Комплексы гидрофобизованных поликатионов с отрицательно заряженными липосомами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

? 1 О Ос» .

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ

р ,, , ^ЕВрЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

1 Ь и^ОСУДАРбТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 541.183.24+541.64

ЯРОСЛАВОВА Екатерина Геннадиевна

КОМПЛЕКСЫ ГИДРОФОБИЗОВАННЫХ ПОЛИКАТИОНОВ С ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ ЛИПОСОМАМИ

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1998

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: академик, доктор химических наук, профессор В.А.Кабанов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор М.И.Штильман кандидат биологических наук А.А.Левина

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова

Защита состоится " 1998 г. в 15 часов на

заседании диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.А.Миронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие синтетических полиэлектролитов с поверхностью клеток и модельных объектов -бислойных липидных везикул (липосом) является предметом интенсивного исследования на протяжении последних 30 лет. Как известно, поверхность большинства клеток несет суммарный отрицательный заряд. Поэтому интерес исследователей был сконцентрирован на изучении поведения поликатионов на поверхности натизных и фиксированных клеток либо отрицательно заряженных липосом. Обсуждаемые вопросы касаются различных аспектов такого взаимодействия и включают состав и строение межфазных комплексов; структурные перестройки в липосомальной мембране; конформационные переходы в адсорбированном полиэпекгролите; а также агрегацию, слияние и разрушение липосом. Эти проблемы являются предметом многочисленных публикаций, им посвящен ряд обстоятельных обзоров. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения прогнозирования возможных последствий контакта полиэлектролитов и биологически активных веществ на их основе с клеточной поверхностью.

Гораздо меньше внимания уделено исследованию взаимодействия поликатионов с клеточными и искусственными биологическими мембранами в условиях конкуренции со стороны отрицательно заряженных макроионов. На это счет имеются отдельные, весьма отрывочные сведения. Между тем этот вопрос представляется чрезвычайно важным. Действительно, оказавшийся в биологическом окружении поликатион неминуемо должен вступать в электростатическое взаимодействие с различными отрицательно заряженными объектами -полисахаридами, ДНК, белками, фрагментами разрушенных клеточных мембран, концентрация которых в любой биологической жидкости достаточно велика. Включение поликатиона в комплекс с этими полианионами может серьезно осложнить и даже полностью подавить его связывание с клеточной поверхностью.

Кроме того, говоря о взаимодействии полиэлектролитов и, в частности, поликатионов с клетками, следует иметь в виду, что на внешней стороне клеточной мембраны располагается гидрофильный слой, гликокаликс, сформированный полисахаридными фрагментами, ковалентно присоединенными к липидным молекулам и мембранным

белкам. Этот слой может оказывать существенное влияние на результат взаимодействия клеток с полиэлектролитами.

Повысить аффинность поликатиона к биологической мембране можно, (1)гидрофобизуя основную цепь полимера либо (2)модифицируя ее боковыми гидрофобными радикалами. Строение таких поликатионов схематически может быть представлено следующим образом (гидрофобные участки изображены заштрихованными прямоугольниками):

© 0 © ©0 @© 0 © 0

(1) (2)

Адсорбция таких модифицированных поликатионов на поверхности мембраны может сопровождаться встраиванием гидрофобных фрагментов в гидрофобную часть липидного бислоя, что должно приводить к повышению устойчивости комплексов поликатион-мембрана в присутствии отрицательно заряженных конкурентов.

Цель работы состояла в изучении взаимодействия гидрофобизованных поликатионов, кватернизованных производных поли-4-аиниллиридина (ПВП), с отрицательно заряженными липосомами, а также состава и сбойств полученных комплексов поликатион-липосома. В работе исследованы:

- адсорбция поликатионов на поверхности смешанных липосом, приготовленных из отрицательно заряженного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ) и электронейтрального фосфатидилхолина (яичного лецитина, ЯЛ);

- взаимодействие поликатионов с КЛ/ЯЛ липосомами, поверхность которых дополнительно гидрофилизована включением в липидный бислой молекул неионогенного ПАВ (Бридж 58) - эфира полиоксиэтилена (ПОЭ) и цетилового спирта. Создаваемая на поверхности липосом гидрофильная "опушка" из коротких цепочек ПОЭ моделировала клеточный гликокаликс;

- устойчивость комплексов поликатион-липосома в водно-солевых средах; и

- конкурентные реакции в тройной системе липосома-поликатион-полианион.

