Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка М1: электрохимический подход тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А. Н Фрумкина РАН Лаборатория биоэлектрохимии

на правах рукописи

КНЯЗЕВ ДЕНИС ГЕННАДЬЕВИЧ

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛИПИД-БЕЛКОВЫХ СТРУКТУР НА ПРИМЕРЕ ВИРУСНОГО БЕЛКА М1: ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ПОДХОД.

Специальность 02.00.05 - Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

з О СЕН 2008

Москва 2008

003447379

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им А. Н. Фрумкина РАН

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Валерий Сергеевич Соколов

Официальные оппоненты.

доктор химических наук Владимир Валентинович Арсланов

доктор физико-математических наук Всеволод Александрович Твердислов

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии

им. А.Н Белозерского, МГУ

Защита состоится ^ / октября 2008 года в ~f / час. ЮО мин. на заседании диссертационного совета Д 002.259 03 при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А. Н Фрумкина РАН по адресу

119991, г. Москва, Ленинский проспект, д 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им А. Н. Фрумкина РАН.

Автореферат разослан /<Р сентября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

Г. М Корначева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность исследования. Матриксный белок М1 вируса гриппа, наиболее представленный среди белков вириона, является мембранно-ассоциированным. Он образует каркас (сеть) внутри липидного бислоя, который обеспечивает механическую прочность вирионов. Белок М1 является ключевым элементом, опосредующим процессы инфицирования клетки вирусом, причем основополагающим является взаимодействие белка с бислойными липидными структурами. В процессе вирусного слияния при понижении pH среды внутри эндосомы происходит транспорт ионов Н+ через протонные каналы вируса, в результате чего происходит диссоциация белкового каркаса Экспериментально обоснованного механизма этой диссоциации до сих пор не было предложено. Белок представляет собой небольшую (27 8 кДа, 252 аминокислотных остатка) молекулу, плотно прилегающую к внутренней стороне вирусной мембраны (Ruigrok, R.W., 2007). В ряде работ показано, что белок М1 способен связываться с липидными мембранами (El Karadaghi, S. et al., 1984, Ruigrok, R.W.H. et al., 2000). Однако, не исключено, что при образовании сети он должен взаимодействовать также с вирусными трансмембранными гликопротеинами

Согласно данным, полученным методами малоуглового нейтронного рассеяния и электронной микроскопии (Arzt, S. et al., 2001, Schulze, I.T., 1972), мономер Ml имеет форму стержня. Образуемый такими молекулами в вирионе каркас имеет толщину около 60À, а размер ячейки около 40Â. Структура М- и N-доменов этого белка (остатки 2158) была успешно определена методом рентгеноструктурного анализа (Baudin, F. et al., 2001, Sha, B.D. and Luo, M., 1997). Однако структура бежа, связанного с липидной мембраной, может отличаться

от его структуры в кристалле. Нативный белок имеет еще и С-домен, структура которого не установлена, поскольку в процессе кристаллизации он отщепляется. Продолжается активная дискуссия о характере М1-М1 взаимодействий в составе матрикса и взаимодействий белка М1 с вирусной мембраной in situ. Так, в работе (Ruigrok, R.W.H. et al., 2000) утверждалось, что связывание белка с лшщцной мембраной осуществляется за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных аминокислот М1 с отрицательно заряженными группами мембранных липидов. Однако другие авторы (Sha, B.D. and Luo, M., 1997) говорят о гидрофобных взаимодействиях N-концевого домена белка М1 с вирусной липидной мембраной.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия матриксного белка с липидной поверхностью. В ней использовались системы, моделирующие липидную поверхность вирусной мембраны. На этих системах оказалось возможным изучить роль электростатических взаимодействий при адсорбции белка М1 на липидной поверхности путем варьирования поверхностного заряда мембраны за счет изменения содержания в ней заряженных липидов, значения рН раствора и его ионной силы

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей формирования белок-липидных структур при адсорбции матриксного белка М1 на липидную поверхность. Для этого были выбраны такие модельные системы, как бислойная липидная мембрана (БЛМ), липидный моно- и бислои на твердой подложке. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние рН на адсорбцию белка М1 в значимом для вируса гриппа диапазоне рН от 5 до 7;

2) Выяснить эффективность связывания белка М1 с липидом в различных условиях;

3) Оценить толщину слоя адсорбировавшегося белка и уточнить ориентацию молекулы М1 относительно липидного слоя.

Новизна исследования и его научно-прикладное значение.

Использованные в работе оригинальные экспериментальные подходы позволили впервые детально изучить адсорбцию нативного матриксного белка М1 на липидных поверхностях. Исследованы роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в адсорбции белка, а также влияние на нее рН в физиологически значимом диапазоне. На основе оценки толщины слоя адсорбированных белков и распределения в нем заряда предложены вероятная ориентация молекулы М1 на поверхности липидного слоя, а также механизм диссоциации белкового каркаса при понижении рН среды.

Практическая значимость работы обусловлена тем, что матриксные белки принимают непосредственное участие в инфицировании клетки оболочечными вирусами, и выяснение механизма их функционирования имеет огромное значение в разработке новых лекарственных препаратов. В частности, в настоящее время ведутся работы над созданием универсальной вакцины от гриппа В отличие от обычных вакцин, мишенью которых являются трансмембранные гликопротеины, эта вакцина основана на «настраивании» иммунной системы именно на белок М1, который является высоко консервативным во всех штаммах вируса.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях молодых ученых ИФХЭ РАН (Москва, 2006, 2007), на 8-м международном Фрумкинском симпозиуме «Кинетика электродных процессов» (Москва, 2005), на XX Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008) и на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва, 2004-2007).

Публикации. За время работы над диссертацией опубликована одна статья в отечественном реферируемом журнале и 2 тезиса докладов на международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Работа изложена страницах и

иллюстрирована^/рисунком. Диссертация состоит из введения, трех основных частей (восьми глав, включая обзор литературы) и заключения Список цитированной литературы содержит /йбаименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЯ.

Матриксный белок Ml был выделен из вирионов гриппа штамма A/PR/8/34 методом Жирнова (Zhirnov, O.P., 1992). Концентрация белка в растворе определялась количественным аминокислотным анализом на анализаторе Hitachi L-8800 (Япония) в стандартном режиме разделения на катионобменной колонке с детекцией нингидриновым реагентом. Для предотвращения агрегации белка Ml его концентрация в ячейке не превышала

1 мкг 300 мкл '

Эксперименты, проведенные методом компенсации внутримембранного поля (КВП). Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) формировали по методу Мюллера-Рудина из дифитаноилфосфатидилхолина (ДФФХ) и дифитаноилфосфатидилсерина (ДФФС) или из их смеси в мольном отношении 7:3, соответственно.

Разность граничных потенциалов БЛМ измеряли электрохимическим методом компенсации внутримембранного поля с использованием второй гармоники емкостного тока (Соколов, B.C. и др., 19 8 0 ). Измерение осуществлялось с помощью автоматической установки с использованием фазочувствигельного усилителя DSP-7265 (Signal Recovery, США), который

управлялся компьютером через приборный интерфейс GPIB (Measurement Computing, США) с помощью разработанной в лаборатории программы.

Белок добавлялся в отсек с электродом, соединенным со входом Keithley-427 (потенциал этого электрода поддерживался равным нулю),- этот отсек мы будем называть цис-отсеком. Другой отсек с электродом, на который подавалось напряжение, будем называть транс-отсеком

Эксперименты, проведенные методом спектроскопии поверхностного плазменного резонанса (ППР). Измерения адсорбции белка Ml на липидной поверхности проводились на ППР-рефлектометре Biosuplar-б (реализация по Кретчману) производства Mivitec (Германия). Добавление белка производилось при непрерывной перфузии через экспериментальную ячейку (объемом 20 мкл) белковой суспензии соответствующей концентрации.

Химическая модификация поверхности производилась по методике, описанной в (Mirsky, V.M. et al., 1999). Монослойное тиольное покрытие формировалось на стеклянной пластине с напыленным слоем золота в двух вариантах. В первом использовался октадекантиол (ОДТ), формирующий гидрофобную поверхность раздела с водным раствором Поверх тиольной поверхности за счет перфузии ячейки раствором с липосомами формировался липидный монослой, на который и адсорбировался Ml Липосомы формировались либо из смеси ДФФХ и ДФФС в мольном отношении 7:3, либо из азолектина, либо из ДФФХ. Добавление бежа производилось при непрерывной перфузии через экспериментальную ячейку объемом 20 мкл белковой суспензии с различной концентрацией белка. Во втором варианте применялся карбоксигексадекантиол (КГДТ), создающий полярную заряженную поверхность, имитирующую липидную. В этом случае адсорбция Ml проводилась непосредственно на слое тиолов, что позволило упростить методику и повысить стабильность данной системы.

