Формирование неселективных пептид-липидных пор как модель процесса белковой трансдукции с помощью поликатионных аналогов грамицидина A тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

на правах рукописи

Ковальчук Сергей Игоревич

Формирование неселективных пептид-липидных пор как модель процесса белковой трансдукции с помощью поликатионных аналогов грамицидина А

Специальность: 02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени Кандидата химических наук

Москва - 2010

1 1 ш 2010

004612174

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Научный руководитель

Академик РАН Иванов Вадим Тихонович

Официальные оппонепты:

Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Барсуков Леонид Иванович

кандидат химических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела «Учебно-научный центр» ИБХ РАН

Ведущая организация

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «20» октября 2010 года в (О часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН Автореферат разослан « (Т~я 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук ____В.А. Олейников

Актуальность проблемы

В последние годы становится всё более актуальной задача доставки ключевых био.молекул (пептиды, белки, нуклеиновые кислоты) в цитоплазму эукариотиче-ских клеток. Однако, в то время как технология доставки нуклеиновых кислот разрабатывалась в течение десятилетий, что к сегодняшнему дню привело к появлению множества высокоэффективных подходов и препаратов для трансфекции эукариотических клеток, методология доставки белков (белковой трансдукции) находится на значительно более низком уровне развития.

Одним из наиболее привлекательных с точки зрения простоты и эффективности подходов является использование низкомолекулярных, в частности пептидных векторов, способных обратимо сорбироваться на поверхности белков за счёт лабильных нековалентных связей (гидрофобные, электростатические и т.д.) с образованием комплексов, которые бы при попадании в клетку разрушались, освобождая при этом нативную молекулу транспортируемого соединения.

Несмотря на очевидную перспективность применения, на данный момент описано всего две группы пептидов, способных подобным образом транспортировать белки. К первой группе относится катионный амфипатичный пептид рер-1 и его аналоги. К второй - сконструированные в нашей лаборатории аналоги природного антибиотика грамицидина А, несущие дополнительную гидрофильную последовательность, обогащенную катионными аминокислотами. Существенным фактором, ограничивающим дальнейшее развитие данного подхода является отсутствие общепринятых представлений о механизме проникновения в клетки пептид-белковых комлексов.

Цель работы

Целью представленной работы является исследование механизма процесса белковой трансдукции, опосредованной катионными грамицидиновыми аналогами (КГА). Согласно литературным данным, процесс транслокации нековалентных

пептид-белковых комплексов является энергетически независимым, т.е. проходит через взаимодействие комплексов непосредственно с липидами мембран. В связи с этим, изучение механизма транспорта включало детальное исследование взаимодействия КГА с модельными мембранными системами и с транспортируемыми белками как в растворе, так и в присутствии липосом. Кроме того, на серии направленно модифицированных пептидов в культуре эукариотических клеток НеЬа была изучена трансдукция модельного белка Р-галактозидазы и прослежена корреляция транспортной активности с поведением тех же пептидов в искусственных мембранных системах. С этой целью, наряду с некоторыми ранее описанными КГА, нами были получены новые производные, отличающиеся по таким признакам как длина и состав катионного и гидрофобного доменов и их относительная локализация в последовательности пептида.

Научная иовизиа и практическая значимость работы

Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании физико-химических механизмов, лежащих в основе взаимодействия КГА с мембранами, а также пептид-опосредованной трансдукции белков. Обнаруженная нами в ряду аналогов полная корреляция между эффективностью внутриклеточной доставки белков и каналообразовательной активностью КГА на искусственных мембранных системах позволяет рассматривать формирование пептид-липидных пор как необходимое условие и существенный этап процесса транслокации нековалентных пептид-белковых комплексов.

Полученные результаты планируется использовать как для оптимизации существующих пептидных векторов, так и для дизайна новых пептидов, обладающих трансдукционной активностью, с целью расширения возможностей применения метода доставки макромолекул в составе нековалентных комплексов с переносчиками.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены на 2-ом международном симпозиуме по мембрано-актнвным пептидам, Лиссабон, Португалия, 2007, 20-ом международном американском пептидном симпозиуме, Монреаль, Канада, 2007, 4-ом Российском симпозиуме «Белки и Пептиды», Казань, Россия, 2009 и 3-ем международном симпозиуме по внутриклеточной доставке терапевтических агентов, Монпелье, Франция, 2009. По материалам работы вышли 5 статей в рецензируемых журналах.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 189 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, результаты, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы, включающий 226 ссылок. В работе содержится 51 рисунок н 8 таблиц.

Содержание работ!,i

Синтез пептидов

В рамках данной работы, наряду с некоторыми ранее описанными пептидами (PIC, Р5С, Р10С, NIC, PIN [1]), были также синтезированы и изучены несколько серий новых КГА (таблица 1). Помимо аналогов грамицидина А, были синтезированы пептиды магайшш-2 и мелиттнн для контроля методов исследования на искусственных липидных системах.

Таблица 1. Пептиды, синтезированные и изученные в данной работе

Название Последовательность

Р1С form - VGALdAVdWdWLdWLdWLdW - eta - suc - PGRRRRSQS

катионный домен PGRRRRSQS

NIC ^c-VGALDAVDVVDWLDWLDWLDWpAGSGEEEESQS

Р10С Лс-VGALDAVDWDWLDWLDWLDWPAGSGPKKKRKVC

Р5С ^C-VGALdAVdVVdWLdWLdWLdWPAGSGPKKKRKVG

РК4С VGALDAVDWDWLDWLDWLDWPAGSGKKKKC

P1N CPKKKRKVGSGVGALDAVDVVDWLDWLDWLDWPA

PK4GN GKKKKGSGVGALDAVDWDWLDWLDWLDWPA

PK4N CKKKKGSGVGALDAVDWDWLDWLDWLDWPA

PK6N CKKKKKKGSGVGALDAVDWDWLDWLDWLDWPA

PK8N CKKKKKiCKKGSGVGALDAVDVVDWLDWLDWLDWpA

PK10N CKKKKKKKKKKGSGVGALdAVdVVDWLdWLdWLdWPA

PS2C VGALDAVDVVDWLDGSGPKKKRKVC

PS3C VGALDAVDWDWLDWGSGPKKKRKVC

PS4C VGALdAVdVVdWLdWLdGSGPKKKRKVC

PS5C VGALdAVdVVd\VLdWLdWGSGPKKKRKVC

PS6C VGALdAVDVVDWLDWLDWLDGSGPKKKRKVC

PIleC VGALdAVdVVdWLdWLdILdIPAGSGKKKKC

магаинин-2 GIGKFLH s akkfgk af vgeimn s

мелиттин GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ

* В последовательности пептидов буквой d обозначаются D-аминокпслоты (например,

Lo),form - формил, Ас - ацетил, eta - этаноламин, site - сукцинил.

Для упрощения понимания описанных результатов в названии пептидов зашифрована некоторая информация относительно их аминокислотной последовательности. Первая буква (Р или N) обозначает заряд гидрофобной последовательности (Positive - положительный или Negative - отрицательный, соответственно). Последняя буква (N или С) соответствует локализации катионного домена на N- или С-конце гидрофобного грамицидинового домена. Информация между первой и последней буквами либо просто соответствует условному порядковому номеру пептида, либо несёт некоторую дополнительную информацию: пептиды PS2C ■*• PS6C имеют укороченный грамицидиновый домен (буква S обозначает shorted - укороченный); пептиды РК4С и PK4N PK10N имеют различную длину

катионной части, обозначение Кх соответствует количеству (х) остатков Lys в гидрофильном домене; в пептиде РПеС ряд остатков Тгр в грамицидиновом домене замещён на Ile; пептид PK4GN в катионном домене имеет 4 остатка Lys и остаток Cys, замещённый на Gly.

Все перечисленные в таблице 1 пептиды были синтезированы твердофазным методом в автоматическом варианте путём наращивания цепи с С-конца на модифицированных полистирольных смолах. Аминокислоты присоединяли к пептидил-полимеру через образование бензо-триазолового эфира в присутствии диизопропилкарбодиимида. Защита боковых функциональных групп аминокислотных остатков была выбрана с расчётом на конечное деблокирование трифтор-уксусной кислотой. Для временной защиты a-NHrrpynn использовали флуоренилметоксикарбонильную группу.