Научная новизна. В работе показано, что адсорбция полностью кватернизованного ПВП, содержащего только боковые этильные радикалы, на поверхности КЛ/ЯЛ липосом определяется в основном электростатическим взаимодействием положительно заряженных звеньев поликатиона с отрицательно заряженными группами КЛ. Такой поликатион может быть практически полностью удален с липосомальной мембраны при увеличении ионной силы раствора или в результате добавления избытка полианиона, образующего с поликатионом более прочный отрицательно заряженный нестехиометричный интерполиэлектролитный комплекс (ИПЭК). Модификация поликатиона боковыми цетильными фрагментами (не более 3 мол.%) обеспечивает дополнительную стабилизацию комплекса поликатион-липосома в водно-солевых растворах и в присутствии отрицательно заряженных макроионов за счет встраивания боковых алкильных радикалов в гидрофобную часть липидного бислоя. Целостность липосомальной мембраны при этом сохраняется. Более того, отрицательно заряженные ИПЭК, сформированные гидрофобизованными поликатионами и линейными полианионами, способны адсорбироваться на отрицательно заряженной липосомальной мембране без ее разрушения.

Взаимодействие этилированного ПВП с КЛ/ЯЛ липосомами сопровождается их агрегацией. Агрегаты наибольшего размера формируются при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом адсорбированным поликатионом. В отличие от этого гидрофилизованные КЛ/ЯЛ/Бридж липосомы с мольной долей полиоксиэтиленовых "головок" равной 30% сохраняют свой размер даже при полной нейтрализации их поверхностного заряда адсорбированным поликатионом.

При адсорбции гидрофобизованного поликатиона на поверхности КЛ/ЯЛ/Бридж липосом его боковые цетильные радикалы способны проникать сквозь экспонированный в водную фазу слой ПОЭ цепочек и заглубляться в гидрофобную область липосомальной мембраны.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании модельной системы поликатион-липосома, имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических поликатионов и биологически активных веществ на их основе с клеточной мембраной. Проведенная в работе сравнительная оценка способности гидрофобизованных поликатионов

взаимодействовать с поверхностью отрицательно заряженных липосом позволяет предложить эффективный способ повышения стабильности комплексов поликатион-биомембрана в водно-солевых средах и в условиях конкуренции со стороны отрицательно заряженных макроионов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном симпозиуме по мицеллам, микроэмульсиям и монослоям (США: Гайнесвил, 1995); 9 Международной конференции по поверхностным явлениям и коллоидам (Болгария: София 1997); 6 Международном совещании по биокапсулированию (Испания: Барселона, 1997); 212, 213 и 214 Национальных конференциях Американского химического общества (США: Орландо, 1996; Сан-Франциско, 1997; Лас-Вегас, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 99 страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Экспериментальную часть, Обсуждение результатов, Основные выводы и Список цитируемой литературы из 145 ссылок. Работа содержит 39 рисунков и 1 таблицу.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цель и задачи.

В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся в литературе данные по методам получения бислойных липидных везикул (липосом), структуре липидного бислоя, строению и свойствам комплексов линейных полиэлектролитов с противоположно заряженными линейными макромолекулами, белками и молекулами ПАВ, а также обсуждены эффекты, вызываемые в липосомальной мембране адсорбированными синтетическими поликатионами и катионными полипептидами, и обратимость взаимодействия поликатион-липосома.

В Экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе были использованы следующие катионные сополимеры (в скобках указаны составы): (1)М-этил~4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (95/5), П2; (50/50), П2(50); и (30/70), П2(30); (2)ГЧ-этил-4-винилпиридиний бромид/Ы-гептил-4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (77/3/20), П2,7; (3)Ы-этил-4-винилпиридиний бромид/N-додецил-4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (74/3/23), П2,12; и

(4)М-этил~4-винилпиридиний бромид/М-цетил-4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (83/3/14), П2.16. Состав сополимеров был определен методом ИК спектроскопии. Степень полимеризации всех поликатионов, определенная методом светорассеяния, была равна 1070. Степень полимеризации полиакриловой кислоты (ПАК) составляла 70. Концентрация катионных сополимеров всюду приведена в молях кватернизованных групп на литр раствора, концентрация ПАК в осново-моль/л.

Использовали двух (КЛ/ЯЛ) и трехкомпонентные (КЛ/ЯЛ/Бридж) липосомы, которые получали, озвучивая водные дисперсии липидов или их смесей с неионогенным ПАВ. В случае двухкомпонентных липосом мольное соотношение компонентов КЛ/ЯЛ=20/80. Состав трехкомпонентных липосом задавался соотношением КЛ/ЯЛ/Бридж= 20/80-М/1М, где N - мольная доля Бридж. Размер липосом, определенный методом фотонной корреляционной спектроскопии, находился в пределах 40-70 нм.