Эксперименты, проведенные методом атомной силовой микроскопии (АСМ). Атомный силовой микроскоп был представлен контроллером Multimode Nanoscope IV и сканирующей головкой типа Е с ячейкой для электрохимических измерений в жидкости Все перечисленные компоненты были приобретены у Veeco Digital Instruments, США. Данный прибор позволяет получать топограмму поверхности, а также проводить эксперименты по силовой микроскопии. Все опыты осуществлялись при комнатной температуре в жидкости в резонансном режиме. В качестве зондов использовались заостренные кантилеверы из нитрида кремния с номинальной жесткостью 0 6 Н/м (Veeco Digital Instruments, США).

Для формирования липидного бислоя на подложке (слюда) использовался т н. метод разворачивания липосом на поверхности. Были использованы липосомы, сформированные из смеси ДОФХ и ДОФС в молярном отношении 9.1. Для формирования липидного покрытия на свежесколотую слюду (Veeco Digital Instruments, США) добавлялась суспензия липосом. После инкубации в течение 15 минут слюда промывалась буферным раствором. В результате описанной процедуры на ее поверхности формировался лшшдный бислой. Однородность полученного липидного покрытия контролировалось по топограммам, а о том, что это покрытие представляет собой бислой, свидетельствовала его толщина, оцененная по силовым кривым. Белок в соответствующем буферном растворе добавлялся над липидным бислоем на подложке и инкубировался в течение часа. После этого подложка промывалась чистым буферным раствором и помещалась в измерительную ячейку АСМ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение адсорбции белка Ml на БЛМ методом КВП. При изучении адсорбции белка Ml методом КВП мы варьировали следующие параметры:

концентрацию М1 в растворе, значение рН и ионную силу водной среды, липидный состав БЛМ.

Кинетика изменения разности граничных потенциалов БЛМ при введении различных концентраций М1 в водный раствор при рН 5.0 приведена на рис. 1а. В этом и последующих КВП-экспериментах, если это не оговорено особо, БЛМ формировалась из смеси ДФФХ и ДФФС в мольном отношении 7:3. Белок вводился с одной стороны БЛМ Каждая из представленных на рисунке кривых выходит на насыщение, причем время этого выхода для разных концентраций М1 заметно различается. От концентрации белка в растворе зависело и стационарное значение разности граничных потенциалов БЛМ (в дальнейшем мы будем называть ее потенциалом адсорбции). При этом наблюдалась неаддитивность при последовательных добавках белка в ячейку: если белок при нейтральном рН вводился в раствор не сразу, а в несколько этапов, так чтобы каждое последующее добавление делалось после достижения стационарного потенциала от предыдущего добавления, то потенциал адсорбции оказывался меньше, чем после разовой добавки того же количества белка Отмывка белка из ячейки с помощью замены раствора не приводила к заметному уменьшению потенциала, что указывает на то, что десорбция бежа М1 с поверхности БЛМ или вообще невозможна, или происходит очень медленно. Это позволяет предположить, что матриксный белок способен формировать на поверхности БЛМ сети различной структуры в зависимости от концентрации белка.

Зависимость потенциала адсорбции от рН. Эксперименты, аналогичные приведенному на рис. 1а, проводились при различных значениях рН в физиологически значимом диапазоне от 5 до 7. Было показано, что рН влияет как на кинетику изменения граничного потенциала после добавления М1 в раствор, так и на конечное значение потенциала адсорбции.

На рис. 16 приведена типичная кинетика изменения граничного потенциала при адсорбции М1 при рН 7 0.

а

б

о

50

100 время,мин

Рис. 1. Изменение граничного потенциала при введении M1-белка с цис-стороныБЛМ, сформированной из смеси 70%ДФФХи 30%ДФФС Состав водной среды IOmMKCI, 0.1 мМ EDTA при разн ых значениях рН. а) В буферном растворе 2 мМ MES, рН 5.0 Концентрация добавленного белка в ячейке 50, 100 и 200 нМ для кривых 1-3, соответственно, б) В буферном растворе 2 мМ HEPES, рН 7.0. Концентрация добавленного белка в ячейке 100 нМ. Стрелкой показано добавление белка.

Из сравнения этой кривой с кривой для соответствующей концентрации М1 при рН 5 0 (рис. 1а) можно заключить, что время выхода кинетических кривых на насыщение при обоих рН приблизительно одинаково (около 150 минут). Однако при рН 7.0 потенциал изменялся во времени немонотонно В начале записи потенциал становился отрицательным, и только с течением времени он рос, достигая положительных значений. Мы полагаем, что немонотонное изменение потенциала при рН 7 вызвано изменением ориентации молекул белка на поверхности липидной мембраны в процессе формирования сети Зависимость величины потенциала адсорбции от рН иллюстрирует рис. 2, где приведены значения этого потенциала при трех различных рН: 5.0, 6.0 и 7 0. Видно, что самое сильное влияние рН на потенциал имеет место в диапазоне от 7 до б В отдельных экспериментах было показано, что поверхностный заряд БЛМ данного состава при изменении рН от 7.0 до 5.0 практически не меняется. Таким образом, возможной причиной рН-зависимости потенциала адсорбции М1 является изменение свойств самого

белка, а не липидного бислоя. В принципе, увеличение потенциала при понижении рН может быть вызвано либо а) увеличением количества молекул белка, адсорбированных на мембране, либо б) изменением заряда или ориентации молекул белка на поверхности мембраны

рн

Рис. 2. Вверху: Потенциал адсорбции при введении белка (100 нМ), измеренный при разных рН. Состав буферного раствора: 10 мМ КС1, 0.1 мМ ЕОТА, 2 мММЕЗ (при рН 5 и б), 2 ШНЕРЕ5 (при рН 7)

О 100 200 300 400

>р«мя,мия

Рис 3 Эксперимент с изменением рН среды до рН 5.0 (стрелка 2 -добавление НС1) при достижении стационарного значения после введения белка (100 нМ) при нейтральном рН (стрелка 1). Состав буферного раствора • 10 ШКС1, 01 мМ ЕОТА, 2 мМ цитрат

Был проведен эксперимент, который позволил проверить, какое из двух приведенных выше предположений верно. В нем адсорбция белка М1 сначала проводилась при рН 7, затем, после выхода потенциала адсорбции на стационарное значение, рН среды добавлением кислоты понижался до 5. Сразу же после этого наблюдался быстрый рост граничного потенциала' за 10 минут сигнал вырос на 20 мВ (рис. 3). Рост потенциала происходил значительно быстрее кинетики выхода потенциала на насыщение после добавки М1 в раствор. Этот факт нельзя объяснить вновь начавшейся после уменьшения рН среды адсорбцией белка, за столь малое время могли произойти лишь переориентация белка или изменение его заряда

Зависимость потенциала адсорбции от ионной силы. Чтобы выяснить, не влияет ли рН на заряд белка, мы оценили величину привнесенного белком заряда на БЛМ, изучая зависимость потенциала адсорбции от ионной силы. Результаты опытов, представленные на рис. 4, были получены по следующей схеме. Сначала на БЛМ адсорбировался белок М1. Адсорбция М1 проводилась при низкой ионной силе (10 мМ КС1) в среде с рН 6.0 или 7.0. Спустя примерно 3 часа с момента добавки М1 пошагово изменялась ионная сила сначала в цис-отсеке, а затем в транс-отсеке, не содержащем белка. Запись такого эксперимента при рН 6 0 представлена на рис. 4а. Изменение ионной силы в отсеках начиналось с момента, когда кривая адсорбции М1 выходила на насыщение. Изменение потенциала происходило быстро по сравнению с длительностью адсорбции белка Так как измерялась разность граничных потенциалов БЛМ, то увеличение ионной силы в разных отсеках давало эффект разного знака. Изменение потенциала при введении КС1 в разные отсеки различалось и по абсолютной величине, в цис-отсеке, содержащем белок, изменение потенциала было меньшим по сравнению с транс-отсеком, где белок отсутствовал. Судя по полученным результатам, белок привносит на мембрану небольшой положительный заряд по сравнению с абсолютной величиной исходного отрицательного заряда БЛМ При этом адсорбция белка не вызывает перезарядку ее поверхности.

Заряд, привнесенный белком на БЛМ, был оценен следующим образом Используя зависимость изменения граничного потенциала от ионной силы в каждом из двух отсеков, мы определяли величины поверхностного заряда для обеих сторон БЛМ: с адсорбировавшимся белком (цис-сторона) и без него (транс-сторона). Зависимости изменения граничного потенциала от ионной силы в соответствующем отсеке (рис. 4а) были перестроены следующим образом Значение потенциала для каждой концентрации КС1 в соответствующем отсеке было получено путем сложения эффектов от всех предыдущих добавок соли в этот отсек (рис 46) в предположении, что

изменения граничных потенциалов от каждого из монослоев с обеих сторон БЛМ были независимыми друг от друга Нулевые уровни для каждой зависимости соответствуют исходной разности граничных потенциалов в фоновом электролиге (10 мМ KCl) перед повышением его ионной силы. Расчет поверхностного заряда производился в рамках модели Гуи-Чепмена по формуле, описывающей разность поверхностных потенциалов, соответствующих начальному (в растворе 10 мМ KCl) и конечному (после увеличения ионной силы) состояниям, как и в работе (Соколов, B.C. и др., 1980):

F aj+^af+1

где а, = ^g^y, > а ~ поверхностный заряд монослоя со стороны цис- или

транс-отсека, £ - абсолютная диэлектрическая проницаемость среды, R -газовая постоянная, Т - абсолютная температура, F - постоянная Фарадея, с, -концентрация KCl. Индекс 1 относится к начальному состоянию, когда концентрация соли составляла 10 мМ, индекс 2 - к раствору после добавки KCl (с концентрацией 30 мМ, 60 мМ или 120 мМ) Теоретическая кривая для каждого из отсеков проводилась по экспериментальным точкам методом наименьших квадратов, где свободным параметром был поверхностный заряд о.

