Компьютерное моделирование нано-био-селективных полимерных систем на основе гетерофункциональных полиэлектролитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

00501857У

З Га правах.

ЦВЕТКОВ Владимир Борисович

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО-БИО-СЕЛЕКТИВНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ГЕТЕРОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

„ о \ г -з 7П17 1 і .-НІГ

Москва-2012

005018579

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук, Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В. II. Ореховича Российской академии медицинских наук и Исследовательском центре биомодуляторов и лекарственных соединений Научно-инновационного фонда Здоровья.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук Сербии Александр Владимирович

доктор биологических наук Веселовский Александр Владимирович

докгор физико-математических наук Кудрявцев Ярослав Викторович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук, заведующий лабораторией

кандидат химических наук Январев Дмитрий Васильевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда Российской академии наук, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элемеотоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук

Защита диссертации состоится « 26 » апреля 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.234.01 в ИНХС РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинский проспект, 29, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИНХС РАН. Автореферат разослан « 26 » марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сорокина Е.Ю.

Общая характеристика работы

Актуальность. Фундаментальная роль высокомолекулярных соединений (ВМС) в организации живых систем определяет ключевое значение химии ВМС в решении многих актуальных проблем медицины. Так, поиск лекарственных средств на уровне только низкомолекулярных соединений (НМС) вступает в объективное несоответствие с тем обстоятельством, что в большинстве случаев мишенями лекарственной терапии являются белки - биологические полимеры, склонные к самоорганизации в нано объекты. "Малая молекула" НМС способна к контакту лишь с локальным участком белковой (нано) мишени, оставляя преобладающую часть макромолекулы свободной от воздействия. Поэтому в результате мутаций болезнетворных микроорганизмов их белковые компоненты быстро выходят из-под лекарственного контроля. Это становится критически актуальной проблемой в случае заболеваний, вызываемых инфекционными агентами повышенной мутационной изменчивости. К их числу относится вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - возбудитель заболевания СПИД. В этих случаях традиционные НМС-лекарства, а также вакцины, становятся малоэффективными, и возникает острая необходимость создания лекарств нового поколения - на уровне ВМС, адекватно-соразмерных белковым мишеням и искусственно "программируемых" на многоточечную избирательную блокаду таких мишеней. Анализ предшествовавших исследований в этой области позволяет выделить синтетические полиэлектролиты на основе гете-рофункционально модифицированных производных чередующихся сополимеров малеиново-го ангидрида, среди сотен опытных образцов которых выявлены высокоактивные ингибиторы репродукции ВИЧ. Их биологические испытания на экспериментальных моделях инфицирования клеток (in vitro) показали, что блокируется ранний этап проникновения вируса в клетку, предположительно, - слияние (фузия) вирусной оболочки с клеточной мембраной. Однако эксперимент in vitro не дает четкого понимания молекулярных механизмов блокады, что делает актуальным молекулярное моделирование взаимодействий синтетических полимеров с белковыми медиаторами фузии в вычислительном эксперименте (in silico).

Для определения возможных мест связывания лекарства с мишенью широко используется докинг. При этом гибкость структуры лиганда моделируется либо множеством жестких конформаций, либо одной конформацией, которая в процессе докинга подвергается изменениям. Однако в реальном времени вычислительного эксперимента оба подхода практически не применимы к макромолекуле как единому целому в силу ее огромной "конформа-ционной ёмкости"*. Поэтому не менее актуальной являлась задача выработки стратегии рациональной фрагментации моделей макромолекул для реализации докинга и анализа его результатов в целях исследования механизмов взаимодействий полимеров с мишенью.

* количество конформеров молекулы НМС может достигать 10"-103, ал-мерных ВМС > КГ" - 10"'".

Цель работы - исследование методами компьютерного моделирования потенциальных механизмов блокирующего воздействия гетерофункционально модифицированных анионных полиэлектролитов в ряду производных сополимеров малеинового ангидрида на белковые (нано) медиаторы слияния оболочки ВИЧ с клеточной мембраной.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ химической организации природных полимерных объектов белковой природы, опосредующих слияние вирус - клетка, в качестве потенциальных мишеней воздействия синтетических полиэлектролитов анионного типа.

2. Выработать алгоритм моделирования взаимодействий белковых мишеней с синтетическими полимерами (гетерогенно модифицированными сополимерами малеиновой кислоты) в рамках программных инструментов компьютерного моделирования методами до-кинга и молекулярной динамики.

3. Получить данные о местах локализации, химической природе и уровнях энергии межмолекулярных контактов структурных компонент исследуемых синтетических полимеров с белковой мишенью в вычислительном эксперименте докинга и дать интерпретацию потенциальных молекулярных механизмов блокады вирусной фузии.

4. Провести выборочное тестирование молекулярных моделей, приближенных к масштабам материальных цепей исследуемых полимеров, в вычислительном эксперименте молекулярной динамики. Сравнить результаты молекулярной динамики с результатами докинга. Оценить возможности модуляции поведения полимерного остова при варьировании его мономерного состава, и внедрении в цепь центров псевдоживой полимеризации.

5. Выполнить сравнительный анализ результатов вычислительного (in silico) эксперимента в сопоставлении с данными биологических испытаний (in vitro) опытных образцов реальных полимеров. Сформулировать основы и перспективы направленного синтеза ингибиторов ВИЧ повышенной эффективности на этапе блокады вирусной фузии.

Научная новизна. Впервые методами докинга и молекулярной динамики выполнено компьютерное моделирование синтетических анион- и алицикл-модифицированных чередующихся сополимеров малеиновой кислоты в качестве агентов блокады биополимерных (нано) медиаторов слияния оболочки ВИЧ с плазматической мембраной клетки человека.

Предложен и реализован 7-уровневый алгоритм моделирования по принципу последовательных (пошаговых) приближений от частных компонент химической структуры полимеров к целостным полимерным цепям, что сделало возможным применение процедуры докинга для более адекватного моделирования полимер-полимерных взаимодействий.

Впервые сформулированы параметры «программирования» химической структуры макромолекул на эффективную блокаду триспирального (NHR)3 (нано) комплекса белков

щэ41 вирусной оболочки - ключевого инициатора слияния ВИЧ с клеткой. Показана возможность «переключения» способа блокирующего воздействия полимера на мишень с «аксиального» на более эффективный «опоясывающий» или «комбинированный».

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для проектирования и направленного синтеза новых лекарственных соединений против СПИДа и родственных заболеваний. Практическая значимость результатов обоснована корреляцией данных вычислительного экспериментов с данными биологических испытаний.

Разработанные и апробированные подходы к моделированию исследованных рядов гетерофункциональных полиэлектролитов представляют практическую ценность для развития методологии компьютерного моделирования применительно к специфике синтетических полимеров и их взаимодействий с биополимерными (нано) объектами на базе программных инструментов докинга и молекулярной динамики.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования: выборе направления, постановке задач, планировании и проведении экспериментов, обработке полученных данных, обсуждении результатов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: по противовирусным исследованиям (София, Болгария, 2011), но иерархически структурированным полимерам (Гаргнано Лаго ди Гарда, Италия, 2010), по биоинформатике (Ы1АГО - 15ТС, Москва, 2010, 2011), "Пластмассы со специальными свойствами" (Санкт-Петербург, 2011); международной школе "Наноматериалы и нанотех-нологии в живых системах. Безопасность и наномедицина" (Московская область, пансионат «Заря», 2011), 19-м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), европейском полимерном конгрессе (Грац, Австрия, 2009; Гранада, Испания, 2011).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 14 печатных работах, из них 5 публикаций в рецензируемых журналах и 9 - в сборниках тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов и их обсуждения (глава 2), экспериментальной части (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы (205 наименований). Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 15 таблиц и 35 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 содержит анализ литературных данных о биополимерных медиаторах начальных этапов проникновения ВИЧ в клетки человека, которые суммированы на рис. 1.

А Б В

Рис. 1. Биополимерные медиаторы проникновения ВИЧ-1 в клетки человека.

А - Связывание и удаление гликопротеинов ^р120]3 оболочки вируса с помощью рецепторов клетки Сй4 иССКБили ССЙ4 приводит к активации трех трансмембранных белков gp41, инициирующих фузию:

Б - N-окончания (FP)3 трех молекул gp41 заякориваются в липидный матрикс мембраны клетки, а С- хвостовая часть остается связанной с вирусом; a-спиральные регионы NHR полимерных цепей gp413 формируют тример (NHR)3, к которому устремляются регионы CHR;

В - образование шесгиспирального комплекса за счет сближение и самоскручивание 3 CHR + (NHR)3 увлекает за собой поверхности вирусной и клеточной мембран навстречу друг другу, инициируя их слияние; Г-модель комплекса [(NHR)3+3CHR] - трехспиральной сердцевины (NHR)3 и антипараллельно агрегированных на ее поверхности еще трех спиралей CHR.

Ключевым моментом инициации слияния является реакция формирования комплекса: (NHR)j + 3 CHR ~> [(NHR)3+3CHR] с участием а-спиралей N-концевых (NHR) и С-концевых (CHR) "регионов повторяющихся гептад" трех белковых молекул gp41 вируса (рис.1). Предотвращение этой реакции посредством блокады сердцевины (NHR)3, либо CHR, от контактов друг с другом становится одним из лидирующих направлений поиска новых ингибиторов ВИЧ-инфекции. Большинство соответствующих разработок посвящено низкомолекулярным соединениям, для изучения взаимодействий которых с белковой мишенью широко применяется компьютерное моделирование методами докинга. С другой стороны, высокий потенциал синтетических ВМС в качестве эффективных ингибиторов начальных этапов проникновения ВИЧ в клетки (с индексом селективности до нескольких тысяч) был обнаружен в ряду алицикл-модифицированных сополимеров малеиновой кислоты*1. Биологические исследования in vitro показали замедление адсорбции вируса и возможность практически полной блокады пост-адсорбционных процессов - предположительно фузии. Однако эти данные не были дополнены моделированием in si/ico, которое могло бы прояснить молекулярные механизмы наблюдаемых эффектов.

Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Предмет и объекты исследования

Основным предметом исследования были взаимодействия синтетических полимеров

* Разработки ИНХС РАН и НИФ Здоровья в сотрудничестве со специалистами НИИ Вирусологии РАМН (Москва), ГНЦ ВБ "Вектор" (Кольцово), Rega Institute (Belgium), NICHD NIH (USA).