Электрофоретическую подвижность (ЭФП) липосом определяли методом лазерного микроэлектрофореза. В работе использовали также методы флуоресцентной, УФ и ИК спектроскопии, кондуктометрии и потенциометрии. Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц. Эксперименты проводились в 10"2 М боратном буферном растворе с рН 9,2 при температуре 20°С.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ (Обсуждение результатов)

В настоящей работе в качестве взаимодействующих с липосомальной мембраной поликатионов были использованы кватернизованные производные ПВП. Гидрофобные фрагменты формировались в основной цепи поликатионов за счет неполной кватернизации ПВП бромистым этилом либо вводились как боковые алкильные заместители с количеством метиленовых групп от 7 до 16.

1. Взаимодействие частично кватернизованных поли-4-винилпиридинов с отрицательно заряженными липосомами

В работе были использованы этилированные производные поли-4-винилпиридина с содержанием алкилированных пиридиновых звеньев 30, 50 и 95 мол.% (Л2(30), П2(50) и П2, соответственно). Для исследования адсорбции этих поликатионов на поверхности липосом и стабильности комплексов поликатион-липосома в водно-солевых средах и в присутствии отрицательно заряженного полимерного конкурента, полиакрилат-аниона (ПАА), были использованы КЛ/ЯЛ (20/80) липосомы, в мембрану которых был встроен флуоресцентно меченый липид, флуоресцеин -изо-тиоцианилдипальмитоилфосфатидилэтаноламин (ФИТЦ-ДПФЭ).

Известно, что кватернизованные производные ПВП являются тушителями флуоресценции. Поэтому за образованием и разрушением комплексов этих поликатионов с мечеными липосомами следили по изменению относительной интенсивности флуоресценции встроенной в мембрану метки, 1/10.

Как следует из рис.1, адсорбция всех трех поликатионов на поверхности меченых липосом сопровождалась тушением флуоресценции метки (кривые 1-3). Последующее добавление №С1 к сформированным комплексам поликатион-липосома приводило к восстановлению флуоресценции, однако степень восстановления зависела от доли нек8атернизованных (гидрофобных) пиридиновых звеньев в молекуле поликатиона (рис.2). В случае П2 (поликатиона с минимальным содержанием некватернизованных звеньев) флуоресценция возвращалась к исходному уровню (кривая 1), что свидетельствовало о полной диссоциации комплексов, образованных этим поликатионом и КЛ/ЯЛ липосомами. Существенно, что этот процесс развивался в относительно узком интервале концентраций №С1: от 0,15 до 0,25 М. Это означало, что адсорбция П2 на поверхности КЛ/ЯЛ липосом определяется в основном ионными контактами каатернизованных звеньев поликатиона с отрицательно заряженными полярными группами молекул КЛ. Диссоциация этого комплекса представляет собой кооперативный процесс аналогичный диссоциации ИПЭК, образованных линейными полиэлектролитами.

l/l0 1.0

0 12 3

[Поликатион]х104, М

Рис.1.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ липосом от концентрации поликатионов до (1-3) и после добавления ПАА (4-6). П2 (1,4); П2(50) (2,5); и П2(30) (3,6). Концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, 10"2 М; 20°С. [ПАА]/[Поликатион]=3.

I/I0

0.0 0.2 0.4 0.6 [NaCI], М

Рис.2.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ липосом в комплексе с П2 (1), П2(50) (2) и П2(30) (3) от концентрации ЫаС1. [П2]=2х10*4 М; [П2(30)]= (П2(50)]=10"4 М; концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, Ю-2 М; 20°С.

В то же время увеличение концентрации №С1 в растворе приводило лишь к частичному восстановлению флуоресценции липосом, связанных в комплексы с П2(50) и П2(30) (кривые 2 и 3, рис.2). Это означало, что П2(50) и П2(30) не полностью десорбировались с поверхности липосом даже при концентрации МаО равной 0,25 М, которая была достаточна для полной диссоциации всех ионных связей между звеньями адсорбированных поликатионов и входящими в состав липосомальной мембраны молекулами КЛ. По-видимому, оба поликатиона продолжали удерживаться на поверхности липосом благодаря встраиванию своих гидрофобных участков, представленных некватернизованными пиридиновыми звеньями, в гидрофобную часть липидного бислоя. Согласно этой модели, прочность комплексов в водно-солевых средах должна возрастать с увеличением общей длины гидрофобных блоков в цепи поликатиона. Именно это и наблюдалось в эксперименте: степень восстановления флуоресценции встроенной в липосомальную мембрану метки или что то же - степень диссоциации комплексов поликатион-липосома

уменьшалась с уменьшением степени кватернизации ПВП (ср.кривые 1-3 на рис.2).

