Адсорбция полилизина и интерполиэлектролитных комплексов с его участием на бислойных липидных мембранах: состав и строение межфазных комплексов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

- 8 ИЮН 1338

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ и ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 541(183.12+49+64):536.7

КУЧЕНКОВА Ольга Евгеньевна

Адсорбция полилизина и иитерполиэлектролнтных комплексов с его частием на бнслойных липидных мембранах: состав и строение межфазных

комплексов

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1998

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединен» Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: академик, доктор химических наук,

профессор Кабанов В.А.

доктор химических наук Ярославов А. А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Зайцев С.Ю.

кандидат химических наук Курочкин И.Н.

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Защита состоится "10" июня 1998 года в 1500 часов на заседая; диссертационного совета Д 053.05.43 по химическим наукам п Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторш корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химическс факультета МГУ им. М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан — 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Миронова А.^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтетические полиэлектролиты активно используются в различных областях медицины и биологии. Это делает необходимым исследовать их поведение в биологическом окружении и, в первую очередь, механизмы их взаимодействия с клетками. При рассмотрении физико-химических аспектов такого взаимодействия наряду с клетками часто используются модельные системы, среди которых широкое распространение получили бислойные липидные везикулы (липосомы). Известно, что клетки несут суммарный отрицательный поверхностный заряд. Поэтому наибольший интерес вызывает исследование взаимодействия отрицательно заряженных липосом с поликатионами.

Такой подход позволил исследовать состав комплексов, образованных адсорбцией поликатионов на поверхности липосом, структурные перестройки в липосомальной мембране, конформационные переходы в адсорбированном поликатионе и его влияние на проницаемость мембраны, а также исследовать агрегацию и слияние липосом. Полученные результаты представляют большой интерес для прогнозирования возможных последствий контакта полиэлектролитов с клеточной поверхностью.

В то же время эти результаты стимулировали появление новых вопросов, связанных со строением и стабильностью комплексов поликатион-липидная мембрана.

1. Оказалось, что адсорбция синтетических поликатионов может индуцировать в смешанных жидких липосомах переход отрицательно заряженных липидных молекул с внутренней стороны липосомальной мембраны на внешнюю (так называемый флип-флоп). В липосомах с большим содержанием отрицательно заряженного липида это приводит к существенному обеднению внутренней части бислоя и разрушению липосомальной мембраны. Аналогичные структурные перестройки могут происходить и в клеточной мембране после ее контакта с поликатионом, что, в конечном итоге, может привести к разрыву мембраны и гибели клетки. Это заставляет обратиться к поиску поликатионов способных эффективно адсорбироваться на клеточной мембране, но при этом не вызывать ее разрушения. Перспективными в этом отношении могут быть положительно заряженные полипептиды. Эти поликатионы биосовместимы, биодеградируемы, нетоксичны и несут легко поддающиеся модификации функциональные группы.

2. В большинстве работ исследовано взаимодействие поликатионов с так называемыми малыми липосомами, диаметр которых составляет 50-100 нм. Небольшие размеры этих липосом обеспечивают значительную жесткость их формы. В отличие от этого

мембрана нативных клеток, размер которых лежит в микронной области, обладает высокой эластичностью, которая позволяет ей выдерживать без разрушения значительные деформации. Это свойство клеточной мембраны может играть важную роль в ее взаимодействии с макромолекулярными объектами, к числу которых относятся и синтетические полиэлектролиты. Моделировать эту особенность строения клеточной мембраны можно, переходя от малых липосом к большим с диаметром 300 нм и выше.

3. Как правило, в опубликованных работах анализируется поведение систем, состоящих всего из двух компонентов - липосом и поликатиона. Между тем, любая биологическая жидкость содержит помимо клеток большое количество отрицательно заряженных полиионов, которые сами могут образовывать прочные комплексы с поликатионом и тем самым препятствовать его взаимодействию с клетками. Такие конкурентные реакции можно исследовать, используя модельную систему липосомы - поликатион - полианион.

Цель работы состояла в изучении строения и свойств комплексов, образованных синтетическим катионным полипептидом, поли-Ь-лизином (ПЛ), и малыми и большими отрицательно заряженными липосомами, а также конкурентных реакций в тройной системе липосома - ПЛ - полианион.

