Влияние фазового состояния липидной мембраны на состав и строение комплекса поликатион-липосомы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ и ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

г, д 0 Д ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

1 1 НОЯ Шз

На правах рукописи

УДК 541(183.12+49+64):536.7

ЕФИМОВА Анна Александровна

Влияние фазового состояния липнднон мембраны из состав п строение комплекса полпкатион-липосомы

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединении

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1996

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: академик, доктор химических наук, профессор В.А. Кабанов доктор химических наук, A.A. Ярославов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Р.В.Тальрозе кандидат химических наук И.Н.Курочкин

Ведущая организация:

Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится 1996 года в^часов на заседании

диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 1996 года.

Ученый секретарь спец. диссертационного совета, кандидат химических наук А.А.Миронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последнее время усиливается интерес к использованию синтетических иопогенных полимеров в различных областях биологии и медицины. Так, например, на их основе были разработаны новые высокоэффективные лекарственные вещества, вакцинирующие препараты и средства доставки генетического материала в клетки. Развитие работ и этом направлении требует детального понимания молекулярных механизмов взаимодействия синтетических полиэлектролитов с клетками. Однако круг вопросов, касающийся поведения таких полимеров на поверхности клетки, реакции клеточной мембраны на адсорбированный полимер и обратимости такого взаимодействия, остается практически неисследованным. Адсорбция полимера на поверхности клетки может сопровождаться появлением асимметрии в распределении липидов в пределах каждого монослоя и между слоями, изменениями в проницаемости мембраны, а также агрегацией, слиянием и даже разрушением клеток. После удаления полимера (если такое удаление возможно) с поверхности клетки мембрана может пе вернуться в исходное состояние. Перечисленные выше процессы могут повлиять на биологические функции клетки и должны быть приняты во внимание при описании поведения полимеров в контакте с клеточной мембраной.

В подобных физико-химических исследованиях в качестве модели клеточной мембраны часто используются бислойные сферические везикулы (липосомы). Размеры липосом сопоставимы с клеточными; их поверхность, так же как и поверхность клетки, может нести отрицательный заряд; но в отличие от живых клеток, модельные частицы стабильны и их поверхность может быть полностью охарактеризована.

Цель работы состояла в изучении взаимодействия синтетического поликатиона (кватернизованного поли-4-винилпиридина) со смешанной липидной мембраной, состоящей из отрицательно заряженного кардиолипина (дифосфатидилглицерола) и нейтрального ципальмитоилфосфатидилхолина. В работе исследовали: • влияние фазового состояния лигшдной мембраны на состав и строение

комплекса поликатион-липосомы; » возможность удаления ноликатиона с поверхности липосом; ► обратимость структурных перестроек в процессе адсорбции/десорбции поликагиона.

Научная новизна. В работе показано, что фазовое состояние щпидной мембраны оказывает влияние на состав и строение комплексов юликатиопа с противоположно заряженными липосомами. Ниже

температуры фазового перехода (в случае твердых липосом) в образовании комплекса принимают участие лишь отрицательно заряженные лииидные молекулы, расположенные на внешней стороне мембраны. Выше температуры фазового перехода (в случае жидких лииосом) адсорбция поликатиона индуцирует переход отрицательно заряженных липидных молекул с внутренней на внешнюю сторону мембраны. Параллельно с этим наблюдается латеральная сегрегация липидов, заключающаяся в концентрировании отрицательно заряженного кардиолипина вблизи адсорбирующихся молекул поликатиона. В результате, в образовании комплекса с поликатионом принимают участие все отрицательно заряженные липиды мембраны. Показано, что поликатион фиксирует положение липидов в бислое и делает практически невозможным процесс обмена липидами между отдельными липосомами.

Впервые исследована возможность удаления поликатиона с поверхности липосом, а также обратимость структурных перестроек I! процессе адсорбции-десорбции поликатиона.

Показано, что поликатиона не может быть удален с поверхности твердой липидной мембраны. Установлено, что поликатион, адсорбированный па поверхности жидких липосом, может быть полностью десорбирован в раствор в результате образования нестехиометричного интерполиэлектролитного комплекса с синтетическим полианионом.

Впервые показано, что после удаления поликатиона с поверхности жидких липосом полностью восстанавливается исходное распределение липидов в латеральном и трансмембранном направлениях, при этом липиды вновь приобретают возможность перемещаться между отдельными липосомами.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты имеют принципиальное значение для понимания механизмов взаимодействия синтетических полиэлектролитов с клеточной мембраной. Эти результаты позволяют прогнозировать поведение синтетических полимеров, адсорбированных на клеточной мембране, а также реакцию клеточной мембраны на адсорбированный полимер.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались па Международной научной конференции аспирантов и студентов "Ленинские горы -95" (Россия, Москва, 1995); 1-ом Международном симпозиуме по полиэлектролитам (Германия, Потсдам, 1995); 6-ой Международной конференции "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах" (Россия, Иваново, 1995), 7-ой Международной конференции "Органические реакции с участием полимеров" (Польша, Вроцлав, 1996); 24-ом Международном конгрессе

Федерации Европейских биохимических сообществ (Испания, Барселона, 1996)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 стр. машинописного текста, содержит 33 рисунка, 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 107 ссылок.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цель и задачи.

В литературном обзоре проанализированы приведенные в литературе данные по структуре липидного бислоя и изменениям, происходящим в липидной мембране при ее фазовом переходе из твердого состояния (состояния геля) в жидкокристаллическое, а также подробно обсуждены эффекты, вызываемые в липидном бислое адсорбированными пол и катионами: полиаминами, полилизином, полигистидипом.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе использовали: статистический сополимер КГ-зтил-4-винияпиридшшйбромид/4-винилпиридин (95/5) (ПЭВП) степени полимеризации 1070 и полиакриловую кислоту (ПАК) степени полимеризации 1000. Для получения липосом использовали этанольные растворы кардиолипина (ЮГ) (дифосфатидилглицерола),

дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и дипальмитоил-фосфатидилэганоламина, меченого флуоресцеинизотиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ). В работе использовали смешанные ДПФХ-КЛ липосомы, в которых молярная доля отрицательно заряженных полярных головок КЛ хд= 1 /2[КЛ]/(1/2[КЛ]+[ДПФХ]) составляла 0,05; 0,1; 0,15. Размер липосом был равен 40-60 нм. Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц.

