условия проведения эксперимента.

6.1. Действие галектинов при заражении клеток вирусом гриппа, сравнение трех разных условий проведения эксперимента. С помощью цитофлуориметрии и окрашивания мопослоя (Таблица 1, №1,2) были получены противоречивые результаты, то есть ингибиторное и промсггирующее действие галектинов. Однако, в этих двух методах детектировались разные параметры (адгезия и заражение) и при этом оба подхода отличались условиями проведения эксперимента (суспензия и монослой клеток). Поэтому, возникла необходимость разработать единый подход, в рамках которого путем варьирования условий возможно было отдельно рассмотреть процессы адгезии и полного цикла инфицирования. Количественно детектировать оба параметра на монослое клеток удалось по измерению ферментативной активности нейраминидазы. А именно, в эксперименте после инкубации с вирусом в течение часа (этого достаточно для связывания вирионов) или ночи (полный цикл заражения), в систему вносили флуоресцентный субстрат для NA (MU-NANA), который после расщепления дает флуоресцентный продукт мстилумбеллиферон. При этом галектины добавляли в систему эксперимента на разных стадиях (Таблица 1, №35):

• на монослой клеток одновременно наносили галектин и вирус (№3)

• перед нанесением на клетки вирус инкубировали с галектином (№4)

• галектин предварительно нагружали на клетки, и только после этого вносили вирус

(№5).

Таблица 1. Влияние галектинов на взаимодействие вируса гриппа с клетками. Сравнение разных методов.

Jfe Метод Детекция Стадия, на которой добавлялся галектин Что фактически исследовалось Эффект от галектинов (интенсивность)

1 Связывание вируса с клетками. Цитофлуориметрия. (суспензия клеток МЕЮК) меченый вирус Галектин предварительно нагружали на клетки Связывание Увеличение адгезии вируса (++)

Галектин предварительно нагружали на вирус

2 Окрашивание монослоя клеток МОСК фетуин-перокеццазой после заражения по субствту перокендазы Галектин смешивался с вирусом Заражение Ингнбирование (—)

3 Количественная оценка заражения/связывания по ферментативной активности ЫА (монослой клеток МОСК.) По реакции расщепления MU-NANA Галектин одновременно с вирусом Связывание Ингибированне (-)

Заражение Ингнбирование (- -)

4 Галектин предварительно нагружали на вирус Связывание Ингибированне

5 Галектин предварительно нагружали на клетки Связывание Увеличение адгезии вируса (+)

Заражение Ингибированне (-)

В условиях метода №3 наблюдалось ингибирующее действие галектинов как при связывании, так и при заражении. Однако, галекгины в разной степени ингибировали процесс: в то время как СО-2 действовал при концентрации 25 мкг/мл, СО-1А - уже начиная с концентрации 1 мкг/мл (Рис. 15), то есть СО-1А являлся более сильным ингибитором. Противовирусный эффект в большей степени проявлялся в условиях полного цикла заражения клеток, нежели при оценке только стадии адгезии (Рис. 15, черные и серые столбики).

вирус

CG-2, 100 інші — CO-2,25 CG-2, 5 CG-2, 1 CG-2, 0.5 CG-2, 0.2

CG-2

□ Связывание ■ Заражение

100

150

вирус

CG-1A, 100 CG-1 А, 25 CG-1A, 5 CG-1A, 1 CG-1A, 0.5 CG-1A, 0.2

Рисунок 15. Влияние галектинов Сй-2 и СС-1А в различных концентрациях (мкг/мл) на связывание и заражение клеток вирусом гриппа (Метод №3, см. Таблицу 1). Здесь и далее активность нейраминидазы в отсутствие галектина принята за 100%.

Аналогичный методу №3 ингибиторный эффект от галектинов обнаруживался в методе № 4. Дополнительное время инкубации галектинов с вирионами приводило к еще большему снижению уровня адгезии, чем в условиях метода №3 (Рис. 16). По-видимому, при такой постановке эксперимента в условиях методов №3 и №4 происходит агрегация вирусных частиц, а инкубация с галсктином только увеличивает этот эффект. Как результат, процесс физиологической адгезии вирионов на поверхности клеток происходит менее эффективно.

