Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами: формирование, строение и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Заборова

Ольга Владимировна

Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами: формирование, строение и свойства.

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

6 НОЯ 2014

МОСКВА-2014

005554669

Работа выполнена в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова на химическом факультете (кафедра высокомолекулярных соединений, лаборатория полимеризашонных процессов).

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

Штильман Михаил Исаакович, доктор химических паук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский химико-технолопгческий университет имени Д. И. Менделеева» (РХТУ), профессор кафедры химической технологии пластмасс

Литманович Андрей Аркадьевич, доктор химических наук, Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский автомобильно-дорожный инспггут (государственный технический университет)» (МАДИ), профессор кафедры Химия

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Защита состоится 24 декабря 2014 г. в 15 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы д. 1, стр.3, МГУ имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус «А», кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государетвешгого университета имени М.ВЛомоносова и на сайте Химического факультета vvww.chcm.msu.ru.

Автореферат разослан 23 октября 2014 г. Ученый секретарь

диссертационного совета к.х.н.

Долгова Алла Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сферические бислоГшые лииидные везикулы (липосомы) широко используются в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения биологически активных веществ. Уникальность устройства липосом позволяет инкапсулировать в них гидрофобные и гидрофильные соединения, встраивая первые в гидрофобную часть липосомалыюй мембраны и растворяя вторые во внутренней водной полости липосом. Несмотря на значительный прогресс в области создания липосомальных контейнеров, лишь немногие лекарственные препараты были реализованы на практике. Основные причины неудач — ограниченная ёмкость липосомального контейнера, низкая эффективность захвата липосом целевыми клетками и медленное высвобождение лекарства в зоне терапевтического действия.

Разл1гчными научными группами ранее предпринимались попытки иммобилизовать липосомы на поверхности твердых носителей (имплантов) с целью локального концентрирования контейнеров и повышения тем самым эффективности терапевтического действия липосомальных лекарств. Однако закрепление липосом на твердом носителе (стеклянной пластинке, полимерном волокне, коллоидной частице и проч.) обычно сопровождается их разрушением и неконтролируемым выходом лекарства. Описанные в литературе немногочисленные удачные примеры иммобилизации нативных (неразрушенных) липосом предполагают проведение достаточно сложных процедур предварительной модификации как липосом, так и поверхности. Это заставляет обратиться к поиск)' новых подходов к иммобилизации липосом, которые лишены указанных выше недостатков.

Цель работы состояла в исследовании электростатической адсорбшш анионных липосом на поверхности полимерных микросфер, содержащих привитые гюликатионные цепи, в изучении физико-химических характеристик адсорбированных липосом и в определении устойчивости полученных комплексов полимерная микросфера/липосома в водно-солевом растворе.

Научная новизна работы.

В работе впервые исследована адсорбция анионных липосом на поверхности полимерных микросфер с привитыми поликатиопными цепями («сферических поликатионных щёток»). Впервые получены мультшмпосомальные комплексы с заданным соотношением инкапсулировшшых в липосомах веществ. Впервые получены комплексы поликатионных щёток и анионных липосом со встроенным в мембран)' липидоподобным амфифильным соединением, которое способно изменять свою конформацию при изменении

рН окружающего раствора Впервые продемонстрировано, что адсорбированные липосомы высвобождают инкапсулированное вещество при повышении кислотное™ раствора и скорость выхода вещества из мультилипосомальных комплексов в несколько раз превышает скорость его выхода из индивидуальных (не связанных в комплекс) липосом. Выявлена роль привитых поликатионных цепей в сохранении нагивной (неразрушенной) структуры адсорбированных липосом.

Практическая значимость работы. Разработан способ электростатической иммобилизации анионных липосом на поверхности полимерных микросфер с привитыми кагионными макромолекулами, позволяющий концентрировать в небольшом объеме несколько десятков липосомальных контейнеров с различными наполнителями. Иммобилизованные липосомы устойчивы в центральных и слабощелочных растворах, но быстро высвобождают инкапсулированное вещество при попадании в слабокислую среду. Предложен способ создания новых эффективных мультилипосомальных контейнеров, что может быть использовано для инкапсулирования и контролируемого высвобождения биологически активных (лекарственных) веществ.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов до обсуждения н оформления результатов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011» и «Ломоносов-2013», Москва, Россия; Байройтском полимерном симпозиуме «BPS'11», Байройт; Германия (2011); VI Всероссийской конференции по химии среди студентов и аспирантов «Менделеев-2012», Санкт-Петербург, Россия (2012); Австрийско-словенском полимерном симпозиуме «ASPM' 13», Блед, Словения (2013).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 10 печатных работах, из них 1 статья в журнале, который включен в перечень ВАК РФ российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертации, 3 статьи в журналах, индексируемых Web of Science, и 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (136 наименований). Работа изложена на 100 страницах, содержит 33 рисунка, 1 таблиц^'.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В обзоре литературы суммированы основные свойства и качества, которыми должны обладать носители для доставки биологически активных веществ. Описаны способы получения, строение н свойства штосом, иммобилизация липосом на твердой поверхности, структура липидных мембран в комплексе с катонными полимерами, стабильность комплексов поликатион/липосома в водно-солевом растворе и 1гх цитотоксичность.

В экспериментальной части представлено описание объектов и методов исследования. Для получения липосом использовали этанольные растворы анионных дифосфатидилглицернна (кардиолипина, КЛ2") и фосфатидилсерина (ФС1"), цвнтгер-ионных (электронейтральных) диолеоилфосфатидилхолнна (ДОФХ) и

дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), и флуоресцентно меченых липидов: дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ), и 1,2-диолеоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-М-(лиссамин сульфородамин Б) (ДОФЭ-СР). Липосомы готовили ультразвуковой обработкой водной суспензии смеси липидов, доля отрицательно заряженных полярных «головок» (у) варьировалась от 0 до 0.54. Размер липосом (гидродинамических диаметр) находился в интервале 40-60 им.