Измерение электрофоретической подвижности и среднего гидродинамического диаметра частиц проводили методом квазиупругого эассеяния лазерного света. Фазовые переходы в липосомах исследовали метолом микрокалориметрии на адиабатном сканирующем иикрокапориметре. В работе также использовались методы флуориметрии, УФ-спектроскопии, кондуктометрии и нотенциометрии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В работе исследовано взаимодействие синтетического поликатиона, ПЭВП с моноламеллярными смешанными отрицательно заряженными ДПФХ-КЛ липосомами. Изменением температуры задавалось различное фазовое состояние липосомальной мембраны: оно могло быть твердым, в котором подвижность липидных молекул как целого резко ограничена; или жидким, в котором лшшдные молекулы способны перемещаться вдоль каждого из формирующих мембрану монослоев (латеральная подвижность), а также переходить из одного монослоя в другой (трансмембранная миграция или флип-флоп). Это позволило проследить за тем, как фазовое состояние бислоя сказывается на строении образующихся полпкатиоп-липидных комплексов и обратимости контакта поликатион-липосома.

I. Лнпосомальпая мембрана.

Температура фазового перехода ДПФХ-КЛ (у кл=0,1) липосомальной мембраны была определена методом микрокалориметрии (рис.1). Как следует из рисунка, липосомы, полученные озвучиванием при 55°С в течение 400 с, характеризуются широким фазовым переходом с максимумом при температуре около 39°С и плечом при температуре около 34,5°С, которые, по-видимому, отвечают плавлению областей мембраны, содержащих разное количество КЛ. Повторные прогревы суспензии липосом (кривые 2 и 3) приводили к тому, что мембрана липосом становилась более однородной. Наконец, после четвертого прогрева на калориметрической кривой остается только один узкий и симметричный пик с максимумом при Т =39°С (ср. кривые 4 и 5). Очевидно, что две последние кривые описывают плавление однородной мембраны, в которой отрицательно заряженные молекулы КЛ равномерно распределены среди нейтральных молекул ДПФХ как в пределах каждого монослоя, так и между ними. Ниже температуры Т=35°С липидный бислой находится в твердом состоянии, в котором подвижность липидных молекул как целого резко ограничена. При повышении температуры сверх 40°С мембрана переходит в жидкое состояние. В этом состоянии липидные молекулы приобретают способность перемещаться вдоль каждого из формирующих мембрану монослоев (латеральная подвижность) и переходить из одного монослоя в другой (трансмембранная миграция или флин-флоп).

В работе была также исследована способность липидов жидкой мембраны к перемещению не только в пределах каждой липосомы, но и

между ними. Для этого были приготовлены ДПФХ-КЛ липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой, ДПФЭ-ФИТЦ (Ь*).

4,5

Рнс.1. Последовательные записи калориметрических кривых (1-5) плавления

суспензии ДПФХ-КЛ липосом, 1.

Концентрация липосом 1мг/мл;

боратный буфер, 10" М; рН 9,2.

25

30

т.°с

1

50

Концентрация липосом была равна 0,1 мг/мл. Молярная доля ДПФЭ-ФИТЦ в липосомах, фдафч-фтц, составляла 0,1. Этого было достаточно для того, чтобы вызвать самотушение флуоресценции ДПФЭ-ФИТЦ. Интенсивность флуоресценции таких липосом была невысокой (точка Г, рис. 2). Затем к этим липосомам были добавлены немеченые липосомы (Ь), в соотношении Сь/Сх *=9/1, после чего была исследована кинетика изменения интенсивности флуоресценции в полученной смеси. Результаты тля твердых и жидких липосом приведены на рис.2.

В случае твердых липосом интесивность флуоресценции полученной ;меси со временем практически не менялась (кривая 1). Это означало ггсутствие миграции молекул ДПФЭ-КЛ между твердыми липосомами.

Напротив, сразу же после смешения меченых и немеченых жидких ншосом интенсивность флуоресценции начинала возрастать и через 40 шнут достигала своего максимального значения (кривая 2). Это видетельствовало об уменьшении концентрации ДПФЭ-ФИТЦ в [ипосомальной мембране при переходе части молекул ДПФЭ-ФИТЦ с теченых липосом на немеченые.

Естественно было ожидать, что конечным результатом такой миграции должно быть равномерное распределение молекул ДПФЭ-ФИТЦ между всеми липосомами в Ь/Ь смеси. При этом молярная доля ДПФЭ-ФИТЦ фдпфЭ-фитц в липосомах должна была уменьшаться в +С, *) 10

раз, то есть до 0,01. Мы приготовили жидкие меченые липосомы с молярной долей ДПФЭ-ФИТЦ Фда,ф>-фищ=0,01 в концентрации (С[+С[*)^1мг/мл. Оказалось, что интенсивность флуоресценции этой суспензии (кривая 3) в точности сооветствует предельному значению флуоресценции, устанавливающемуся в ходе описанного выше кинетического эксперимента (ср. кривые 2 и 3).

Таким образом, при переходе мембраны из твердого состояния в жидкое молекулы липидов приобретают способность перемещаться в латеральном и трансмембранном направлениях, а также мигрировать между липосомами. Результатом этих процессов является полное усреднение распределения липидов как в пределах каждой липосомы, так и между всеми линосмами в системе.

t, MUH

Рис.2. Кинетика изменения относительной интенсивности флуоресценции смеси немеченых липосом (L) и липосом меченых ДПФЭ-ФИТЦ (L ) (фдпф>фити - 0.1) в соотношении CJ CL*=9/1 при 20 (1) и 55°С (2); и липосом меченых ДПФЭ-

ФИТЦ (фд|1фы[,игц= 0.01) при 55°С (3). В точке Л к смеси L+L (9/1) был добавлен Г1ЭВП, что вызвало падение флуоресценции до значения, соответствующего точке Б. В точке В к комплексу ПЭВП-липосомы была добавлена ПАК в соотношении [ПАК]/[ПЭВП]=3/1. Общая концентрация ДПФХ-ЮТ липосом 0,1) 1мг/мл; [Г1ЭВП]- 1,5x10"М; боратный буфер, 10"2М;рН9,2.