4

ряда I (рис. 2) с полимерными нано-объектами белковой природы (рис. 1) в поиске молекулярных механизмов ВИЧ-блокирующих эффектов, зарегистрированных in vitro.

BU/ С-^^сн-риД

I Г1 I J<

I 1

AU- -FU- = -cvVr. Vv • fV' Л '~СНгСГ о

la (FU = FUa) \J \ / CY lb (FU = FUb) / \ \_/

id (FU = FUCJ) erY ^Ua FUb FUc Fud FUe

le (FU = FUe) R

I I [ I J —' -(CH2)m- . -CH— •

Y_ = co-.coo-у-, СОШ-У- -y-= |_(CH2)m_NH_, _(CH2V-0—

M = H / Na

-Q = -ом;: -Ом; -sö2

KK CK ЦП ЦГ НБ НБ" НБ° ДНБ АД

Кислотно-анионные > 80% Алициклические (Ali) < 20%

Рис. 2. Чередующиеся сополимеры малеинового ангидрида (I):

с дивиниловым эфиром 2:1 (1а), фураном 1:1 (lb), 2,3-дигидро-(Ic) и 2,5-дигидрофураном (Id), а также с N-винилпирролидоном (1е), гетерогенно модифицированные в боковых позициях через мос-тиковые группировки (Y) анионогенными: карбокси- (КК) и(или) сульфокислотными (CK) группами, и(или) гидрофобно-алициклическими структурами: циклопентана (ЦП), циклогексана (ЦГ), норборна-на (НБ) - бицикло[2.2.1]гептана, норборнан-2-ена (НБ11), 2,3-эпоксинорборнана (НБ°), динорборнена (ДНБ) - тетрацикло[4.4.0.125171О]додецена, адамантана (АД) - трицикло[3.3.1.13'7]децена. Соотношение различных YZ варьируется в процессе синтеза, обеспечивая растворимость в водных (био-) средах при избытке кислотно-ионогенных групп (КК+СК > 80%) и влияя на анти-ВИЧ активность.

2.1. Моделирование и анализ белковых структур (NHR)3 и CHR в качестве мишеней.

Ранее (NHR)j и CHR рассматривались как мишени локальных воздействий "малых" молекул НМС и полипептидов без анализа целостного объекта и его компонентов в качестве потенциальной мишени для блокады синтетическими полиэлектролитами анионного типа I. Схема регионов NHR и CHR и их аминокислотных последовательностей показаны на рис. 3. Каждая из трех идентичных спиралей NHR имеет избыток остатков основных аминокислот (Arg542"43'557'579, Lys574 и His564) по отношению к кислотным (Glu560). Это определяет избыток положительного заряда при ионизации в водно-физиологической среде до +5 на одну спираль и +15 - на комплекс (NHR)3. Напротив, участки CHR имеют избыток кислотных остатков (О1ц«30,634,647,648,654,657,659,662^ ^632,66^ ^ отшшению R основным (Arg63\ LyS«5'665, His643)

и способны аккумулировать отрицательный заряд до - 6 на каждую спираль CHR. Следовательно, полипептидные регионы NHR и CHR представляют собой, соответственно, поли-катионный и -анионный блоки, ионно комплементарные для агрегации в комплекс [(NHR)3+3CHR],

Аналогично CHR, синтетические сополимеры I (рис.2.) также имеют кислотные цепочки, которые ионизируются с накоплением отрицательного заряда, а значит, кулоновские силы будут притягивать спирали NHR и отталкивать спирали CHR. Следовательно, полианионная природа полимеров I соответствует их избирательной афинности к (NHR)3. С точки

зрения гидрофильно-гидрофобного баланса состав ЫНЯ существенно смещен в сторону гидрофобных аминокислот (48%) по сравнению с СНЯ (28%). В этом плане водорастворимые молекулы I (при малых степенях модификации алициклами) также подобны СНИ, а введение гидрофобных алициклов в позиции Ъ предполагает лишь усиление избирательной тропности к (1ЧН11)з. Таким-образом, в отношении белковых объектов (ЫНЩз/СНЯ исследуемые синтетические полимеры группы I следует рассматривать, как нацеленные предпочтительно на (МН11)з - подобно вирусным СНИ, но в конкуренции с ними.

Энергия связывания по данным AutoDock4' :

ТМ . заякоренный в мембрану (оболочку) вируса

Leu5'6 Gin'"

Thr583

FP , N-конец. заякоренный в клеточную мембрану

Рис. 3. Блок-схема агрегации и аминокислотная структура медиаторов слияния вирус - клетка

А - схема агрегации региона CHR с (NHR)3 (условно показан CHR только одной из "грех молекул gp41). Энергия связывания CHR с (NHR)3 была расчитана в работах Ramirez С.G.G. (2007) и Gaston F. (2008). Б - схематический вид (NHR)3 со стороны клетки (N-конца gp41). В таблице даны аминокислотные остатки спирально повторяющихся позиций a-g: позиции and стыкуют спирали между собой; Ь, с, е, f, g - формируют поверхность контакта с внешней средой.

Ионогенные остатки отмечены соответственно + или - (А и Б); гидрофобные выделены черным (А).

Пространственные габариты мишени (5,1 х 2.5 нм) соответствуют масштабам классического нанообъекта, рис. 4. Симметрия тримера однонаправленных а-спиралей воспроизводит геометрию и характеристики поверхности (1МШ1)з по мере поворота вокруг оси на каждые 120°. На поверхности мишени имеются три яруса (я1-яШ, рис. 4Б) впадин, образуемых между соседними спиралями. На каждом ярусе впадины трехкратно повторяются вокруг мишени (рис. 4Б). На границе наиболее крупных впадин (ярус я!) расположена гидро-

фильная и ионизирующаяся до положительного заряда аминогруппа остатка лизина (Lys574), а рядом - амидные окончания глицина (Gin563, Gin5" и Gin577) - гидрофильные доноры и акцепторы водородных связей. С противоположной стороны - ряд гидрофобных углеводородов боковых радикалов остатков Leu565, Leu568, Leu581 и индола остатка Тгр571 (рис. 4Б). Эти впадины (в диапазоне аминокислот с 565 по 581 а-спиралей (NHR)j), обозначаемые в литературе, как «гидрофобные карманы», играют решающую роль в состыковке с CHR (в зоне избытка кислотных и гидрофобных остатков 628-634, рис.ЗА).

Рис. 4. Пространственная организация мишени - (МШ)3

А - ленточная схема: вид продольный и торцевой (со стороны С-конца). Катионогенные аминокислоты выделены знаком +. Б - поверхность с градацией глубины ее впадин. Показано окружение горловины одной из триплета наиболее глубоких впадин - "карманов"; менее выраженные впадины также выделены пунктиром, а все три яруса триплетов указанных углублений обозначены я1, яП и яШ.

Рассмотренная ЗО модель (№Ж)з, построенная на основании базы данных РБВ 1А1К, ранее применялась в поиске ингибиторов слияния ВИЧ с клеткой с помощью докинга НМС в локальные зоны "карманов", тогда как потенциал блокирующих воздействий синтетических полимеров оставался практически не исследованным. Фокусировка внимания только на "карманах" ограничивала целостность восприятия наномишени, оставляя вне поля зрения возможности кооперативных контактов с ВМС на всех трех ярусах я1, я11 и »111 (рис. 4Б). 2.2. Моделирование сополимеров I и их взаимодействий с (!УНЯ)} методами докинга

Современные вычислительные мощности и программы не позволяют моделировать макромолекулу ВМС как целостный лиганд в процедуре докинга в силу огромной конформационной емкости*. Поэтому в данной работе предложен и реализован специальный

7

алгоритм пошагового моделирования полимеров (на примере ряда I, рис.2) для анализа взаимодействий с белковой мишенью. Этап 1 - докинг отдельных фрагментов остова макромолекулы (Ви = Аи и ТО), повторяющихся вдоль цепи, и ее боковых групп (вС), состоящих из функционально активных структур (Т) и мостиков (У), соединяющих Z с ЕШ. На этом этапе определяются вероятные сайты посадки на мишень и оцениваются соответствующие энергии связывания с мишенью всех структурных компонент полимера. Этап 2 заключается в пошаговой сборке фрагментов 1 -го этапа в укрупненные модели и их исследование в процедуре гибкого докинга. Каждый шаг этого этапа дает новую информацию: каким образом проявляются вклады различных структурных компонентов в позиционирование, ориентацию и энергию связывания с мишенью по мере их кооперации в полимерные «мотивы», и как эта кооперация модулирует взаимодействия с мишенью (полимер-кооперативные эффекты). Степень полимеризации модели (т) в сравнении с таковой для материальной цепи (л) ограничена (т < п) расчетными возможностями докинга в реальном времени вычислительного эксперимента. Этап 3 - экстраполяция результатов докинга к масштабу материальных цепей (/и->я). В данной работе выполнено дифференцированное моделирование компонент структур ряда I с их пошаговой сборкой по семи уровням модельных приближений (М1- М7): см., например, рис.5.

М5 Мб _

11—сн2 н->с—сн—сн-н "С? 1° 1 | он он М ¿0 1 | он он

1 1 он он . ¿н он п

Г'"

1Я

М7

М5- МЗМ4-М6 -МЗМ4-М5

М5- МЗМ5 М6-МЗ-М6

мз- М5-МЗ МЗ-М6-МЗ

М5-МЗ М6-МЗ

М4

н-сн—сн-н I I

со со

но ¿н

н н-сн2 Н2С-Н

со со со со ¿н он Ан он

н н

М4,

>я

М4ф

М1

о = СК, ЦП, цг.

НБ, НЕ11, НБ°,

АД, ДНБ, ...

М4,

ФДМ

мз

н н н—сн, н2с-

со со со со

¿н I ¿н М2 М2

М2

н -

н н -- ын

СЬЬ -'СНг)„, (СН2)

*М1 М1 М1

Рис.5. Уровни моделирования сополимеров на примере ряда 1а.

М1 = гн - концевые фрагменты боковых групп; М2 = М1 + последовательность атомов мостика в сторону остова = 2УН; МЗ = М2 + единичный фрагмент полимерного остова - НСН(Уг)-СН(У2)Н, или НХН; М4 = единичный фрагмент остова не модифицированный = МЗ (где -Уг = -СОКК, 100%); М5 = полное звено полимерного остова СН2(У2)СН(У2)ХН, не модифицированное (-Уг = -СОКК, 100%); Мб = [М5]„, п = 2, 3, 4, ... — цепи не модифицированных звеньев остова (олигомеры); М? = гетерогенно модифицированные олигомерные цепи с различными комбинациями боковых групп -\2.