Естественно было ожидать, что встраивание достаточно объемных гидрофобных фрагментов в липосомальную мембрану будет сопровождаться появлением в ней дефектов, что можно зарегистрировать по увеличению проницаемости липосом в комплексе с гидрофобизованными поликатионами. Для проверки этого предположения были приготовлены липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен 1М раствором №С1. После добавления к этим липосомам П2 и гидрофобизованного П2(30) измеряли проводимость полученных растворов. Результаты сравнивали с максимально возможным приростом проводимости в результате необратимого разрушения липосом, вызываемого добавлением 10-кратного избытка раствора Тритона Х100. Оказалось, что взаимодействие липосом с П2 не вызывает увеличения проводимости, в то время как добавление П2(30) приводит к его заметному (на 15-20%) возрастанию. Это означает, что адсорбция П2 на липосомальной мембране не вызывает нарушения ее целостности. Напротив, взаимодействие с П2(30) приводит к некоторому увеличению проницаемости мембраны, т.е. к появлению в ней дефектов, очевидно, благодаря встраиванию незаряженных гидрофобных фрагментов поликатиона в липидный бислой. Очень важно, что этот процесс не сопровождается необратимым разрушением липосом. Не исключено, что адсорбция П2(30) индуцирует их слияние, которое, как следует из литературных данных, также характеризуется частичным вытеканием содержимого липосом из внутреннего объема. Этот очень интересный вопрос требует дополнительных исследований.

Поведение описанных выше комплексов поликатион-липосома в присутствии отрицательно заряженного полимерного конкурента, ПАА, качественно описывается теми же закономерностями, что и поведение этих комплексов в водно-солевых средах. Добавление ПАА к комплексам меченых липосом с поликатионами в соотношении [ПАА]/[Поликатион]=3 приводило к восстановлению флуоресценции липосом до исходного уровня в случае комплекса липосома-П2 (кривая 4, рис.1), частичному возгоранию флуоресценции в случае комплекса липосома-П2(50) (кривая 5, рис.1) и практически полному отсутствию эффекта в случае комплекса липосома-П2(30) (кривая 6, рис.1). Эти результаты свидетельствуют о том, что линейный полианион количественно удаляет П2 с поверхности липосом в виде нестехиометричного отрицательно заряженного ИПЭК. В

то же время полианион не может полностью вытеснить ни П2(50) ни П2{30). По-видимому, и в этих случаях полиакрилат-анион образует ИПЭК с поликатионами. Однако включенные в эти комплексы П2(50) и П2(30) сохраняют контакт с липосомальной мембраной благодаря взаимодействию их гидрофобных фрагментов с гидрофобной частью липидного бислоя.

Иными словами, полианион даже взятый в значительном избытке не может полностью разрушить уже сформированный комплекс гидрофобизованного поликатиона (частично кватернизованного лоли-4-винилпиридина) с отрицательно заряженной мембраной. Между тем, учитывая высокую концентрацию и значительную подвижность отрицательных макроионов-конкурентов в биологической жидкости, следует ожидать, что добавленный в нее поликатион в первую очередь будет взаимодействовать именно с этими компонентами. В таком случае возникает принципиальный вопрос: сохранит ли такой поликатион способность взаимодействовать с биологической мембраной, если он связан а отрицательно заряженный нестех иометричный ИПЭК с полианионом?

Для ответа на этот вопрос мы приготовили ИПЭК ПАА/П2(30) состава 3/1 и добавили его к суспензии меченых КЛ/ЯЛ липосом. Однако тушения флуоресценции метки это не вызвало. Более того, тушения не наблюдалось и после добавления поликатиона к смеси меченых липосом и ПАА. Соотношение [ПАА]/[П2(30)| в последнем случае также было равно 3/1. Эти результаты убедительно свидетельствовали том, что в смеси отрицательно заряженных липосом с линейными отрицательно заряженными полиионами П2(30) предпочитает взаимодействовать со вторыми, образуя с ними ИПЭК. В избытке полианиона ИПЭК несет суммарный отрицательный заряд, который препятствует непосредственному контакту гидрофобных звеньев П2(30) с липосомальной мембраной.

Таким образом, включение гидрофобных фрагментов в основную цепь поликатиона не может обеспечить его связывание с липидной мембраной в присутствии превосходящих количеств отрицательно заряженных полиионов.

2. Взаимодействие кватернизованных поли-4-винилпиридинов, несущих боковые алкильные радикалы, с отрицательно заряженными липосомами

Иной подход к повышению аффинности поликатиона к липидной мембране заключается в модификации его цепи боковыми алкильными заместителями. В этом разделе описано взаимодействие КЛ/ЯЛ липосом с кватернизованными производными поли-4-винилпиридина, содержащими наряду с этилированными небольшое количество звеньев, алкилированных гептильными, додецильными или цетильными радикалами (П2,7, П2,12, и П2,16, соответственно).