После деблокирования и отщепления от полимера пептиды выделяли методом ОФ-ВЭЖХ н характеризовали методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии. В среднем выходы пептидов (относительно исходной концентрации активных групп на полимере) составляли 5-10% для аналогов грамицидина А при содержании целевого компонента в смеси от 80 до 95% и -20% для магаинина-2 и мелиттина при чистоте >95%.

Для стандартизации экспериментальных условий все цистеин-содержащие пептиды использовали в димерной форме (если в явном виде не указано иного).

Взаимодействие капюиных грамицилиновых аналогов с искусственными мембраннымн системами

Исследование селективности нептид-индуцированной мембранной проводимости

Ранее на БЛМ для димерной формы цистеин-содержащих КГ А была показана индукция неселективной проводимости ионов [1]. Данный эффект, по сути, являлся отправной точкой для настоящей работы, в которой было проведено

подробное исследование индукции КГА неселективной проводимости мембран и её взаимосвязи с белковым транспортом.

В настоящей работе вопрос селективности проводимости мембран в присутствии КГА был изучен на липосомах, содержащих потенциал-зависимый флуоресцентный краситель сафранин О, в условиях трансмембранного градиента концентрации КС1. Данная система позволяет наблюдать появление ион-селективных каналов через повышение уровня флуоресценции красителя при формировании трансмембранного диффузного потенциала, что приводит к повышению общей флуоресценции эмульсии липосом.

Изучение в данной системе катионных грамицидиновых аналогов на примере пептида Р1С показало, что при низких концентрациях в мембранах присутствуют грамицидин-подобные К-селективные каналы, в то время как при повышении концентрации выше 1 мкМ происходит сброс ранее сформированного потенциала (рис. 1). Таким образом, было доказано, что появление в мембране дефектов с высокой неизбирательной ионной проводимостью (впоследствии охарактеризованных как «неселективные поры») носило концентрационно-зависимый характер. Характерно, что анионный аналог NIC вне зависимости от концентрации был способен образовывать только классические К -селективные грамициди-новые каналы (данные не показаны).

А. _ Б. »_, В.

0.0001 м&1

/

PIC. 1 «M

фЕИМцидю* А 0X1 ыкМ

log ¡пептид], мкМ время, с время, с

Рис. 1 Формирование трансмембранного потенциала на липосомах при добавлении пептидов.

А. Зависимость трансмембранного потенциала от концентрации пептида PIC. Б. Сброс

трансмембранного потенциала, преформированного добавлением грамицидина А, высокой

концентрацией пептида PJC. В. Зависимость трансмембранного потенциала на липосомах от

концентрации пептидов грамицидина А (П) и Р/С (Ш). Трансмембранный градиент

t'

концентрации KCl обеспечивался помещением липосом, содержащих раствор 200 мМ KCl, в безкалиевую среду. Флуоресценцию сафранина О измеряли при л = 581 им.

Исследование проводимости одиночных КГА-индуцированных мембранных дефектов (пор)

Для выяснения способа индукции КГА неселективного ионного транспорта была изучена флуктуация тока на плоских бислойных липидных мембранах. Измерения проводили на пептидах PK4N и РК4С, сочетающих в себе все основные черты КГА, однако в силу структурных особенностей не способных к формированию основной проводящей формы грамицидиновых каналов - спиральных димеров. Подобный выбор объектов для анализа был обусловлен задачей дальнейшего целенаправленного изучения неселективной проводимости, в то время как наличие фоновой катионной грамицидиновой проводимости в ряде случаев существенно усложняет экспериментальную работу. А. , Б. .

Г. 0.4 НА 0.1 НА

ЯР*. Ъ ■ - I , —

Рис. 2 Флуктуации тока, появляющиеся при одностороннем добавлении 0.27 мкМ пептидов РК4С (А) и PK4N (Б) на плоской БЛМ, сформированной из дифитаноил-фосфатидил холина в гексадекане. Буфер IOmMTRJS, IOmMMES, 1 М KCl, pH 7. U=80mB. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии взаимосвязи между индукцией неселективной проводимости и какого-либо рода дестабилизирующей мембрану активности для данных КГА. Наблюдаемый характер флуктуации трансмембранного тока (рис. 2) указывал на формирование в присутствии пептидов крупных пор неизвестной структуры, появление которых, как и на липосомах, носило коццентрационно-зависимый характер. При этом обнаруженные неселективные поры обладали очень высоким уровнем проводимости (от 1 до 10 нСм), в сотни раз превышавшим проводимость грамицидин-подобных каналов, образуемых КГА в аналогичных условиях в низких концентрациях (16 пСм [1]).

Структура КГ А

В рамках задачи исследования детальной структуры неселективных пор, в первую очередь, было проверено, оказывает ли какое-нибудь принципиальное влияние на вторичную структуру пептидов включение дополнительной гидрофильной последовательности. Сопоставление спектров КД мембрана-ассоциированного пептида Р10С со спектрами ^модифицированного грамицидина показало, что добавление катионного домена не вносит существенных изменений в конформа-ционное равновесие КГА. Другими словами, появление неселективных пор не было связано с образованием пептидами какого-либо нового типа вторичной структуры, отличного от ранее описанных одиночных и двойных спиралей грамицидина. Из литературных данных известно, что никакие грамицидиновые структуры не способны проводить что-либо крупнее ионов аммония, что, наряду с чрезвычайно высоким уровнем проводимости неселективных пор, указывало на их олигомерный характер. Т.е. формирование высокопроводящих структур было основано на локальном взаимодействии в мембране нескольких молекул КГА.

Исследование природы песелективпых пор

Описано несколько механизмов нарушения пептидами проницаемости мембран при их локальной олигомеризащш. Для конкретизации данного процесса у КГА нами были исследованы сопряжённость порообразования с индукцией пептидами трансбислойной диффузии липидов. Кроме того, была изучена временная зависимость мембранной активности пептидов.

Сравнение утечки красителя из липосом и флип-флопа. индуцированных КГА

Для выяснения возможности участия липидов мембран в формировании неселективных пор была исследована корреляция концентрационных зависимостей (от мольного соотношения липид/пептид - л/п) флип-флопа и утечки содержимого липосом.

Изучение процесса флип-флопа проводили с помощью синтезированного нами флуоресцентно-меченного липида 1 -лауроил-2-( 1 -пиренбутироил)-5п-глицеро-3 -

фосфатидилхолина (руРС). Выбор данного соединения из предложенных на сегодняшний день подходов к изучению флип-флопа и затраты на его целенаправленный синтез (не относившийся к основной задаче представленной работы) были оправданы высокой информативностью пиренил-липидов по сравнению с другими метками, в то время как использование в качестве основы короткоцепо-чечного липида позволяло быстро и эффективно формировать асимметрично-меченные липосомы. Перераспределение молекул пи-ренил-меченного липида между слоями мембран в процессе флип-флопа приводит к снижению концентрации метки в исходно содержавшем её слое липидов и изменениям спектра флуоресценции эмульсии липосом, количественно пропорциональных уровню флип-флопа. Для оценки 100%-ого уровня флип-флопа были использованы спектры флуоресценции асимметрично-меченных липосом после 40 мин инкубации при 80°С.

Способность КГА индуцировать неселективную мембранную проводимость была исследована на липосомах, нагруженных карбоксифлуоресцеином (КФ) в концентрации самотушения. В данной системе нарушение мембранного барьера приводило к разбавлению красителя при его попадании в омывающий липосомы буфер и росту суммарной флуоресценции эмульсии. Для измерения 100%-ого уровня утечки красителя флуоресценцию измеряли после разрушения липосом детергентом Triton XI00.