Сферические поликатионные щётки (СК+) били синтезированы, охарактеризованы и предоставлены профессором М. Баллауффом из Университета г. Байройта, Германия. Средняя степень полимерзации привитых цепей составляла 110, на каждой щётке располагалось около 500 поликатионых цепей, размер (гидродинамический диаметр) щёток был равен 300 нм. Концентрация СК+ приведена в молях кватернизованных звеньев в литре раствора, [СК+].

Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц.

Результаты и обсуждение 1. Комплексы поликатионных щёток с анионными липосомами 1.1. Комплексы с участием КЛ2~/ФХлипосан

Схематическое изображение поликатиошюй щётки представлено на рис. 1. Для регистрации связывания анионных липосом с поликатионными щётками был использован метод флуоресценции. К суспензии СК+ добавляли суспензию ФИТЦ-меченых липосом, СК+ с адсорбированными липосомами отделяли центрифугированием и измеряли интенсивность

флуоресценции супернатантов, которую пересчитывали в концентрацию липосом, используя соответствующую калибровочную кривую.

Рисунок 1.

Схематическое изображение полимерной микросферы с привитыми поликатионными цепями (поликатионной щётки).

На рис. 2 представлены зависимости концентрации липосом в супернатанте от общей концентрации липосом в системе. Видно, что все липосомы количественно связываются с СК+ вплоть до концентрации Ь„ред (мг/мл), выше которой липосомы начинают появляться в растворе. Величина Ь^д зависит от состава липосом и уменьшается по мере возрастания доли анионного липида в липосомальной мембране. Полученные результаты позволили рассчитать предельное количество липосом, адсорбированных на одной поликатионной щётке, К1

5 4 3

Ttr

fl 4

1 N

f 80

У/ //

//

и. л

Сл»посом в системе, мг/мл

Рисунок2.

Зависимость концентрации КЛ2"/ФХ липосом в над-осадочной жидкости от общей концентрации липосом в системе. Доля заряженного липида в мембране, V = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5); [СК+]= 1 х 1 о^1 осново-моль/л; 10"2 М боратный буфер, рН 9.2; 20°С.

40

0.2

Рисунок 3.

Зависимость количества (N1) КЛ27ФХ липосом, связаных с одной СК+, от доли заряженного липида в мембране (V). 10'2 М боратный буфер рН 9.2; 20°С.

Зависимость N от доли анионного липида в мембране V имеет нелинейный характер (рис.3): величина N резко уменьшается от 80 до 40 при увеличен™ у от 0.05 до 0.1 и

1 cy^Chjn'Д V ComPlexation of anionic liposomes with spherical polycationic brushes / A.V. Sybachin, M. Ballauff. E. Kesselman

J. Schmidt, Y. Talmon, L. Tsarkova, F. M. Menger, A. A. Yaroslavov/7 Langmuir-2011 - V 27 - P. 5310-5315

становится равной 15 при V = 0.4.

Принципиальный вопрос касается стабильности комплексов к диссоциации на составляющие компоненты - СК+ и липосомы в водно-солевых средах. Катаонные полимеры являются эффективными тушителями флуоресценции. Поэтому за формированием и последующей диссоциацией комплексов следили, регистрируя интенсивность флуоресценции ФИТЦ-меченого липида, встроенного в липосомальную мембрану. Добавление суспензии СК+ к суспензиям меченых липосом всех составов приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции метки (рис. 4). Последующее добавление раствора соли (ЫаС1) оказывает различный эффект в зависимости от содержания анионного липида в адсорбированных липосомах. Установлено, что комплексы липосом с V = 0.05 полностью диссоциируют при |ТЧаС1] = 0.15 М, комплексы липосом с V = 0.1 при [ЫаС1] = 0.25 М, в то время как липосомы с V > 0.2 формируют комплексы, которые не диссоциируют в растворах с концентрацией соли до 1.2 М (рис. 5).

Ш 1.0

11 2Г 3,4,5

0.6 1.2 [CK+JX10-4, осново-моль/л

Рисунок 4.

Зависимость относительной флуоресценции в системе КЛ27ФХ липосомы-

Рисунок 5.

интенсивности Зависимость

относительной интенсивности флуоресценции а системе КЛ27ФХ липосомы-

СК+ от концентрации добавленных СК+. v = 0.05 СК+ от концентрации добавленной соли NaCl. v = (1), 0.1 (2), 0.2(3), 0.3(4), 0.4(5), 10"2 М боратный 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5);

буфер, рН 9.2; 20 "С.

концентрация липосом 1 мг/мл: [КЛ ]/[СК+] = 2/3; 10"2 М боратный буфер, рН 9.2; 20 °С.

Необратимое связывание липосом с СК+ могло быть результатом встраивания фрагментов привитых поликатнонных цепей в липосомальные мембраны. Такое встраивание должно сопровождаться образованием дефектов в липидном бислое и вытеканием водного содержимого из липосом в окружающий раствор. Целостность ФХ/КЛ2" липосом в комплексе с СК+ анализировали методом кондуктометрии, используя липосомы. внутренний водный объём которых был заполнен 1 М раствором NaCl. Нарушение целостности мембраны

приводило к увеличению электропроводности липосомальной суспензии. Полученный результат сравнивали с электропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента - разрушения липосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за 100 %. Оказалось, что добавление липосом с v < 0.3 к суспензии СК+ не влияет на электропроводность системы (рис. 6, кривые 1-4), в то время как добавление липосом с v = 0.4 приводит к возрастанию электропроводности (кривая 5). Иными словами, после связывания с СК+ целостность липосом с v < 0.3 сохраняется, увеличение доли анионного липида до v = 0.4 сопровождается появлением дефектов, через которые происходит вытекание раствора NaCl.