Результаты допинга моделей 1а

Концевые фрагменты боковых групп Н2 (модели М1) без учета мостиков и полимерного остова. Алициклы широко распределяются по поверхности мишени (рис. 6А-Б), концентрируясь преимущественно в области гидрофобных сайтов трех основных "карманов" яруса я1, и частично - в зонах менее выраженных углублений ярусов я11 и яШ. Минимум свободной энергии достигается в зоне "кармана" вблизи гидрофобного Тгр571, а его амплитуда растет в последовательности (ккал/моль)*2: ДНБ (-18.74) > АД (-16.58) ~ НБ° (16.80) > НБ (-15.09) -НБ11 (-15.13), > ЦГ (-13.84) > ЦП (-12.66).

Рис. 6. Результаты докинга моделей М1 и М2 на поверхность мишени — (NHR)3: А — лиганды ряда М1, где Z = все вариации алициклов (124 результата докинга); Б — производные от М1 модели М2 = ZYH, где -У- = -(CH2V3NHCO- (1342 результата докинга). В — из числа результатов Б показаны по 10 наилучших по энергии связывания для каждого типа алициклов;

Боковые группы с фрагментами мостиков HYZ (модели М2) позволяют оценить вклад мостиков Y, соединяющих Z с остовом полимера (но без учета самого остова). В целом мостики Y не нарушают основную тенденцию позиционирования алициклических Z по трем ярусам триплетов углублений мишени (рис.бБ, В). Метиленовые -СНо- фрагменты Y служат в основном "шарнирами гибкости" мостика, незначительно влияя на энергию связывания, тогда как более жесткий амидный фрагмент -NHCO- может вносить существенный вклад в энергию кулоновских взаимодействий. Основную роль играет значительный отрицательный заряд атома кислорода, индуцирующий взаимодействия с локальными положительными зарядами у атомов азота мишени, например, в зоне "кармана" - остатков Lys574, Gln563'S67'577, Arg579. Регистрируемые вычислительным алгоритмом докинга, такие контакты с участием атомов водорода позволяют формировать водородные связи. С учетом сольватации энергии связывания М2 в зоне "кармана" на примере -Y- = -СH2NHCO- показаны в табл. 1.

Здесь и далее значения свободной энергии даны соответственно оценочной функции ММ (И1ЪА - см. главу 3

9

Тип Z в составе М2 НБ НБ11 НБи ДНБ АД

Энергия, ккал/моль* экзо эндо

Emmgb/sa (А) - 22.0 (-6.9) -20.9 (-5.8) 20.2(-5.1) -22.6(-5.8) - 23.2(-4.5) -21.4(-4,8)

в т.ч. ВВС -22.5 -22.3 -20.6 -23.8 -23.7 -21.4

К+Р 3.9 4.9 3.8 1.6 4.3 3.5

ПДР -3.4 -3.4 -3.4 -3.5 -3.7 -3.5

*Емм ев/SA ~ п0 оценочной функции MM GB/SA (глава 3). а в скобках - уменьшение энергии по сравнению с таковой для моделей Ml. Ниже приведены парциальные вклады в Emmgb/sa' ВВС - ван-дер-ваалъсовых сил, К+Р - кулоновскш сил с учетом влияния растворителя, ПДР - поверхности, доступной растворителю

Замена в моделях М2 алициклических окончаний Z на сульфокислотно-анионные (Z = SO3") не меняет общую картину трехъярусного (я1-яШ) распределения М2 по поверхности мишени и локализации наиболее выгодных мест посадки в зоне "карманов", но существенно изменяет приоритеты локальных контактов связывания. Так, в зоне "кармана" в отличие от алициклов группы S03~ концентрируются у катионогенных остатков Lys374 и Arg57'', вытесняя амидные и углеводородные группировки мостиков в полости впадин. Там для NHCO фрагментов остается возможность контакта с амидными окончаниями Gin563,567 '77, а у углеводородных - с гидрофобными Leu565'568'581 и Тгр371. Но в целом при сравнимых мостиках амплитуда минимума энергии связывания сульфокислотных моделей с мишенью на 7-10 ккал/моль ниже, чем алициклических аналогов (показанных в табл. 1).

Карбоксикислотные фрагменты мономерных остатков полимерного остова 1а (модели М4, М5) аналогично сульфокислотным концентрируются преимущественно в зоне карманов вблизи Lys574 или Arg579, и в меньшей степени - в зонах менее выраженных впадин следующих ярусов я11 и яШ - вблизи His564 и Arg'57.

Олигомерные карбоксикислотные цепочки полимера (модели Мб) также перекрывают зоны "карманов" мишени, но распространяются и за их пределы - в основном в продольном направлении (рис.7) — между соседними а-спиралями мишени таким образом, что одна молекула Мб перекрывает один из трех "карманов", а остальные два "кармана" перекрываются двумя другими молекулами Мб. Иными словами, отрицательно заряженные цепочки искусственного полимера ведут себя подобно отрицательно заряженным а-спиралям CHR вируса, ориентируясь вдоль противоионных спиралей (NHRJs.

Рис. 7. Результаты докинга моделей Мб -

не модифицированных карбоксикислотных олигомеров.

Минимум энергии связывания модели в три полных звена достигает - 30.3 ккал/моль Преобладает продольная ориентация -аналогичная ориентации вирусной спирали CHR (рис. 1В и ЗА)

В отличие от алициклических М1 поликислоты Мб способны формировать водородные связи, а в отличие от фрагментов NHCO мостика моделей М2 - еще и ионно-солевые связи с положительно ионизирующимися боковыми группами мишени. Это создает дополнительные точки фиксации полимерных цепей, как в зонах "карманов", так и вдоль спиралей NHR: в последовательности Arg579, Lys574, His564, Arg557 с экстраполяцией к Arg543, Arg542. Расчетные энергии связывания карбоксилатных моделей с мишенью представлены в табл. 2.

Таблица 2. Минимумы энергии связывания с мишенью моделей М4, М5 и Мб

Модель \ Энергия, ккал/моль * ЕмМ GB/SA ВВС .К+Р ПДР

М4 = СН3-М4Я-СН3 -14.2 -15.9 4.5 -2.7

СНз-М4ф-СНз -17.3 -18.5 4.5 -3.2

М5 = СНз-М4„-М4ф-СНз -19.6 -27.5 12.0 -4.1

М4М5 = CH3-M4„-M4»-M4„-CH3 -17.1 -15.7 2.0 -3.4

СНз-М4ф-М4я-М4ф-СНз -20.5 -32.2 16.3 -4.6

М6 = СНз-М4ф-М4я-М4ф-М4я-М4ф-М4я-СНз -30.3 -50.1 26.0 -6.2

*Емм Gilsa - по оценочной функции ММ GB/SA (глава 3), в т. ч. вклады: ВВС - ван-дер-ваальсовых сил, К+Р - куликовских сил с учетом влияния растворителя, ПДР - поверхности, доступной растворителю Отсутствие аддитивного роста энергии соответствует тому, что объединение фрагментов в поличерную цепь ограничивает пространственную свободу каждого отдельного фрагмента в реализации сы>его энергетически оптимального контакта с мишенью. Но цепочечная связка формирует кооперативно-многоточечные контакты с мишенью, аккумулируя итоговую энергию связывания.

На уровне моделей (МЗ и М5) - состыковки фрагментов остова 1а, с боковыми группами Z посредством варьируемых мостиков -У- открываются интересные нюансы возможного антагонизма или кооперации отдельных по расположению и различных по химической природе составных компонентов макромолекул во взаимодействиях с мишенью и друг с другом. Проясняются доминанты локализации и ориентации фрагментов цепи на мишени. Наглядные примеры дает, в частности, детальное рассмотрение взаимодействий в полости "карманов". Наряду с тропностью активно-"якорных" алициклов (Z = НБ, НБ11, АД, ДНБ) к гидрофобным участкам Leu568 и Тгр571, кислотные группы (Z = КК и'CK) устремлены в противоположном направлении - к катионогенным аминогруппе Lys574 (рис. 8) или гуанидиновой группе Arg579. В результате, если звено модифицировано CK, то КК группы вступают с ними в конкуренцию за связывание с катионогенными остатками аминокислот.

Напротив, алициклы не конкурируют с карбоксигруппами, а создают дополнительные точки контактов с остатками гидрофобных аминокислот, например, Leu565,568'581 и Тгр571 в локусе "кармана". При этом химическая структура фрагмента остова, к которому через мостик присоединен атицикл, определяет локальную ориентацию посадки на мишень. В случае присоединения боковой группы по фурановому фрагменту (FU) кислотный компонент локализуется у Lys574, а алицикл ориентируется в сторону Leu568, Трг571 (рис. 8А,В). Если же боковая группа присоединена по янтарно-кислотному фрагменту остова (AU), то алицикл позицию не меняет, а ориентация кислотной компоненты "переключается" на Arg579.

Варьирование длины

мостика -Y- = -(CH2)„NHCO между якорем и остовом в диапазоне п = 0-3, качественно не меняет указанную ориентацию моделей, а наращивание метиленовых вставок приводит лишь к заполнению свободного пространства в пределах той же полости "кармана" (рис.8 В, Г).

Таким образом, позиция прививки боковой якорной группы к конкретному фрагменту остова 1а (фурановому, либо янтарно-кислотному) существенно влияет на ориентацию связки "якорь - мостик - фрагмент остова". При этом анизотропия контакта модели с мишенью согласуется с геометрией "кармана": подходы к Arg579 ограничены локальным сужением полости "кармана", что создает пространственно селективное затруднение для фуранового фрагмента остова, но не для янтарно-кислотного (более компактного и гибкого), рис.9. Однако в полимерной молекуле единичные фрагменты остова интегрированы с соседними фрагментами цепи. Поэтому для понимания влияния якоря и мостика на ориентацию участка полимерной цепи, непосредственно прилегающего к алицикл-модифицированному фрагменту, вышерассмотренные модели были дополнены соседними не модифицированными фрагментами остова - рис.9. Докинг показал, что АД-модифицированный фурановый фрагмент в окружении двух янтарно-кислотных сохраняет свою локализацию вблизи Lys574 (рис. 9А,Б). А аналогично модифицированный янтарно-кислотный фрагмент в окружении двух фурановых утрачивает приоритет локализации у Arg519, перестраиваясь также к Lys574 (сравни рис. 8Б и 9В). То есть, янтарно-кислотный фрагмент теряет преимущества адаптации к узкой горловине "кармана" в сторону Arg579 из-за роста габаритов участка остова с учетом соседних структур. Уточнилось также влияние длины мостика на ориентацию прилегающего участка остова. Модели с укороченным мостом проявили тенденцию к поперечной ориентации по отношению к мишени (рис.9А,В), а с удлиненным мостом - к продольной (рис. 9Б).