В целом, на основании влияния пептидов на вышеописанные системы (индукция пептидом PK4N флип-флопа, его сопряжённость с процессом утечки красителя из липосом, зависимость активности от заряда поверхности липосом (рис. 3)) в качестве механизма индукции КГА неселективной проводимости мембран следует

9

1000 100 10 л/п, М/М

—»— ДОФХ утечка —» ■ ДОФХ флип-флоп ДОФГ утечка ДОФГ флип-флоп

Рис. 3 Утечка КФ и флип-флоп, индуцированные пептидом PK4N на липосомах, сформированных из цвиттерионных липидов (ДОФХ - диолеоилфосфатидилхо-лин) и анионных липидов (ДОФГ - дио-леоилфосфатидилглицерол).

принять образование тороидальных пептид-липидных пор, в состав стенок которых помимо пептидов также входят полярные головки липидов.

Интересными результатами, требующими более подробного дальнейшего изучения, являлись пониженная порообразовательная активность катионных пептидов на анионных липосомах по сравненню с цвиттерионными, а также отличия в структуре пор на липосомах разного заряда, проявлявшиеся в селективности флип-флопа (аналогичные особенности характерны для тороидальных пор, образуемых широко известным катионным амфипатичным пептидным токсином мелиттином).

Временная зависимость мембранной активности КГА

Помимо изучения структуры формируемых КГА пор, для понимания механизма процесса индукции неселективной проводимости необходимо было выяснить движущие силы процесса порообразования, а именно, являются ли проводящие структуры результатом спорадической случайной агрегации молекул пептида при их диффузии в мембране (при этом частота появления каналов должна быть пропорциональна соотношению пептид/липид в мембране) или имеет место временное нарушение структуры мембран в процессе транслокации пептида, исчезающее после полного перераспределения молекул КГА между слоями мембраны.

Для этого нами было изучено количество доступного для восстановления дитионитом натрия (БОТ) флуоресцентного красителя нитробензоксадиазола (МВО) в составе меченых липидов через разные промежутки времени инкубации симметрично-меченных липосом с пептидами. Данный подход предполагает измерение суммы эффектов, включающей затекание дитионита внутрь липосом через пептид-липидные поры и флип-флоп.

Исходя из полученных на пептидах РК4С и РК4Ы результатах, индукция неселективной проводимости была связана с двумя независимыми процессами. Было обнаружено, что количество доступного для восстановления красителя было заметно выше в случае добавления восстановителя вместе с пептидом, при этом в даль-

10

нейшем уровень активности выходил на плато (рис. 4). Т.е. при встраивании пептида в мембрану частота образования каналов (или их размеры) были выше, чем последующий стабильный уровень активности. Мы предположили, что данный эффект может быть связан с агрегацией пептида в растворе и с участием в индукции КГА неселективной проводимости, наряду с тороидальными порами, процесса, подобного «тонущему рафту», при первоначальном связывании пептидов с внешней поверхностью липосом.

Рис. 4 Временная зависимость активности пептида РК4Ы на липосомах. приготовленных из смеси ДОФХ/1% ЫВО-олеоил-ФХ. Предста&1ены кинетики гашения флуореа/енции симметрично меченных липосом (а) при добавлении БОТ, (б) при одновременном добавлении к лнпосомам ВОТ и пептида, (в) при добавлении 5£>Г через 15 мин посте добавления пептида.

Соотношение пептид/липид = ¡/256 моль/моль. время, мин

Агрегация КГА в растворе

Для реализации подобного механизма необходимо, чтобы с мембраной взаимодействовали не отдельные молекулы пептида, а крупные пептидные агрегаты. В целях проверки данной гипотезы, а также в рамках последующего изучения процесса комплексообразования с белками мы исследовали уровень агрегарован-ности КГА (на примере пептида РК4Н) в растворе. В качестве метода изучения нами была использована, как и при изучении связывания пептидов с белками в следующем разделе, флуоресцентная корреляционная спектроскопия. Данный подход основан на статистической обработке флуктуаций сигнала флуоресценции от микроскопического объёма внутри образца в условиях регистрации сигнала от малого числа молекул. Последующее автокоррелирование временного сигнала интенсивности флуоресценции позволяет получить информацию о коэффициенте диффузии и концентрации флуоресцирующих частиц.

Как и ожидалось исходя из высокой гидрофобное™ и жёсткой структурированности грамицидинового домена, пептиды в растворе существовали в виде крупных конгломератов, размер которых мог составлять десятки нм (рис. 5), что подтвер-

II

tD = 18 msec

\

ждало предложенную выше гипотезу о возможности реализации механизма «тонущего рафта» при связывании пептидов с мембранами.

Таким образом, весь процесс индукции КГА несе- " лективной проводимости мембран можно описать ^ следующим образом: пептидные агрегаты, сорби- оЦ руясь на мебране, приводят к кратковременному появлению сверхвысокопроводящих дефектов (по

т. sec

структуре, скорее всего, также представляющих Рис. 5 Автокорреляционная собой пептид-липидные комплексы), после чего функция родамин-меченного происходит равномерное распределение молекул пептида PK4N. Наблюдаемое

пептида по всему объёму мембраны и периодиче- ереш д"ФФУ™и = 18

сопоставимо с таковым 0,1 мки

ски спонтанно появляются тороидальные поры.

липосом.

Формирование нековалентпых комплексов с белками

Помимо изучения свойств пептцдов-переносчиков, понимание процесса трансдукции невозможно без детального исследования их взаимодействия с белками, и в случае образования между ними комплексов - их взаимодействия с мембранами.

Рис. 6 Формирование нековалентпых пептид-белковых комплексов. Вверху. Флуктуации флуоресценции при разных соотношениях пептид/белок. Внизу. Схематическое изображение соответствующих пептид-белковых агре-молекулы пептида • * '-у гатов.

Взаимодействие КГА с белками изучали на примере пептида PK4N и родамин-меченного бычьего сывороточного альбумина (Rh-БСА) методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии. В результате исследования был обнаружен постепенный рост размеров комплексов с увеличением соотношения концентраций пептида и белка в растворе, т.е. стехиометрия комплексов изменялась в

соотношение белок/пептид, М/М 80/1 160/1 640,

«А—«-id «is^-wi—V*

. молекулы Rh-БСА f ^

соответствии с соотношением пептид/белок. Данный результат проиллюстрирован на рис. 6, где в верхней части приведены записи флуктуаций флуоресценции для разного соотношения пептид/белок. Начиная с соотношения 80/1 в фокусе измерения наблюдается появление пиков с высокой амплитудой и большим временем диффузии, связанное с формированием крупных ярко флуоресцирующих частиц в результате пептид-белковой агрегации (рис. 6 внизу).

Взаимодействие пептид-белковых комплексов с искусственными мембранами

В рамках настоящей работы мембранную активность КГА в присутствии белков оценивали по утечке флуоресцентного красителя из липосом на примере пептида РК4Х и БСА. Был показан ннгибирующий эффект связывания белков с пептидами на мембранную активность последних. В то же время добавление даже очень большого количества белка не могло полностью подавить порообразовательную активность пептидов, что говорит о возможной мембранной активности комплексов.

При этом необходимо отметить, что полученные результаты носят предварительный характер и их однозначная интерпретация является весьма спорной (в частности, «мембранная активность комплексов» может являться результатом активности молекул пептида, десорбировавшихся с белка и оставшихся в мембране в процессе транслокации). В целом они могут рассматриваться как начало нового цикла исследований взаимодействия с модельными липидными системами нековалентных пептид-белковых комплексов.

Корреляция порообразующей и транедукнионной активности в пялу направленно модифицированных КГА

Необходимо отметить, что обнаружение у КГА способности формировать пептид-липидные поры само по себе вовсе не означает участие данного процесса в переносе белков. В связи с отсутствием достоверных методов для прямого иссле-

довання физико-химических основ процесса одновременного взаимодействия между пептидами, белками и липидами мембран, поиск взаимосвязи осуществляли косвенным путем через изучение зависимости структура-функция в ряду большой группы КГА по двум показателям: порообразоватсльной активности на искусственных мембранных системах и эффективности пептнд-опосредованного белкового переноса. Вывод о наличии взаимосвязи между данными процессами делали на основании анализа корреляции влияния модификаций пептидов на два вышеуказанных варианта активности. Для оценки уровня порообразовательной активности использовали индукцию утечки красителя из липосом. Транспортную активность оценивали по транедукции клеток НеЬа р-галактозидазой. В качестве меры эффективности переноса рассматривали скорость разрушения субстрата о-нитрофенил-Р-О-галактопиранозида при его добавлении к клеточным лизатам. Данный субстрат разлагается с образованием окрашенного продукта, концентрация которого может быть оценена спектрофотометрически (т.е. оценивалась условная активность фермента (в у.е.) по поглощению клеточных лизатов, проинкубированных с субстратом).