Рнсунок 6.

Зависимость относительной электропроводности (ДП/ДПМШ0) КЛ27ФХ липосомы-СК+ суспензии от времени, v = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; [КЛ2"]/[СК+] = 2/3; 10"3 М борагный буфер, pH 9.2; 20 "С.

1, мин

Для сравнения мы добавили ФХУКЛ2" липосомы, заполненные раствором ЫаС1, к суспензии 100 нм полимерных микросфер без привитых поликатионных цепей. В этом эксперименте были использованы «традиционные» микросферы с катионными группами на поверхности. Добавление липосом с у = 0Л к суспензии таких микросфер сопровождалось уменьшением заряда последних, что указывало на связывание липосом с поверхностью микросфер. Однако одновременно с комплексообразованием мы регистрировали заметное возрастание электропроводности, которое, очевидно, было следствием появления дефектов в адсорбированных липосомах и вытекания раствора №С1. Этот результат демонстрирует принципиальное различие в поведении анионных липосом, связанных с двумя типами катионных полимерных микросфер: разрушение липосом при их адсорбции на «жёсткой» катионной поверхности традиционных полимерных микросфер и сохранение целостности липосом, адсорбированных на поверхности с привитыми катионными цепями. В последнем случае разрушению липосом препятствует гидрофильный слой привитых макромолекул, который предотвращает непосредственный контакт иммобилизованных липосом с твёрдой поверхностью полистирольного ядра.

Для получения дополнительной информации о морфологии комплексов СК+/липосома был использован метод криогенной трансмиссионной электронной микроскопии (крио-ТЭМ). Этот метод был специально разработан для анализа морфологии «мягких» объектов, в том числе липосом, которые могут существенно менять размер и форму при высушивании образца, что неизбежно в традиционных вариантах электронной микроскопии. На рис. 7а показана типичная микрофотография поликатионной щетки в водно-солевом буферном растворе; привитые поликатионные цепи видны на этом рисунке без дополнительного контрастирования. Электронная микрофотография липосом (рис. 76) подтверждает их моноламеллярную структуру; полученный этим методом средний размер липосом (50±10 нм) согласуется с приведенными выше данными динамического светорассеяния. Частицы комплекса СК+/липосома изображены на рис. 7в. Каждая частица состоит из одной поликатионной щётки, окруженной несколькими липосомами. Видно, что сферическая форма липосом (то есть целостность липосом) после их связывания со щётками сохраняется.

Рисунок 7.

Крио-ТЭМ изображения СК+ (а), ФХ/КЛ2" липосом (б) и комплекса липосомы-СК+ (в). Для приготоштения образцов использованы 1.5 мг/мл суспензия СК+ (а), 0.1 мг/мл суспензия липосом (б) и смешанная суспензия, содержавшая 1.5 мг /мл СК+ и 0.1 мг/мл липосом (в).

1.2. Комплексы с участием ФС'УФХ липосач

Ранее было показано, что целостность анионных липосом в комплексе с линейными катионными полимерами определяется геометрической формой анионного липида2.

Для выяснения влияния формы анионного липида на целостность липосом, адсорбированных на поверхности полимерных микросфер с привитыми поликатионными цепями, были использованы липосомы, заполненные 1 М раствором NaCl. Лилосомы с различным содержанием «симметричного» ФС1" добавляли к суспензии поликатионных щёток. Как видно из рис. 8, соль не вытекает из липосом с v < 0.5 (кривые 1-5); последующее

" Efimova A, Sybachin A., Yaroslavov A. Effect of anionic-lipid-molecule geometry on the structure and properties of liposome-polycation complexes // Polymer Science - Series C. - 20 Ц, - V. 53, № I. - P. 18.

увеличение доли анионного липида приводит к быстрому возрастанию электропроводности (кривая 6), что свидетельствует о формировании дефектов в липосомальной мембране.

Рис. 9 отражает тушение флуоресценции ФИТЦ-меченых ФС''/ФХ липосом с различным содержанием анионного липида при их связывании с СК+. Как видно из рис. 10, добавление раствора соли к суспензиям комплексов СК+/липосома сопровождается восстановлением флуоресценции до исходного уровня при условии, что мольная доля ФС1" в липосомах не превышает 0.5 (кривые 1-5). Комплексы липосом с большим содержанием ФС1" не диссоциируют на исходные компоненты при добавлении соли (кривая 6). Полученные результаты коррелируют с данными о целостности липосом в комплексах (рис. 8): формирование дефектов в мембранах адсорбированных липосом делает их связывашк со щётками необратимым.

Все полученные комплексы сохраняют устойчивость в физиологическом растворе с [NaCl] = 0.15 M (рис. 10). Было определено предельное количество липосом, способных адсорбироваться на одной поликатионной щётке: от 40 для липосом с v = 0.1 до 13 для липосом с v = 0.5. Таким образом, замена «несимметричного» KJ12' на «симметричный» ФС1" позволяет сохранить адсорбционную ёмкость щёток но анионным липосомам и одновременно расширить интервал составов липосом, формирующих стабильные электростатические комплексы с СК+. Последнее может быть принципиально для создания мультшшпосомальных контейнеров с контролируемой скоростью выхода различных лекарств.

1

1.0

Рисунок 8.