. CG-1A, 100 11 вирус с галектином

■ (вирус+галсктин) -

CG-1A, 25 CG-1A, 5 CG-IA, 1 —¡■її і * ' 1 инкубация (№4)

CG-1A, 0.5 CG-1A, 0.2

50 100 150 Расщепление Mu-NANA

Рисунок 16. Влияние галектина CG-1A (мкг/мл) на адгезию вируса гриппа в условиях предварительной инкубации с вирусом (Метод №4) и без нее (Метод №3).

Метод №5 отличался тем, что галектины предварительно нагружали на монослой клеток, и только потом наносили вирус. При этом для адгезии и заражения были получены противоположные результаты. Вирус гриппа лучше связывался с поверхностью клеток, на которую нагружены галектины CG-1A и CG-2 (Рис.16а). Этот результат согласовался с данными метода №1, однако, эффект от галектинов в условиях метода №¡5 был не столь ярким. По-видимому, в условиях метода №5 не наблюдается агрегации вирионов в растворе, так как галектины заякорены на поверхности клетки.

а) вирус СО-2, 1 са-2,5 СС-2, 25 СО-2, 100 Св-ІА, 1 ССМА, 5 СО-1 А, 25 СО-.."

50 100 150 200 Расщепление Ми^АІЧ А

Рисунок ¡7. а) Влияние галектинов СО-1 А и СО-2 (мкг/мл) на адгезию вируса гриппа на клетках МОСК в условиях метода Ме5.

Влияние галектинов б) СС-1А и в) СО-2 на заражение клеток МОСК. вирусом гриппа в условиях метода №5._ ____

б)

вирус

СО-1А, 0.5 Сй-ІА, 1 СО-1А, 2 Св-ІА, 5 Св-ІА, 10 Сй-ІА, 25 Св-ІА, 50 Св-ІА, 100

^ Расщеплеїшс Ми-\л!\л' * !

В)

вирус

Сй-2,0.5 СО-2, 1 СО-2, 2 СО-2, 5 СО-2, 10 Св-2,25 СО-2, 50 СО-2, 100

0 50 100

Расщепление МЫ^А^

В полном цикле заражения в условиях одного и того же метода (№¡5) разные галектины действовали неодинаково. Если галектин СО-1 А выступал как ингибитор (Рис. 176), аналогично результатам методов №2-4, то СО-2, который увеличивал адгезию в методе №5, не ингибировал заражения, хотя и не способствовал ему (Рис. 17в).

Таким образом, как в случае суспензионной культуры, так и в случае монослоя клеток, независимо от того, на какой из двух компонентов нагружались галектины, и независимо от того, промотировалась или ингибировалась стадия адгезии, итогом действия галектинов на заражение клеток в большинстве случаев было его торможение, то есть стадия адгезии не является определяющей.

7. Введение флуоресцентной метки в состав вириона. Мечение вируса гриппа с помощью флуоресцеинизотиоцианата (РІТС) проводится в щелочных условиях (рН 9.5), что может вызывать изменения ЫА и НА. Чтобы избежать влияния процедуры мечения и ковалентного присоединения самой метки на связывание вируса гриппа с галектинами, мы разработали альтернативный подход, где флуоресцентная метка вводилась с помощью синтетического липида (РІио-ІЮРЕ) (Рис. 18).

оя

Рисунок 18. Структура Fluo-DOPE. Остаток флуоресцеина (Fluo) связан с остатком диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) 15-атомным спейсером.

Дизайн и синтез липидной структуры РІио-ЕЮРЕ, содержащей флуоресцентную метку, был проведен в лаборатории углеводов ИБХ РАН к.х н Е.Ю. Корчагиной; структура каждого фрагмента в молекуле БІио-ЮРЕ критична для встраивания в мембрану; в частное™, ненасыщенные олеоильные цепи обеспечивают высокую степень и скорость встраивания, а спейсер делает всю конструкцию растворимой (точнее, диспергируемой) в водной среде. Флуоресцентная метка в виде липидного производного вводится в физиологических условиях, что в отличие от химической модификации белков РГГС, позволяет максимально сохранять их поверхность натииной Мы сравнили мечение четырех штаммов вируса гриппа с помощью ИТС и флуоресцентным липидом по следующим параметрам: изменение рецепторних свойств НА влияние на ферментативную активность ЫА, способность меченых вирионов связывался с клетками. Было показано, что Пио-ООРЕ является более «мягким» агентом для введения в состав вируса флуоресцентной метки и не оказывает влияния на активность ИА и НА.