Изученные аналоги по характеру модификаций можно разделить на несколько рядов: по возможности формирования димерной формы, по относительной локализации катионного и гидрофобного доменов, по составу и длине катлонного и гидрофобного доменов. Также необходимо отметить, что в случае варьирования длины гидрофильного или гидрофобного доменов заранее предполагались слабые количественные изменения уровней активности, в связи с чем данные модификации рассматривались на больших сериях аналогов.

Уровень димеризации пептидов

Впервые индукция неселективной проводимости мембран была обнаружена при

ковалентной димеризации цнстеин-содержащих КГА в окислительных условиях.

Детальный анализ влияния димеризации на проводимость мембран и уровень

транедукционной активности в присутствии КГА проводили в восстановительных

условиях и на парах пептидов Р10С - Р5С и РК4И - РК4вМ, в которых пептиды

14

Р5С и РК4вЫ содержали остаток 0!у вместо Сув на соответстующей позищш. Как вндно нз рис. 7, для проявления пептидами обоих вариантов активности димеризация носила индуцирующий, но не обязательный характер.

А-

а,%

Б-

а, %

100 150 2М 250

время, с

1114**7*« 10 II

бита,, МК.М

п/п. ММ

Рис. 7 Влияние перехода мономер-димер иа мембранную (А и Б) и трансдукционную (В) активности КГА. А. Кинетика утечки КФ из липосом. Пептиды РЮС и Р5С. л/п = 256. В. Концентрационные зависимости уровня утечки КФ из липосом под действием пептидов PK4N и PK.4CN. Липосомы приготовлены из ДОФХ. С. (из [I]) Трапсдукция ¡S-галактозидазы в клетки HeLa пептидами РЮС и Р5С.

Относительная локализация катионного и гидрофобного доменов Из литературных данных известно, что локализация каких-либо модификаций на С или N-конце молекулы грамицидина, в связи с несимметричным распределением в ней аминокислот, может приводить к совершенно различному поведению полученных пептидов в мембранах. При рассмотрении пар КГА, идентичных по аминокислотному составу, но отличающихся по взаимному расположению доменов (ранее описанная пара РЮС - PIN и новые аналоги РК4С - PK4N), было показано, что данный параметр не оказывает сколько-нибудь существенного влияния ни на мембранную, ни на трансдукционную активности (рис. 8).

Отсутствие влияния взаиморасположения доменов, с нашей точки зрения, является одним из наиболее значимых свидетельств в пользу общности механизмов порообразования и белкового транспорта. Если во всех остальных случаях предполагаемые изменения уровня активности внутри серий пептидов носят количественный характер и могут быть интерпретированы с разных точек зрения и этапов взаимодействия пептидов с белками или мембранами, то в случае данной моди-

фикации речь идёт о принципиальных моментах механизма реализации пептидами потенциала активности на искусственных мембранных системах и на клетках. А.

1« «. %

n/n. М/М

мкм

п/п. МЛУ1

Рис. S Влияние взаимного расположения гидрофильного и гидрофобного доменов на активность КГА. (а) пептиды с С-концевым катионным доменом (Р10С, РК4С). (Ь) пептиды с N-концевым катионныи доменом (PIN, PK4N). А. Утечка КФ из липосом, приготовленных из ДОФХ. Пептиды РК4С (а) и PK4N (Ь). Б. Флип-флоп па липосомах, приготовленных из DOPG, Пептиды РК4С (а) и PK4N (Ь). В. (из [1]) Траисдущия [S-галактозидазы в клетки HeLa пептидами PI0C (а) и PIN(b).

Модификации катионного домена

Влияние состава катионного домена. Первоначально транедукционная активность была показана для пептидов, содержащих в качестве катионного домена сигнал ядерной локализации обезьяньего вируса SV-40. На основании полученных в данной работе результатов (рис. 7, 8, 9), а также анализа ранее опубликованных данных [1], можно утверждать, что ни порообразовательная, ни транспортная активности не зависели от наличия какой-либо специфической последовательности в гидрофильном домене. Определяющим фактором для проявления пептидами обоих видов активности являлось содержание в нём основных аминокислот.

Длина катионного домена. Ранее было показано, что как порообразовательной, так и транедукцконнои активностями обладают только положительно заряженные пептиды. Влияние на уровни активности величины заряда катионного домена было изучено на серии аналогов PK4N, PK.6N, PK8N и PK10N с зарядом гидрофильного домена от +4 до +10. Как видно из рис. 9, и мембранная, и транедукци-

онная активности изменялись пропорционально содержанию основных аминокислот.

А.100

и,%

Б.

PK10N "PKSN «3"1' "PK6N 5¿„,.

-PK4N Sí'

£ о oe —-

о |0. ¡-,0><

51о,Г 1

J .

PK10N PK8N

- PKSN

- PK4N

- Р10С

W 100 150 200

время, с

Рис. 9 Влияние длины катионно-го домена на активность КГА. А. Утечка КФ из липосом, приготовленных из ДОФХ. л/п = 200. Б. Трансдукция Р-галактозидазы в Kicmmi HeLa.

Модификации гидрофобного домена

Длина гидрофобного домена. При введении в пептиды-транспортёры грамициди-новой последовательности мы предполагали возможность появления каких-либо новых свойств по сравнению с рер-1 благодаря большей длине гидрофобной части формируемых пептидами структур и их достаточности для пересечения гиро-фобного слоя мембран. С целью изучения влияния на активность пептидов длины гидрофобного домена были синтезировали пептиды Р82С РБ6С, которые имели в своём составе грамицидиновую последовательность, укороченную с С-конца (т.е. со стороны, содержащей остатки триптофана). Как видно из рис. 10, это приводило к снижению активности в обеих тестовых системах, при этом примечательным фактом является практически полное исчезновение активности у пептида РБ4С, укороченного всего на 3 аминокислоты Тгр - 0-\7а1 - Тгр.

А-„

и. " о

Б.

-PS2C " 9 PS3C

PS4C s S „

PS5C g °

-PS6C ? s 14

Рис. 10 Влияние длины гидрофобного домена.

~ PS2C

~ PS3C Л. Утечка КФ из липосом. PS4C

PS5C приготовленных из ДОФХ. -PS6C

~РЮС л/п - 200. - Б. Трансдукция р-галакто-

ереня'° зидазы в клетки HeLa.

Таким образом, аналогично процессу порообразования, необходимым условием для проявления пептидами транспортной активности оказалась достаточная для перекрывания толщины мембраны длина пептидной спирали, что, очевидно, указывает на сходство механизмов данных процессов.

Замена остатков триптофана. Укорочение КГА по грамицидиновому домену, помимо снижения общей гидрофобности пептидов и длины гидрофобных спиралей, также приводило к уменьшению содержания в пептиде остатков Тф. В то же время, ранее в литературе встречались указания на возможную ключевую роль остатков Тгр при взаимодействии с белками пептида рер-1. Для проверки гипотезы о связи процесса переноса белков с длиной гидрофобного домена был синтезирован пептид PIleC, который вместо 2 концевых Тгр содержал остатки Ile и по содержанию Тгр соответствовал пептиду PS4C. Как видно из рис. 11, данный аналог сохранял как мембранную, так и трансдукционную активности практически на уровне исходного триптофан-содержащего пептида, в то время как его укороченный прообраз по содержанию Тгр PS4C был практически неактивен в обеих тестовых системах (рис. 10). Т.е. исчезновение трансдукционной активности при укорачивании гидрофобного домена пептидов не было связано с уменьшением содержания в пептидах остатков Тгр.

Рис. 11 Влияние замены остатков Тгр на Ile. Пептиды РК4С (а) и PIleC (б). А. Утечка КФ из липосом, приготовленных изДОФХ. Б. Трансдукция Р-галакто-зидазы в клетки HeLa.