Так же как и в случае системы липосома-частично кватернизованный поли-4-винилпиридин взаимодействие поликатионов, несущих боковые алкильные радикалы, с КЛ/ЯЛ липосомами и стабильность образованных комплексов поликатион-липосома были исследованы методом флуоресценции. Адсорбция П2,7, П2,12 и П2,16 на липосомальной мембране, в которую встроен флуоресцентно меченый липид, ФИТЦ-ДПФЭ, вызывала тушение флуоресценции метки. Зависимости интенсивности флуоресценции в системе от концентрации этих поликатионов изображены на рис.3 (кривые 1-3). Добавление №С! к

Рис.3.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ липосом от концентрации поликатионов в отсутствии (1-3) и в присутствии ПАА (4.5). П2,7 (1); П2,12 (2); П2,16 (3); комплекс Л2.16-липосома + ПАА (4); и липосомы + комплекс ПАА-П2.16 (5). Концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, Ю-2 М; 20°С. (ПАА]/[Поликатион]=3.

сформированным комплексам поликатион-липосома приводило к восстановлению флуоресценции, однако величина эффекта была различной для разных поликатионов. В случае Л2,7 интенсивность флуоресценции восстанавливалась до исходного уровня (кривая 1, рис.4). Ранее то же отмечалось для комплексов, образованных КЛ/ЯЛ липосомами и содержащими только короткие этильные радикалы

молекулами П2 (кривая 1, рис.2). Это значит, что комплекс липосома-П2,7 как и комплекс липосома-П2 полностью диссоциирует при увеличении ионной силы раствора. Другими словами, адсорбция обоих поликатионов, П2 и П2,7, определялась ионными взаимодействиями алкилированных звеньев поликатионов с отрицательно заряженными группами молекул КЛ.

I/In

1.0

0.5

/

Г-

0.0

0.2

0.4 0.6 {NaCI], М

0.8

1.0

Рис.4.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ липосом в комплексе с П2,7 (1), П2.12 (2) и П2,16 (3) от концентрации ЫаС!. [П2,7]=[П2,12]=[П2,16]= 1,5x10-* М; концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, 10-2 м; 20°С.

Иная картина наблюдалась в случае комплексов, образованных П2.12 и П2,16. В этом случае увеличение концентрации №С1 в растворе даже сверх той, которая была необходима для диссоциации всех ионных связей в комплексах, приводило лишь к частичному восстановлению флуоресценции липосом (кривые 2 и 3, рис.4), причем степень восстановления была одинакова для обоих поликатионов. Это означало, что П2.12 и П2,16 не полностью, но в одинаковой степени десорбировались с поверхности липосом. Очевидно, эти поликатионы удерживались на поверхности липосом благодаря встраиванию своих длинных боковых алкильных фрагментов в гидрофобную часть липидного бислоя. Важно, что для предотвращения диссоциации комплексов было достаточно ввести в молекулу поликатиона не более 3 мол.% додецильных или цетильных боковых групп.

Для проверки целостности липосом после адсорбции поликатионов с длинными боковыми алкильными радикалами мы применили описанный ранее прием, основанный на использовании липосом,' нагруженных 1М раствором №С1. Оказалось, что добавление П2,16 к таким липосомам не вызывает увеличения проводимости растворов. Это означает, что целостность липосом после адсорбции П2.16 сохраняется. По-видимому, причина этого заключается в структурной комплементарное™ формирующих липосомальную мембрану липидных молекул и встраивающихся в мембрану цетильных радикалов П2.16.

Добавление ПАА к комплексу меченых липосом с П2,16 в соотношении [ПАА]/[П2,16]=3 приводило, как и при добавлении №С1, лишь к частичному восстановлению флуоресценции липосом (кривая 4, рис.3). Это говорит о том, что избыток ПАА не может удалить П2,16 с липосомальной мембраны.

В другой серии экспериментов предварительно сформированный отрицательно заряженный ИПЭК ПАА/П2.16 состава 3/1 был добавлен в суспензию меченых КЛ/ЯЛ липосом. Это сопровождалось понижением интенсивности флуоресценции (кривая 5, рис.3). Полученный результат свидетельствовал об адсорбции отрицательно заряженного ИПЭК ПАА-П2,16 на поверхности отрицательно заряженных липосом. Очевидно, это было возможно благодаря встраиванию боковых цетильных радикалов поликатиона в гидрофобную часть липосомальной мембраны.

Таким образом, модификация поликатиона боковыми алкильными радикалами значительно повышает аффинность поликатиона к липидной мембране. Такие поликатионы сохраняют способность взаимодействовать с мембраной даже в избытке отрицательно заряженного полимерного конкурента.