Рис. 9. Результаты докинга моделей М4МЗМ4 (2 = АД)

На уровне интегрирующего моделирования М7 достигается максимальное приближение к полимерно-цепочечным участкам макромолекул I с комбинаторным варьированием типа концевых фрагментов Ъ боковых групп (их комбинаций), мостиков -У-, протяженности цепи и расположения вдоль цепи боковых структур -УХ относительно друг друга. Наращивание полимерного остова до трех полных звеньев с одним якорем при фурановом фрагменте центрального звена подтверждает вышеотмеченную тенденцию ориентации в зависимости от длины мостика (рис. 10А- короткий мостик, Б - мостик с тремя метиленовыми вставками).

Однако по мере удаления от центрального фрагмента с якорем концевые фрагменты остова обретают все большую свободу ориентации к мишени. Для достаточно длинных цепей существенным становится наличие более чем одного якоря и дистанция между ними. Наличие якорей в каждом 3-4-м звене соответствует расстояниям между двумя карманами мишени. В этом случае наблюдается не столько продольная, сколько поперечно-опоясывающая ориентация (от кармана к карману), рис. 10В. Дальнейшее увеличение дистанции меиеду якорями приводит к преобладанию продольного расположения - рис. ЮГ.

Таким образом, в отличие от спирально-структурированных полипегтгидных цепочек СНЯ вируса, гибкие цепи полимеров 1а существенно более мобильны в адаптации к поверхности (ШЖ)з в различных направлениях, а "переключение" с продольного способа агрегации с (МНК)з на опоясывающий (более эффективный для блокады фузии) может регулироваться якорями алициклического типа.

MMGB/SA, -34.0 ккал/моль -58.0 ккал/моль -70.6 ккал/моль

ккал/моль

в т.ч. ВВС/К+Р/ПДР

-43.8 /31.6/-6.9 - 59.8/33.7/-7.8 -81.2/33.1 /-9.9 -82.58/21.8/-9.8

Рис. 10. Результаты докинга моделей М7: три полных звена с одним якорем -CONH(CН:)„,-АД при фурановом фрагменте центрального звена - А (ш = 0) и Б (ш = 3); четыре и пять полных звеньев, соответственно, - В и С - с двумя якорями -CONH(CH2)m-Afl при концевых звеньях.

2.3. Моделирование методами молекулярной динамики

Тестирование моделей Мб и М7 более крупноразмерных, чем допускает процедура докинга (п > 10-40), в вычислительных экспериментах молекулярной динами в целом подтвердило роль "карманов" мишени в качестве зон основных контактов с якорными фрагментами сополимеров 1а. Но молекулярная динамика позволила более четко прояснить целостную картину взаимодействий с мишенью моделей, приближенных по размерам к материальным цепям. В частности, на примере "эффективно якорных" Z = АД и ДНБ в составе моделей М7 показана их достаточно высокая аффинность не только к "карманам", но и к соседним ярусам (рис. 4 и 6) триплетов менее выраженных впадин мишени, особенно в соседстве с Arg557. Карбоксильные группы, присутствующие в цепи (>60%) одновременно с якорями, создают систему дополнительной фиксации на поверхности белка за счет полярных, водородных и ионно-солевых связей. В результате даже те контакты алициклов с менее выраженными впадинами, которые в эксперименте докинга на малых моделях (Ml - МЗ) оценивались как энергетически "слабые", в молекулярной динамике укрупненных моделей М7 (п= 10-30) проявляются более стабильно. Локальные отрывы якорей от впадин обратимо восстанавливаются благодаря тому, что в целом полимерная цепь, удерживается вблизи поверхности белка за счет остальных (соседних) якорей, особенно прочно стабилизированных в зонах "карманов". То есть, в молекулярной динамике четко обнаруживается эффект полимер-специфической кооперации многоточечных воздействий на мишень.

Молекулярная динамика показала также критическую роль слишком близкого взаимного расположения якорей (особенно АД и ДНБ) - в каждом 3-м звене и ближе. В этом случае наблюдается их активная самоагрегация во внутримолекулярные кластеры (до трех якорей).

Несмотря на рост габаритов суммарного контакта кластера с гидрофобными зонами мишени, кластеризация экранирует часть поверхности отдельно взятого якоря, сковывает свободу его погружения вглубь впадин, ограничивает подвижность прилегающей полимерной цепи и может препятствовать эффективному опоясыванию мишени.

Моделирование вариаций полимерного остова различного мономерного состава было направлено на оценку гибкости цепи, существенную для адаптации полимера к поверхности мишени. Результаты моделирования представлены в таблице 3

Таблица 3. Расчетные оценки жесткости моделей полимерных цепей

Параметры звена Оценка жесткости*

Полим. остов длина А количество точек гибкости L ■JTifT 7<Л2> ■J<R2 > '¡р /оД 2 усредн. 2 способ 1рс

1а 8,70 3 2,30 3,13 8,19 10,06 18,48

lb 5,78 1 3,48 2,40 7,71 9,14 9,95

1с 5,05 1 1,26 3,20 48,90 147,90 64,41

Id 5,14 1 1,58 2,89 15,27 40,96 55,92

* характеристика и способ расчета различных оценок даны ниже - раздел 3 (экспериментальная часть); L ~ контурная длина полимера в максимально вытянутой конформации, R - радиус гирации.

Разные способы оценки жесткости не дают полной корреляции между собой, но в целом можно выстроить следующий ряд увеличения жесткости цепи: lb - la < Id < Ic.

Оценка возможной модуляции поведения полимерных цепей, синтезированных методом "живой" радикальной полимеризации по механизму обратимой передачи цепи (ОПЦ'). Синтез сополимеров ряда 1а, тестированных in vitro, выполнялся на основе ангидридных предшественников - сополимеров дивинилового эфира с малеиновым ангидридом, получаемых радикальной сополимеризацией в условиях регуляции степени полимеризации с помощью тетрагидрофурана (ТГФ), как агента передачи цепи. Такой путь синтеза приводил к включению в полимерные молекулы концевых фрагментов ТГФ, родственных фрагментам 3,4-YZ^H3aMeineHH0r0 ТГФ в самой цепи (общая формула 1а/тгф):

(П

1а/тгФ

Диапазон контроля гі) = 8-45, MJM„ ~ 1.4

ZY YZ S ZY YZ ZY YZ ZY YZ

Іа/втк

Диапазон контроля п = 2р- 8-40, MJM„ = 1.1-1.2

П)

Недавно успешно апробирована новая методика - "живой" радикальной полимеризации с применением в качестве агента ОПЦ дибензилтритиокарбоната (БТК). Это обеспечило более эффективный контроль степени полимеризации, но сам полиангидрид и продукты его полимераналогичных превращений Іа/втк включают в состав молекулы остатки БТК: тритио-карбонатный (по центру цепи) и бензильные (на концах цепи). В этой связи представлялось важным оценить возможные эффекты модуляции поведения молекул 1а/Бтк за счет указан-

ных микроструктурных изменений. Вычислительный эксперимент молекулярной динамики моделей Ph-CH2-M6/7-S-CS-S-M6/7-CH2-Ph действительно выявил специфические особенности. Во-первых, -S-CS-S- группировка, расположенная по центру цепи, фиксирует локальный изгиб, придавая полимерной молекуле характер "диблочного макрохелата". При этом сама тритиокарбонатная группировка проявляет тенденцию к агрегации в локусе Arg557, Ala561 мишени. А во-вторых, концевые фенильные группы оказались активными в агрегации с ароматическими кольцами боковых групп Трг571. Таким образом, моделирование прогнозирует возможность модуляции биологического поведения ВМС ряда 1а в зависимости от микроструктурных различий, обусловленных методом их синтеза. Полученный результат указывает на необходимость дополнительных биологических испытаний.

2.4. Сравнительный анализ результатов вычислительного (in silico) и биологического

(in vitro) экспериментов, выводы и перспективы.

Наиболее полно в тестах in vitro были исследованы сополимеры ряда Ja. Результаты "структура - активность" обобщены нами в сообщении [1] и представлены в табл. 4. Соотнося данные in vitro и in silico с химической организацией рассматриваемых полимеров в ряду 1а (рис.2, 1а), следует выделить две группы структурных факторов: неизменный по химической структуре полимерный остов (константная часть) и варьируемые по структуре, составу и положению вдоль цепи комбинации боковых групп -YZ (вариабельная часть). В этой связи решающие факторы изменения активности in vitro от образца к образцу следует искать в вариабельной части структурных факторов, исследуемых уже на начальных уровнях моделирования - Ml и М2. Анти-ВИЧ эффективность полимерных веществ в сопоставлении с энергией связывания моделей М2 показана в табл. 5. Анализ данных биологического и вычислительного экспериментов обнаруживает высокую корреляцию между ними при использовании различных оценочных функций: PMF-Score, Dockó, D-Score, G-Score, MM GB/SA и Chem-Score (последняя дает наилучшую корреляцию*3). Наращивание моделей до уровня М7: СНзМяМфм-МяМфм(-\'г)-МяМфм в целом не меняет вышеприведенную корреляцию. При этом, как in vitro, так и in silico наблюдается следующий ряд относительной эффективности алициклических боковых групп:

ДНБ > АД ~ НБ, НБ», НБ° » ЦГ, ЦП.

Снижение анти-ВИЧ эффекта алицикл-содержащих полимеров при одновременном введении в позиции Z сульфокислот (сравни Ia0+1 с 1а0+,+2, табл. 4) находит свое объяснение в конкуренции алициклических и сульфокислотных структур за близко расположенные сайты связывания. Посадка сульфокислотных групп в районе Lys574 становится фактором

* Вероятно, это связано с тем, что данная функция наиболее полно учитывает не только водородные связи и энтропию вращения, но и липофильные контакты, характерные для гидрофобно-алициклических структур 7.

вытеснения алициклов из зоны кармана.