Подобный эксперимент был проведен с твердыми липосомами. В этом случае флуоресценция не изменяется с течением времени (рис.2, кривая <{). Очевидно, это связано с отсутствием перемещения липидов с одной липосомы на другую.

Таким образом, в твердой липидной мембране подвижность липидньтх молекул как целого резко ограничена, а в жидкой липидной мембране липиды способны к перемещению в пределах каждой липосомы и между липосомами, что приводит к равномерному распределению липидов как в пределах каждой липосомы, так и между всеми частицами в системе.

2. Адсорбция поликатнона на липидной мембране.

2.1. Взаимодействие поликатиона с твердыми липосомами:

В работе для регистрации взаимодействия ПЭВП с липосомами использовали метод лазерного микроэлектрофореза. Использование этого метода основан па том, что адсорбция поликатиона на поверхности отрицательно заряженных частиц сопровождается нейтрализацией их поверхностного заряда и, следовательно, изменением их электрофоретической подвижности (ЭФ11). На рис.3 приведены зависимости изменения ЭФП твердых ДПФХ-КЛ липосом (Т-20°С), содержащих 5%, 10%, 15% отрицательно заряженных групп КЛ 0,05; 0,1 и 0,15 соответственно), от концентрации ПЭВГ! (кривые 1-3). Добавление поликатиона вначале приводит к уменьшению ЭФП липосом до нулевого значения, затем происходит перезарядка поверхности, и, наконец, ЭФП достигает своего предельного положительного значения.

Параллельные измерения размеров частиц, присутствующих н системе, свидетельствуют о том, что адсорбция ПЭВП на поверхности липосом сопровождается их агрегацией (рис.4, кривые 1-3). Частицы максимального размера образуются при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом, то есть когда ЭФП частиц становится равной нулю. Дальнейшее увеличение концентрации ПЭВП вызывает уменьшение размера частиц, который приближается к размеру исходных липосом. Это связано с появлением на их поверхности избыточного положительного заряда, привнесенного адсорбированным ПЭВП (ср.рис.3 и 4).

Как следует из рис.3 и 4 (кривые 1-3), концентрация ПЭВП, необходимая для нейтрализации поверхностного заряда липосом и образования частиц максимального размера оказывается прямо пропорциональной доле КЛ в липидном бислое.

Добавлепный поликатион практически нацело связывается с липидной мембраной, если его концентрация в системе не превышает 2,5x104 М; при больших концентрациях ПЭВП перестает связываться с липосомами и начинает накапливаться в растворе (рис.5). Сравнение результатов, приведенных на рис.3 и 5, показало, что адсорбция иоликатиона прекращается, когда ЭФП липосом практически достигает своего предельного положительного значения. Таким образом, адсорбция ПЭВП на поверхности ДПФХ-КЛ липосом развивается чрезвычайно эффективно: весь вводимый в систему поликатион связывается с липидной

ЭФП, (мкм/с)(В/см) -3

Рис.3. Зависимость ЭФП частиц в системе ПЭВП-твердые ДГ1ФХ-КЛ липо-сомы от концентрации ПЭВП. Ущ 0,05 (1); 0,1 (2); 0,15 (3). Концентрация липосом 1мг/мл; боратный буфер, 10~2 М; рН 9,2.

ГПЭВП1 х ю , м

-т 0.5

г-

2 Л 4 [ПЭВП1 х 10 , М

Рис.4. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц в системе НЭВП-твердые ДПФХ-КЛ липосомы от концентрации ПЭВП. V., 0,05 (1); 0,1 (2); 0,15 (3). Концентрация

липосом 1мг/мл;

боратный буфер, 10~2 М; рН 9,2.

мембраной, при этом на 1ранице раздела вода-липидная мембрана образуется поликатион-липидный комплекс, стабилизированный множественными ионными контактами между положительно заряженными звеньями ПЭВГТ и отрицательно заряженными полярными группами КЛ. Ранее было показано, что взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными линейными макромолекулами, мицеллами поверхностно активных веществ, коллоидными частицами и плоскими поверхностями характеризуется чрезвычайно высоким сродством компонентов друг к другу и приводит к формированию стабильных комплексов. Поведение исследованной нами системы поликатион-липосомы подчиняется тем же закономерностям.

[ПЭВП] х 104, м

Рис.5. Зависимость концентрации не связанного с липосомами ПЭВП от его общей концентрации при 20 (1) и 55°С (2). ДПФХ-КЛ липосомы, 0,1. Концентрация липосом 1мг/мл; боратный буфер, 10"2М;рН 9,2.

[ВГ]0 х 104, М

Рнс.6. Зависимость концентрации бромид-иоиов в надосадочной жидкости после отделения комплекса ПЭВП- липосомы от общей концентрации бромид-ионов при 20 (1) и 55°С (2). ДПФХ-КЛ липосомы, 0,1. Концешрация липосом 1мг/мл; боратиый буфер, 10~2 М; рП 9,2.