Зависимость относительной электропроводности (ДГ2/ДПмо>с) суспензии комплекса СК+/липосома ФС' /ФХ от времени, содержание анионного липида в липосомах v = 0.1 (/), 0.2 (2), 0.3 (5), 0.4 (О, 0.5 (.5), 0.54 (б) Общая концентрация липидов 1 мг/мл; [СК+]х10"* осново-моль/л = 1.9 (/), 3.9 (2), 5.9 (5), 7.9 (4), 9.9 (5), 10.1 (б); 10' М трис буфер, рН 7.0; 20 °С.

■j-——1-1_

О 40 80

120 t, МИН

0 0.7

0.5 1.0 1.5

[СК+]*1СИ, осново-моль/л

Рисунок 9.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе СК+/меченые липосомы ФС'7ФХ от концентрации СК+. v - 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (6). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; 10" М трис буфер, рН 7.0; 20 °С.

[№С1], М

Рисунок 10.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции комплекса СК+/меченые липосомы ФС' /ФХ от концентрации ЫаС1. v = 0.1 (/), 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (6). Общая концентрация липидов 1 мг/мл; трис буфер, рН 7.0; 20 °С.

2. Структурные перестройки в мембранах адсорбированных липосом

Из литературы известно, что взаимодействие анионных липосом с линейными кагионными полимерами может сопровождаться структурными перестройками в липосомальных мембранах; существенным ускорением трансмембранной миграции липидных молекул (флип-флопом) и фазовым разделением в липосомальной мембране (латеральной сегрегацией липидов). Структурные перестройки в мембранах анионных липосом, связанных в комплекс с поликатионными щётками, изучали, используя методы лазерного микроэлектрофореза и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Первый из этих методов отражает изменение электрофоретической подвижности (ЭФП) кагионных СК+ по мере заполнения их поверхности анионными липосомами, то есть при нейтрализации поверхностного заряда щёток адсорбировшшыми липосомами. На рис. 11 представлены зависимости ЭФП комплексов для липосом с различной мольной долей анионных ФС1" «головок». Видно, что во всех случаях образование комплекса сопровождается уменьшением поверхностного заряда СК+ и переходом его в отрицательную область при больших концентрациях липосом. Увеличение доли анионного липида в липосомальной мембране требует меньшего количества (концентрации) липосом для нейтрализации заряда СК+ и одновременно повышает максимальный отрицательный заряд, приобретаемый СК+ в избытке липосом.

„, мг/мл

Рису нок И.

Зависимость ЭФП частиц комплекса СК+/липисомы ФС'7ФХ от концентрации липосом. v = 0.1 (/), 0.2 (2), 0.3 (5), 0.4 (4), 0.5 (5), 0.54 (б). [СК+] = 1x10*" осново-моль/л; 10"2 М трис СК+, от 1/у. [СК+] = МО" осново-моль/л, буфер, рИ 7.0, 20 СС. Ю"2 М трис буфер, рН 7.0, 20 °С.

Рисунок 12.

Зависимость концентрации ФС' /ФХ липосом, включенных в электронейтральный (ЭФП=0) комплекс с

Кривая 1 на рис. 11 описывает электрофоретическое титроваиие суспензии СК+ суспензией ФС'"/ФХ липосом с v = 0.1. Выше мы показали, что липосомы такого состава количественно связываются с поликатиоиными щётками. Это означает, что в точке ЭФП = 0 положительный заряд щёток численно равен суммарному отрицательному заряду ФС1" липидов, расположенных на внешних (обращенных к СК+ поверхности) монослоях адсорбированных липосом. Принимая во внимание сохранение целостности липосом после комплексообразования, полученный результат однозначно указывает на то, что адсорбция сопровождается переходом анионных липидов с внутренней стороны липосомальной мембраны на внешнюю (флип-флопом). Если индуцированный СК+ флип-флоп ФС1" молекул развивается в липосомах с различным содержанием ФС1", концентрация липосом в точке ЭФП = 0 (|Лип]-)фп=о) должна быть обратно пропорциональна у. Действительно, значения [Лип]эфп-о, полученные из рис. И, описываются линейной зависимостью во всем интервале 1/у (рис. 12). Таким образом, СК+ индуцируют флип-флоп в адсорбированных липосомах всех исследованных составов.

При мольной доле ФС1" в мембране V = 0.5 и менее индуцированный СК+ флип-флоп не оказывает влияния на целостность липосом, поскольку миграция ФС1" с внутренней стороны мембраны на внешнюю компенсируется переходом равного количества нейтральных ФХ молекул в противоположном направлении: с внешней стороны мембраны на внутрешпою.

При повышении доли апиошюго лшшда до 0.54 его переход на внешнюю сторону мембраны уже не может быть компенсирован синхронным перемещением нейтрального липида: в бислое появляются дефекты, что регистрируется кондуктометрически (рис. 8). Геометрическая комплементарность ашюнного и нейтрального липидов оказывает сушествешюе влияние на стабильность адсорбированных липосом. Лшюсомы, в которых КЛ2", имеющий форму усеченного конуса, распределен среди цилиндрического ФХ, разрушаются при доле КЛ2" v > 0.3. Мембрана, содержащая смесь цилиндрического ФС1" и цилиндрического ФХ, сохраняет целостность вплоть до содержания ФС1" равного 0.5.