Таблица 4. ВИЧ-1 ингибирующая эффективность выборки наиболее активных полимеров ряда 1а

¿ Ъ г-у Х-Ъ 1а I 1 1Ь

Группа Состав -YZ в макромолекуле (% от общего числа Z) Анти-ВИЧ эффект (ICsoVMO-5, М"' Штамм

Соединение -YZo = -сокк -YZ, = -CONH-yZi -y-sOj" -YZ2 = -CONH--у-Алицикл -y-Z2 ВИЧ-1 1*1

'а 1 1а0+2 100 0 - 0 5,0 11,2 EVK [П] z [П]

2 3 4 5 92 92 93 92 0 0 0 0 -(СН:):-ЦІ1 -(СН;);-ЦГ -СН(СН3)-НБ -СНт-НБ" экзо 7,5 7,5 7.7 7.8 6,0 >2,9 78,6 51,2 96,5 EVK [П] EVK [П] HIB [D] EVK [П] Z[n]

6 7 8 9 92 92 92 96 0 0 0 0 -CHj-HB" эндо •СНт-НБ0 АД -СНт-АД 7.8 7,7 7.9 5,6 50,7 >38,4 57.5 52.6 103,0 EVK [П] EVK [П] EVK [П] EVK [П] Z[n]

10 11 12 94 93 94 0 0 0 -(СН2)2-АД -(CH2)j-NH-M -(СН2)з-АД 6,5 6,5 5,4 47,0 36,3 32,7 17,0 EVK [П] EVK [П] EVK [П] 899 [Б]

13 1а0+1 93 0 -СНг-ДНБ 7,5 61,1 121,9 EVK [П] Z[n]

14 15-18 1а0+1+2 19-23 24-27 28-31 60 97-»75 89->67 89-»67 90->68 -C6H4-S03" 40 -(CH:):-S03- 3->25 -(CH2)2-S03- 3->25 -(CH2)2-S03" 3->25 -(CH^-SOj" 3->25 -CHj-HB -СНт-НБ" зкзо -СН^АД 0 0 7.7 7.8 7,5 19,0 1,8->26,2 1,6-> 8,7 1,6-» 7,8 5,6-» 2,0 Z[ri] 899 [Б] Z[n] Z[n] zrni

lb" ,„ 100 0 - 0 30,1 EVK fni

НМС- аналог (ремантадин) An" +Н]Ы-СН(СН3)-АД <0,01 899 [Б]

- антивирусный препарат

* Экспериментальное тестирование выполнено: [П] - при участии Н.Г. Перминовой, И.В. Тимофеева и др. на экспериментальной базе ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцова, Новосибирская обл.); [В] - при участии М.Е. Бурштейн в лаборатории проф. А.Г. Букринской на базе НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва!; [01 - в

лаборатории проф. Е. De Clercq, Rega Institute ¡Belgium).

"Нано-биоселективность" исследуемых ВМС, как принципиальное отличие от НМС в реализации блокады вирусов. Анти-ВИЧ активность рассмотренных алициклов проявляется только в полимер-интегрированном состоянии (в данном исследовании - в составе ВМС I), но не на уровне "малых молекул" НМС, например, - АД-содержащего ремантадина (табл.4). Результаты моделирования объясняют этот факт: единичные контакты "один алицикл -мишень" энергетически не достаточно стабильны при физиологических температурах. Более

того, такой моноточечный контакт оставляет не задействованными все остальные "карманы", впадины и иные сайты поверхности мишени (> 90%). Напротив, интеграция нескольких алициклов-"якорей" вдоль гибкой полимерной цепи с дополнительными карбоксилатными лигандами в молекулу ВМС, соразмерную с мишенью, меняет ситуацию кардинально.

Таблица 5. Сравнение результатов in vitro и in silico в выборке варьируемых концевых структур боковых заместителей Za

In vitro*: In silico:

Образец анти-ВИЧ эффект /л(1С5о), моль/л Модель CHj-Ml, минимум свободной энергии докинга (ДЕ), ккал/моль, по различным оценочным функциям "-Score"**:

"EVK' "Z" Dockô PMF D- G- MM GB/SA Chem-

la» 1 -13,12 -13,93 — 0 0 0 0 0 0

1а0* 1 -13,30 - СН.-ЦП -15.8 -2.0 -28.6 -64.4 -14.3 -13.7

6 -15,44 -16,08 СН,-НБ" эндо -19.0 -5.7 -35.5 -74.9 -15.0 -16.2

S -15,45 - СНгНЕ11 экзо -18.9 -4.3 -36.2 -74.4 -14.8 -16.4

9 -15,48 -16,15 СНз-АД -22.5 -9.2 -44.0 -93.0 -18.6 -18.6

13 -15,63 -16,32 СН.-ДНБ -25.9 -9.5 -46.6 -104.4 -20.6 -20.0

г. в тестах на штамме EVK": Корреляция в тестах на шта\ше "Z": 0.822 0,987 0,863 0,943 0,840 0,988 0,811 0,983 0,764 0,985 0,815 0,995

* Взяты выборки экспериментального тестирования образцов на двух штаммах ВИЧ-1: Е\/К и 1. ** Характеристики оценочных функций см. ниже - глава 4 (экспериментальная часть)

На уровне ВМС создается возможность формировать сеть многоточечных контактов с полной поверхностью мишени. При этом достижима взаимная стабилизация множественных и различных по химической природе и энергии контактов, в том числе "точечно нестабильных" посредством их кооперации через единую полимерную цепь. Организация такой кооперации фрагментов {-Ъ, -У-, -ГО-) в молекулах I без взаимной конкуренции, а в режиме согласованной нацеленности на мишень, позволяет многократно минимизировать энергию связывания.

Представление о потенциале синтетических полимерных цепей и низкомолекулярных производных АД связывать мишень в конкуренции с вирусным агентом - СНЯ можно оценить на основании показательных результатов докинга, приведенных в таблице 6.

Локируемая модель Ориентация Е ккал/моль ММ kD -Е/ММ ккал/(моль*кО)

СНК (38 аминокислот, рис.3) аксиальная - 23.2* 4.8 4.8

М2 = Н-СОШ-СНз-АД якорь и мостик - -21.4 0.19 112.6

М5= СН,-Аи-ЬХЧ1 - -19.6 0.36 54.1

Мб = Н-Ги-Аи-Ки-Аи-Щ-Аи-Сн, аксиальная -30.3 1.05 28,7

М7 = [ри-А1Л4 + 2 концевых АД якоря опоясывающая -58.0 1.68 34.5

М7 = [Ги-А|1]5 + 2 концевых АД якоря аксиальная -70.6 2.02 35.0

Е - энергия связывания моделей по сравнению с СН11 (по данным АиК>Е)оск4, рис. 3). ММ - молекулярная масса, и - Е/ММ величина может быть критерием «емкости энергии связывания» мишени в расчете на единицу массы лиганда.

Видно, что энергетический потенциал связывания мишени низкомолекулярным производным «якорного» АД (М2, аналог контрольного образца, неактивного против ВИЧ, табл.4)

18

и отдельного звена полимерного остова (М5) не превышают потенциал вирусного полипептида CHR. Однако «удельная энергетическая емкость» связывания мишени в расчете на единицу молекулярной массы превосходит таковую вирусного конкурента в десятки раз. Это создает благоприятные предпосылки роста конкурентоспособности искусственных соединений, как агентов блокады (NHR)3 и вирусной фузии, на пути интеграции потенциалов полианионных и якорных структур в сторону полимерных продуктов (Мб и М7, моделирующие участки цепочек, соответственно, немодифицированных - 1а 0 , и модифицированных якорными группами - 1а "+2, табл.4).

Моделирование цепей 1а прогнозирует разные способы блокады (NHR)3, рис. 10. Возможность продольно-аксиального (А) взаимодействия с мишенью использует сам вирус посредством трех полипептидных спиралей CHR, инициируя фузию. Ту же специфичность, но с эффектом конкурентного препятствования CHR, демонстрируют и модели Мб, подобные CHR по ионогеной природе (аккумуляции отрицательного заряда).

А Б А,Б3

Рис. 11. Возможные способы ориентации полимерных цепей на поверхности мишени.

А - продольная (аксиальная) ориентация, характерная как для вирусных агентов фузии - полипептидов CHR, так и для моделей Мб (рис.7), соответствующих полимерам 1а° и lb" (табл. 4). Б - опоясывающая ориентация, обнаруживаемая на моделях М7 с эффективными алициклическими якорями - АД, ДНБ (рис. 10, и в дополнение к нему - Б1 - аналогичный цокинг на мутационно измененную мишень - PDB 1 £23). Соответствует образцам 1а"+2 (табл. 4).

А,Б3 - вариант комбинированной ориентации, в экстраполяции к полноразмерным ВМС 1аи модели (NHR)3 с тремя ярусами триплетов впадин, восприимчивых к "якорям" (Апс - всего 9 якорей).

Однако введение якорных боковых групп (Апс) может приводить к другой -опоясывающей ориентации (Б) - более эффективной для экранирования (NHR)3 от агрегации с CHR (в силу поперечного перекрывания подходов спиралей CHR), а значит - и более эффективной для защиты клетки от слияния с вирусом. Как показало моделирование, именно такой способ блокады может стать приоритетным для гибкоцепных сополимеров ряда 1а при оптимальном использовании боковых "якорных" групп Z2 алициклического типа, что хорошо согласуется с данными in vitro (табл.4, группа ВМС 1а0 2).

"Переключению" e аксиального на более эффективный - опоясывающий способ блокады (NHR)3, согласно моделированию сополимеров 1а, должно способствовать использование укороченного мостика (см. рис.9 и 10А). Действительно в ряду опытных образцов 8-13 (Z2 = АД) наиболее активен против ВИЧ образец 8 (табл.4). И, нахонец, одним из решающих факторов настройки химической структуры сополимеров 1а на опоясывающую блокаду (NHR)j является не только выбор основы, якорей и мостиков, но и оптимальной степени модификации = (количество Z2):(K0m4ecTB0 Z2 + Zq). Расчет оптимальной степени модификации сополимеров 1а алициклическими якорями 1а 6-8 % по данным моделирования [1] практически совпадает с эмпирическим результатом отбора in vitro наиболее активных против ВИЧ образцов, имеющих фактическую степень модификации 5^8% (табл. 4). Увеличение содержания алициклов в макромолекуле не приводило к повышению противовирусной эффективности, а сопровождалось лишь ростом токсичности и снижением растворимости в водных средах [1]. Это согласуется с данными молекулярной динамики, регистрирующей внутримолекулярную кластеризацию якорей при слишком близком их расположении - степенях модификации > 1 якорь на 3 звена (Z2 > 8% от общего числа Z).