Аналогичным образом определялись значения поверхностных зарядов при pH 7 0 (данные не приведены). Рассчитанные по уравнению (1) значения поверхностных зарядов БЛМ со стороны транс-отсека при двух значениях pH оказались близкими: сгрН( = 2 ± 0 1 • мкКл /см1, арН1 = 2.3 ± 0.1 • мкКл /см1. Они хорошо согласуются с результатом измерения электрофоретической подвижности липосом из тех же липидов: арН1 = 2 \±0.\-мкКя/см1. Значение привносимого белком на поверхность положительного заряда находится как

разность между полученными значениями а для каждого из монослоев при соответствующем рН Этот заряд при рН 6.0 (А<трН6 =1.6±0.1-мкКл/см2) оказался примерно в 3 раза выше, чем при рН 7.0 ( АсгрН1 = 0.5 ± 0.1 • мкКл/см1)

30

60

о,

X i

100 200 250 300 МО 340 время, мин

KCl, M

0,1

Рис. 4 а) Последовательное увеличение ионной силы водного раствора в ячейке после достижения стационарного значения потенциала в присутствии белка (100 нМ), добавленного в начальный момент времени. Исходная концентрация KCl в ячейке 10 мМ. Добавление 2 M раствора KCl производилось с цис-стороны БЛМ (широкие стрелки вверх) и транс-стороны БЛМ (тонкие стрелки вниз) до концентрации 30, 60 и 120 мМ для стрелок 1-3, соответственно. Исходный буферный раствор 10мМКС1, 01 мМ EDTA, 2 мМMES, pH

6 0. б). Приращение граничного потенциала в эксперименте, приведенном на рис. 6а в зависимости от концентрации KCl в цис-отсеке ячейки (темные точки) и в транс-отсеке (светлые точки). Теоретические кривые построены по уравнению (1) при значении плотности поверхностного заряда, равном а = 0 4 ± 0 03 • мкКп / см2 и ст = 2 + 0.1- мкКл/см2 для цис-и трас-стороны БЛМ, соответственно.

На основании известного аминокислотного состава белка можно показать, что полученное выше изменение величины привнесенного заряда в зависимости от pH коррелирует с изменением суммарного заряда всей молекулы М1. Оценка заряда проводилась в предположении, что значения рКа боковых групп аминокислот в полипептидной цепи не отличаются от соответствующих рКа одиночных аминокислот в растворе (Saggerson, D., 1988 ). В рассматриваемом диапазоне pH основной вклад в изменение заряда белковой молекулы будут вносить такие аминокислоты, как гистидин,

аспарагин, глутамин. Расчет показал, что заряд матриксного белка при рН 7.0 составляет +8, а при рН 5.0 и 6.0 - +16,2 и +11.3 ед. элементарного заряда соответственно При этом основной вклад в положительный заряд белковой молекулы вносит С-домен. Обычно считают, что С-домен в вирусе обращен в водный раствор и взаимодействует с рибонуклеопротеиновыми (РНП) комплексами вириона. Однако, на плоской БЛМ, в отсутствие РНП, ориентация С-домена может отличаться от таковой на мембране вириона. Так, в нашей модельной системе при закислении среды не исключено такое изменение ориентации С-домена относительно мембраны, что отрицательный заряд липидов будет компенсироваться положительным зарядом и этого домена.

Различие в оценках, полученных выше по результатам измерения зависимости граничного потенциала от ионной силы раствора (рис. 4) и по аминокислотному составу, не столь велико. Оно может быть объяснено тем, что размеры белка сопоставимы с толщиной диффузной части двойного электрического слоя, и на потенциал адсорбции наибольшее влияние оказывают не все заряженные участки М1, а только находящиеся в непосредственной близости от поверхности мембраны. Возможно, такими участками в домене, ответственном за взаимодействие с БЛМ (Ы-домене), являются положительно заряженные а-спирали остатков 108-117 и 89-104, поскольку они несут на себе большой положительный заряд.

Чтобы изучить влияние ионной силы на потенциал адсорбции белка в более широком диапазоне, мы изменили предыдущий эксперимент и варьировали концентрацию КС1 до введения белка. В экспериментах, результаты которых представлены на рис. 5, М1 адсорбировался на БЛМ, сформированной из ДФФС, в водной среде с концентрацией КС1 10 мМ, 100 мМ, 500 мМ и 1000 мМ при рН 7.0. Потенциал адсорбции был положительным и составил 22 и 14 мВ при концентрации КС110 и 100 мМ, соответственно. При дальнейшем увеличении концентрации потенциал практически не менялся. Это

может свидетельствовать о том, что при адсорбции белка меняется не только поверхностная, но и дипольная компонента граничного потенциала.

25 т

15-

10

100 KCl, мМ

Рис. 5. Значения потенциала адсорбции белка (100 нМ) на отрицательно заряженной БЛМ, сформированной изДФФС, измеренные при разной ионной силе раствора Состав исходного буферного раствора: 2 мМHEPES, pH 7 и указанная на оси абсцисс концентрация

KCl.

Зависимость потенциала адсорбции от состава БЛМ. Потенциалы адсорбции белка на мембранах, сформированных из смеси ДФФХ и ДФФС в мольном отношении 7:3, либо только из ДФФХ, представлены на рис. 6. Видно, что в присутствии отрицательно заряженного липида потенциал адсорбции существенно выше как при рН 5.0, так и при рН 7.0. Значения потенциалов адсорбции при рН 5.0 на отрицательно заряженной и нейтральной мембране составили 31 мВ и 14 мВ, соответственно. В экспериментах по адсорбции М1 на БЛМ разного состава была отмечена следующая особенность: форма кинетической кривой, а именно, наличие или отсутствие немонотонной кинетики изменения потенциала, определяется не только рН водного раствора, но и наличием в БЛМ отрицательно заряженного липида. При концентрации М1 100 нМ падение потенциала на начальном этапе адсорбции (аналогичное представленному на рис. 16) на нейтральных БЛМ (ДФФХ) наблюдалось как при низком, так и при нейтральном значениях рН, и, напротив, это падение

отсутствовало при обоих рН в случае отрицательно заряженной БЛМ (ДФФС). Ряд контрольных экспериментов, которые были проведены на БЛМ из диолеоилфосфатидилсерина и диолеоилфосфатидилхолина показали, что потенциал оставался прежним, когда фитановые углеводородные цепи липидов заменялись на олеиновые. Это означает, что на адсорбцию белка влияют не углеводородные цепи липидов, а их полярные группы.

Рис 6 Потенциал адсорбции белка (100 нМ) на нейтральной БЛМ изДФФХ (А), и отрицательно заряженной БЛМ из 70% ДФФХ и 30% ДФФС (Б) Состав исходного буферного раствора: ЮОмМКС! и 2 мМ HEPES, рН 7 (темные колонки), либо 2mMMES, рН 5 (заштрихованные колонки).

В литературе обсуждался вопрос, способен ли белок М1 встраиваться в липидный бислой (Sha, B.D. and Luo, M., 1997). Пытаясь ответить на него, мы измеряли проводимость БЛМ при адсорбции на ней бежа М1. Если бы белок встраивался в мембрану, это должно было приводить к увеличению ее электропроводности. Однако, во всем диапазоне концентраций белка М1 в растворе увеличения проводимости БЛМ не наблюдалось. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что белок М1 не встраивается в липидную мембрану Такой же вывод был сделан на основе данных,

полученных методом электронной микроскопии, согласно которым белок расположен вне липидного бислоя (Иг1д1еу, N.6., 1979).

Изучение адсорбции белка М1 на липидном монослое на подложке методом ППР. Этот метод позволяет получить толщину слоя адсорбировавшегося белка в случае, когда этот слой можно аппроксимировать сплошной пленкой. Приведенная ниже оценка проводилась по результатам серии экспериментов по адсорбции белка М1 на ОДКТ (рис. 7). Приведенные графики представляют собой изменение эффективного показателя преломления среды над пластиной в относительных единицах, в зависимости от концентрации белка в растворе при двух значениях ионной силы. Видно, что кривые выходят на насыщение Толщина адсорбировавшегося слоя М1 была рассчитана в предположении, что данное насыщение соответствует полному заполнению поверхности белком. Это предположение подтверждается результатами АСМ-экспериментов, которые будут приведены ниже. Сигнал ППР с хорошей точностью можно считать пропорциональным показателю преломления среды над пластиной (Jung, L.S. et al., 1998):

R = m(neif-n,) (2),

где R - сигнал ППР (ответ на изменение показателя преломления приповерхностной области), п^ - эффективный показатель преломления среды над пластиной, Iis -показатель преломления раствора над адсорбировавшейся пленкой, m - коэффициент пропорциональности. Величина R берется на уровне выхода кинетической кривой на насыщение.