Научная новнзна. В работе показано, что адсорбция ПЛ на поверхности малых жидких липосом (диаметр около 50 нм), состоящих из смеси отрицательно заряженного дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ) и нейтрального фосфатидилхолина (яичного лецитина, ЯЛ), с молярной долей КЛ менее 0,5 определяется электростатическим взаимодействием положительно заряженных протонированных звеньев поликатиона с отрицательно заряженными группами КЛ. При этом в образовании ионных связей с ПЛ принимают участие только молекулы КЛ, находящиеся во внешнем монослое мембраны. КЛ молекулы внутреннего монослоя мембраны участия в образовании комплекса с ПЛ не принимают. Целостность липосомальной мембраны в контакте с ПЛ сохраняется. В отличие от этого, адсорбция ПЛ на поверхности малых КЛ/ЯЛ липосом с молярной долей КЛ более 0,5 и больших КЛ/ЯЛ липосом (диаметр около 350 нм) сопровождается встраиванием молекул ПЛ в липосомальную мембрану и появлением дефектов в ней.

Адсорбция ПЛ на жидкой липосомальной мембране индуцирует латеральную сегрегация липидов и формированием двух микрофаз, одна из которых обогащена молекулами КЛ, связанными в комплекс с ПЛ, другая - молекулами ЯЛ. Этот процесс развивается только во внешнем монослое мембраны.

Устойчивость комплексов ПЛ с жидкими липосомами зависит от

состава и размера последних. Комплексы ПЛ с малыми липосомамн (молярная доля КЛ менее 0,5) полностью диссоциируют при повышении ионной силы раствора. ПЛ полностью удаляется с поверхности малых липосом добавлением избытка линейного полианиона, например, полиакрилатаниона (ПА"). Напротив, комплексы ПЛ с малыми липосомами (молярная доля КЛ более 0,5) и большими липосомами устойчивы в водно-солевых средах и в присутствии избыточных количеств конкурентного полианиона, например, полиакрилат-аниона (ПА").

Большие жидкие КЛ/ЯЛ липосомы способны без разрушения взаимодействовать с отрицательно заряженными

интерполиэлектролитными комплексами ПЛ-ПА".

Практическая значимость. Полученные результаты важны для прогнозирования поведения синтетических полиэлектролитов и биологически активных веществ на их основе в биологическом окружении, и в частности, для понимания механизмов взаимодействия полимерных соединений с клетками.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 6 Международной конференции "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах" (Россия, Иваново, 1995), 213 конференции Американского химического общества (США, Сан-Франциско, 1997), Международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (Россия, Москва, 1997) и 9 Международной конференции по коллоидной химиии и поверхностним явлениям (Болгария, София, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа

изложена на _ страницах машинописного текста и состоит из

введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 109 ссылок. Работа содержит_ рисунка.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цель и задачи.

В литературном обзоре проанализированы приведенные в литературе данные по получению и физико-химическим свойствам липосом, а также подробно обсуждены эффекты, вызываемые в липосомальной мембране адсорбированными синтетическими поликатионами и катионными полипептидами.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе использовали две фракции поли-Ь-лизина (ПЛ) со средними степенями полимеризации, Р, равными 50 и 430; поли-Ь-лизин, ковалентно модифицированный флуоресцеин-изо-тиоцианатом (ПЛ-ФИТЦ), с Р=50; полиакриловую кислоту (ПАК) с Р= 1250; и полиакриловую кислоту, ковалентно модифицированную флуоресцеин-тиокарбомоил-гексаметилендиамином (ПАК-Ф), с Р= 1250. Концентрация сополимеров всюду приведена в моль/л.

Для приготовления липосом использовали КЛ, ЯЛ и ДПФХ. Малые жидкие К Л/ЯЛ и твердые КЛ/ДПФХ липосомы с диаметром 40-60 нм готовили методом озвучивания. Большие жидкие и твердые КЛ/ЯЛ липосомы с диаметром 300-350 нм готовили методом обращения фаз. Молярная доля отрицательно заряженных полярных "головок" КЛ в липосомах задавалась соотношением V =2[КЛ]/(2[КЛ]+[ЯЛ])= 2[КЛ]/(2[КЛ]+[ДПФХ]) (каждая молекула КЛ содержит две орицательно заряженные группы). Липосомы со встроенным в бислой флуоресцентно меченым липидом получали добавлением к КЛ/ЯЛ смеси 0,5 вес.% Ь-а-фосфатидилхолин,Р-(пирен-1-ил)деканоил-у-пальмитоила (ФХ-Пирен).