Экстраполяция моделей М7 к полноразмерным макромолекулам 1а приводит к пониманию возможности их искусственной настройки и на комбинированную (AiBj) ориентацию в контакте с мишенью (рис. 11). "Программирование" молекул 1а на заданную "нано-биоселективность" предполагает: 1) степень полимеризации («=30-50), соразмерную вирусной нано-мишени; 2) наличие нацеленных на "карманы" и впадины мишени эффективно-якорных алициклов (ДНБ>АД>НБ,НБ",НБ); 3) оптимизацию мостиков для связи "якорей" с полимерным остовом, а также 4) соблюдение дистанций между местами прививки "якорей". Так, полноразмерная цепочка la, модифицированная не менее чем девятью якорями ДНБ, допускает возможность комбинированной блокады А1Б3 по всем трем ярусам (яЬяШ) мишени (рис. 11). Такой "программе" соответствует образец la^^O, проявивший максимальную анти-ВИЧ эффективность in vitro (табл. 4).

Аналогичная настройка химических параметров на полимер-кооперативную нано-селективность на уровне "малых молекул" не выполнима, поэтому проведенные исследования показывают принципиальные преимущества ВМС для создания лекарств нового поколения. А полученные результаты моделирования дают ориентиры направленного синтеза высокоэффективных ингибиторов ВИЧ-инфекции, и других инфекционных патогенов, использующих для проникновения в клетки белковые агенты слияния 1 и 3 классов, подобные (NHR)3. Вытекающий из анализа моделирования полимер-кооперативный механизм многоточечной блокады белковой мишени означает также снижение на несколько порядков вероятности мутационного выхода вируса из-под блокирующего контроля (например, рис. 11Б1),

что было подтверждено экспериментально на опытном образце Ia0"1^) (данные НИФ Здоровья).

Глава 3.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Модель мишени (NHR)} пространственная (3D) структура взята из открытой базы данных по белковым соединениям PDB 1 aik и ШЗ (http://www.pdb.org).

Модельные соединения (409 конструкций), соответствующие компонентам структуры исследуемых ВМС I на различных уровнях моделирования М1-М7 (см. глава 2, например, рис. 6) были построены в молекулярно-графическом пакете Sybyl 8.1.

Расчёт частичных зарядов на атомах, если их число (без учета Н) превышало 200, проводили методом Гастайгера - Хюккеля, используя Sybyl 8.1. А для моделей с меньшим числом атомов применяли квантово-механический полуэмпирический метод РМЗ (Stewart J. J. P. "РМЗ" 1998), реализованный с помощью модуля МОРАС программы Vega ZZ (http://www.vegazz.net). Оптимизация геометрии мишени реализована с применением Sybyl через минимизацию энергии с помощью метода Пауэлла в силовом поле TRIPOS, радиус обрезания для нековатентных взаимодействий - 12Á.

Процедура допинга выполнялась на базе программы Dock 6.4 (http://dock.compbio.ucsf.edu), алгоритм которой моделирует гибкость лиганда разбиением его структуры на жесткие сегменты с дальнейшим поиском оптимального расположения наибольшего из них на мишени с последующим присоединением остальных, используя оценочную функцию энергии связывания лиганда с мишенью. Расчет ван-дер-ваальсовой компоненты межатомных взаимодействий проводился в силовом поле Amber99. При отборе лучшего конформера лиганда использовалась вторая оценочная функция, учитывающая растворитель как непрерывную среду с помощью обобщенной модели Борна и с учетом гидрофобного вклада поверхности, доступной растворителю. Фильтрацию результатов докинга проводили с помощью второй оценочной функции (MM GB/SA) программы Dock 6.4 и функций, входящих в модуль CSCORE пакета Sybyl: D-Score, G-Score, ChemScore и PMF, при этом результаты с положительными или нулевыми значениями хотя бы по одной из оценочных функций отбрасывались. Лучшие результаты из полученного множества отбирались с помощью MM GB/SA и ChemScore (как наиболее адекватно учитывающих природу исследуемых лигандов, см. табл.4).

Моделирование в режиме молекулярной динамит было реализовано на базе программного пакета Amber 8. Необходимые для расчётов параметры атомов лиганда брались из поля general AMBER force field (GAFF), а в случае мишени - ШЗ. Растворитель учитывался в двух вариантах. В первом - неявным образом с помощью обобщенной модели Борна в варианте, предложенном A. Onufriev и др. 2004 (концентрация NaCl бралась той же, что и в процедуре докинга). Во втором - явным образом с использованием модели растворителя TIP3P. В случае с неявным растворителем учитывался также гидрофорбный вклад каждой из компонент комплекса, пропорциональный поверхности доступной растворителю. При обоих вариантах расчётов радиус отсечки при вычислении ван-дер-ваальсовых взаимодействий был равен 12 А. Для контроля температуры использовался термостат Ланжевена с частотой столкновений 1 пс"1. Продукционная фаза моделирования выполнялась при температуре 300 К на протяжен™ 80 не, и в случае явного растворителя при давлении 1 атм. Снимки системы записывались через каждую пикосекунду. Анализ траектории проводился с помощью модуля PTRAJ. Для визуализации траекторий использовалась программы VMD.

Для ускоренной и оптимальной автоматизированной обработки массива данных докин-га автором предложен оригинальный метод конценсусной оценки и соответствующая программа его реализации (на базе 8РЬ - внутреннего языка БуЬуО. Для молекулярной динамики были также разработаны программы учета вкладов отдельных компонентов полимера в энергию взаимодействия с мишенью, выявления, наиболее посещаемых сайтов мишени и анализа динамики пространственной структуры полимера.

Оценка гибкости полимерных цепей проводилась посредством расчёта её персистент-ной длины с использованием нижеперечисленных способов, при этом связи, жестко сочлененные с гетероциклом вдоль остова, учитывались в виде результирующего вектора, например:

1. Вычисление по формуле (1) проекционной длины 1р Ь определяемой, как проекция вектора А, соединяющего концевые атомы полимера, на направление, задаваемое первой связью.

2. Расчёт по формуле (2) ориентационной корреляционной длины 10С - ориентационной корреляционной функцией, оценивающей экспоненциально убывающую с ростом у'-;' корреля-

ждой ;-й связи определяется система координат (смотри приведённую ниже схему). Матрица перехода из системы координат, соответствующей г+7-связи, в систему координат, связанную с /-связью, имеет вид, определяемый формулой (3). В заданных координатах ^ вычисляется по формуле (4). Для вычисления 10С были предложены подходы: 1) Для ;'=/,...А'/2 и ¡=N,...N/2 строились наборы {с,у}л и {Су,.}'. ^, каждый из полученных наборов сглаживался методом скользящего среднего по формуле (5), затем используя МаДлЬ

]

7.10.0, фитировали экспоненциальную зависимость С . от ^ГЦ^Ц для получения 1жЛ , ито-

говая 10с вычислялась по формуле (6).

2) Для i=N/2,...N-l по формуле (7) вычислялся множество, С,- . далее рассчитывается ряд С: ] по формуле (8), для получения 10С ряд сглаживался и фитировался как в первом варианте.

cos(fl) sín(0,) о

Т, = -cosí-д )sm(í7) uWv> )а>4'') sm(f>) (3) , sin(v>,)sin(0 ) -án(f>,)cos|W) (oMV,),

\ Jn

(4)

Y

3. Расчет в рамках модели Порода - Кратке по формуле:

I.

выводы

1. Впервые методами докинга и молекулярной динамики выполнено компьютерное моделирование синтетических гетерогенно-модифицнрованных чередующихся сополимеров ма-леиновой кислоты, в качестве агентов блокады ключевого нано-медиатора (5,1x2,5 им) проникновения ВИЧ в клетки человека - триспирального комплекса (NHR)3 трех белковых молекул gp41 оболочки вируса.

2. С учетом специфики процедуры докинга и параметров исследуемых объектов разработан и реализован 7-уровневый алгоритм моделирования по принципу последовательных приближений от частных компонент химической структуры синтетических полимеров к целостным полимерным цепям. При этом показана целесообразность применения "гибкого докинга" для моделирования олигомерных лигандов, а на завершающих этапах моделирования - дополнительно молекулярной динамики.

3. Разработанная методология апробирована на выборке полимерных соединений, синтезированных в лаборатории и прошедших экспериментальное тестирование in vitro на анти-ВИЧ активность (—170 опытных образцов). Выявлена корреляция данных вычислительного (in silico) и биологического (in vitro) экспериментов, позволяющая интерпретировать молекулярные механизмы блокады вирусной мишени в зависимости от структуры полимерного остова, степени его полимеризации, природы и состава боковых групп и дистанций между ними. Получен также прогноз модуляции блокады мишени при введении в цепь остатков тритиокарбонатного агента "живой" полимеризации.

4. Впервые сформулированы параметры "химического программирования" макромолекул на эффективную блокаду вирусного нанокомплекса (NHR)3. Показана возможность "переключения" способа блокирующего воздействия полимера на мишень с аксиального на более эффективный опоясывающий или комбинированный. Заданная "нано-биоселективность" предполагает: 1) степень полимеризации (п=30-50), соразмерную вирусной нано-мишени; 2) наличие нацеленных на "карманы" мишени эффективно-якорных алициклов; 3) оптимизацию мостиков для прививки "якорей" к полимерному остову и дистанций между местами прививки - через каждые 3-4 звена.

5. Ввиду невозможности аналогичной настройки химических параметров на заданную нано-селективность на уровне НМС, проведенные исследования подтверждают принципиальные преимущества ВМС для создания лекарств нового поколения. Полученные результаты имеют важную прикладную перспективу проектирования и направленного синтеза ВМС-лекарств против ВИЧ и других инфекционных агентов, проникающих в клетки человека посредством белковых медиаторов слияния (1 и 3 классов).

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Сербии А.В., Веселовский А.В., Цветков В.Б. Исследование in vitro и in silico интерфе-роногенных аналогов нуклеиновых кислот, искусственно программируемых на блокаду начальных этапов ВИЧ-инфицирования клеток // Биотехнология. - 2012. - № 1. -С. 72-89.

2. Serbin А. V., Karaseva Е. N., Tsvetkov V. В., Alikhanova О. L., Rodionov I. L. Hybrid Polymeric Systems for Nano-Selective Counter Intervention in Virus Life Cycle // Macromolecular Symposia. 2010. Vol. 296. № 1. P. 466-477.