Таким образом, на всех вышеперечисленных сериях КГА была выявлена полная корреляция между порообразовательной активностью на искусственных мембранных системах и транспортной активностью на эукариотических клетках, что указывало на близость физико-химических механизмов, лежащих в их основе.

Сравнение механизмов трансдукционной активности рер-1 и КГА

Таким образом, в результате представленных в работе исследований обнаружено формирование неселективных пептид-липидных пор пептидами, способными образовывать с белками нековалентные комплексы и транспортировать их внутрь клеток. Кроме того, найдены косвенные доказательства (на основе влияния на

18

л/п, М/М

активность пептидов модификаций аминокислотной последовательности) взаимосвязи физико-химических основ процессов трансдукции и формирования неселективных пептид-липидных пор. В этом отношении КГА существенно отличаются от ранее описанного белкового переносчика рер-1, для которого в работах Энри-кеса и Кастаньо не было обнаружено каких-либо каналоподобных образований в мембране.

В представленной работе в качестве механизма индукции пептидами неселективной проводимости мембран предложено два связанных процесса: спорадическое формирование тороидальных пор при диффузном распределении молекул пептида в мембране и формирование дефектов (скорее всего, также пептид-липидной природы) при связывании с мембранами пептидных агрегатов.

КГА принципиально не отличаются от рер-1 по аминокислотному составу: обе группы пептидов имеют 2 домена, гидрофильный катнонный и гидрофобный, обогащенный остатками триптофана. В то же время, данные пептиды сильно различаются по вторичной структуре: рер-1, согласно литературным данным, имеет достаточно лабильную структуру, содержащую элементы как неупорядоченной конформации, так и а-спирали и р-структуры, в результате чего молекулы рер-1 в растворе агрегированы достаточно слабо, тогда как молекулы КГА как в растворе, так и в липидном окружении содержат элементы жёстких упорядоченных гидрофобных грамицидиновых спиралей. Это обстоятельство приводит к формированию КГА в водной среде крупных агрегатов, что позволяет пептиду в месте встраивания в мембрану достигать локальной концентрации, достаточной для порообразования, тогда как рер-1 встраивается в мембрану более равномерно, что снижает возможность локального массового дисбаланса.

Помимо уровня агрегации, включение в состав КГА грамициднновой последовательности приводит к сильному увеличению длины гидрофобной области молекулы по сравнению с рер-1. Длина гидрофобной а-спирали рер-1 составляет максимум 19,5 А, т.е. он просто физически не способен пересечь гидрофобный

слой мембраны (-40 А). При этом КГ А, благодаря особенностям грамицидиново-го домена, способны формировать спиральные димеры и двойные спирали, длины которых вполне достаточно для перекрывания гидрофобного слоя мембраны (при этом уменьшение этой длины приводит к резкому падению порообразователытой активности). Т.е., по-видимому, особенностью, определяющей возможность формирования неселективных пор КГА и их отсутствие у рер-1, является наличие в составе КГА грамицидннового домена.

Рассмотрим теперь более подробно процесс белковой трансдукции. Если предполагать, что для проннкновення белков через мембрану необходимо формирование некоторого аналога олигомерных пептид-липидных пор или локальный массовый дисбаланс, должен существовать механизм, способствующий агрегации пептидов на мембране в месте проникновения. Очевидно, что при условии формирования пептид-белковых комплексов подобными центрами агрегации пептида могут являться сами молекулы белка, что и обеспечит наличие достаточного для формирования неселективной поры количества молекул пептида в месте проникновения. В то же время, в этом случае становится очевидным, что для проявления трансдукционной активности пептиду не обязательно иметь мембранную активность самому по себе, т.к. если последняя обеспечивается склонностью пептида к самоагрегации, то для транспортной активности достаточным условием может являться сорбция пептида на поверхности белка. Вероятно, данная ситуация и реализуется в случае пептида рер-1.

Примерная схема механизма трансдукции нековалентными пептидными векторами приведена на рис. 12. Схема построна на основе механизма, ранее предложенного для рер-1, с дополнениями и уточнениями, полученными в результате данной работы.

р-1

Рис. 12. Механизм актив-

ности пековалеитпых пептидов-псреносчиков.

бслок-петмд-лилидиая вмебрзне{8! OnUCüJtUe в УПСКСЮС.

пора (9)

С

агрегаты S растворе (6)

^' ( при их ковалентной диме-

S растворе (6) Слсва> Активность рер-1.

ризации.

Справа. Активность КГА. Маленькими красными кружками на пептидах обозначены SH-группы или S-S мостики

Активность КГА. КГА ввиду высокой гидрофобности и оформленной вторичной структуры (для упрощения схемы все молекулы КГА представлены в виде двойных спиралей) уже в растворе находится в агрегированном состоянии (6). Кроме того, агрегация может стимулироваться ковалентной димеризацией пептида через образование Б-Э связей. При взаимодействии подобных агрегатов с мембраной, а также при диффузном распределении пептида происходит формирование пептид-липидных олигомерных пор (8). Формирование комплекса пептидного агрегата с молекулой белка (7) обеспечивает высокую концентрацию пептида в потенциальной точке проникновения белка через мембрану и, соответственно, возможность формирования белок-пептид-липидного комплекса (9), по структуре сходного с неселективными порами (8).

Активность рер-1. Пептид рер-1 в отсутствие белка представлен в виде мономеров или ковалентных димеров в различной конформации, слабоагрегированных в растворе (2) и не агрегированных в мембране (4). Появление белковой глобулы стимулирует агрегацию пептида через сорбцию на её поверхности (3), что приводит к повышению локальной концентрации пептида в месте взаимодействия комплекса с мембраной и формированию белок-пептид-липидной каналоподобной структуры (5). Необходимо отметить, что представленное на рис. 12 образование

белок-пептид-липидной поры для рер-1 (5) пока ещё не подтверждено экспериментально и изображено по аналогии с таковым для КГА.

Выводы:

1. Синтезированы 5 ранее описанных и 12 новых химерных пептидов, включающих гидрофобный домен на основе последовательности грамицидина А, модифицированный с N или С-конца гидрофильной катионной или анионной последовательностью.

2. На примере нескольких типичных представителей исследовано взаимодействие амфипатичных грамицидиновых аналогов с искусственными мембранными системами. Наряду с ранее показанной для подобных пептидов способностью формировать грамицидин-подобные катион-селективные каналы, при высоких концентрациях пептидов обнаружена индукция неселективной проводимости мембран.

3. На основании участия молекул липидов и ряда других признаков в качестве механизма индукции неселективной проводимости предложено формирование катионными производными грамицидина А структурных аналогов тороидальных пептид-липидных пор. Кроме того, в качестве дополнительного механизма предложена индукция каналообразования по аналогии с процессом т.н. «тонущего рафта» при взаимодействии с мембранами пептидных агрегатов.

4. Методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии подтвервдено ранее описанное образование нековалентных комплексов с белками. Обнаружен постепенный рост размеров комплексов с увеличением соотношения концентраций пептида и белка в растворе, т.е. стехиометрия комплексов изменялась при изменении соотношения пептид/белок.

5. В ряду 16 катионных производных грамицидина А выявлена высокая степень корреляции между порообразованием и транспортной активностью, свидетельствующая о близости физико-химических механизмов этих двух процессов.

6. Предложен механизм белковой трансдукции, основанный на экстраполяции мембранной активности пептидов на взаимодействие с липидными бислоями

22

пептид-белковых комплексов. В предложенной системе в качестве определяющего момента процесса переноса предполагается формирование пептид-белковых комплексов в растворе как механизм, обеспечивающий повышенную и достаточную для формирования каналоподобного образования концентрацию пептидов в месте взаимодействия комплекса с мембраной.

Цитируемая литература

[1] Стоилова ТБ, Синтез и свойства химерных мембрано-активных пептидов на

основе грамицидина А, автореф. дис. канд. биол. наук, ИБХ РАН - М., 2008- 23

стр.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Antonenko YN, Stoilova ТВ, Kovalchuk SI, Egorova NS, Pashkovskaya AA, Sobko AA, Kotova EA, Sychev SV, Surovoy AY, Large unselective pore in lipid bilayer membrane formed by positively charged peptides containing a sequence of gramicidin A, FEBS Lett. 2005, 579 (23), 5247-5252.