Поскольку заполнение поверхности полное, мы можем записать п^ц как:

h п

Ч о '<i

2z f 2d>\

''dz = 1-е'1'

\ J

fa-",)+", С3).

л

где <1 - толщина адсорбировавшегося слоя, Ц - характерная длина затухания электромагнитного поля, которая по грубой оценке составляет 37 ±

13% от длины волны падающего света (в нашем случае 1а = 240 нм), г -координата по оси, перпендикулярной плоскости пластины и направленной от металла в раствор, п(г) - показатель преломления как функция т.

2

Нормировочный множитель — находится из условия п(0)=па

0,060.05 0,040,03 0,020,01-0,00-I(l

100 200 300 400 концентрация М1

500

Рис. 7. Концентрационная зависимость адсорбции Ml на поверхности, сформированной из отрицательно заряженного тиола (КГДТ) Кружки соответствуют экспериментам с 10 мМКС1, звездочки - 100 мМKCl. Буферный раствор: 2mMHEPES, pH 7. По оси ординат отложен сигнал ППР в относительных единицах.

Таким образом, комбинируя (2) и (3), а затем логарифмируя получившееся уравнение, получаем

(4),

где Лт„ = т(па -пг). Иными словами, соответствует сигналу ППР для гипотетического случая бесконечно толстого белкового слоя ((1»1а).

В нашем случае, когда сигнал И много меньше , формула (3) переходит

в

По данным, приведенным на рис. 7, - =—

я»«

—=0,048. Здесь

iax

определялся по известному из литературы значению показателя преломления белка (пр) с массой 28 кДа (Voros, J., 2004), равному 1,48: пшш = пр-ns,

где п, = 1,33 (показатель преломления водного раствора). Оценка толщины слоя белка по формуле (5) дала значение d = 6,3 ± 0,6 нм По данным рентгеноструктурного анализа матриксный белок можно аппроксимировать параллелепипедом с размерами 3x4x6 нм Полученные результаты позволяют конкретизировать ориентацию белка относительно липидной поверхности, а именно, полагать, что «стержень» М1 расположен перпендикулярно мембране. Наши данные хорошо согласуются с данными, полученными в (Schulze, I. Т., 1972), где при помощи криоэлектронной микроскопии было показано, что толщина М1-каркаса в вирионе составляет 6 нм.

Рис. 8. Адсорбция белкаМI на отрицательно заряженной липидной поверхности (70% ДФФХи 30%ДФФС) Буферный раствор. 10мМКС1, 2ШНЕРЕ5, рН 7. По оси ординат

отложен сигнал ППР в относительных единицах Первая стрелка показывает начало перфузии ячейки раствором, содержащим М1 в концентрации 500 нМ Стрелки со знаком "|| "указывают намомент остановки перфузии ячейки белковым раствором, со знаком "/>" - намомент возобновления перфузии. Последняя стрелка указывает намомент начала перфузии ячейки буферным раствором, не содержащим белка (в течение 1 часа)

буфер

0

40

Время, мин

80

120

Для того, чтобы подтвердить полученный методом КВП результат о необратимости адсорбции белка М1 на липидном бислое, после выхода адсорбционной кривой на стационарное значение производилась перфузия ячейки буферным раствором, не содержащим белка (рис. 8). Видно, что сигнал при этом практически не изменялся, а следовательно, десорбции белка не происходило.

Изучение адсорбции белка М1 на липидном бнслое на подложке методом АСМ. Белок М1 в исходной объемной концентрации 2 мкМ адсорбировался на поверхность с бислойным липидным покрытием. Топограмма такой поверхности с адсорбировавшимся белком при значении рН водной среды 7 приведена на рис. 9, слева. Состав буферного раствора 100 мМ ЫаС1, 2 мМ СаС12, 2 мМ НЕРЕБ. Видно, что белок образует сплошную сеть на липидном бислое. Темные круглые участки - дефекты в липидном покрытии. Эти данные, как и представленные выше, показывают, что матриксный белок образует самоорганизующиеся структуры на плоском липидном бислое. Результат понижения значения рН среды до 5 приведен на рис. 9, справа: целостность слоя адсорбировавшегося белка в этом случае была нарушена

Силовые кривые, снятые для каждого из случаев (данные не приведены), показывают, что упругие свойства системы адсорбировавшийся белок-липидный бислой заметно изменяются при изменении рН. А именно, в случае целой белковой сети (рН 7) система состоит из двух сред с различными упругими свойствами: липидного бислоя и слоя адсорбированного белка. Когда белковая сеть разрушена (рН 5), система ведет себя как однородная, а именно, ее упругие свойства определяются только липидным бислоем.

В измерениях методом сканирующей зондовой микроскопии информативной величиной является перепад высот, а не их абсолютное значение, тк. за базовый уровень на топограмме принимается самая низкая точка на площадке сканирования, которой может оказаться дефект в липидном

покрытии или иная неровность, например, дефект слюды. Поэтому толщину слоя белка М1 на липидной поверхности с большей точностью удалось определить при адсорбции белка в кислой среде, т.к. в этом случае лучше видна поверхность липидного бислоя. Определенная таким образом толщина белкового слоя составила 6±1 нм, что согласуется с полученным ранее методом ППР результатом.

5.70Ш1 733гт

2Ç0nmU

Рис. 9. Топограмма липидного бислоя состава 10% ДОФС и 90% ДОФХ с адсорбировавшимся белком М1 в буферном растворе со значениелг рН 7 (2 мМ HEPES, рисунок слева) и после замены буферного раствора на буферный раствор со значением рН 5 (2 мМ MES, рисунок справа). Состав водной среды: 100 мМ NaCl, 2 мМ СаС1г- Справа от каждой топограммы приведены шкалы высот. Приведенный масштабный отрезок соответствует 200 нм. Исходная концентрация белка в растворе 2 мкМ.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что белок М1 способен адсорбироваться на липидных поверхностях. Это свидетельствует о том, что наличие трансмембранных гликопротеинов для сборки белкового каркаса не является необходимым.

2. Полученные результаты свидетельствуют, что белок М1 при адсорбции на липидной поверхности может образовывать сеть, структура которой зависит от рН раствора и объемной концентрации белка.

3 Электрохимическим методом компенсации внутримембранного поля было показано, что при адсорбции белка М1 на липидную поверхность привносится положительный заряд, значение которого возрастает при понижении значения рН среды

4. Результаты экспериментов по атомной силовой микроскопии свидетельствуют, что понижение значения рН приводит к разрушению белковой сети на липидной поверхности. Предложен возможный механизм дестабилизации сети - электростатическое отталкивание мономеров вследствие возрастания их заряда (см. п 3).

5. Перфузия ячейки с адсорбировавшимся на поверхности белком М1 буферным раствором в экспериментах по спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса не приводила к его десорбции Таким образом, было показано, что адсорбция матриксного белка на липидной поверхности необратима.

6. Показано, что регистрируемые в экспериментах сигналы, связанные с адсорбцией М1, значительно возрастают в случае, если поверхность отрицательно заряжена. Тем не менее, на нейтральной поверхности адсорбция тоже происходит. Это свидетельствует о том, что в процессе адсорбции существенны как кулоновское взаимодействие разноименно заряженных липидов и белка, так и взаимодействие белка с нейтральными липидами, возможно, гидрофобное.

7. Двумя независимыми методами - спектроскопией поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопией - была определена толщина слоя адсорбировавшегося белка, которая составила около 6 нм. Это позволило предложить ориентацию адсорбированных молекул белка, в которой стержневидная молекула белка расположена перпендикулярно липидной поверхности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Князев Д.Г., Радюхин В.А., Соколов ВС. Изучение межмолекулярных взаимодействий белков Ml вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля // Биологические мембраны,- 2008 - Т.25 - №6.- С.491-500.

2. Knyazev DG., Maksaev G.I. Research on virus matrix protein Ml-bilayer lipid membrane interaction // Abstracts of VIII International Frumkin Symposium "Kinetics of electrode processes".- Moscow, 2005.- P.205.

3. Князев Д.Г., Батищев O.B, Соколов B.C. Изучение взаимодействия матриксного белка вируса гриппа Ml с липидным слоем // Сб. Тезисы докладов XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»,- Москва, 2008 - С.57.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз. 2008 год.

Введение.

Обзор литературы.

§1. Вирус гриппа.

§2. Вирусное слияние и баддинг.