3. Цветков В.Б., Карасева Е.Н., Веселовский А.В., Сербии А.В. Искусственно-полимерные агенты блокады биополимерных наномедиаторов слияния мембран вирусов и клеток 1. Ингибиторы ВИЧ-инфекции // Пластмассы со специальными свойствами. - под ред. Лаврова Н.А. - СПб. - ЦОП «Профессия». - 2011 - С. 261-266.

4. Tsvetkov V., Veselovski A., Serbin A. Polymer-Coupled Systems for Blocking the Viral Fusion I. Modeling in silico the in vitro HIV-1 Entry Inhibitors II Antivir Research. 2011. Vol. 90. №2. P. 46.

5. Serbin A., Karaseva E., Alikhanova O., Tsvetkov V. Polymer-Cooperative Approach to multi-Blocking the VirusesII Antivir Research. 2011. Vol. 90. №2. P. 76.

6. Сербии А.В., Карасева E.H., Цветков В.Б. Макрореагенты для двухвекторного (epa<j>m+«RAFT») направленного синтеза И Научная конф. ИНХС РАН (Москва, 6-8 апреля 2009). - Сб. тез. - С. 54.

7. Serbin А. V., Tsvetkov V. В., Veselovsky A.V., Karaseva Е. N., Alikhanova О. L. Macromolecular intervention in viral biopolymers hierarchical assembly for antiviral protection II EUPOC 2010 - Hierarchically Structured Polymers: Abstr. (Gargnano - Italy, May 30 - June 4, 2010)-P. 33.

8. Tsvetkov V., Serbin A., Veselovsky A. Computational modeling for development of multi-blocking antivirals. HIV-1 entry inhibitors based on graft-variable alternating polymers II Joint N1AID-ISTC Conference: Bioinformatics. Tools and Techniques for Allergy and Infectious Disease Research (Moscow, June 7-9, 2010). - Proceedings: https://conferences.niaid.nih.gov/bioinformatics

9. Serbin A.V., Karaseva E.N., Alikhanova O.L., Tsvetkov V.B. Polymer-cooperative blocking the viruses - strategy, synthesis, and effectiveness II European Polymer Congress 2011 (EPF' 11): Abstr. (Granada - Spain, June 26 - July 1, 2011). - P. 558.

10. Tsvetkov V.B., Veselovski A.V., Serbin A.V. Polymer-cooperative blocking the viruses: in silico modeling the in vitro HIV-1 entry inhibitors И European Polymer Congress 2011 (EPF' 11)): Abstr. (Granada - Spain, June 26 - July 1, 2011). - P. 1337.

11. Serbin A., Tsvetkov V. Biomedical Polyomics as tool and pipeline for drug-capable polymeric structures prediction // 2nd Joint NIAID-ISTC Workshop on Bioinformatics Tools and Innovations through Collaboration (Moscow, August 29 - September 1, 2011). Proceed.: https://respond.niaid.nih.gov/conferences

12. Сербии А.В., Цветков В.Б., Карасева E.H. Искусственно-молекулярные системы поиска и нейтрализации вирусных нанообьектов // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Пансионат «Заря» -Московская обл., 19-24 сентября 2011). - Сб. тез. - С. 99-100.

13. Сербии А.В., Карасева Е.Н., Цветков В.Б. Синтез и моделирование «молекулярныхроботов» поиска-нейтрализации вирусных нанообьектов II 19-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград, 25-30 сентября 2011). - Сб. тез., Т. 2 - С. 567.

Подписано в печать:

23.03.2012

Заказ X» 6885 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

öl VZ-2/b'Zb

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии

медицинских наук Научно-инновационный фонд Здоровья

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО-БИО-СЕЛЕКТИВНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ГЕТЕРОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ

J-Cü [описи

ЦВЕТКОВ Владимир Борисович

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения 03.01.03 - Молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук Сербии A.B.

доктор биологических наук Веселовский A.B.

Москва-2012

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Список сокращений..............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................5

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................7

1.1. Полимерные наноструктуры в жизненном цикле клеток и виру- 7 сов...........

1.2. Биополимерные наномедиаторы проникновения ВИЧ в клетку............................11

1.2.1. Адсорбция вируса на клеточной поверхности ..................................................11

1.2.2. Слияние (фузия) мембран вируса и клетки..........................................................14

1.3. Ингибиторы проникновения ВИЧ-1 в клетку..........................................................15

1.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы слияния ВИЧ с клеткой................16

1.3.2. Поли(олиго)мерные ингибиторы слияния ВИЧ с клеткой..................18

1.3.3. Синтетические полиэлектролитные ингибиторы ВИЧ, ..................21

1.4. Состояние проблемы моделирования агентов блокады белковых мишеней 24

1.4.1. Моделирование агрегации вирусных спиралей СИЯ на поверхности

(ЫНЯ), инициирующей фузию..................................................................................................24

1.4.2. Моделирование взаимодействий с мишенью НМС........................................25

1.4.3. Проблемы моделирования синтетических ВМС................................................25

1.5. Выводы и постановка задач собственных исследований........................................29

Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 31

2.1. Моделирование и анализ белковых структур (1ЧШ1)з и СНЫ

в качестве мишеней воздействия анионных полиэлектролитов................................32

2.1.1. Анализ аминокислотной структуры а-спиралей СНЯ и ИНЯ в качестве потенциальных мишеней анионных полиэлектролитов........................................32

2.1.2. Анализ пространственной организации и характеристик (1ЧНЯ)з............34

2.2. Моделирование сополимеров I и их взаимодействий с (ТЧНК)з методами докинга..........................................................................................................................................37

2.2.1. Алгоритм моделирования в рамках возможностей программных средств докинга применительно к специфике исследуемых объектов..............37

2.2.2. Результаты докинга................................................................................................38

2.2.3. Контрольный докинг модельных лигандов на (ТУНЯ)з мишень мутант-

ного штамма вируса ......................................................................................................48

2.2.4. Промежуточные выводы и экстраполяция результатов докинга к

масштабам материальных цепей сополимеров 1............................. 52

2.3. Моделирование сополимеров I и их взаимодействий с (NHR)3 методами мо-

лекулярной динамики..................................................................... 56

2.3.1. Моделирование полимерных цепей более высоких степеней полимеризации, чем допускает процедура докинга (т > 10-^20 ->п)..............................................56

2.3.2. Моделирование вариаций полимерных цепей различного мономерного состава и оценка их гибкости....................................................................................................................89

2.3.3. Оценка возможной модуляции поведения полимерных цепей, синтезированных методом «живой» радикальной полимеризации по механизму обратимой передачи цепи .................................................................. 91

2.4. Сравнительный анализ результатов вычислительного (in silico) и биологического (in vitro) экспериментов, оценка перспектив направленного синтеза ингибиторов ВИЧ повышенной эффективности....................................... 97

2.4.1. Анализ экспериментальных данных (НИФ Здоровья и ИНХС РАН) испытаний исследуемых сополимеров на анти-ВИЧ активность.................. 97

2.4.2. Корреляция эффективности блокады ВИЧ-1 и энергии связывания якорных структур с вирусной мишенью (КЧШ)з по результатам докинга .... 99

2.4.3. Полимер-кооперативные эффекты и «нано-био-селективность» как принципиальное отличие ВМС от НМС в реализации блокады вируса......... 103

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................................107

3.1. Формирование моделей....................................................................................................................................107

3.2. Процедура докинга................................................................................................................................................107

3.3. Анализ результатов докинга..........................................................................................................................109

3.4. Процедура молекулярной динамики......................................................................................................111

3.5. Оценка гибкости полимерных остовов................................................................................................112

ВЫВОДЫ .............................................................. 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. 120

Список сокращений:

АД Адамантан (трицикло[3.3.1.137]децен)

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

ВИЧ-1 ВИЧ первого типа

ВМС высокомолекулярные соединения

ДНБ динорборнен (тетрацикло[4.4.0.12 5171П]додецен)

КК окончание: -КК = -ОМ М+ в составе карбоксикислотных

групп -СОКК

МА малеиновый ангидрид

ММ молекулярная масса

СПИД синдром приобретенного иммунодефицита

СК сульфокислотное окончание боковой группы: -СК = -S03"

НБ норборнан (бицикло[2.2.1]гептан)

НМС низкомолекулярные соединения

ЦГ циклогексан

ЦП циклопентан

AU янтарно-кислотные фрагменты полимерной цепи (рис.2-1)

BU мономеные фрагменты остова полимерной цепи (рис. 2-1)

CHR С- концевой участок повторяющихся гептад аминокислотной

последовательности эктодомена гликопротеина gp41 ВИЧ

FU фуран-производные фрагменты полимерной цепи (рис. 2-1)

NHR N-концевой участок повторяющихся гептад аминокислотной

последовательности эктодомена гликопротеина gp41 ВИЧ

PDB база данных по белковым соединениям (Protein Data Bank)

SG боковые группы полимерных молекул и их моделей

ВВЕДЕНИЕ

Фундаментальная роль высокомолекулярных соединений (ВМС) в организации живых систем определяет ключевое значение химии ВМС в решении многих актуальных проблем медицины. Так, поиск лекарственных средств на уровне только низкомолекулярных соединений (НМС) вступает в объективное несоответствие с тем обстоятельством, что в подавляющем большинстве случаев (> 90%) мишенями лекарственной терапии являются белки - природно-биологические полимеры, склонные к самоорганизации в нано объекты. "Малая молекула" НМС способна к контакту лишь с локальным участком белковой (нано) мишени, оставляя преобладающую часть макромолекулы свободной от воздействия. Поэтому в результате мутаций болезнетворных микроорганизмов их белковые компоненты быстро выходят из-под лекарственного контроля. Это становится критически актуальной проблемой в случае летально-опасных заболеваний, вызываемых инфекционными агентами повышенной мутационной изменчивости. К их числу относится вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - возбудитель ВИЧ-инфекции и заболевания СПИД. В этих случаях традиционные НМС-лекарства, а также вакцины, становятся малоэффективными, и возникает острая необходимость создания лекарств нового поколения - на уровне ВМС, адекватно-соразмерных белковым мишеням и искусственно "программируемым" на многоточечную избирательную блокаду таких мишеней. Анализ предшествовавших исследований в этой области позволяет выделить синтетические полиэлектролиты на основе гетерофункционально модифицированных производных чередующихся сополимеров малеинового ангидрида, среди сотен опытных образцов которых выявлены высокоактивные ингибиторы репродукции ВИЧ. Их биологические испытания на экспериментальных моделях инфицирования клеток (in vitro) показали, что блокируется ранний этап проникновения вируса в клетку, предположительно, - слияние (фузия) вирусной оболочки с клеточной мембраной. Однако эксперимент in vitro не дает четкого понимания молекулярных механизмов блокады, что делает актуальным молекулярное моделирование взаимодействий синтетических полимеров с белковыми медиаторами фузии в вычислительном эксперименте (in silico).