Второй из упомянутых выше методов, дифференциальная сканнрующуя калориметрия (ДСК), позволяет анализировать фазовые переходы в липидном бислое, что, в свою очередь, дает возможность следить за микрофазовым разделением в мембране адсорбированных липосом, т.е. распределением ФС1' молекул в мембране ФС' /ФХ липосом до и после их адсорбции на поверхности поликатионных щёток. Липидный бислой характеризуется температурой фазового перехода (температурой плавления) 7ф. Ниже температуры 7ф липидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидных молекул ("твёрдые" лшюсомы). При температуре выше Гф мембрана переходит в жидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает ("жидкие" липосомы). В наших экспериментах природный ФХ, представляющий собой смесь липидов с различными температурами плавления, был заменен на синтетический аналог, дипальмотоилфосфатидилхолин (ДПФХ), с температурой плавления 41 °С. Калориметрическая кривая, отражающая плавление липосом, сформированных из нейтрального ДПФХ, представлена на рис. 13а (кривая 1) и воспроизведена на рис. 136 (кривая 1) и рис. 13в (кривая 1).

Калориметрическая кривая смешанных ФС'"/ДПФХ липосом с v = 0.1 (рис. 13а, кривая 2) характеризуется широким фазовым переходом с пиком при 39 °С и плечом при 35 °С, которые отвечают плавлешпо двух смешанных ФС'"/ДПФХ микрофаз с различным соотношением компонентов. В дополнение к этому на кривой имеется еще один пик при 41 °С, который указывает на присутствие в мембране доменов, состоящих только из молекул электронейтрального ДПФХ.

Добавление СК+ к суспензии липосом с v = 0.1 делает пик фазового перехода более узким с максимумом при 41 °С (рис. 13а, кривая 3), который отражет образование ДПФХ доменов, освобожденных от анионного ФС"1 в результате связывашм последнего в электростатический комплекс с СК+. Плечо при 40 °С отвечает доменам ДПФХ с

-- 1 ... 2 — 3

30

т, °с

Рисунок 13.

Калориметрические кривые ДПФХ липосом (кривые 1, контроль), ДПФХ/ФС1" липосом (кривые 2) и комплекса СК+ с ДПФХ/ФС1 липосомами (кривые 3). ДПФХ/ФС1" липосомы с v = 0.1 (а), 0.3 (б) и 0.5 (в); 10"2 М трис буфер, pH = 7.0.

20 30 40

Т, °С

незначительной примесью ФС"1. Что касается комплекса СК+/липосома, его фазовый переход лежит в области температу р ниже 5 °С, за пределами возможностей использованного микрокалориметра.

Повышение доли ФС"1 в липосомальной мембране до у = 0.3 сопровождается заметным уширением калориметрической кривой и смещением её в область низких температур, при этом на кривой выделяются два максимума при 32 и 38 °С (рис. 136, кривая 2). Добавление СК+ к липосомальной суспензии не влияет на диапазон температу р фазового перехода, однако на кривой обнаруживается лишь один пик с максимумом при 37 °С (рис. 136, кривая 3). Отсутствие пика при 41°С указывает на то, что мембрана ФС'/ФХ липосом с V = 0.3, адсорбированных на поверхности СК+, не содержит доменов, состоящих из чистого ДПФХ: нейтральный ДПФХ включён в смешанные домены с анионным ФС"1.

В следующем эксперименте доля ФС"1 в липосомальной мембране была увеличена до

v = 0.5, что соответствует предельному содержанию ФС"1, при котором липосомы все ещё сохраняют свою целостность после адсорбции. Широкий фазовый переход в таких липосомах (рис. 13в, кривая 2) указывает на образование доменов с различным соотношением обоих липидов. Последующее добавление СК+ к суспензии липосом не приводит к появлению 41 °С пика на калориметрический кривой и, следовательно, не вызывает разделения мембраны на две микрофазы: чистого ДПФХ и ФС"1, связанного в комплекс с катионными группами СК+. В адсорбированных липосомах с V = 0.5 (так же, как и в случае липосом с V = 0.3) нейтральный ДПФХ формирует смешанные домены с анионным липидом.

Строение мембраны адсорбированных липосом представлено на рис. 14. При невысоком содержании ФС"1 большая часть ФС"1 молекул сосредоточена в области, непосредственно примыкающей к поверхности СК+. Лишь немногие молекулы ФС"1 остаются на противоположной (внешней) стороне адсорбированных липосом, обращенной в буферный раствор (рис. 14а); именно эти немногочисленные молекулы ФС"1 придают комплексу невысокий отрицательный заряд, регистрируемый методом микроэлектрофореза (рис. 11, кривая 1). Увеличение доли анионного липида до V = 0.3 и далее до V = 0.5 приводит к последовательному увеличению количества молекул ФС1' на внешней стороне адсорбированных липосом (рис. 146) и, как следствие, к про1рессивному возрастанию отрицательного заряда комплекса (рис. 11, кривые 2-5)

Таким образом, полное фазовое разделение в мембране липосом, адсорбированных на СК+ возможно лишь при малой доле анионного липида.

а б

Рисунок 14.

Схематическое представление липосом с низким (а) и высоким (б) содержанием анионного липида до (левые части рисунков а и б) и после (правые части рисунков а и б) связывания с СК+. Низкое содержание липида соответствует V = 0.1, высокое содержание липида V = 0.3.

3. Комплексы, содержащие липосомы с наполнителями различной химической природы

Сказанное выше относится к комплексам, полученным путем адсорбции на поверхности щеток липосом, запоненных водорастворимой солью (№С1). Однако описанный прием позволяет формировать мультилипосомальные контейнеры, содержащие липосомы с различными наполнителями. В этом случае адсорбируемая смесь может быть пригогоатена из липосом одинакового липидного состава, но содержащих различные - гидрофильные (водорастворимые) и/или гидрофобные (мембранорастворимые) - инкапсулированные вещества. Такие вещества не будут вносить вклад в суммарный отрицательный заряд липосом и поэтому не будут влиять на способность липосом связываться с положительно заряженными сферическими щётками. Можно ожидать, что соотношение липосом в адсорбированном слое не будет отличаться от их соотношения в липосомальной смеси до адсорбции.