2. Antonenko YN, Stoilova ТВ, Koyalchuk SI, Egorova NS, Pashkovskaya AA, Sobko AA, Kotova EA, Surovoy AY, Redox-regulated ion channel activity of a cysteine-containing gramicidin A analogue, Biochim Biophys Acta. 2006, 1758 (4), 493-498.

3. Стоилова ТБ, Дуцева EA, Пашковская AA, Сычев CB, Ковальчук СИ, Собко АА, Егорова НС, Котова ЕА, Антоненко ЮН, Суровой АЮ, Иванов ВТ, Различные типы ионных каналов, индуцированные в липидных мембранах производными грамицидина А, несущими на С-конце катионную последовательность, Биоорг. химия 2007,33 (5), 511-519

4. Stoilova ТВ, Kovalchuk SI, Egorova NS, Surovoy AY, Ivanov VT, Gramicidin Abased peptide vector for intracellular protein delivery, Biochim Biophys Acta. 2008, 1778 (10), 2026-2031.

5. Kovalchuk SI, Kotova EA, Stoilova ТВ, Sychev SV, Egorova NS, Surovoy AY, Antonenko YN, Ivanov VT, Positively charged gramicidin A based peptides form

23

two types of membrane channels, Adv Exp Med Biol, The proceedings of the 20th American Peptide Symposium 2007, (Valle S, Escher E, Lubell WD, Eds.), 2009, 611,565-566.

6. Собко AA, Ковальчук СИ, Котова EA, Антоненко ЮН, Индукция флип-флопа липидов колицином Е1 - признак образования белково-липидных пор в мембранах липосом, Биохимия, 2010, 75 (6), 819-826.

Тезисы докладов

1. Stoilova ТВ, Kovalchuk SI, Egorova NS, Antonenko YN, Surovoy AY, Ivanov VT, Cationic motif linked to gramicidin A induced protein delivery into cells, Abstract book of the 2nd workshop on Biophysics of Membrane-active peptides, Lisbon, Portugal, 2007, 113.

2. Петрова AC, Толчева ЕВ, Ковальчук СИ, Стоилова ТБ, Егорова НС, Иванов ВТ, Внутриклеточная доставка белковых молекул с помощью поликатионных аналогов грамицидина А, Тезисы докладов 4-ого Российский симпозиум "Белки и пептиды", Казань, 2009,70.

3. Ковальчук СИ, Толчева ЕВ, Петрова АС, Егорова НС, Стоилова ТБ, Антоненко ЮН, Суровой АЮ, Иванов ВТ, Каналоформерная активность как возможный механизм внутриклеточной дотавки белков нековалентными пептидными векторами на основе поликатионных аналогов грамицидина А, Тезисы докладов 4-ого Российского симпозиума "Белки и пептиды", Казань, 2009,202.

4. Kovalchuk SI, Tolcheva EV, Petrova AS, Egorova NS, Stoilova ТВ, Kotova EA, Antonenko YN, Surovoy AY, Ivanov VT, Channel-forming activity as a possible pathway of intracellular protein delivery mediated by noncovalent peptide vectors based on polycationic gramicidin A analogues, Abstracts of the 3rd International Symposium "Intracellular Delivery of Theuraputic Molecules: from bench to bedside", Montpellier, France, 2009, 60.

Подписано в печать 14 сентября 2010 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 687 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Оглавление.

Список сокращений.

1 Введение.

2 Литобзор.

2.1 Введение.

2.2 Катионные амфипатичные пептиды.

2.2.1 Состав и свойства АМП.

2.2.2 Мембранная активность катионных амфипатичных РАМП.

2.2.2.1 Индивидуальная структура молекул РАМП.

2.2.2.2 Надмолекулярная организация РАМП в мембране.

2.2.2.2.1 Связывание пептидов с мембранами.

2.2.2.2.1.1 Агрегация пептидов на поверхности мембраны.

2.2.2.2.2 Транслокация.

2.2.2.2.2.1 Механизм «тонущего рафта».

2.2.2.2.2.2 Молекулярная электропорация.

2.2.2.2.2.3 Тороидальная пора.

2.2.2.2.2.4 Альтернативные варианты пор.

2.2.2.2.2.5 Потенциал-зависимость.

2.2.2.2.2.6 «Всё-или-ничего» У8 ступенчатый выход.

2.2.2.2.2.6.1 «Всё-или-ничего».

2.2.2.2.2.6.2 Ступенчатый выход.

2.2.2.2.2.6.3 Интегральная утечка.

2.2.2.2.3 Глобальные структурные изменения мембран.

2.2.2.2.3.1 Механизм ковра, или детергент-подобный механизм.

2.2.2.2.3.2 Слияние мембранных везикул.

2.2.2.2.4 Селективность утечки.

2.2.2.3 Принцип определения механизма активности АМП.

2.2.2.3.1 Спонтанная кривизна мембраны.

2.2.2.3.2 Влияние пептидов на спонтанную кривизну.

2.2.2.3.3 Изменение толщины мембраны.

2.2.2.3.4 Факторы, влияющие на активность АМП.

2.2.2.3.4.1 Мембранные факторы.

2.2.2.3.4 1.1 Влияние заряда мембраны.

2.2 2 3.4 1.2Зависимость от модуляторов спонтанной кривизны мембраны.

2 2.2.3.4.1 3 Влияние фазы липидов на активность АМП.

2 2 2.3.4.1.4 Влияние АМП на ламеллярные фазы липидов.

2 2 2.3 4 1.5 Влияние АМП на форму везикул.

2.2.2 3.4.2 Влияние состава пептидов.

2.2.2.3.4.2.1 Гидрофобность.

2 2.2.3.4 2 2Глубина секторов.

2.2.2.3.4.2.3 Другие факторы

2.2.2.3.4 3 Влияние рН и температуры.

2.2.2.3 5 Теория «двух состояний».

3 2 Синтез пептидов. . 90

3 3 Анализ уровня димеризации цистеин-содержащих пептидов. . 92

3 4 Взаимодействие КГА с мембранами 93

3.4.1 Исследование селективности пептид-индуцированной мембранной проводимости .93

3.4.2 Исследование проводимости одиночных КГА-индуцированных мембранных дефектов (пор).98

3 4.3 Структура КГА.102

3.4.4 Исследование природы неселективных пор.105

3.4 4.1 Утечка карбоксифлуоресцеина из липосом.106

3.4 4.2 Измерение скорости трансбислойной диффузии липидов (флип-флопа) на пиренил-меченных липосомах.108

3.4 4 2 1 Проверка асимметричности липосом.110

3 4 4 2.2 Температурозависимый флип-флоп. 111

3 4.4 2 3 Исследование флип-флопа на модельных АМГТ мелиттине и магайнине-2 .113

3.4 4 2.4 Влияние пептидов на симметрично меченные липосомы.115

3.4.4.3 Сравнение утечки красителя из липосом и флип-флопа, индуцированных КГА.117

3.4.4.4 Временная зависимость мембранной активности КГА .122

3.4.4.4.1 Восстановление NBD-групп дитионитом натрия на симметрично меченных липосомах . 122

3 4 4.4.2 Метод изучения временной зависимости уровня мембранной активности пептидов . 125

3 4.4.4.3 Исследование временной зависимости взаимодействия КГА с мембранами. 127

3 4 5 Заключение по разделу «Взаимодействие КГА с мембранами».129

3 5 Агрегация КГА и формирование нековалентных комлпексов с белками в растворе . . 130

3.5.1 Агрегация КГА в растворе.131

3.5.2 Формирование нековалентных комплексов с белками.133

3 б Взаимодействие пептид-белковых комплексов с искусственными мембранами . .135

3 7 Корреляция поробразующей и трапсдукционнои активности в ряду направленно модифицированных КГА . . . 138