3. Взаимодействие кватернизованных поли-4-винилпиридинов с отрицательно заряженными гидрофилизованными липосомами

В предыдущих разделах мы рассмотрели особенности взаимодействия синтетических гидрофобизованных поликатионов со смешанными везикулами, мембрана которых состояла только из молекул липидов - отрицательно заряженного и нейтрального. При этом мембрана таких везикул выступала в качестве модели клеточной поверхности. Чтобы учесть возможный вклад, привносимый гликокаликсом во взаимодействие поликатион-клетка, на поверхности липосом была сформирована гидрофильная "опушка" из молекул неионогенного ПАВ (Бридж 58), эфира ПОЭ степени полимеризации 20 и цетилового спирта. Мольная доля ПАВ в везикулах варьировалась от 0 до 30%. Взаимодействие везикул с П2 и П2,16 было исследовано методами лазерного микрозлектрофореза, фотонной корреляционной спектроскопии и флуоресценции.

Адсорбция П2 на поверхности смешанных отрицательно заряженных КЛ/ЯЛ липосом, не содержащих Бридж, приводила к нейтрализации их поверхностного заряда, что регистрировалось по уменьшению ЭФП липосом (кривая 1, рис.5). Этот процесс сопровождался

укрупнением частиц (кривая 1, рис.6). Частицы максимального размера, превышавшего исходный а десятки раз. образовывались при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом, то есть при ЭФП=0. Последующее увеличение концентрации поликатиона в растворе приводило к перезарядке липосомальной мембраны и стабилизации частиц комплекса поликатион-липосома - их размер приближался к размеру исходных липосом.

ЭФП, (мкм/с)/(В/см)"1

Рис.5.

Зависимость ЭФП частиц комплекса П2-КЛ/ЯЛ/Бридж липосомы от концентрации П2. Мольная доля Бридж в липосомах: 0 (1); 10 (2); 20 (3) и 30% (4).

Концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, 10~2 М; 20°С.

Рис.6.

Зависимость размера частиц комплекса П2-КЛ/ЯЛ/Бридж липосомы от концентрации П2. Мольная доля Бридж а липосомах: 0 (1); 10 (2); 20 (3) и 30% (4). Концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, 10-2М;20°С.

[П2]х104, М

Включение возрастающих количеств Бридж в мембрану КЛ/ЯЛ липосом сопровождалось понижением их ЭФП (начальные точки на кривых 2-4, рис.5). Одновременно, используя метод фотонной корреляционной спектроскопии, мы обнаружили, что появление гидрофильной "опушки" из ПОЭ цепей на поверхности липосом приводит к возрастанию их гидродинамического диаметра с 36 до 46 нм. Это позволяет оценить толщину примембранного гидрофильного ПОЭ слоя, который оказывается равен примерно 5 нм. Таким образом, понижение ЭФП липосом при встраивании в мембрану молекул Бридж связано с

[П2]х104, м

О, мкм

увеличением толщины ПОЭ слоя и, как следствие, смещением плоскости скольжения в поверхностном слое липосом вглубь раствора.

Добавление П2 к КЛ/ЯЛ/Бридж липосомам также вызывало нейтрализацию их поверхностного заряда (кривые 2-4, рис.5), что свидетельствовало об адсорбции поликатиона на покрытой гидрофильным слоем мембране.

Интересно, что появление на поверхности липосом гидрофильного слоя не сказывалось на способности адсорбированного П2 вызывать тушение флуоресценции встроенной в липосомальную мембрану метки (ср.кривые 1 и 2, рис.7). Это позволило использовать метод флуоресценции для исследования стабильности комплексов КЛ/ЯЛ/Бридж липосом с П2 в водно-солевых средах и в присутствии ПАА. Как и следовало ожидать, флуоресценция встроенной в липосомальную мембрану метки полностью восстанавливалась, то есть комплексы липосома-П2 полностью диссоциировали, при увеличении концентрации №0 (кривая 1, рис.8) или добавлении избыточных количеств ПАА

0.5 ■

1 2 3

[П2]х104, М

Рис.7.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ/Бридж липосом от концентрации П2 до (1,2) и после (3) добавления ПАА. Концентрация липосом 1 мг/мл; боратный буфер, 10"2 М; 20°С. [ПАА]/[П2]=3. Мольная доля Бридж в липосомах: 0 (1) и 30% (2,3).

2 4 6

[N301], М

Рис.8.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ/Бридж (20/50/30) липосом в комплексе с П2 (1) и П2.16 (2) от концентрации МаС1. (П2]=[П2,16]=1,5Х10-4 М; концентрация липосом 1 мг/мл: боратный буфер, 10"2 М; 20°С.

(кризая 3, рис.7). Эти результаты говорили о том, что природа адсорбции П2 на мембране КЛ/ЯЛ/Бридж липосом оставалась электростатической.