Для проверки этой гипотезы были приготовлены три типа ФС'УФХ (у = 0.1) липосом. Первые были заполнены водным раствором 7-гидроксифеноксазона (лакмуса) (ЛЛак); в мембрану вторых был встроен гидрофобный краситель 1,1-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорат (ДИЛ) (Лдил); третьи содержали дипальмитоил-фосфатщщлэтаноламин, ковалентно меченый карбоксифлуоресцеииом (ДПФЭ-КФ) (Лк<ь). Как видно го рис. 15, липосомы содержали разные типы наполнителей: гидрофильный, гидрофобный и гидрофильный с гидрофобным якорем.

Суспензии трёх типов липосом смешивали в разных весовых соотношениях С^нсх- (Ллах)исх /(Лдил) нсх /(ЛКФ) исх, и полученные смеси добавляли к суспензии СК+ с таким расчетом, чтобы суммарная концентрация липосом вдвое превышала ту, которая обеспечивала насыщение поверхности щёток. После отделения комплекса центрифугированием в супернатанте спектрофотометрически определяли концентрацию каждого вида липосом. Липосомы, заполненные раствором лакмуса, детектировали при 586 нм, липосомы со встроенным ДИЛ при 551 нм и липосомы с ДПФЭ-КФ при 498 нм. Получешше результаты пересчитывали в концентрации связавшихся со щётками липосом и представляли в пиле весового соотношения Отм„=СЛла«)»-л,У(Лдил)»„г/(Ли,)„,МП. Как видно из дагшых Таблицы I, С2ясч ~ О«™ для всех исследованных смесей. Описанная методика является хорошей иллюстрацией предлагаемого нами простого способа получения мультилипосомальных контейнеров с контролируемым содержанием инкапсулированных веществ.

Рисунок 15.

Схематическое изображение липосом с различными наполнителями: лакмус (а), ДИЛ (б) и ДПФЭ-КФ (в).

Таблица 1. Составы смесей липосом до и после связывания со СК+.

№ п/п Оисх С^комп

(Ллак)исДЛдил)исх/(Лкф)ису (Л Лак)комп/(Л дил )комг/ (Л Кф)и»ш

1 0.66/1/1 0.6/1.15/1

2 0/1/2 0/1/1.85

3 0.1/1.5/1 0.16/1.4/1

4. Комплексы поликатионных щёток с рН-чувствнтельными липосомами

Для того чтобы "открыть" липосомальные контейнеры и высвободить биолопгчески активное содержимое не случайным образом, а при попадании их в слабокислую среду характерную для воспаленных тканей и опухолей был использован следующий подход. В мембрану анионных липосом на стадии их приготовления было встроено липидоподобное амфифильное соединение - алкшгарованное производное т/ии/с-3,4-дигидроксш1инсридшга (ДОП) (рис. 16). Повышение кислотности среды и протонирование атома азота в молекуле ДОП сопровождается образованием в1гутримолекулярной водородной связи и изменением конформашга ДОП-фрагментов и пространственной ориентации алкильных цепей. В липосомах со встроенным ДОП-липвдом такой конформационный переход приводит к нарушению упаковки гидрофобной части бислоя и высвобождению содержимого липосом в окружающую среду. Использованные в наших экспериментах рН-чувствительные липосомы содержали три компонента (в мольных долях): анионный ФС1" (0.1), цвигтер-ионный ФХ (0.6) и ДОП-липвд (0.3). Поведение рН-чувствительных липосом сравнивали с поведением традиционных ФС'"/ФХ липосом (v = 0.1).

ШП допн*

Рисунок 16. Схема конформационного перехода в ДОП-липиде при изменении рН среди

На рис. 17 (кривая 2) приведена зависимость ЭФП катионных щёток от концентрации добавленных тройных рН-чувствительных липосом в буферном растворе с рН 7. Эта кривая полностью повторяет профиль ЭФП зависимости катионных щёток в присутствии бинарных ФС'"/ФХ липосом с v = 0.1, не содержащих ДОП-липвда (рис. 17, кривая 1). Такой вид

кривой электрофоретического титрования для рН-чувствительиых липосом отражает их адсорбщпо на поверхности катионных щёток при рН 7 и указывает на то, что движущей силой адсорбции является образование солевых связей между анионными группами ФС1" и катионными группами СК+. Третичные аминогруппы ДОП-липида при рН 7 находятся в непротошфованной (незаряженной) форме и поэтому не вносят вклад в электростатическую адсорбщпо ФС'7ФХ/ДОП липосом.

Иная картина наблюдается в растворе с рН 5: ЭФП щёток в присутствии рН-чувствительных л1шосом описывается горизонтальной кривой 5 (рис. 17), в то время как соответствующая кривая 4 для бинарных липосом по-прежнему имеет 8-образный вид характерный для системы «бинарные липосомы - СК+» в растворе с рН 7. Эти результаты говорят об отсутствии взаимодействия рН-чувствигельных липосом со щетками при рН 5 и адсорбции бинарных анионных липосом на поверхности щёток в этих условиях.

С™™*»., мг/мл С„,„осо„, мг/мл

Рисунок 17.

Зависимость ЭФП поликатионных щёток от концентрации липосом. Комплексы СК+/липосомы ФС'7ФХ при рН 7 (1) и рН 5 (4); комплексы СК+/липосомы ФС' /ФХ/ДОП при рН 7 (2) и рН 5 (5); ФС'УФХ'ДОП липосомы были адсорбированы на поверхности щёток при рН 7, после чего раствор был подкислен до рН 5 (3). [СК+] = 1 хЮ"4 осново-моль/л.