Чтобы определить долю звеньев поликатиона, образующих солевые связи с фосфатными группами КЛ, использовали следующий прием. ПЭВП добавляли к суспензии липосом, затем нолученные полимер-липосомные частицы отделяли центрифугированием и в надосадочной жидкости определяли концентрацию бромид-иопов- низкомолекулярных противоионов ПЭВП [Вг~]р (рис.6, кривая 1). В описанном случае липосомы и их комплекс с поликатионом готовили в бессолевом водном растворе. Очевидно, что концентрация [Вг ]р равна концентрации кватернизованных звеньев поликатиона, образовавших солевые связи с молекулами КЛ, [ПЭВП+]ц0ЫШ. Соотношение:

р = [ПЭВГГ]К0ШИ / [ПЭВП+]0 = [Вг~]р / [Вг"]0,

где [Г1ЭВП+]0 = [Вг ]0 -общая концентрация кватернизованных звеньев ПЭВП позволяет оценить их долю, участвующую в образовании поликомплекса ПЭВП-липосома. Расчет по данным рис.6 дает р - 0.85.

Полученные данные позволяют оценить состав комплекса, образовавшегося при адсорбции ПЭВП на твердой липидной мембране. Проще всего это сделать в точке, соответствующей полной компенсации заряда липосом адсорбированным поликатионом, то есть при ЭФП-0. Поскольку добавленный к суспензии липосом ПЭВП полностью

связывается на липндной мембране, то в точке ЭФП=0 привносимый им заряд численно равен поверхностному заряду липосомы. Иными словами, в этой точке концентрация положительно заряженных звеньев [ПЭВГТ^эфп^о оказывается равной концентрации отрицательно заряженных молекул КЛ, сосредоточенных во внешнем слое липидной мембраны 1КЛ]внега-Соотношение:

У - [КЛ]В11е1П / [КЛ]0 = [ПЭВП+];№1И) / [КЛ]о,

где [КЛ]„ - общая концентрация KJI в растворе, позволяет определить долю КЛ молекул, образовавших комплекс с иоликатионом. Поскольку [ПЭВП'Ьфпи) ~~ [ПЭВП]-)ф)М)Хах р где [ПЭВП]эфп-о -общая концентрация мономерных звеньев ПЭВП в растворе при ЭФП~0 и а 0,95 (доля кватерннзованных звеньев в ПЭВП), то расчет, проведенный на основании рис.7 (кривая 1), дает у-~0.5. Полученный результат означает следующее. Во-первых, в мембране исходных твердых липосом отрицательно заряженные молекулы КЛ равномерно распределены между обеими сторонами бислоя. Во-вторых, только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне мембраны, участвуют в образовании комплекса с адсорбированным поликатионом.

2.2. Взаимодействие поликатиона с жидкими липосомамп.

2.2.1. Индуцированный поликатионом флип-флоп молекул КЛ.

Для перевода мембраны липосом в жидкое состояние ее нагревали до температуры 55°С, превышающей температуру фазового перехода Г (см.рис.1). Выше температуры фазового перехода липиды в мембране приобретают значительную подвижность. При этом они могут перемещаться вдоль каждого из монослоев, формирующих мембрану (латеральная подвижность), и переходить из одного монослоя в другой (трансбислойная миграция или флип-флоп). Оба этих процесса могут влиять на структуру и свойства комплексов, образующихся при взаимодействии полиионов с жидкими мембранами.

Качественно взаимодействие поликатиона с лсидкой липидной мембраной подчиняется тем же закономерностям, что и поведение системы поликатион -твердые липосомы. Добавленный поликатион полностью связывается с поверхностью липосом (рис.5, кривая 2). Основная часть звеньев поликатиона образует ионные связи с молекулами КЛ (рис.6, кривая 2). Такое взаимодействие сопровождается нейтрализацией поверхностного заряда липосом (рис.7, кривая 2) и

образованием крупных агрегатов (рие.8, кривая 2). Сравнение результатов, приведенных на рис.5 и 7, показало, что адсорбция поликатиона прекращается, когда ЭФП лнпосом практически достигает своего предельного положительного значения.

Однако количество ПЭВП, необходимое для полной нейтрализации заряда липосом и формирования агрегатов максимального размера оказалось вдвое большим, чем количество ПЭВП, вызывавшее аналогичные эффекты при добавлении к твердым липосомам (ср.кривые 1 и 2 рис.7, а также 1 и 2 рис.8). Очевидно, что в данном случае в образовании комплекса принимают участие все молекулы КЛ.

ЭФП, (мки/с)(В/ск) -3 т

л (ПЭВЩхЮ , м

Рнс.7. Зависимость ЭФП частиц в системе ПЭВП-липосомы от концентрации ПЭВП при 20 (1) и 55°С (2). ДПФХ-КЛ липосомы, \'к г0, 1 ■ Концентрация липосом 1мг/мл; боратньтй буфер, 10'2М; рН 9,2.

Рис.8. Зависимость среднего

гидродинамического диаметра частиц в системе ПЭВП- липосомы от концентрации ПЭВП при 20 (1) и 55°С (2). ДПФХ-КЛ липосомы, укл- 0,1. Концентрация липосом 1мг/мл; борашый буфер, 10"2 М; рН 9,2.

[ПЭВЩжЮ . м

Одной из причин этого явления может быть разрушение поликатионом мембран жидких липосом. Такое разрушение могло

сопровождаться образованием небислойных структур, а регистрируемые агрегаты могли быть сформированы из фрагментов исходной разрушенной мембраны. При этом все отрицательно заряженные липиды, расположенные как с внешней, так и с внутренней стороны мембраны могли участвовать в образовании ионных связей с ПЭВ11.

Целостность липосомальной мембраны в контакте с ПЭВП была проверена двумя способами. В первом из них использовали липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен раствором флуоресцентного красителя, карбоксифлуоресцеина (КФ), в концентрации самотушения. Нарушение целостности мембраны должно было приводить к вытеканию красителя из липосом и увеличению интенсивности флуоресценции раствора. Однако добавление ПЭВП к таким липосомам не вызывало возгорания флуоресценции.

Во второй серии экспериментов ПЭВП добавляли к липосомам, наполненным 1М раствором ЫаС.1. В этом случае нарушение целостности мембраны должно было сопровождаться увеличением электропроводности липосомальной суспензии. Оказалось, что после добавления ПЭВП электропроводность суспензии не изменялась. Оба эти результата однозначно свидетельствовали о том, что целостность мембраны в комплексе с ПЭВП сохранялась.