Однако формирование поверхностного гидрофильного слоя оказывало сильное влияние на агрегативную устойчивость комплексов липосом с П2. Увеличение доли Бридж в липосомальной мембране приводило к понижению размера агрегатов в системе (кривые 2-4, рис.6). Везикулы с мольной долей Бридж равной 30% практически не меняли своего размера даже при полной нейтрализации их поверхностного заряда адсорбированным П2 (ср.кривую 4, рис.6 и кривую 4, рис.5). По-видимому, на поверхности липосом указанного состава завершалось формирование достаточно плотного слоя ПОЭ, равномерно распределенного по всей липосомальной мембране. Это и обеспечивало стерическую стабилизацию липосом в комплексе с поликатионом.

В таком случае возникал естественный вопрос: не препятствует ли этот слой гидрофобному "заякориванию" П2,16 на поверхности КЛ/ЯЛ/Бридж липосом? Иными словами, способны ли боковые цетильные радикалы П2,16 проникать через слой, образованный цепями ПОЭ, и встраиваться в гидрофобную часть липосомальной мембраны?

Ответ на этот вопрос был получен с помощью метода флуоресценции. Добавление П2,16 к суспензии меченых КЛ/ЯЛ/Бридж липосом вызывало тушение флуоресценции метки (кривая 1, рис.Э), что отражало адсорбцию П2,16 на липосомальной мембране. Последующее

!/10 Рис.9.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции меченых КЛ/ЯЛ/Бридж (20/50/30) липосом от концентрации П2,16 до (1) и после (2) добавления ПАА, а также в присутствии комплекса ПАА-П2.16 (3,4). Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С. Боратный буфер, 10"2 М (1-3); боратный буфер, 10_2 М +■ NaCI, 1,5x10-1 М (4). [ПАА]/[П2,16]=3.

добавление NaCI к комплексу липосома-П2,16 сопровождалось лишь частичным возгоранием флуоресценции (кривая 2, рис.В), означавшим, что поликатион продолжал удерживаться на мембране липосом даже после диссоциации всех ионных связей, участвующих в образовании

комплекса. Очевидно, причиной этого могло быть только встраивание бокового цетильного радикала поликатиона в липосомальную мембрану.

Естественно было ожидать, что гидрофобное "заякоривание" П2,16 на поверхности КЛ/ЯЛ/Бридж липосом будет повышать устойчивость комплекса в присутствии конкурирующих за связывание П2,16 полианионов. Действительно, как это видно из данных рис.9 (кривая 2), добавление ПАА к комплексу КЛ/ЯЛ/Бридж липосом с П2,16 в трехкратном избытке по отношению к поликатиону сопровождалось лишь частичным повышением уровня флуоресценции. Это значит, что взятая в избытке ПАА не могла удалить П2,16 с поверхности липосом.

Более того, после добавления к меченым КЛ/ЯЛ/Бридж липосомам предварительно сформированного отрицательно заряженного ИПЭК ПАА/П2.16 состава 3/1 наблюдалось заметное понижение уровня флуоресценции в системе (кривая 3, рис.9). Этот эффект усиливался, если в растворе находился №С! в концентрации 1,5х10"1 М (кривая 4, рис.9). Приведенные результаты убедительно свидетельствовали о том, что модифицированный боковыми алкильными радикалами поликатион сохранял способность взаимодействовать с лилосомами, поверхность которых была покрыта достаточно плотным слоем гидрофильных цепочек ПОЭ, и при физиологических значениях ионной силы раствора.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Исследовано взаимодействие алкилированных производных поли-4-винилпиридина (ПВП) с липидными везикулами, сформированными из смеси отрицательно заряженного кардиолипина (КЛ) и нейтрального яичного лецитина (ЯЛ), а также с везикулами, поверхность которых была дополнительно модифицирована включением в липидный бислой неионогенного ПАВ (Бридж 58), эфира полиоксиэтилена (ПОЭ) и цетилового спирта.

2. Адсорбция полностью кватернизованного ПВП, содержащего этильные боковые радикалы, на поверхности КЛ/ЯЛ липосом определяется в основном электростатическим взаимодействием положительно заряженных звеньев поликатиона с отрицательно заряженными фуппами КЛ. Такой поликатион может быть практически полностью удален с липосомальной мембраны при увеличении ионной силы раствора или в результате добавления избытка линейного полианиона, образующего с поликатионом более прочный отрицательно

заряженный нестехиометричный интерполиэлектролитный комплекс (ИПЭК).

3. Гидрофобизация поликатиона за счет его неполной кватернизации этильными радикалами (на 30-50 мол.%) или модификации боковыми цетильными фрагментами (на 3 мол.%) обеспечивает дополнительную стабилизацию комплекса липосома-поликатион в водно-солезых растворах и в присутствии отрицательно заряженных макроионов за счет встраивания гидрофобных фрагментов поликатиона в гидрофобную часть липидного бислоя. Отрицательно заряженные ИПЭК, образованные несущим цетильные радикалы поликатионом (П2.16) и линейным полианионом, способны адсорбироваться на отрицательно заряженной липосомальной мембране без ее разрушения.