§3. Матриксный белок М1.

§4. БЛМ и мембранная электростатика.

Материалы и методы.

Результаты.

§1. Изучение адсорбции белка М1 на БЛМ

Компенсация внутримембранного поля.

§2. Изучение адсорбции белка М1 на липидном монослое на подложке

Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса.:.

§3. Изучение адсорбции белка М1 на липидном бислое на подложке

Атомная силовая микроскопия.

Выводы.

Вспышки гриппа — прогнозируемое явление для зимы в Северном и Южном полушариях. Грипп распространяется очень быстро. По статистике, ежегодно заболевает до 10% взрослого населения. Показателя заболеваемости и смертности остаются стабильно высокими с 20-х годов прошлого века, не имея тенденции к улучшению. Именно это является причиной того, что фундаментальные исследования вируса гриппа остаются востребованными по сей день.

Вирус гриппа является серьезным патогеном человека, который на протяжении XX столетия вызвал три пандемии с высоким уровнем смертности. Пандемический штамм вируса возникает намного реже эпидемических штаммов, в результате комбинирования генетического материала человеческого вируса гриппа типа А с материалом животного вируса гриппа, в результате чего образуется абсолютно новый штамм, против которого у человека нет естественного иммунитета. Это приводит к началу пандемии — эпидемии в мировом масштабе. При этом имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов вируса. Именно высокий пандемический потенциал сделал вирус гриппа объектом углубленных исследований. Лучшее понимание жизненного цикла вируса гриппа, особенно стадий, приводящих к инфицированию клетки, крайне важно для создания новых превентивных и терапевтических стратегий. Данные, полученные на вирусе гриппа, могли бы создать подход и основу для изучения других особо опасных патогенов человека, таких как ВИЧ и вирус лихорадки Эбола.

Подобно многим другим оболочечным вирусам, вирус гриппа доставляет нуклеокапсид в цитоплазму клетки хозяина путем эндоцитоза, а затем слияния своей оболочки с мембраной эндосомы. Как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов обеспечиваются тонко согласованным взаимодействием основных мембранных белков вируса, в том числе трансмембранного гликопротеина гемагглютинина (ГА) и матриксного белка М1.

Эти взаимодействия определяют всю архитектуру вириона. При низких значениях рН, вызывающих конформационную перестройку молекул ГА, а также изменение взаимодействия М1 с поверхностными гликопротеинами ГА и нейраминидазой (НА), происходит диссоциация слоя белка М1, что в конечном счете обеспечивает выход вирусного генома в клетку. Роль матриксного белка крайне важна на многих стадиях репликации вируса — от вхождения вируса в клетку и его «раздевания» до сборки и почкования дочерних вирионов.

Прогресс в понимании всего процесса молекулярных перестроек в вирионе вируса гриппа при низких значениях рН, определяющих инфицирование клетки, сдерживается отсутствием необходимой структурной информации о пространственной организации полноразмерного М1 белка при слиятельно активном (5) и нейтральном (7) рН in situ (т.е. в том же окружении, что и в составе вириона), его ориентации относительно вирусной мембраны и характере взаимодействий М1-М1, М1-липид и М1-рибонуклеопротеин. В данной работе исследуются межмолекулярные взаимодействия белка М1 на липидной поверхности, которые определяют диссоциацию и сборку белкового каркаса в вирионе. Эти взаимодействия в вирусах гриппа различных штаммов реализуются, по-видимому, одними и теми же молекулярными механизмами, поскольку а) белок М1 является высоко консервативным для разных штаммов вируса и б) вирус гриппа инфицирует преимущественно клетки эпителия верхних дыхательных путей, т.е. липидный состав оболочки, с которой взаимодействует белок, можно считать постоянным.

Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей формирования белок-липидных структур при адсорбции матриксного белка М1 на липидную поверхность. Для этого были выбраны такие модельные системы, как бислойная липидная мембрана (БЛМ), липидный моно- и бислои на твердой подложке. В проведенных экспериментах изучалась адсорбция белка М1 на бислойной липидной мембране и на липидном моно- и бислоях на подложке методами компенсации внутримембранного поля, спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопии. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние рН на адсорбцию белка М1 в значимом для вируса гриппа диапазоне рН от 5 до 7;

2) Выяснить эффективность связывания белка М1 с липидом в различных условиях;

3) Оценить толщину слоя адсорбировавшегося белка и уточнить ориентацию молекулы М1 относительно липидного слоя.

Обзор литературы

§1. Вирус гриппа.

Вирусы представляют собой самостоятельную неклеточную форму жизни. В самом примитивном варианте вирус состоит из некоторого количества генетического материала (РНК или ДНК), упакованного в плотную белковую оболочку. Поэтому размер вирусов мал, он редко превышает 100-200 нм. Некоторые вирусы (т.н. оболочечные) обладают также липидной оболочкой, представляющей собой липидный бислой с некоторым количеством белков, так или иначе способствующих попаданию вирусного генома внутрь клетки-хозяина. Цель вирусной частицы — доставить свой генетический материал в ядро инфицируемой клетки с тем чтобы, используя клеточные механизмы, обеспечить воспроизводство таких же вирусных частиц. Как правило, для того, чтобы вирусный геном попал по назначению, ему необходимо преодолеть только один барьер - клеточную мембрану. Поэтому некоторые вирусы внедряют свой геном внутрь клетки, формируя лишь пору в клеточной мембране, другие - проникают внутрь клетки путем эндоцитоза, а лишь затем высвобождают свой генетический материал. Для формирования пор в мембранах клеток вирусы обладают специальными белками слияния, которые могут находиться в двух состояниях - неактивном и слиятельно-активном, переход между которыми включается каким-либо внешним воздействием (триггером). Им может быть как простое взаимодействие белка слияния с рецепторами на клеточной мембране (ВИЧ), так и понижение рН внешней среды (вирус гриппа).

Вирус гриппа является оболочечным вирусом из семейства ортомиксовирусов. Для человека клинически значимыми являются вирусы гриппа типа А и В. В данной работе исследовался компонент вируса гриппа А. Схематическое изображение и электронная микрофотография вириона гриппа А приведены на рис. 1. Внешняя часть вириона представляет собой липидный бислой, сформированный из цитоплазматической мембраны инфицированной клетки. В липидную оболочку встроены вирусные трансмембранные белки: вирусный белок слияния гемагглютинин (ГА), фермент нейраминидаза (Н) и протонный канал М2. Гемагглютинин является трансмембранным гликопротеином, который посттрансляционно модифицируется добавлением КГ-связанных углеводородов к семи остаткам аспарагина каждого мономера и ковалентным соединением пальмитиновой кислоты к трем остаткам цистеина в области цитоплазматического конца. Функциональной единицей, экспонированной на мембране вируса, является тример гемагглютинина. Удаленный от мембраны домен гемагглютинина - т.н. ГА] — содержит сайты узнавания сиаловых рецепторов, находящихся на поверхности клетки-мишени и ответственен за сорбцию на клетке-мишени. 1М-концевой домен гемагглютинина - т.н. ГА2 — является рН-активируемым доменом, отвечающим за слияние с эндосомальной мембраной клетки-мишени [1,2]. Функция еще одного трансмембранного гликопротеина - нейраминидазы — заключается в десорбции вновь синтезированного вириона с поверхности клетки-хозяина. Вирусный протонный канал М2 представлен в вирионе в виде тетрамера и активируется низким значением рН [3,4].

Внутренний монослой вирусной липидной мембраны ассоциирован с белковым каркасом, образованным из вирусного матриксного белка М1 (более подробно он будет описан в следующем разделе), который формирует белковую оболочку вокруг содержимого вирусной частицы [5]. Эта сетка-каркас представляет собой монослой М1-белка толщиной около 60А, с размером ячейки около 40А [6]. Под белковой оболочкой располагается рибонуклеопротеин (РНП) — это комплекс РНК с нуклеопротеином и полимеразами, заключённый в липидную оболочку, сформированную из цитоплазматической мембраны инфицированной клетки-хозяина в процессе размножения вируса [7,8]. Геном вируса гриппа А представляет собой восемь отдельных сегментов одноцепочечной отрицательной РНК, кодирующей по меньшей мере 10 вирусных белков, три из которых функционируют в качестве полимераз. Вирусная РНК, нуклеопротеин и полимеразы чрезвычайно сильно ассоциированы в РНП [9,10].

Рис. 1. Схематическое изображение вириона гриппа [б] (слева) и электронная микрофотография вируса гриппа [11](справа). На схеме показаны вирусные белки ~ ГА, нейраминидаза, Ы1 и Ы2, а также липидная мембрана и РНП. На микрофотографии (X 350 ООО) хорошо видны "шипы " - внешние домены вирусных белков, окружающие вирусный капсид.