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что наиболее вероятной причиной упомянутого сдвига кривых на рис.7, 8 в сторону больших концентраций ПЭВП в жидкой липосомальной мембране являетсяся индуцированный поликатионом флип-флоп молекул КЛ из внутреннего моиослоя во внешний. При этом одновременно с флин-флопом молекул КЛ, очевидно, происходит переход равного количества молекул Д11ФХ в обратном направлении- из внешнего монослоя во внутренний. Именно такое одновременное движение молекул КЛ и ДПФХ позволяет липидной мембране сохранять бислойную структуру, а, следовательно, и свою целостность.

2.2.2. Индуцированная поликатионом латеральная сегрегация липидов.

Естественно было ожидать, что если полнкатион способен индуцировать флип-флоп отрицательно заряженных молекул липида из внутреннего монослоя во внешний, то он способен вызвать и процесс латеральной сегрегации липидов, сводящийся к образованию двух микрофаз, одна из которых обогащена отрицательно заряженным липидом, а другая- нейтральным. В нашем случае исходная липосомальная мембрана, в которой молекулы КЛ были равномерно распределены среди нейтральных молекул ДПФХ при протекании такою процесса должна была раздаляться на две фазы, одна из которых была бы обогащена ДПФХ, а

другая - КЛ. За процессом сегрегации липидов в смешанной ДПФХ-КЛ мембране мы следили с помощью метода мнкрокалориметрии. Один компонент мембраны, ДПФХ характеризуется определенным химическим строением и узким пиком фазового перехода при Т=41,5°С; второй компонент, КЛ, представляет собой ееёвй смесь лшшдов с набором фазовых переходов в области низких температур (<10°С). Поэтому о сегрегации липидов мы судили по появлению на калориметрической кривой пика, соответствовавшего плавлению ДПФХ.

Фазовый переход в мембране исходных ДПФХ-КЛ липосом описывается кривой 1, рис.9. Как отмечалось ранее, этот процесс характеризуется одним острым максимумом при Т*= 39°С. Увеличение концентрации ПЭВП приводит к постепенному смещению этого пика в область более высоких температур до полного совпадения по форме и положению с пиком плавления индивидуального ДПФХ (рис.9, кривые 2-

Эти изменения однозначно свидетельствуют о том, что в смешанной ДПФХ-КЛ мембране при адсорбции ПЭВП формируются области, состоящие практически из чистого ДПФХ. Такие области могут возникнуть лишь вследствие выделения второго компонента- КЛ в отдельные кластеры при его связывании с ПЭВП.

5).

4,5

Рис.9. Калориметрические кривые плавления ДПФХ-КЛ липосом (\'к;,= 0,1) (1), их комплексов с ПЭВП (2-4), ДПФХ липосом (5), а также тройной системы (ДПФХ-КЛ лкпосомы)- ПЭВП- ПАК (6). Кривая 6 получена добавлением ПАК в концентрации 6х 10"4 М к комплексу ПЭВП- (ДПФХ-КЛ липосомы), плавление которых описывается кривой 4. Концентрация липосом 1 (14,6) и 0,9 мг/мл (5). [ПЭВП] = 5x10"5 (2), 10" (3), 2x10""М (4,6). Боратный буфер, 10~2М; рН 9,2.

30

40

Описанные выше изменения прекращаются после того, как концентрация ПЭВП становится равной 2x104 М (рис.9, кривая 4), что практически совпадает с концентрацией ПЭВП, необходимой для полной нейтрализации заряда молекул КЛ, расположенных по обе стороны липосомальной мембраны (рис.7, кривая 2). Иными словами, фазовое разделение липидов в смешанной ДПФХ-КЛ мембране под действием адсорбированного ПЭВП развивается параллельно с описанной ранее трансмембранной миграцией молекул КЛ и завершается после перехода всех молекул КЛ на внешнюю сторону мембраны.

Описанные процессы флип-флопа и латеральной сегрегации липидов приводят к возникновению в мембране резкой зарядовой асимметрии. Все отрицательно заряженные молекулы КЛ оказываются сосредоточенными на внешней стороне мембраны и собранными в кластеры, т.е. мембрана перестраивается таким образом, чтобы образовать максимальное число ионных контактов с адсорбированной макромолекулой.

3. Обратимость взаимодействия полнкатион-лнпосома.

Адсорбция ноликатиона на противоположно заряженной мембране практически необратима: разбавление системы не приводит к его десорбции. Как уже отмечалось выше, устойчивость межфазного поликатион-липидного комплекса связана с образованием множественных ионных контактов между противоположно заряженными звеньями полимера и ионогенными группами молекул КЛ. Различные поликислоты -природные и синтетические, которые могут также образовывать прочные интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) с поликатионом, способны конкурировать с поверхностью липосом за связывание поликатиона. Причина повышенной стабильности ИПЭК заключается в структурной комплементарное™ образующих его линейных молекул полиионов, которая не может быть достигнута в межфазном комплексе поликатион-мембрана.

3.1. Конкурентные реакции в тройной системе: липосома-поликатион-

полианнои.

3.1.1. Удаленна поликатиоиа с липосомальной поверхности.