8. Заключение

Несмотря на то, что вирус гриппа является одним из самых хорошо изученных вирусов, он, по-прежнему, представляет опасность доя здоровья человека. Лекарственные препараты, которые доступны на сегодняшний день, направлены на подавление активности нейраминидазы или М2 белка вируса гриппа. Между тем, эти компоненты являются минорными, в то время как большую часть поверхности вируса занимает гемагтлютинин. Однако, лекарственных средств направленного действия против гемагглютинина пока не существует. Выявленные в данной работе закономерности делают более полным понимание процесса адгезии вируса на клетке-мишени. Полученные результаты могут способствовать разработке терапевтического подхода, объединяющего блокирование гемагглютинина и гапектина. Еще одним средством борьбы с вирусом гриппа является вакцинация. Несмотря на огромные усилия по разработке синтетических вакцин, реально действующими и надежными остаются вакцины, основанные на целых вирионах, которые по современным технологиям нарабатываются в клеточной культуре. Обнаруженные в данном исследовании факты влияния галектипов на адгезию вирусов к клетке и на процесс заражения, несомненно, внесут определенные коррективы в будущие разработки новых противогриппозных вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена способность галектпнов связываться с вирусом гриппа. Нагрузка галектинов на поверхность вируса не изменяет функциональную активность гемагглютинина и нейраминидазы.

2. Связывание с галектинами маскирует антигенные детерминанты поверхности вируса гриппа, предохраняя его от присоединения антител.

3. Галекгины в отсутствие сиалозидов способны обеспечивать адгезию вируса фиппа на клетке-мишени. На галектин-опосредованную адгезию влияет углеводный состав как вируса, так и клетки.

4. Галекгины ингибируют инфицирование, несмотря на то, что способствуют адгезии вируса гриппа на клетке.

5. Предложен новый метод мечения вируса гриппа с помощью введения гидрофобной флуоресцентной метки в состав липидной мембраны вирионов.

Автор выражает благодарность: А.С. Гамбарян (Институт полиомиелита РАМН, Москва) за помощь в выращивании вирусов, Е.М. Рапопорт (ИБХ РАН, Москва) за помощь в клеточной работе, Е.Ю. Корчагиной (ИБХ РАН, Москва) за синтез Fluo-DOPE и обсуждение работы, Л.В. Кордюковой (НИИ ФХБ, Москва) за рекомендации в проведении ряда экспериментов, Т. Гардеру (Институт Фридриха-Леффлера, Грайфсвальд, Германия) за сотрудничество в проведении ряда экспериментов, М.Н. Мотросовичу (Марбургский университет имени Филиппа, Марбург, Германия) за предоставление культуры MDCK6SIAT, Е.И.Бурцевой (НИИ Вирусологии, Москва) за предоставление вируса H1N1 Москва и человеческой сыворотки и Г.-И. Габиусу (Мюнхен, Германия) за предоставление галектинов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи

1. Черный Е.С., Рапопорт Е.М. Апдрэ С., Калтнер Г. Габиус Г.-И, Бовин Н.В., Галектины способствуют взаимодействию вируса гриппа с клеткой // Биохимия 2011. Т. 76. С. 23-24.

2. Hadac Е.М., Federspiel MJ„ Chemyy E.S., Tuzikov A.B., Korchagina E.U., Bovin N.V., Russell S., Henry S.M., Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions //J. Virol. Methods. 2011 V. 176. P. 78-84;176(l-2):78-84.

Тезисы докладов на конференциях

1. Chemyy E.S., Bovin N.V., Study of Additional Influenza Virus to Cell Interaction // Program and abstracts for the 2009 meeting of the society for Glycobiology - San Diego, USA. Glycobiology 2009 V. 19. №11. P. 1259-1379.

2. Chemyy E.S., Bovin N.V., Study of binding of influenza virus with human tracheobronchial mucins // Summer Course Glycosciences 2008, Netherlands; http://www.vlaggraduateschool.nl

Подписано в печать:

14.05.2013

Заказ № 8465 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1з - 68 85

2012499160