Содержание компонентов вируса гриппа В/Ног^ Коп^8/73 приведено в таблице 1 [6]. Полная масса вируса составляет около 190 МДа, из которых на долю липидов приходится около 20% (для вируса гриппа А 19-20% [12,13], для вируса гриппа В - 20% [14]) и 2.5% - на долю РНК (полный геном составляет 14639 пар нуклеотидов, что соответствует 4.5 МДа). Упомянутый в таблице белок ЫВ является, вероятно, аналогом М2-белка вируса гриппа А и, возможно, также формирует тетрамеры [15].

Строение вирусной частицы изучено довольно подробно с помощью электронной микроскопии и биохимических методов. Как было сказано выше, нуклеокапсид вируса заключен в бислойную липидную мембрану, несущую вирусные белки (на электронных микрофотографиях видны как "шипы", торчащие из оболочки вируса, длина которых обычно порядка 10-15 нм (рис. 1).

Вирионы гриппа А обычно полиморфны (т.е. форма вирионов неодинакова). Диаметр частиц, близких по форме к сферическим, по данным электронной микроскопии обычно порядка ОД - 0,15 мкм [16]. При этом в случае вируса гриппа А (в отличие от В) размер и форма вирионов в значительной степени варьируют, что было продемонстрировано криоэлектронной микроскопией вирусной суспензии [17]. Большие вирусные частицы содержат непропорционально мало генетического материала, т.е. выглядят почти пустыми изнутри.

Сегмент Кодируемый Мол. вес Кол-во коппй на Доля от 190

РНК белок белка, кДа вирион МДа, %

1 РВ2 86 8 0.36

2 РВ1 83 8 0.35

3 РА 80 8 0.34

4 НА 64 (70) 350-400 тримеров 38-44

5 NP 56 630 19

6 NA 51 (60) 50 тетрамеров 6

NB 12 15 мономеров 0.1

7 М1 27 1100 17

8 NS1 31 -

NS2 13 -

Таблица 1. Стехиометрия компонентов вируса гриппа В/Hong Kong/8/73 [б].

Так как вирусный геном сегментирован, нуклеокапсид также состоит из 8 частей, однако до сих пор не удалось выделить суперструктуру, которая включала бы в себя все 8 сегментов РНП. РНК составляет приблизительно 1012% от общей массы РНП [18,19], что означает, что каждый мономер нуклеопротеина связан с 20-26 нуклеотидами РНК. Нуклеопротеин связывается с сахаро-фосфатным остовом РНК неспецифично по отношению к нуклеотоидной последовательности и препятствует таким образом формированию вторичной структуры. Следовательно, нуклеотидные основания оказываются экспонированными наружу, что позволяет полимеразе транскрибировать вирусную РНК без диссоциации нуклеопротеина от РНК [20]. Каждый отдельный полимеразный комплекс связан с одим из концов отдельного РНП-стержня. Внутри РНП полимераза связана как с 3'-, так и с 5'-концами вирусной РНК и, скрепляя их, формирует кольцевую структуру РНК. Это кольцо затем суперспирализуется и превращается в стержневидную структуру [18,19].

Вирионы семейств арена-, альфа-, рабдо-, парамиксо-, ортомиксо- и ретровирусов получают свою липидную оболочку из плазматической мембраны [21,22]. Роль липидной мембраны вируса до недавнего времени казалась второстепенной, так как она заимствуется вирусом у клетки-хозяина в результате "почкования" - кооперативного процесса, приводящего к объединению матриксного белка, трансмембранных белков и нуклеокапсида -и содержит относительно немного липида (около 20% по массе - см. выше) (рис. 2).

Рис. 2. Последовательные этапы формирования вирионов вируса гриппа на поверхности инфицированной клетки (X350 ООО) [11].

Однако, липидный состав вирусных оболочек значительно отличается от липидного состава мембраны клетки-хозяина [23,24], от которой отщепилась вирусная частица. Это было показано для разных типов вирусов: вируса леса Семлики [25], вируса Синдбис [26], вируса везикулярного стоматита [27].

Подобные данные говорят в пользу предположения о том, что так называемые рафты ("гайв" - домены специфического состава, содержащиеся в мембране) клеточной мембраны избирательно встраиваются в вирусную мембрану в процессе отщепления вирусной частицы от клеточной мембраны. Например, в работе [28] был проанализирован липидный состав мембраны вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и цитоплазматической мембраны клеток, в которых созревал вирус. Было показано снижение уровня фосфатидилхолина и фосфатидилинозитола на 50 % и 80 % соответственно, увеличение содержания холестерина в 2,5 раза, фосфатидилсерина на 50-140 % и фосфатидной кислоты на 100 % относительно уровня клеточной мембраны. Оказалось, что высокий процент холестерина в мембране вириона критичен для инфекционности вируса. Например, экстракция около 50% холестирина из мембран вируса везикулярного стоматита снижает его ифекционность более чем на 85%, для ВИЧ снижение уровня холестерина в оболочке на 50-60 % редуцирует его инфекционность на 50 % [29]. Роль холестерина в процессе слияния, индуцируемого белками, не совсем ясна. По данным ЭПР-спектроскопии, наличие холестерина повышает параметр упорядоченности мембраны вириона. Процесс слияния вируса с мембраной-мишенью можно также ингибировать добавлением в среду экзогенных липидов типа лизофосфатидилхолина, либо ускорить добавлением липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая кислота, арахидоновая кислота).

Теперь, когда были вкратце описаны сам вирус гриппа и его основные компоненты, целесообразно перейти к описанию вирусного слияния и баддинга. При этом основное внимание будет уделено роли матриксного белка в этих процессах.

Выводы

В работе исследовалась адсорбция белка М1 на бислойной липидной мембране и на липидном моно- и бислое на подложке методами компенсации внутримембранного поля, спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопии. Была четко показана рН-зависимость адсорбции белка на липидных поверхностях. Изучалась зависимость адсорбции от ионной силы и липидного состава поверхности. Были предложены ориентация молекулы М1 относительно липидного бислоя, а также механизм диссоциации белкового каркаса в кислом рН.

На основе имеющейся рентгеновской структуры М1 [65] часто предполагают, что вирусный белковый каркас стабилизируется как гидрофобными, так и электростатическими взаимодействиями. По этой причине при нейтральном значении рН заряды молекул М1 оказываются частично скомпенсированными. Как известно, в процессе инфицирования М1-каркас внутри вириона разрушается при изменении рН внешней среды с 7 до 5 [49]. При этом известная из рентгеноструктурного анализа пространственная структура N- и М-доменов белка (а следовательно, и распределение на них гидрофобных участков) не меняется [61]. Однако, как обсуждалось выше, в этом случае существенно увеличивается общий положительный заряд белка.

Можно предположить, что именно изменение белок-белкового взаимодействия внутри каркаса (например, электростатическое отталкивание мономеров матриксного белка друг от друга в кислом рН) дестабилизирует вирусный белковый каркас.

Результаты, полученные разными методами, находятся в хорошем согласии друг с другом. Это позволило сделать следующие выводы об особенностях адсорбции матриксного белка на липидной поверхности. - Показана необратимость адсорбции белка М1 на липидных поверхностях. Таким образом, взаимодействия М1-липид достаточно для ассоциации белковых молекул на липидной оболочке вириона.

- Показано наличие зависимости потенциала адсорбции и сигнала поверхностного плазмонного резонанса от концентрации белка в растворе, что позволило предположить создание на липидной поверхности белковых сетей различной структуры.

- Оценен привносимый белком на БЛМ заряд. Проведенная оценка показала, что этот заряд положителен и зависит от значения рН среды.

- Показана зависимость адсорбции белка от липидного состава поверхности и от ионной силы раствора: при наличии отрицательно заряженных липидов и при низкой ионной силе раствора адсорбция происходит с большей эффективностью.

Изучение адсорбции М1 с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса проводилось под руководством профессора В.М. Мирского в Университете Регенсбурга, Германия.

Автор благодарит Н.В.Федорову и Л.А.Баратову за предоставленный матриксный белок, В.И.Золотаревского за помощь в проведении АСМ-экспериментов, О.В.Батищева за помощь и поддержку в ходе выполнения всей работы, Ю.А.Чизмаджева за предоставленную идею исследования и ценные обсуждения работы, В.С.Соколова за ответственное и участливое руководство и весь коллектив лаборатории биоэлектрохимии.

1. Wiley D.C., Skehel J.J.// The Structure and Function of the Hemagglutinin Membrane Glycoprotein of Influenza Virus.// Annual Review of Biochemistry.1987. V.56.P.365-394.

2. Lear J.D.//Proton conduction through the M2 protein of the influenza A virus; a quantitative, mechanistic analysis of experimental data.// Febs Letters. 2003. V.552.N l.P. 17-22.

3. Wu Y. J., Voth G.A.// Computational studies of proton transport through the M2 channel.//Febs Letters. 2003. V.552.N 1. P.23-27.

4. Schulze I.T.//The structure of influenza virus. II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 1972. V. 47. P. 181-196.

5. Ruigrok R.W.// Structure of Influenza A, B and C Viruses.//Textbook of Influenza./ /Ed. A.H.N.C.R.Webster. Blackwell Scientific Publications, 2007. P.