В настоящей работе исследована поведение тройной системы: этрицательно заряженные ДПФХ-КЛ линосомы-ПЭВП-ПАК. Полианион добавляли к комплексу липосомы-ПОВП в соотношении ПАК]/[ПЭВП]=3/1. Ожидалось, что результатом конкурентной реакции Зудет образование отрицательно заряженного пестехиометричного ИПЭК

ПЭВП-ПАК и удаление поликатиона с поверхности липосом. За адсорбцией и последующим удалением поликатиона (сильного тушителя флуоресценции) следили по изменению интенсивности флуоресценции метки (ДПФЭ-ФИТЦ), встроенной в липидный бислой (ф;а,г1, _ф|ГП1= 0,01)-

Как следует из рис.10, адсорбция поликатиона на поверхности обоих типов липосом сопровождается тушением флуоресценции метки (кривые 1 и 2). Последующее добавление ПАК приводит к восстановлению флуоресценции липосом до исходного уровня в случае жидких липосом за время смешения компонентов, которое не превышало 10 секунд (кривая 2'), и вызывает лишь незначительное увеличение флуоресценции в случае твердых (кривая Г). Эти результаты означают, что ПАК количественно снимает ПЭВП с поверхности жидких липосом, образуя с ним водорастворимый ИПЭК, но не способна снять его с поверхности твердых липосом. Удаление ПЭВП с поверхности жидких липосом приводит к устранению причины существования агрегатов (исчезновение полимерной "скрепки"); в результате они диссоциируют до размера исходных липосом (рис.11, кривые 1,2). В случае твердых липосом агрегаты сохраняются, поскольку ПЭВП не уходит с поверхности частиц и продолжает удерживать их рядом друг с другом (рис.12, кривые 1,2).

Такое поведение комплексов ПЭВП- липосомы в присутствии ПАК вызывает удивление. Как отмечалось выше, адсорбция ПЭВП на поверхности жидких ДПФХ-КЛ липосом приводит к латеральной сегрегации липидов в липосомальной мембране и формированию межфазного комплекса с максимальным числом ионных контактов КЛ-11ЭВП. Такой комплекс должен быть прочнее, чем комплекс ПЭВП с твердыми липосомами, однако изложенные выше результаты свидетельствуют об обратном.

Причина наблюдаемого противоречия может заключаться в следующем. Известно, что ниже температуры фазового перехода возрастает вероятность образования различных дефекгов в липосомальной мембране. Это может привести к объединению мембран нескольких липосом и появлению частиц большего размера (слияншо липосом). Из литературных источников известно, что твердые лнпидные мембраны более охотно, чем жидкие, сливаются друг с другом. Исследуемые в настоящей работе заряженные ДПФХ-КЛ липосомы в твердом состоянии сохраняют свою устойчивость, однако адсорбция поликатиона и вызванная этим агрегация липосом могуг также способствовать слиянию липидных мембран. .При этом молекулы поликатиона могут частично включаться внутрь новой мембраны по местам дефектов. Понятно, что такие слившиеся липосомы со встроенным поликатионом невозможно восстановить до исходного размера добавлением ПАК.

1/1 , О. С.

о

[ПЭВП| х 104,М

Рис.10. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе ПЭВП-меченые липосомы от концентрации ПЭВП до (1, 2) и после (1', 2') добавления ПАК при 20 (1, 1') и 55°С (2, 2')- 1ПАК]/[ПЭВП]=3/1. ДПФХ-КЛ липосомы, укл= 0,1. Концентрация липосом 1мг/мл; боратпый буфер, 10' М; РН 9,2.

Для проверки целостности липосомальной мембраны в контакте с ПЭВП были использованы липосомы, внутренний объем которых был заполнен 1М хлоридом натрия. Оказалось, что добавление ПЭВП к твердым липосомам приводит к возрастанию электропроводности раствора. Этот процесс полностью завершается за время смешения компонентов (не более 10 сек). Важно, что это возрастание составляет лишь 35% от максимально возможного прироста электропроводности в результате необратимого разрушения липосом. (Последнее достигалось добавлением к суспензии липосом раствора тритона Х-ЮО в соотношении [Х-100]/[Липид]-10/1.) Это однозначно свидетельствует- о том, что адсорбция ПЭВП на поверхности твердых липосом сопровождается образованием короткоживущих дефектов (пор) в липосомальной мембране, через которые и происходит частичное вытекание хлорида натрия из липосом во внешний раствор. Как уже упоминалось выше, появление таких дефектов может быть причиной слияния твердых липосом и включения поликатиона внутрь липосомальной мембраны.

Как упоминалось ранее, в случае жидких лииосом добавление ПЭВП не создает дефектов в липосомальной мембране и, следовательно, никак не сказывается на электропроводности раствора.

Рис.11. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц в системе ПЭВП- липосомы от концентрации ПЭВП до (1) и после (2) добавления ПАК при 55°С. [ПАК]/[ПЭВП]=3/1. ДПФХ-КЛ

липосомы, 0,1. Концентрация

липосом 1мг/мл; боратный буфер, 10"2 М; рН 9,2.

Р, мки

Рис.12. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц в системе ПЭВП-липосомы от концентрации ПЭВП до (1) и после (2) добавления ПАК при 20°С. [ПАК]/[ПЭВП]~3/1. ДПФХ-КЛ липосомы, Хкг 0,1. Концентрация липосом 1мг/мл; боратный буфер, 10"2М; рН 9,2.

Таким образом, возможность удаления поликатиона с поверхности отрицательно заряженных липосом в значительной степени определяется фазовым состоянием липосомальной мембраны.

3.1.2. Обратимость структурных перестроек в липосомалыюн мембране в процессе адсорбции;десорбции поликатиона.

В связи с этим возникает естественный вопрос: восстанавливается ли начальное распределение липидов в мембране после удаления поликатиона? Как упоминалось ранее, вопрос этот важен прежде всего с точки зрения биомедицинского использования поликатиопов в качестве иммуностимуляторов и компонентов искусственных иммуногенов, компонентов ДНК-содержащих комплексов, используемых для генетической трансформации клеток. Структурные перестройки в мембране в случае их необратимости могут отрицательно сказаться на биологических функциях клетки, что, конечно, необходимо учитывать при изучении поведения клеток в контакте с полиэлектролитами. Однако, несмотря на важность этого вопроса, он до последнего времени в литературе не обсуждался. Данная работа представляет собой первый шаг в исследовании обратимости процессов, вызываемых в биологической мембране взаимодействующими с ней полиэлектролитами.