Причина такого расхождения в поведении липосом с ДОП-лшшдом и без него заключается в следующем. Понижение рН раствора сопровождается протонированием аминогрупп ДОП-липида, нейтрализацией отрицательного заряда ФС1" молекул и уменьшением суммарного заряда рН-чувствительных липосом. При рН 5 суммарный заряд рН-чувствительиых липосом переходит в положотельную область и становится равным 0.78 (мкм/с)/В/см). Такие липосомы перестают связываться с положительно заряженными поликатионными щётками. Что касается бинарных липосом, их отрицательный заряд в основном определяется фосфатными группами ФС1" молекул, степень диссоциации которых

близка к максимальной при обоих значениях рН. Именно это и определяет одинаковую эффективность связывашга бгашрных липосом с СК+ при рН 7 и 5.

Поведение комплекса поликатионных щёток и р1 [-чувствительных липосом, сформированного при рН 7 и затем перемешенного в закисленный внешний раствор с рН 5, представляет особый интерес. Этот эксперимент моделирует ситуацию, когда мультилипосомальный контейнер, введённый в кровоток с рН близким к нейтральному, попадает в слабокислую среду характерную для воспалённых тканей и опухолей.

Зависимость ЭФП комплекса, полученного в растворе с рН 7 и затем доведенного до рН 5, представлена кривой 3 на рис. 17. Видимое на рисунке отсутствие изменений ЭФП могло быть следствием двух причин. Комплекс мог сохраняться при закислении раствора, тогда регистрируемый нами положительный заряд отражал протошфование ДОП-липвда в составе комплекса либо комплекс диссоциировал в растворе с рН 5, и мы фиксирован! положительный заряд поверхности СК+, освобожденной от липосом. Чтобы сделать выбор между этими вариантами, были проведены дополнительные эксперименты по измерению размера частиц в системе методом динамического светорассеяния (рис. 18).

Рисунок 18.

Зависимость гидродинамического диаметра поликатионных щёток от концентрации липосом. ФС'УФХ/ДОП липосомы: рН 7 (1) и 5 (2); ФС'/ФХ'ДОП липосомы были адсорбированы на поверхности СК+ при рН 7, после чего раствор был подкислен до рН 5 (3). [СК+] = 1 * 1 (Г1 осново-моль'л.

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

Сляпосм> МГ/МЛ

Добавление рН-чувствительных липосом к суспензии СК+ при рН 7 приводит к укрупнению частиц в системе (рис. 18 кривая 1), агрегаты наибольшего размера образовываются при полной неигрализашш заряда щёток зарядом адсорбированных липосом (ср. с кривой 2 на рис. 17). Смешение тех же компонентов при рН 5 не сказывается на размере частиц (рис. 18, кривая 2), что коррелирует с отсутствием комплексообразования в этих условиях по данным электрофореза (рис. 17, кривая 5). В «закисленной» системе мы наблюдаем формирование агрегатов (рис. 18, кривая 3), что очевидно указывает на сохранение связывания липосом с поверхностью щёток после смены рН раствора с 7 на 5. Выше мы говорили о том, что связывание v = 0.1 агаюнных липосом с поликагионными

щётками сопровождается латеральной сегрегацией липидов, в результате которой большая часть анионных липидных молекул концентрируется в области, непосредственно примыкающей к поверхности щёток (рис. 146), при этом цвнттер-ионные молекулы ФХ и непротонированные молекулы ДОП-липида вытесняются на противоположную (обращённую во внешний раствор) сторону липосомы. Электростатическое взаимодействие анионного домена в липосомальной мембране и катионной поверхности щёток оказывается настолько прочным, что сохраняется и после протонирования ДОП-липидов и появления полож1ггельного заряда на внешней поверхности комплекса.

Методом спектрофотометрии (см. детали на стр. 5-6) было показано, что каждая катионная щётка способна в среднем связать около 40 рН-чувствительных липосом.

Способность ФС'7ФХ/ДОП липосом высвобождать инкапсулированное вещество при закислении раствора была исследована методом кондуктометр™. В контрольном эксперименте, когда заполненные солевым раствором липосомы добавляли к суспензии поликатионных щёток в буфере с рН 7, уровень электропроводности не менялся в течение 2 часов после смешения компонентов. Иными словами, целостность липосом сохраняется после их связывания с СК+. Закисление внешнего раствора до рН 5 приводит к быстрому возрастанию электропроводности суспензии: до 50% за первые 15 секунд, с постепенным выходом на максимум (60%) через 40 минут после смешения. Для липосом в отсутствии щёток в растворе с рН 5 наблюдается гораздо более медленное вытекание соли: 12.5% за первые 10 минут после смены внешнего раствора с рН 7 до рН 5. Полученные результаты показывают, что липосомы со встроенным ДОП-липидом высвобождают инкапсулированное вещество в ответ на изменение рН раствора и скорость выхода вещества из мультилипосомальных комплексов существенно превышает скорость выхода вещества из несвяза1шых в комплекс липосом.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что липосомы, сформированные из смеси нейтрального и анионного липидов, элекстростатически адсорбируются на поверхности полистирольных микросфер с привитыми поликатионными цепями («сферических поликатионных щёток»). Целостность адсорбированных липосом определяется мольной долей анионного липида (v) и геометрией его молекул: для кардиолипина, молекулы которого имеют форму усечённого конуса, целостность липосом сохраняется при v < 0.3, для цилиндрических по форме молекул фосфатидилсерина при v < 0.5.

2. Предложена модель, описывающая роль привитых поликатпошгых цепей в сохранении целостности адсорбированных липосом. С одной стороны несущая высокий суммарный положительный заряд поликатионная корона обеспечивает эффективное электростатическое связывание нескольких десятков анионных липосом, а с другой предотвращает непосредственный контакт адсорбированных липосом с поверхностью полистирольного ядра.