6. Henkel J.R., Popovich J.L., Gibson G.A., Watkins S.C., Weisz O.A.// Selective Perturbation of Early Endosome and/or trans-Golgi Network pH but Not Lysosome pH by Dose-dependent Expression of Influenza M2 Protein.// J.Biol.Chem. 1999. V.274.P.9854-9860.

7. Portela A., Digard P.// The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to vims replication.// Journal of General Virology. , 2002. V.83.P.723-734.

8. Lamb R.A., Choppin P.W.// The Gene Structure and Replication of Influenza-Virus.//Annual Review of Biochemistry. 1983. V.52.P.467-506.

9. Murti K.G., Webster R.G., Jones I.M.//Localization of RNA polymerases on influenza viral ribonucleoproteins by immunogold labeling.// Virology. 1988. V.164.N 2. P.562-566.

10. Жданов В.МУ/ Атлас вирусной цитопатологии . Москва Медицина, 1975

11. Blough Н.А., Merlie J.P.// The lipids of incomplete influenza virus.// Virology. 1970. V.40.N 3. P.685-692.

12. Klenk H.D., Rott R., Becht H.// On the structure of the influenza virus envelope.//Virology. 1972. V.47.N 3. P.579-591.

13. RuigrokR.W.H.//PhD thesis State University of Leiden, 1985.

14. Brassard D.L., Leser G.P., Lamb R.A.//Influenza В virus NB glycoprotein is a component of the virion.// Virology. 1996. V.220.N 2. P.350-360.

15. Fujiyoshi Y., Kume N.P., Sakata K., Sato S.В .//Fine-Structure of Influenza-A Virus Observed by Electron Cryomicroscopy.// Embo Journal. 1994. V.13.N 2. P.318-326.

16. Booy F.P., Ruigrok R.W.H., van Bruggen E.F.J.//// J.Mol.Biol. 1985. V.184.N 4. P.667-676.

17. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H.// Structure of the Ribonucleoprotein of Influenza Virus.// J.Virol. 1972. V.10.P.795-800.

18. Jennings P.A., Finch J.T., Winter G., Robertson J.S.//Does the higher order structure of the influenza virus ribonucleoprotein guide sequence rearrangements in influenza viral RNA?// Cell. 1983. V.34.N 2. P.619-627.

19. Baudin F., Bach C., Cusack S., Ruigrok R.W.H.// Structure of Influenza-Virus Rnp .1. Influenza-Virus Nucleoprotein Melts Secondary Structure in Panhandle Rna and Exposes the Bases to the Solvent.// Embo Journal. 1994. V.13.N 13. P.3158-3165.

20. Scheiffele P., Roth M.G., Simons K.// Interaction of influenza virus haemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain.// Embo Journal. 1997. V.16.N 18. P.5501-5508.

21. Zhang J., Pekosz A., Lamb R.A.//Influenza virus assembly and lipid raft microdomains: a role for the cytoplasmic tails of the spike glycoproteins.// Journal of Virology. 2000. V.74.N 10. P.4634-4644.

22. Simons K., Ikonen E.// Functional rafts in cell membranes.// Nature. 1997. V.387.N 6633. P.569-572.

23. Simons K., van Meer G.//Lipid sorting in epithelial cells.// Biochemistry. 1988. V.27.P.6197-6202.

24. Renkonen O., Kaarainen L., Simons K., Gahmberg C.J//The lipid class composition of Semliki Forest virus and of plasma membranes of the host cells.// Virology. 1971. V.46.N2. P.318-326.

25. Klenk H.D., Choppin P. W.//Lipids of plasma membranes of monkey and hamster kidney cells and of parainfluenza virions grown in these cells.// Virology. 1969. V.38.N2. P.255-268.

26. McSharry J.J., Wagner R.R.// Lipid Composition of Purified Vesicular Stomatitis Viruses.//J.Virol. 1971. V.7.N 1. P.59-70.

27. Aloia R.C., Tian Hv Jensen F.C// Lipid composition and fluidity of the human immunodeficiency virus envelope and host cell plasma membranes.// P.N.A.S. 1993. V.90.N 11. P.5181-5185.

28. Sarin P.S., Gallo R.C.//Effects of a novel compound (AL 721) on HTLV-III infectivity in vitro.//N.Engl,J. 1985. V.313.N 20. P.1289-1290.

29. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.J.E.//Virus maturation by budding.// Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V.62.N 4. P.l 171-+.

30. Gaedigk-Nitschko K., Schlesinger M.J.// Site-directed mutations in sindbis virus E2 glycoprotein's cytoplasmic domain and the 6K protein lead to similar defects in virus assembly and budding.// Virology. 2008. V.183.N 1. P.206-214.

31. Hunter E.//Macromolecular Interactions in the Assembly of Hiv and Other Retroviruses.// Seminars in Virology. 1994. V.5.N 1. P.71-83.

32. Mebatsion T., Konig M., Conzelmann K.K.//Budding of rabies virus particles in the absence of the spike glycoprotein.// Cell. 1996. V.84.N 6. P.941-951.

33. Nayak D.P.//A look at assembly and morphogenesis of orthomyxo- and paramyxoviruses.// Asm News. 1996. V.62.N 8. P.411-414.

34. Sanderson C.M., Wu H.H., Nayak D.P.// Sendai Virus-M Protein Binds Independently to Either the F-Glycoprotein Or the Hn-Glycoprotein In-Vivo.// Journal of Virology. 1994. V.68.N 1. P.69-76.

35. Schnell M.J., Buonocore L., Boritz E., Ghosh H.P., Chernish R, Rose J.K.// Requirement for a non-specific glycoprotein cytoplasmic domain sequence to drive efficient budding of vesicular stomatitis virus.// Embo Journal. 1998. V.17.N 5. P.1289-1296.

36. Suomalainen M., Liljestrom P., Garoff H.// Spike Protein-Nucleocapsid Interactions Drive the Budding of Alphaviruses.// Journal of Virology. 1992. V.66.N 8. P.4737-4747.

37. Solon J., Gareil O., Bassereau P., Gaudin Y.//Membrane deformations induced by the matrix protein of vesicular stomatitis virus in a minimal system.// Journal of General Virology. 2005. V.86.P.3357-3363.

38. Shnyrova A., Ayllon J., Villar E., Zimmerberg J., Frolov V.A.//Reconstruction of membrane budding by viral matrix protein.// Biophysical Journal. 2007. P.427A-428A.

39. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A., Portela A.//Influenza Virus Matrix Protein Is the Major Driving Force in Virus Budding.// J.Virol. 2000. V.74.N 24. P. 11538-11547.

40. Jayakar H.R., Murti K.GV Whitt M.A.//Mutations in the PPPY motif of vesicular stomatitis virus matrix protein reduce virus budding by inhibiting a late step in virion release.// Journal of Virology. 2000. V.74.N 21. P.9818-9827.

41. Chen B.J., Leser G.P., Morita Ev Lamb R.A.//Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles.// Journal of Virology. 2007. V.81.N 13. P.7111-7123.

42. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre AM Reverse genetics studies on the filamentous morphology of influenza A virus.// Journal of General Virology. 2003. V.84.P.517-527.

43. Elleman C.J., Barclay W.S.//The Ml matrix protein controls the filamentous phenotype of influenza A virus.//Virology. 2004. V.321.N 1. P. 144-153.

44. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre A.//The morphology and composition of influenza A virus particles are not affected by low levels of Ml and M2 proteins in infected cells.// Journal of Virology. 2005. V.79.N 12. P.7926-7932.

45. Jin H., Leser G.P., Zhang J., Lamb R.A.//Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape.// Embo Journal. 1997. V.16.N 6. P.1236-1247.

46. Ruigrok R.W.H., Barge A., Durrer P., Brunner J., Ma Kv Whittaker G.R.// Membrane interaction of influenza virus Ml protein.// Virology. 2000. V.267.N 2. P.289-298.

47. Zhirnov O.P.// Solubilization of Matrix Protein Ml/M from Virions Occurs at Different Ph for Orthomyxoviruses and Paramyxoviruses.// Virology. 1990. V.176.N 1. P.274-279.

48. Roberts P.C., Lamb R.A., Compans R.W.//The Ml and M2 proteins of influenza A virus are important determinants in filamentous particle formation.// Virology. 1998. V.240.N 1. P. 127-137.

49. Antonny B // Membrane deformation by protein coats.// Current Opinion in Cell Biology. 2006. V.18.N 4. P.386-394.

50. Kretzschmar E., Bui M., Rose J.K.//Membrane association of influenza virus matrix protein does not require specific hydrophobic domains or the viral glycoproteins.//Virology. 1996. V.220.N 1. P.37-45.

51. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda T., Ishihama A.//Molecular Assembly of Influenza-Virus Association of the Ns2 Protein with Virion Matrix.// Virology. 1993. V.196.N 1. P.249-255.

52. Ye Z., Baylor N.W., Wagner R.R.//Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides.// J.Virol. 1989. V.63.P.3586-3594.