На рис.13 показано, как изменяется ЭФП частиц комплекса твердые липосомы- ПЭВП после добавления ПАК. Ранее было показано, что в этом случае поликатион не покидает липосомальной мембраны. Как следует из рисунка, добавление полианиона к комплексу с ЭФП близкой к нулевой приводит к появлению в растворе отрицательно заряженных частиц, ЭФП которых примерно в 1.5 раза превышает значение ЭФП исходных твердых лшюсом. Установившееся после добавления ПАК значение ЭФП не меняется с течением времени. Очевидно, описанные изменения являются следствием адсорбции полианиона на частицах комплекса липосомы-11ЭВГ1. Такое взаимодействие, по-видимому, приводит к формированию тройного комплекса липосома- ПЭВП- ПАК, заряд которого определяется зарядом полианиона, расположенного на внешней (экспонированной в водную фазу) стороне комплекса.

Совсем иным является поведение жидкой мембраны после добавления ПАК к комплексу липосомы- ПЭВП. Как видно из рис.14 через 1 минуту после смешения компонентов в растворе регистрируется отрицательно заряженные частицы, ЭФП которых примерно в два раза выше ЭФП исходных жидких липосом (рис.14). С течением времени полученное значение ЭФП уменьшается и примерно через 30 мин достигает уровня исходных липосом.

Выше упоминалось о том, что ПАК количественно удаляет ПЭВП с поверхности жидких липосом. Процесс этот полностью завершался за время, не превышавшее 10 сек. Это позволяет утверждать, что значение ЭФП, которое регистрировалось через 1 минуту после добавления ПАК к комплексу жидкие липосомы- ПЭВП, относится к полностью освобожденным от ПЭВП жидким лииосомам. Очевидно, что в этот

ЭФП, (мкм/с)(В/см)

-4 -

Рис.13. Значения ЭФГ1 липосом до (1) и после (2) добавления поликатиопа. Кинетическая зависимость ЭФП частиц в системе .ПЭВП-липосомы после добавления ПАК (3) при 20°С. [ПАЩПЭВП]-3/1. ДПФХ-КЛ липосомы, 1. Концентрация липосом 1мг/мл; [ПЭВП]=1х10"4М; боратный буфер, 10"2 М; рН 9,2.

1. мин

Рис.14. Значения ЭФП липосом до (1) и после (2) добавления поликатиона. Кинетическая зависимость ЭФП частиц в системе ПЭВП-липосомы после добавления ПАК (3) при 55°С. [ПАК]/[ПЭВП]=3/1. ДПФХ-КЛ липосомы, VкJl=0,l. Концентрация липосом 1мг/мл; [Т1ЭВП]~2х ]0Л\1; боратный буфер, 10"2 М; рН 9,2.

момент времени состояние мембраны является предельно асимметричным: все молекулы кардиолипина сконцентрированы во внешнем монослое мембраны. Заряд и, следовательно, ЭФП этих липосом вдвое больше соответствующих значений исходных жидких липосом. Со временем половина молекул КЛ переходит с внешней стороны мембраны на внутреннюю, что приводит к уменьшению ЭФП до уровня исходных жидких липосом, характеризующихся равномерным распределением молекул КЛ между обеими сторонами мембраны.

Возвращение мембраны жидких липосом к исходному состоянию после удаления ПЭВП было продемонстрировано также методом калориметрии. Эксперимент проводили следующим образом. Избыток ПАК добавляли к суспензии комплекса ПЭВП-ДПФХ-КЛ липосомы, предварительно прогретой до 55°С. В этих условиях фазовое состояние липосомальной мембраны было жидким. Смесь выдерживали при 55"С в течение 30 минут, затем охлаждали до комнатной температуры и записывали калориметрическую кривую (рис.9, кривая 6). Эта кривая полностью совпадает с полученной ранее для исходных ДПФХ-КЛ липосом (ср. кривые 1и 6 на рис.9).

4.3.1.3. Влияние адсорбции/десорбции поликатгюиа па обмен липида\ш между липосомами.

Ранее было показано, что жидкие липосомы способны обмениваться составляющими их липидами. При смешении флуоресцентно меченых и немеченых жидких ДПФХ-КЛ липосом флуоресцентные мет ки - молекулы ДПФЭ-ФИТЦ - равномерно перераспределяются между всеми липосомами, что выражается в возрастании интенсивности флуоресценции раствора (рнс.2, кривые 2,3). Добавление ПЭВП в обменивающуюся лшшдами систему (отмечено точкой А) приводит к его адсорбции на липосомальной поверхности и тушению флуоресценции метки до уровня, отмеченного точкой Б. Это значение со временем не изменяется (рис.2, кривая 4, участок БВ). Вытеснение ПЭВП с липосомальной поверхности в виде нестехиометричного комплекса с ПАК (отмечено точкой В), которое присходит за время <10 с, возвращает систему к исходному состоянию: интенсивность флуоресценции раствора начинает постепенно возраст ать и через 40 мин достигает своего максимального значения.

Эти результаты позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, адсорбция ПЭВП полностью подавляет липидный обмен между липосомами. Это следует из того факта, что возрастание флуоресценции после вытеснения ПЭВП с липосомальной поверхности начинается с того уровня, который был достигнут после адсорбции ПЭВП. Во-вторых, вытеснение ПЭВП с липосомальной поверхности полностью восстанавливает липидный обмен между липосомами.

Совокуиность получештых результатов позволяет сделать вывод о том, что после удаления поликатиона с поверхности жидкой липидной мембраны восстанавливается исходное равномерное распределение липидов в латеральном и трансмембранном направлениях, а также липиды вновь приобретают способность перемещаться между отдельными частицами в системе. Таким образом, структурные перестройки, вызванные взаимодействием с поликатионом, в данном случае являются обратимыми.