3. Впервые показано, что адсорбция липосом сопровождается переходом анионных липидов с внутренней стороны липосомалыюй мембраны на внешнюю (флип-флопом) и микрофазовым разделением липидов в мембране. При этом полное разделение на два типа доменов, состоящих из (1)электронейтральных Л[шидов и (2)аниош1ых липидов, электростатически связанных с катионными звеньями привитых макромолекул, наблюдается в липосомах с малым содержанием анионного липида (при V = 0.1).

4. Впервые получены мультилипосомачьные комплексы с контролируемым соотношением инкапсулировашгых в липосомах веществ путём смешения водной суспензии поликагиошшх щёток и водной суспензии смеси липосом с разными гидрофобными и гидрофильными наполнителями.

5. Впервые получены комплексы, содержащие поликатионные щетки и липосомы со встроенным в мембрану «конфор.чациониым переключателем», диалкил-тяранс-3,4-дигидрокешпшеридином. Адсорбированные липосомы высвобождают инкапсулированное вещество в ответ на уменьшение рН раствора, и скорость выхода данного вещества из мультилипосомачьных комплексов в несколько раз превышает скорость его выхода из индивидуальных (не связанных в комплекс) липосом.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1) Статьи из перечня ВАК РФ российских рецензируемых научных журналов

1. Заборова, О.В. Строите и свойства комплексов поликатионных щеток с анионными липосомами / О.В. Заборова А.В. Сыбачин, М Ballauff, А.А. Ярославов // Высокомолек. соед. Сер. А, —2011,—Т. 53,№ 11,— С. 1877-1884.

2) Статьи из журналов, индексируемых Web of Science

2. Sybachin, A.V. Complexes between anionic liposomes and spherical polycationic brushes. An assembly of assemblies / A.V. Sybachin, O.V. Zaborova, V.N. Orlov, P.I. Semenyuk, M. Ballauff, E. Kesselman, 1. Schmidt, Y. Talmon, F.M. Menger, A.A. Yaroslavov // Langmuir— 2014. — Vol. 30, no. 9. — P. 2441-2447.

3. Yaroslavov, A.A. Lipid segregation in membranes of anionic liposomes adsorbed onto polycationic brushes / A.A. Yaroslavov, A.V. Sybachin, O.V. Zaborova V.N. Orlov, M. Ballauff, Y. Talmon, F.M. Menger // Chemistry - A European Journal. — 2013. — Vol. 19, no. 41. — P. 13674-13678.

4. Sybachin, A.V. Composition and properties of complexes between spherical polycationic brushes

and anionic liposome / A.V. Sybachin, O.V. Zaborova, M.M. Ballauff, E. Kesselman, J. Schmidt, Y. Talmon, F.M. Menger, A.A. Yaroslavov // Lancmuir — 2012. — Vol. 28, no. 46 — P 1610816114.

3) Материалы конференций

5. Калашникова И.В., Заборова О.В. Строение и свойства комплексов полипептидных везикул с анионными липосомами // Материалы Международного молодёжного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2013» [Электронный ресурс]. - М.: МАКС Пресс, 2013. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM), 63.

6. Zaborova O.V., Sybachin A.V. Influence of anionic lipid fraction on lipid rearrangements in the membrane of anionic liposomes induced by complexation with polycationic particles // IV International conference on colloid chemistry and physicochemical mechanics, 2013, Moscow, Russia. Book of abstracts, PP23.

7. Zaborova O.V., Sybachin A.V., Orlov V.N., Yaroslavov A.A. Structural rearrangements in membranes of anionic liposomes induced by their adsorption on the spherical polycationic brushes // Austrian-Slovenian polymer meeting, 2013, Bled, Slovenia. Book of abstracts, S2-P20.

8. Sybachin A.V., Zaborova O.V., Talmon Y., Ballauif M., Yaroslavov A.A., Non-destructive adsorption of anionic liposomes // 12th Biannual Bayreuth Polymer Symposium "BPS 11", 2011, Bayreuth, Germany. Book of abstracts, P. 30.

9. Zaborova O.V., Sybachin A.V., Ballauff M„ Yaroslavov A.A., Spherical polycationic brushes decorated by anionic liposomes // 12th Biannual Bayreuth Polymer Symposium "BPS 11", 2011, Bayreuth, Germany. Book of abstracts, P. 28.

10. Заборова O.B. Новые наноконгейнеры на основе комплексов отрицательно заряженных липосом с поликатионными щётками // Материалы Международного молодёжного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» [Электронный ресурс]. - М.: МАКС Пресс, 2011. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM), 32.

Список сокращений

ДИЛ - 1,1-диоктадециол-3,3,3',3'-тетрамет,т1тдо-карбоцнашш перхлорат ДОП - транс-3,4-дтидроксипиперидин ДОФХ - диолеоилфосфатидштхолин

ДОФЭ-СР- 1,2-диолеош1-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-(лиссамин сульфородамин Б) ДПФХ - дипальмитоилфосфатидилхолин

ДПФЭ-ФИТЦ - дппальмитоил-фосфагидилэтаноламин, меченный флуоресцеинизотиоцианатом

ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия КЛ2" — карднолнпин

Крио-ТЕМ - криогенная трансмиссионная микроскопия Лак - лакмус

СК+ - сферические полкатионные щётки

ФС1" - фосфатидилсернн

ФХ - фосфатидилхолин

ЭФП - электрофоретическая подвижность

Подписано в печать ¿ц. года. Заказ № 2 6 .

Формат 60x90/16. Усл. печ. листов 1,5 . Тираж /00 экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химическою факультета МГУ имени М.В. Ломоносова