Для определения возможных мест связывания лекарства с мишенью широко используется докинг. При этом гибкость структуры лиганда моделируется либо множеством жестких конформаций, либо одной конформацией, которая в процессе докинга подвергается изменениям. Однако в реальном времени вычислительного эксперимента оба подхода практически не применимы к макромолекуле как единому целому в силу ее огромной "конформационной ёмкости"1. Поэтому не менее актуальной являлась задача выработки стратегии рациональной фрагментации моделей макромолекул для реализации докинга и анализа его результатов в целях исследования механизмов взаимодействий полимеров с мишенью.

Цель работы - исследование методами компьютерного моделирования потенциальных механизмов блокирующего воздействия гетерофункционально модифицированных анионных полиэлектролитов в ряду производных сополимеров ма-леинового ангидрида на белковые (нано) медиаторы слияния оболочки ВИЧ с клеточной мембраной.

Конформационная емкость - количество (множество) возможных конформеров молекулы.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Полимерные наноструктуры в жизненном цикле клеток и вирусов

Природные полимерные соединения, способные к структурной, функциональной и информационной кооперации в самоорганизующиеся системы (липиды, белки, нуклеиновые кислоты...), играют фундаментальную роль в молекулярной организации биологических форм жизни и смерти всех клеточных организмов [1] и их генетических паразитов - вирусов [2,3].

Миссия клетки, как элементарной ячейки биологической жизни, сопряжена со сложной системой мульти-молекулярных процессов и состояний, "оперативно управляемых" белковыми соединениями, структура и свойства которых контролируются трансляцией генетического кода нуклеиновых кислот (генома). Жизнедеятельность клетки, включая воспроизводство ее биополимеров, осуществляется на базе "малых" молекул водных сред с активным вовлечением в биосинтез и утилизацию множества низкомолекулярных метаболитов. Поэтому совокупный надмолекулярный масштаб клеточной системы требует достаточной емкости в пространстве и по своим размерам, 1-10 мкм, живые клетки представляют собой объекты микронного масштаба - микрообъекты [4]. Граница же раздела (контакта) клетки с внешней средой имеет типично нано-размерную толщину 5-8 нм - бинарного ли-пидного матрикса клеточной ("плазматической") мембраны [5,6]. Мембрана интегрирует в себе соразмерно нано-масштабные липид-ассоциированные структуры белков, полисахаридов, и их производных в качестве активных агентов подсистемы массо-, энерго- и информационного обмена клетки с внешней средой [4].

Вирусы не способны к самостоятельному биосинтезу и реализуют свой жизненный цикл (рис. 1-1) исключительно в качестве генетических паразитов клеток, внутри которых осуществляется активная фаза жизни вируса - репликация молекулярных компонент и репродукция потомства [2,3].

2 Вода составляет до 90% массы клетки

WW

Вход Дезинтеграции Репликация 4 Самосборка Выход Рис. 1-1. Жизненный цикл вирусов и его наноразмерные состояния: исходный вирион (1), объекты контакта на входе в клетку (2), продукты самосборки новых вирусных частиц на выходе из клетки (3) и новое потомство вирионов вне клетки (4) [7].

На выходе из клеток вирусные частицы освобождаются от низкомолекулярных метаболитов, концентрируя в себе конечные биополимерные продукты репликации, необходимые для выхода во внешнюю среду, поиска новой подходящей для размножения вируса («пермиссивной») клетки, проникновения в нее и запуска очередной генетической программы репродукции вирусного потомства. Поэтому ви-рионы представляют собой максимально компактные концентраты - как правило, кристаллические полимерные комплексы, состоящие из минимального набора нуклеиновых кислот вирусного генома, окруженных белковым защитным футляром - «капсидом». У «оболочечных» вирусов поверхность белкового футляра по-

о

крыта «оболочкой» из остатков липидной мембраны родительской клетки . На поверхности вирионов агрегируются также гликопротеиновые4 шипы ("пепломеры"), предназначенные для узнавания рецепторов пермиссивных клеток, прикрепления к ним и инициации вторжения внутрь клетки. Типичные размеры вирионов лежат в области 20-200 нм, а их биосенсорных шипов - в районе 5-15 нм. Таким образом, вирионы и, особенно, сенсоры их первичных контактов с клеткой являются типичными нанообъектами полимерной природы (табл. 1-1).

J У некоторых «крупных» оболочечных вирусов между капсидом и липидной оболочкой образуется промежуточная оболочка («tegument») неоднородного состава и аморфной структуры

4 Гликопротеины - белки, некоторые остатки аминокислот которых гликозилированы. Сахаридные фрагменты обычно обращены во внешнюю водную фазу, повышая солюбилизацию вириона, создавая защитный экран, и часто участвуя в формировании макромолекулярного образа шипа вируса, как лиганда для селективного связывания рецепторами пермиссивной клетки.

Таблица 1-1.

Вирусы как природно-полимерные наноструктуры

по данным [8-11] (дополнительные ссылки по семействам - в правом столбце)

Семейство вирусов* Заболевания Размер вирионов, нм Состав** Размер гликопротеи-новых шипов, нм

НК Белки ЛП (их количество)

Пикорна- Гепатит А... 20-30 РНК (1) С (4) нет -

Калици- Гепатит Е... 27-38 РНК (1) С(3) нет 3-4 (10-30) [12]

Астро- Диарея... 28-44 РНК (1) С(3) нет ~ 5 (30) [13]

Рео- Респиратор... 60-80 РНК (>10:10) СГР (> 13) нет 12-20 (60) [П]

Парво- Эритема... 18-26 ДНК (1) СГ (> 3) нет ~ 2 (20) [14]

Цирцино- Гепатит 30-50 ДНК (1) С(1) нет -

Полиома- Онкоген ез... 40-50 ДНК (1:1) СГ (> 5) нет -

Папшшома- Папилломы... 50-60 ДНК (1:1) СГ (> 2) нет -

Адено- Респиратор... 70 - 100 ДНК (1:1) СГ(> 11) нет 9-77 (12)

Флави- Энцефалиты... 35-70 РНК(1) СГ(3) Об 2-3 (60/90) [15]

Тога- Энцефалиты... 60-90 РНК (1) СГ (> 2) Об 6(80) [16]

Корона- Респиратор... 60 - 220 РНК (1) СГ (> 5) Об 10-25 (50-100) [17,18]

Ретро- СПИД, онко- 80-130 РНК (1:1) СГР (> 5) Об 8-14 (14-72) [19,20]

Ортомиксо- Грипп... 80 - 120 РНК (7-8) СГ (> 4) Об 9-15 (-500)

Рабдо- Бешенство... 60 -300 РНК (1) СГ (> 3) Об 5-13 (-400)

Парамиксо- Корь, энцефал. 90 -350 РНК (1) СГ (> 8) Об 8-20 [9,21]

Бунья- Энцефалиты... 35 - 120 РНК (3) СГ Об 5-15 (-122) [22,23]

Арена- Менингит... 50 - 300 РНК (2) СГР Об 7-10 [24]

Гепадна- Гепатит Б... 42-47 ДНК (2) его Об 2-3 (90-120) [25]

Герпес- Герпес... 120-200 ДНК (1:1/2:2) СГР (8-80) Об 8 (>100) [26]

Покс- Оспа... 130 -375 ДНК (1:1) СГР (>30) Об 5-20 (>500) [27]

* Представлены семейства вирусов, опасные для человека; название семейства образуется присоединением указанного префикса к слову «вирусы»

** НК — нуклеиновые кислоты —ДНК или РНК (в скобках - число молекул НК в геноме вируса); Белки: С — формирующие структуры капсида, Г — гликопротеины шипов, Р - белки-регуляторы (ферменты и другие), обычно активируются внутри клетки. В скобках указано количество различных типов белков в вирионе

ЛП - липиды: Об - формирующие оболочку вируса из остатков мембраны родительской ("хозяйской") клетки.

В качестве примера приведем данные о надмолекулярной архитектуре представителя РНК-вирусов оболочечного типа семейства ретровирусов (геКочтйаё) -вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) - возбудителя заболевания «синдром приобретенного иммунодефицита» (СПИД), летально опасного для человека и до сих пор неизлечимого [28]. Размеры и структура инфекционно зрелой частицы ВИЧ схематично показана на рис. 1-2.

100 им

5 нм

ч

Белки Н1.А и др., захваченные у родительской клетки Липидная мембрана пп родительской клетка

+ РНК (2 копии макромолекулы)

14 нм 12 нм-

Белки:

ММ* Код генома

рбб ИТ "

р 32 ш ► Р<>1

р12 ,

Р 7 N0 -

р 24 СА >- """

р 17 МА

ВР 41 ВР 120 ТМ 1 5и 1 \ СНУ

Рис. 1-2. Биологические полимеры в нано-структурной надмолекулярной организации нириоиов ВИЧ-1 (схема, по обобщенным данным 119,20.29-31]).

Молекулярными носителями генома ВИЧ-1 являются две идентичные молекулы РНК (биологические полиэфиры) с ММ =2106 и степенью полимеризация Р > 9 10\ Они упакованы в сердцевине вирусной частицы. Генетический код, -записанный на молекулах РНК, во время внутриклеточной репликации посредством биохимических реакций обратной транскрипции, трансляции, и иострапсляпион-пои модификации программирует синтез и структуру вирусных белков (шю логических полиамидов). Основные группы бел кон. формирующих вирион, кодируются генами р<>1, епу. их молекулярные массы представлены на рисунке в кило дал г. тонах (ММ* - в числовой части обозначения белка). Белки группы р<>1, обратная гранекриптаза (КГ), интеграза (114) и протеаза (РК). консервируются в внрионе в небольших к оли'.'совах и активируются после проникновения вируса в клетку. Пел к и группы ответственны за белковый футляр; молекулы нуклеокапендных белков (N0 - р7 - агреги