Выводы:

1. Исследованы состав и строение комплексов, образующихся при адсорбции синтетического поликатиона - сополимера М-этил-4-виннлпиридиний бромида и 4-винилпиридипа (ПЭВП)- на поверхности твердых и жидких моноламеллярных смешанных липосом, состоящих из нейтрального дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и отрицательно заряженного кардиолииина (КЛ),

2. Адсорбция ПЭВП на поверхности обоих типов липосом развивается по принципу "все или ничего": весь добавляемый поликатион оказывается связанным с липосомальной мембраной. При этом около 90% кватернизованных звеньев поликатиона образуют ионные связи с отрицательно заряженными группами КЛ; остальные звенья ПЭВП прочно удерживают Вг-противоины и в образовании комплекса с мембраной не участвуют.

3. Показано, что в исходных линосомах молекулы КЛ равномерно распределены между обеими сторонами липосомальной мембраны. В случае твердых ДПФХ-КЛ липосом в образовании комплекса с ПЭВП участвуют только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне липосомальной мембраны.

Адсорбция поликатиона на поверхности жидких ДПФХ-КЛ липосом вызывает латеральную сегрегацию липидов в липосомальной мембране и трансбислойную миграцию молекул КЛ с внутренней стороны мембраны на внешнюю (индуцированный флип-флоп). В результате, в образовании комплекса с ПЭВП участвуют все молекулы КЛ с внешней и внутренней стороны липосомальной мембраны. Адсорбция ПЭВП на поверхности жидких липосом также полностью подавляет обмен липидов между отдельными липосомами.

4. Исследованы конкурентные реакции в тройной системе ДПФХ-КЛ липосомы-поликатион-полианион. Показано, что добавление избытка полиакрилат-аниона к комплексу ПЭВП с твердыми липосомами приводит к образованию тройного комплекса липосомы-поликатион-полианион. Напротив, при добавлении полианиона к комплексу ПЭВП-жидкие

липосомы поликатион полностью удаляется с липосомальной поверхности в раствор в виде нестехиометричного интерполиэлектролитного комплекса с полиашюном.

5. Удаление поликатиона с поверхности жидких липосом полностью восстанавливает исходное равномерное распределение липидов в латеральном и трансмембранном направлениях и липидный обмен между липосомами.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1) Л.А.Ярославов, А.А.Ефимова, В.Е. Кульков, В.А.Кабанов. Адсорбция поликатиона на поверхности отрицательно заряженных липосом. Влияние фазового состояния липидного бислоя на строение комплекса поликатион-липосома. //Высокомолек. соед. А. 1994. т.Зб. № 2. С. 264-270.

2) A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, M.O.Ignatiev, Е.А. Kiscliova, V.A.Kabanov. Complexation оГ synthetic polyelectrolyles with lipid bilayer membranes. Abstracts of 6-th International Conference on Polymer supported reactions in organic chemistry. Venice. Italy. 1994. P.299.

3) A.A.Yaroslavov, V.Ye Kul'kov, A.A.Efimova, M.O.Ignatiev. Synthetic polycations on the surface of negatively charged liposomes. // Thin Solid Films.

1995. V.265. P.66-70.

4) Yu.A.Ermakov, A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova. Polycation adsorption on the surface of lipid membranes studied by electrokinetic and thermodynamic methods. // Biophys.J. 1995. V.68(2). part 2. P. A-302.

5) A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, V.A.Kabanov. Composition and struclure of polycation-ncgatively charged liposome complexes. Abstracts of VI International Conference on Problems of Solvatation and Complex Formation in Solutions. Ivanovo. Russia. 1995. P. L-16.

6) A.A.Efimova , A.A. Yaroslavov. Effect of phase state of lipid membrane on composition and properties of interfacial lipid-polyelectrolyte Complex. Abstracts of First International Symposium on Polyelectrolytes. Potsdam. Germany. 1995. P. 137.

7) A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, E.A.Kiseliova. Synthetic polycations on the surface of negatively charged liposomes. Abstracts of International Symposium on Micelles. Microemulsions and Monolayers. Gainesville. USA. 1995. P.54.

8) А.А.Ярославов, А.А.Ефимова, В.И.Лобытев, Ю.А.Ермаков, В.А.Кабанов. Обратимость изменений структуры липидных мембран в процессе адсорбции-десорбции поликатиона. // Биологические мембраны.

1996. т.13. №6. С.628-633.

9) A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, E.A.Kiseliova, V.l.Lobyshev, Yu.A.Ermakov. Synthetic polycations in contact with biological membranes. Abstracts of 36th 1UPAC International Symposium on Macromolecules. Seoul. Korea. 1996. P.487.

10) A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, E.A.Kiseliova, V.Ye Koulkov. Synthetic

polycations in contact with oppositely charged biological membranes. Abstracts of 212th ACS National Meeting: Symposium "Colloidal particles: colloid-polymer interactions". Orlando. USA. 1996. No.213.

11) A.A.Efimova, A.A.Yaroslavov, V.A.Kabanov. Polycation-induced structural rearrangements in lipid bilayer. Abstracts of 24lh Meeting of the Federation of European Boichemical Societies. Barselona. Spain. 1996. P.247.

12) A.A.Efimova, D.D.Pervushin, M.N.Rimskaya-Korsakova, A.A.Yaroslavov. Reversibility of polycation-induced structural rearrangements in small and large liposomes. Abstracts of 7th International Conference on Polymer Supported Reactions in Organic Chemistry.Wroslaw. Poland. 1996. P.329.

13) A.A.Efimova, A.A.Yaroslavov. Reversibility of polycation-induced structural rearrangements in the lipid bilayer. Abstracts of 11th International Conference on Surface Forces. Moscow. Russia. 1996. P.34.

14) M.N.Rimskaya-Korsakova, D.D.Pervushin, A.A.Efimova. Reversibility of polycation interaction with large phospholipid bilayer vesicles. Abstracts of XI International Conference on Chemistry of Phosphorus compounds. Kazan. Russia. 1996. P.234.

15) А.А.Ефимова. Обратимость структурных перестроек, вызванных адсорбцией поликатиона на липидной мембране. Тезисы докладов 1-ой Международной конференции по химии высокоорганизованных веществ и научным основам нанотехнологии. Санкт-Петербург. Россия. 1996. С.201.