3.7.1 Уровень димеризации пептидов.139

3 7.2 Локализация поликатионной последовательности .140

3.7.3 Состав катионной последовательности.142

3.7.4 Длина катионного домена (заряд).142

3.7.5 Длина гидрофобного домена.143

3.7.6 Замена остатков триптофана на изолейцин.145

3.7.7 Заключение по влиянию модификаций аминокислотной последовательности пептидов на их активность.146

3.8 Сравнегше механизмов трансдукциогтой активности рер-1 и КГА.147

4 Материалы и методы.153

4.1 Получение Fmoc-производных D-аминокислош (Fmoc-D- Val и Fmoc-D-Leu) . 153

4.2 Пептидный синтез.154

4.2.1 Присоединение первой аминокислоты к хлор-тритильной смоле.154

4.2.1.1 Анализ нагрузки первой аминокислоты на хлор-тритильной смоле. 155

4.2.2 Наращивание полипептидной цепи.155

4.2.2.1 Ручной синтез.155

4.2.2.2 Автоматический синтез.156

4.2.3 Модификация а-ЬШЬ-группы пептидил-полимера.157

4.2.3.1 Ацетилирование пептидил-полимеров по a-NH2-rpynne.157

4.2.3.2 Присоединение Вос-защиты.157

4.2.3.3 Присоединение родамина (получение лиссамин родамин В сульфонил -пептидов).157

4.2.4 Тест Кайзера — качественный тест на наличие аминогрупп на пептид ил-полимере.158

4.2.5 Отщепление пептидов от полимеров.158

4.2.5.1 Отщепление пептидов с одновременным деблокированием.158

4.2.5.2 Отщепление пептидов без деблокирования (с сохранением защитных групп).159

4.2.6 Выделение продукта из реакционной смеси.159

4.2.6.1 Аналитическая ОФ-ВЭЖХ.159

4.2.6.2 Масс-спектрометрия.160

4.3 Измерение концентрации пептидов.160

4.4 Анализ уровня димеризации Cys-содержащих пептидов.160

4.4.1 Тест Эллмана.160

4.5 Исследование пептидов на искусственных мембранных системах.161

4.5.1 Измерение проводимости на Б ДМ.161

4.5.2 Приготовление моноламеллярных липосом.161

4.5.3 Измерение электрического потенциала на мембране.162

4.5.4 КД спектроскопия.162

4.5.5 Измерение утечки карбоксифлуоресцеина из липосом.163

4.5.6 Измерение скорости флип-флопа с использованием 1-лауроил-2-(1-пиренбутироил)-зп-глицеро-3-фосфатидилхолина (руРС).164

4.5.6.1 Синтез 1-лауроил-2-(1-пиренбутироил)-зп-глицеро-3-фосфатидилхолина (руРС).164

4.5.6.2 Приготовление меченых липосом.165

4.5.6.3 Подтверждение асимметричности липосом.166

4.5.6.3.1 Спонтанный флип-флоп.166

4.5.6.3.2 Межлипосомный обмен липидами.166

4.5.6.4 Измерение скорости пептид-опосредованного флип-флопа.166

4.5.6.5 Влияние пептидов на симметрично меченные липосомы.167

4.5.6.6 Измерение пептид-опосредованного флип-флопа.167

4.5.7 Исследование стабильности каналов.168

4.5.7.1 Приготовление симметрично меченных липосом.168

4.5.7.2 Влияние пептидов на тушение флуоресценции симметрично меченных липосом при добавлении SDT.168

4.6 Изучения самоагрегации пептидов и их связывания с белками в растворе. 169

4.6.1 Теоретические основы метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС).169

4.6.2 Получение родамин-меченного производного БСА.173

4.6.3 Флуоресцентная корреляционная спектроскопия.174

4.6.4 Исследование формирования нековалентных комплексов.174

4.7 Исследование пептидов in vitro на эукариотических клетках.174

4.7.1 Клеточные культуры.174

4.7.2 Трансдукция клеток Р-галактозидазой.175

5 Выводы.176

6 Литература.178

Список сокращений

Вос20 ди-трет-бутил пирокарбонат

СРР cell penetrating peptides - мембрано-проникающие пептиды

DCM дихлорметан

DIC ]Ч,]Ч-диизопропил-карбодшшид

DIPEA N -эти л дииз опро пи л амин

DMEM питательная среда (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

DMF ]\Ш'-диметилформамид

DMPC димиристоилфосфатидилхолин

DMSO диметисульфоксид

DOPC дио л ео ил ф о с ф атиди лхо л ин

DOPE-NBD 1,2-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-(7-нитро-2

1,3-бензоксадиазол-4-ил) DPhPC дифитаноилфосфатидилхолин DSPG дистеароилфосфатидилхолин DTT дитиотреитол EDT этандитиол ЕЮН этанол

Fmoc флуоренилметоксикарбонил GA грамицидин А

GUV гигантские моноламеллярные везикулы HOBt 1-гидрокси-бензтриазол MES 2-(К-морфолино)этансульфоновая кислота NBD 7-нитробенз-2-окса-1,3 -диазол

NBD-OPC 1-олеоил-2-(12-((7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) амино) лауроил)-.ул-глицеро-3-фосфатидилхолин NLS сигнал ядерной локализации NMP N-метил-пирролидон oNPG о-нитрофенил-р-В-галактопиранозид РА фосфатидная кислота

PC фосфатидилхолин

РЕ фосфатидилэтаноламин

PG фосфатидилглицерол

PS фосфатидилсерин

PTD protein transduction domain - домен белковой трансдукции py PC 1 -лауроил-2-( 1 -пиренбутироил)-8П-глицеро-3 -фосфатидилхолин

SDS додецилсульфат натрия

SDT sodium dithionite, дитионит натрия, Na2S204

SoyPC соевый фосфатидилхолин

ВиОН трет-бутанол

TFA трифторуксусная кислота

TFE трифторэтанол

THF тетрагидрофуран

ТТЗтриизопронилсилаи

Tris трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-|3-0-галактозид аАМП а-спиральные АМП p-Gal р-галактозидаза

ЗАМП АМП, образующие р-шпильку

АА аминокислота

АМП антимикробные пептиды

БЛМ бислойная липидная мембрана

БСА бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ гель фаза

ЖКФ жидкокристаллическая фаза

КГ А катионные грамицидиновые аналоги

КД круговой дихроизм

КФ/CF карбоксифлуоресцеин л/п соотношение липид/пептид (моль/моль) (используется в разделе «результаты»)

М метанол

МС масс-спектрометрия НАМП нерибосомальные АМП НК нуклеиновая кислота ОФ-ВЭЖХ обращено-фазовая ВЭЖХ ПААГ-электрофорез электрофорез в полиакриламидном геле п/аДСк[^5'6 параллельная/антипараллельная правозакрученная/левозакрученная двойная спираль с 5,6 аминокислотными остатками на виток п/аОСяд6'3 параллельная/антипараллельная правозакрученная/левозакрученная одиночная спираль с 6,3 аминокислотными остатками на виток п/л соотношение пептид/липид (моль/моль) (используется в разделе «литобзор»)

РАМП рибосомальные АМП тдс теория двух состояний тех тонкослойная хроматография

ФКС флуоресцентная корреляционная спектроскопия

X хлороформ цпм цитоплазматическая мембрана

1 Введение

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) является физическим барьером, отделяющим клетку от окружающей среды и препятствующим свободному обмену химических соединений между ними. Для транспортировки через ЦПМ и доставки внутрь клеток крупных молекул, например белков или нуклеиновых кислот, используются разнообразные приёмы, которые можно условно разделить на две основные группы: транспорт с использованием липидных везикул и транспорт через искусственные мембранные дефекты.

К липосомальному транспорту можно отнести как полученные in vitro из синтетических или природных липидов липосомы, нагруженные целевым веществом, так и использование способности клеток к эндоцитозу, когда часть цитоплазматической мембраны уходит в цитоплазму в виде эндосом, при этом всё, что было сорбировано на поверхности данного участка мембраны, оказывается внутри липидных везикул в цитоплазме клеток. Выход целевых соединений непосредственно в цитоплазму может осуществляться в результате утечки при актах слияния и сортинга эндосом в аппарате Голь-джи. Наряду с широкими возможностями, данный подход также имеет ряд недостатков, связанных со сложностью формирования и использования терапевтически активных лекарственных форм препаратов, а также с проблемами высвобождения агентов внутри клеток в интактной форме.