53. Ye Z.P., Pal R., Fox J.W., Wagner R.R.// Functional and antigenic domains of the matrix (Ml) protein of influenza A virus.// J.Virol. 1987. V.61.N 2. P.239-246.

54. Gregoriades A.// Interaction of influenza M protein with viral lipid and phosphatidylcholine vesicles.//J.Virol. 1980. V.36.P.470-479.

55. Gregoriades A., Frangione BJ/ Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion.// J.Virol. 1981. V.40.P.323-328.

56. Chong L.D., Rose J.K./7 Membrane Association of Functional Vesicular Stomatitis-Virus Matrix Protein Invivo.// Journal of Virology. 1993. V.67.N 1. P.407-414.

57. Chong L.D., Rose J.K.//Interactions of Normal and Mutant Vesicular Stomatitis-Virus Matrix Proteins with the Plasma-Membrane and Nucleocapsids.// Journal of Virology. 1994. V.68.N 1. P.441-447.

58. Sha B.D., Luo M J/ Structure of a Afunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml.// Nature Structural Biology. 1997. V.4.N 3. P.239-244.

59. Baudin F., Petit I., Weissenhorn W., Ruigrok R.W.// In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus Ml protein.// Virology. 2001. V.281.N 1. P.102-108.

60. Scianimanico S., Schoehn G., Timmins J., Ruigrok R.H.W., Klenk H.D., Weissenhorn W//Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein.// Embo Journal. 2000. V.19.N 24. P.6732-6741.

61. Harris A., Forouhar F., Qiu S.H., Sha B.D., Luo M.//The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: Ml-Ml protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of Ml.// Virology. 2001. V.289.N 1. P.34-44.

62. Epand R.M.//Proteins and cholesterol-rich domains.// Biochim.Biophys.Acta. 2008. V.1778.N 7-8. P.1576-1582.

63. Shnyrova A.V., Ayllon J., Mikhalyov I.I., Villar E., Zimmerberg J., Frolov

64. V. A J/ Vesicle formation by self-assembly of membrane-bound matrix proteins into a fluidlike budding domain.// Journal of Cell Biology. 2007. V.179.N 4. P.627-633.

65. Saijo S., Kishishita S., Yokoyama S.// Crystal structure of Matrix protein 1 from influenza A virus A/crow/Kyoto/Tl/2004(H5Nl). 2008. RCSB PDB-bank,

66. Ermakov Y.A., Cherny V.V., Sokolov V.S.//Adsorption of beryllium on neutral and charged lipid-membranes.// Biologicheskie Membrany. 1992. V.9.N 2. P.201-213.

67. Ermakov Yu.A., Sokolov V.S.//Boundary potentials of bilayer lipid membranes: methods and interpretations/ZPlanar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications./ /Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova. Elsevier, 2003. P.109-141

68. Соколов B.C., Соколенко E.A., Филинский Д.В., Ермаков Ю.А., Лопина О.Д., Апель Х.-Ю.// Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с №,К,АТР-азой на липидных бислоях.// Биол.мембраны. 2007. V.24.N 4. Р.333-347.

69. Sokolov V.S., Sokolenko Е.А., Filinsky D.V., Ermakov Yu.A., Lopina O.D., Apell H.-J.// Electrostatic potentials created by membrane fragments with Na,K-ATPase adsorbed on lipid membranes.// Eur.Biophys.J. 2007. V.36.N Supplement 1. P.S88-S88.

70. Zhirnov O.P.// Isolation of Matrix Protein-Mi from Influenza-Viruses by Acid-Dependent Extraction with Nonionic Detergent.// Virology. 1992. V. 186.N 1. P.324-330.

71. Соколов B.C., Кузьмин В. Г .//Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока.// Биофизика. 1980. V.25.N 1. Р. 170-172.

72. Mueller P., Rudin D.O., Tien Н.Т., Wescott W. С. //Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.// Nature. 1962. V.194.P.979-980.

73. Tien H. 77/Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice . New York Marcel Dekker, Inc., 1974

74. Nikolelis D.P., Siontorou C.G.// Ammonium ion minisensors form self-assembled bilayer lipid membranes using gramicidin as an ionophore. Modulation of ammonium selectivity by platelet-activating factor.// Anal.Chem.1996. V.68.N 10. P.1735-1741.

75. Cornell B.A., Braach-Maksvytis V.L., King L.G., Osman P.D., Raguse B., Wieczorek L., Pace R.J.// A biosensor that uses ion-channel switches.// Nature.1997. V.387.N 6633. P.580-583.

76. Ivnitski D., Wilkins E., Tien H.T., Otto va A.//Electrochemical biosensor based on supported planar lipid bilayers for fast detection of pathogenic bacteria.// Electrochemistry Communications. 2000. V.2.N 7. P.457-460.

77. Mirsky V.M., Riepl M., Wolfbeis O.S.// Capacitive monitoring of protein immobilization and antigen-antibody reactions on monomolecular alkylthiol films on gold electrodes.// Biosensors & Bioelectronics. 1997. V.12.N 9-10. P.977-989.

78. Mirsky V.M., Hirsch T., Piletsky S.A., Wolfbeis O.S.//A spreader-bar approach to molecular architecture: formation of stable artificial chemoreceptors.// Angew.Chem., Int.Ed. 1999. V.38.N 8. P. 1108-1110.

79. Hirsch T., Zharnikov M., Shaporenko A., Stahl J., Weiss D., Wolfbeis O.S., Mirsky V.M.// Size-controlled electrochemical synthesis of metal nanoparticles on monomolecular templates.// Angew.Chem.Int.Ed Engl. 2005. V.44.N 41.1. P.6775-6778.

80. Boxer S.GJ/Molecular transport and organization in supported lipid membranes.// Current Opinion in Chemical Biology. 2000. V.4.N 6. P.704-709.

81. Welford К.// Surface-Plasmon Polaritons and Their Uses.// Optical and Quantum Electronics. 1991. V.23.N 1. P. 1-27.

82. Jung L.S., Campbell C.T., Chinowsky T.M., Mar M.N., Sinclair S.Y.// Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films.// Langmuir. 1998. V.14.N 5636. P.5648.

83. Butt H.J,, Cappella В., Kappl M//Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.// Surface Science Reports. 2005. V.59.N 1-6. P. 1-152.

84. Egawa H., Furusawa К.// Liposome adhesion on mica surface studied by atomic force microscopy.// Langmuir. 1999. V.15.N 5. P.1660-1666.

85. Ермаков Ю.А., Февралева И.С., Атуллаханов Р.И.//Влияние поликатионов на граничные потенциалы бислойных липидных мембран.// Биол.мембраны. 1985. V.2.N 11. Р.1094-1100.I

86. Финогенова О.А., Филинский Д.В., Ермаков Ю.А.//Электростатические эффекты при адсорбции и десорбции полилизинов на поверхности липидных мембран разного состава.// Биол.мембраны. 2008. V.25.N 3. Р.230-238.

87. Gouy МУ/ Sur la constitution de la charge electrique a la surface d'un electrolyte.//J.Phys.(Paris). 1910. V.9.P.457-468.

88. Chapman D.LJ/A contribution to the theory of electrocapillarity.// Philos.Mag. 1913. V.25.P.475-481.

89. Stern ОУ/The theory of the electrolytic double-layer.// Z.Elektrochem. 1924. V.30.P.508-516.

90. Соколов B.C., Черный B.B., Абидор И.Г.//Измерение поверхностного заряда бислойных липидных мембран.// Доклады АН СССР. 1980. V.251.P.236-239.

91. Stryer Z./У Biochemistry /Ed. Freeman. NY Freeman, 1988 1089 P.

92. Wrigley N.G.// Electron microscopy of influenza virus.// Br.Med.Bull. 1979. V.35.N 1. P.35-38.

93. Voros J.//The density and refractive index of adsorbing protein layers.// Biophys.J. 2004. V.87.N 1. P.553-561.

94. Егоров A.M., Осипов А.П.// Теория и практика иммуноферментного анализа . Москва Высшая школа, 1991

95. Choi E.J., Dimitriadis Е.КУ/Cytochrome с adsorption to supported, anionic lipid bilayers studied via atomic force microscopy.// Biophys.J. 2004. V.87.N 5. P.3234-3241.

96. Mueller H., Butt H.J., Bamberg E.//Force Measurements on Myelin Basic Protein Adsorbed to Mica and Lipid Bilayer Surfaces Done with the Atomic Force Microscope.//Biophys.J. 1999. V.76.P. 1072-1079.

97. Mueller H., Butt H.J., Bamberg E.//Adsorption of membrane-associated proteins to lipid bilayers studied with an atomic force microscope: Myelin basic protein and cytochrome с.// Journal of Physical Chemistry B. 2000. V.104.N 18. P.4552-4559.

98. Князев Д.Г., Радюхин В.А., Соколов B.C.//Изучение межмолекулярных взаимодействий белков Ml вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля.// Биол.мембраны. 2008. V.25.N 6. Р.491-500.