4. Взаимодействие полностью этилированного ПВП с КЛ/ЯЛ липосомами сопровождается нейтрализацией поверхностного заряда частиц и их агрегацией. Гидрофилизованные КЛ/ЯЛ/Бридж липосомы с мольной долей полиоксиэтиленовых "головок" равной 30% сохраняют свой размер даже при полной нейтрализации их поверхностного заряда адсорбированным поликатионом.

5. При адсорбции П2.16 на поверхности КЛ/ЯЛ/Бридж липосом его боковые цетильные заместители способны проникать сквозь слой ПОЭ цепочек и заглубляться в гидрофобную область липосомальной мембраны. Полученные комплексы устойчивы в присутствии значительных избытков конкурентных полиионов. Отрицательно заряженные ИПЭК, > образованные П2,16 и линейным полианионом, способны адсорбироваться на мембране КЛ/ЯЛ/Бридж липосом при физиологических значениях ионной силы раствора.

6. Результаты, полученные при исследовании модельной системы поликатион-липосома, имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических поликатионов и биологически активных веществ на их основе с клеточной мембраной. Проведенная в работе сравнительная оценка способности гидрофобизованных поликатионов взаимодействовать с поверхностью отрицательно заряженных липосом позволяет предложить эффективный способ повышения стабильности комплексов поликатион-биомембрана в водно-солевых средах и в условиях конкуренции со стороны отрицательно заряженных макроионов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. E.G.Yaroslavova, V.Ye.Koul'kov, M.O.Ignatiev. On migration of polyions bound to the surface of oppositely charged liposomes. International symposium on micelles, microemulsions and monolayers: Quarter century progress and new horizons, Gainesville (USA) 1995; Abstracts, p.55.

2. A.A.Yaroslavov, S.A.Sukhishvili, O.L.Obolsky, E.G.Yaroslavova, A.V.Kabanov, V.A.Kabanov. DNA affinity to biological membrane is enhanced due to complexation with hydrophobized polycation, FEBS Lett. 384 (1996) 177-180.

3. E.G.Yaroslavova. Liposomes modified by poly(oxyethylene)-containing surfactant: interaction with liposomes, 212 ACS National meeting; Symposium "Colloidal particles: colloid-polymer interaction", Orlando (USA) 1996; Abstracts, No. 113.

4. E.G.Yaroslavova. Interaction of a polycation with oppositely charged liposomes stabilized by surfactant molecules carrying oligoethyleneglycole headgroups, 10th Conference of the European Colloid and Interface Society, Abo (Finland) 1996, Abstracts, p.118.

5. А.А.Ярославов, О.Е.Кученкова, Е.Г.Ярославова, В.А.Кабанов. О кардинальном различии во взаимодействии отрицательно заряженных липосом с полилизином и поли-М-этил-4-винилпиридиний бромидом, Доклады Акад.Наук 354 (1997) 350-352.

6. E.G.Yaroslavova, M.O.Ignatiev, V.Ye.Koulkov, A.A.Yaroslavov, V.A.Kasaikin. Hydrophobized polycations on the surface of negatively charged liposomes, 9th International conference on surface and colloid science, Sofia (Bulgaria) 1997, Abstracts, p.322-323.

7. A.A.Yaroslavov, V.Ye.Koulkov, E.G.Yaroslavova, O.Ye.Kuchenkova. Polycomplexes in contact with biomembranes, 213 ACS National meeting; Symposium "Polymer-surfactant interactions", San Francisco (USA) 1997; Abstracts, No.055.

8. E.G.Yaroslavova, A.A.Yaroslavov, V.A.Kabanov, F.M.Menger. Negatively charged vesicles coated by poly(oxyethylene) layer: interaction with polycations. Polymer Preprints 38/2 (1997) 640-641.

9. E.G.Yaroslavova, V.Ye.Koulkov, A.A.Yaroslavov, V.A.Kabanov, F.M.Menger. Lipid vesicles coated by ply(oxyethylene) layer, International Workshop Bioencapsulation VI, Barcelona (Spain) 1997, Abstracts, P12.

10. A.A.Yaroslavov, O.Ye.Kuchenkova, E.G.Yarcdavova. Polycomplex-liposome interactions. International Workshop Bioencapsulation VI, Barcelona (Spain) 1997, Abstracts, T4.5.

11. A.A.Yaroslavov, V.Ye.Koulkov, E.G.Yaroslavova, M.O.Ignatiev, V.A.Kabanov, F.M.Menger. Competitive interactions in negatively charged liposomes - polycation - polyanion ternary systems, Langmuir (in press).