К методам внутриклеточной доставки через искусственно созданные мембранные дефекты относятся такие подходы как электропорация, бомбардировка частицами золота с нанесёнными терапевтически активными соединениями, обработка клеток ультразвуком и т.д., т.е. воздействия, приводящие к появлению в ЦПМ физических повреждений. Минусом подобных подходов является серьёзное нарушение мембранного барьера клеток, что, в конечном итоге, часто приводит к их гибели. Кроме того, к этой же группе методов можно отнести использование различных нелипосомальных векторных систем, позволяющих временно локально изменять проводимость мембран, например системы на основе вирусных частиц или химические агенты, нарушающие упорядоченность БЛМ. Данные методы лишены как основного минуса липосомальных систем, т.е. проблемы попадания внутрь клеток интакт-ного материала, так и в достаточно малой степени и очень локально затрагивают целостность мембранного барьера.

В последние годы в связи с широким распространением методов автоматического секвенирования ДНК появилось множество задач, связанных с поиском биологической активности теоретически предполагаемых белковых продуктов экспрессии найденных генов. Однако, в то время как технология доставки нуклеиновых кислот разрабатывалась в течение десятилетий, что к сегодняшнему дню привело к появлению множества высокоэффективных подходов и препаратов (преимущественно, предполагающих нековалентное связывание с НК) для трансфекции эукариотических клеток, методология доставки белков находится на очень низком уровне развития.

Гидрофильные цитоплазматические белки не способны самопроизвольно пересекать клеточную мембрану за исключением очень небольшой группы, в которую входят, например, Tat-белок вируса иммунодефицита человека, белок vp22 вируса простого герпеса и ещё ряд белков различного, в т.ч. невирусного, происхождения. Их транслокационная способность обеспечивается содержанием в последовательности небольших доменов, основной чертой которых является высокое содержание основных аминокислот (т.н. PTD (protein transduction domains) - домены белковой трансдукции). Более того, синтетические пептиды, соответствующие таким доменам, а также синтезированные по аналогии с ними поликатионные пептиды случайного состава, например гомоолигомер аргинина, оказались способны проникать через цито-плазматическую мембрану и без остального белкового окружения. Все подобные пептиды (как природные, так и сконструированные по аналогии искусственные) были условно объединены в группу т.н. «мембрано-проникающих пептидов» (СРР - cell penetrating peptides). К сожалению, механизм процесса транслокации как целых белков, так и их пептидных фрагментов однозначно до конца не выяснен, хотя существует ряд работ, описывающих возможные схемы взаимодействия отдельных представителей с мембранами [1,2].

На основании этих данных было предложено ввести в последовательность белков, которые нужно было транспортировать внутрь клеток, дополнительную пептидную последовательность домена белковой трансдукции. Самый прямой и логичный способ, использующийся на данный момент, предполагает их предварительную ковалентную конъюгацию, которая может достигаться при помощи нескольких подходов, например создание плазмиды, кодирующей конъюгат целевого белка и домена белковой трансдукции, с последующей экспрессией in vitro и выделением продукта (например, [3, 4]), или химическая конъюгация предварительно полученных или выделенных белков с PTD-пептидами в растворе (например, [5]). Наряду с высокой эффективностью данные подходы имеют также и свои недостатки. В частности, синтез конъюгатов через плазмиды является чрезвычайно трудоёмким и сложным процессом, т.к. включает в себя большое количество стадий, а также сталкивается с проблемами, связанными с особенностями системы белковой экспрессии обычно используемых для наработки белков прокариотиче-ских клеток, не способных корректно синтезировать белки эукариот. Химическая конъюгация проще и удобнее для практического использования, однако ограничениями данного метода является необходимость наличия свободных активных групп на поверхности белка, а также невозможность заранее предсказать, как подобная необратимая модификация скажется на биологической активности макромолекулы.

Альтернативой ковалентной конъюгации белков с PTD-домеиами является использование пептидных векторов, способных обратимо сорбироваться на поверхности белков за счёт образования лабильных нековалентных связей (гидрофобные, электростатические и т.д.) [6, 7], которые бы при попадании в клетку разрушались, освобождая при этом нативную молекулу белка. Данный подход был реализован в 2001 г. группой французских учёных с исполь

12 зованием пептида рер-1 [8, 9], который состоит из гидрофобного триптофан-содержащего домена и гидрофильного поликатионного домена, обогащенного остатками лизипа. Для рер-1, а позднее и для ряда его аналогов, была показана высокая трансдукционная активность с сохранением функциональной активности белков после переноса [9-12].

Некоторое время назад в нашей лаборатории способность переносить белки в эукариотические клетки (с использованием в качестве модельного белка фермента р-галактозидазы) была обнаружена у пептидов - аналогов природного антибиотика грамицидина А, несущих обогащенную основными аминокислотами концевую гидрофильную последовательность - катионными гра-мицидиновыми аналогами (КГА) [13]. Было показано, что подобные пептиды, аналогично пептиду рер-1, способны формировать нековалентные комплексы с белками с их последующим переносом через клеточную мембрану. Важным преимуществом КГА перед рер-1 являлось снижение активного соотношения пептид/белок и повышение эффективности переноса, по всей видимости связанных с использованием в качестве гидрофобного домена последовательности грамицидина. Также отличительными чертами КГА являлась их способность в отсутствие белков формировать в мембранах катион-селективные каналы, свойственные природному грамицидину А, а также вызывать в некоторых условиях неселективную проводимость мембран.

В то же время возможности оптимизации метода внутриклеточного транспорта белков в составе нековалентных комплексов с пептидами-переносчиками и расширения спектра трансдукционно-активных соединений значительно ограничивались недостаточной изученностью механизма доставки как с помощью рер-1, так и с помощью КГА. Единственным общепринятым фактом являлась энергетическая независимость транслокации пептид-белковых комплексов, а также локализация белков внутри клетки вне маркерных областей какого-либо из вариантов эндоцитоза [8, 10-12]. Таким образом, транспорт осуществлялся в процессе прямого взаимодействия ком-( плексов с липидами мембран, а, поскольку белки не в состоянии самопроиз

13 ь вольно проникать в клетку, основной вклад в данное взаимодействие, очевидно, вносят пептиды-переносчики.

Целью настоящей работы являлось детальное исследование взаимодействия КГА с модельными мембранными системами и с транспортируемыми белками как в растворе, так и в присутствии липосом. Кроме того, в культуре эукариотических клеток НеЬа была изучена пептид-опосредованная трансдукция модельного белка Р-га лактозттдазы и прослежена корреляция транспортной активности с поведением тех же пептидов в искусственных мембранных системах. С этой целью наряду с ранее описанными КГА нами была также получена серия новых производных, отличающихся по таким признакам как длина катионного и гидрофобного доменов и их относительная локализация в последовательности пептида.

Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании физико-химических механизмов, лежащих в основе трансдукции белков катионными грамицидиновыми аналогами. Обнаруженная нами полная корреляция между эффективностью транспорта и каналооб-разователыюй активностью КГА на искусственных мембранных системах позволяет рассматривать формирование ими пептид-липидных пор как необходимое условие и существенный этап процесса транслокации нековалент-ных пептид-белковых комплексов.

2 Литобзор

Взаимодействие катионных амфипатичных пептидов и грамицидина А с мембранами

2.1 Введение

Как было отмечено выше, данная работа посвящена изучению поведения катионных аналогов грамцидина А (КГА) в искусственных мембранных системах. Поскольку все пептиды этой группы представляют собой «химеры», построенные из двух доменов: с одной стороны, гидрофобного грамицидина А или его аналога, а с другой, катионного олигопептида,— в литературном обзоре мы знакомим читателя с имеющимися данными о структурно-функциональных взаимоотношениях обширного семейства катионных амфипатичных пептидов.

Кроме того, учитывая уникальные структурные особенности грамицидина А. а также его каналообразующие свойства, отдельный раздел будет посвящен пептидам этой группы.