Электрофоретическую подвижность (ЭФП) липосом определяли методом лазерного микроэлектрофореза, размер липосом методом квазиупругого рассеяния лазерного света. Фазовые переходы в липосомах исследовали методом микрокалориметрии. В работе также использовались методы флуоресцентной спектроскопии, кондуктометрии и потенциометрии. Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц. Эксперименты проводили в Ю-2 М фосфатном буферном растворе с рН 7.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Адсорбция полнлизипа на поверхности малых отрицательно заряженных липосом.

Взаимодействие ПЛ с отрицательно заряженными жидкими КЛ/ЯЛ (20/80) липосомами было исследовано при физиологическом рН=7, при котором доля протонированных аминогрупп ПЛ близка к максимальной. Для регистрации взаимодействия был использован метод микроэлектрофореза, поскольку адсорбция ПЛ на липосомальной мембране сопровождается нейтрализацией ее заряда, а, следовательно, изменением ЭФП липосом. Добавление возрастающих количеств ПЛ к суспензии липосом приводит вначале к уменьшению ЭФП до нуля, а затем к незначительной перезарядке их поверхности (кривая 1, рис.1). Адсорбция ПЛ на липосомальной

мембране сопровождается укрупнением частиц (кривая 1, рис.2). Увеличение их размера продолжается вплоть до концентрации ПЛ, соответствующей полной нейтрализации поверхностного заряда липосом. Дальнейшее добавление ПЛ не оказывает влияния на размер частиц в системе. По-видимому, незначительный положительный заряд, приобретаемый поверхностью липосом в избытке ПЛ, не может обеспечить стабилизацию комплекса ПЛ-липосома. Добавленный поликатион полностью связывается с липосомами вплоть до концентрации 1,8x10 4 М. При больших концентрациях избыточный ПЛ накапливается в растворе.

ЭФП, (мкм/с)/(В/см)

[ПЛ]х10\ М

Рис.1.

Зависимость ЭФП

частиц комплексов ПЛ с малыми КЛ/ЯЛ (20/80)

(1) и КЛ/ДПФХ (20/80)

(2) липосомами от концентрации ПЛ. Концентрация липосом 1 мг/мл, 20°С.

Рис.2.

Зависимость размера частиц комплексов ПЛ с малыми КЛ/ЯЛ (20/80)

(1) и КЛ/ДПФХ (20/80)

(2) липосомами от концентрации ПЛ. Концентрация липосом 1 мг/мл, 20°С.

[ПЛ]хЮ , М

Для контроля за целостностью липосомальной мембраны после адсорбции ПЛ были использованы КЛ/ЯЛ (20/80) липосомы.

заполненные 1М раствором 1ЧаС1. Как следует из данных рис.3, проводимость раствора таких липосом не меняется в течение по крайней мерс I часа (кривая 1). Добавление ПЛ к липосомам также не сказывается на проводимости раствора (кривая 2). Это свидетельствует о том, что целостность липосомальной мембраны в комплексе с ПЛ сохраняется.

Для исследования природы адсорбции ПЛ на поверхности липосом и стабильности образующихся комплексов в водно-солевых средах были использованы КЛ/ЯЛ липосомы, в мембрану которых был встроен флуоресцентно меченый липид, ФХ-Пирен. Известно, что поликатионы являются тушителями флуоресценции. Поэтому за образованием и разрушением комплексов ПЛ с мечеными лнпосомами следили по изменению относительной интенсивности флуоресценции встроенной в мембрану метки.

относит, электропроводность, % 100,

80

60

40

20

20 30 40 I, мин

50

.1, 2

60

Рис.3.

Изменение относительной электропроводности суспензии малых КЛ/ЯЛ липосом до (1,3) и после (2,4) добавления ПЛ. V: 0,2 (1,2) и 1 (3,4). Концентрация липосом 1 мг/мл, 20°С.

з

о

Адсорбция ПЛ на поверхности липосом сопровождается тушением флуоресценции метки (кривая 1, рис.4). Однако последующее добавление ЫаС1 к сформированному комплексу ПЛ-липосома приводит к восстановлению флуоресценции до исходного уровня (кривая Г, рис.4), что свидетельствует о полной диссоциации комплекса. Процесс развивается в достаточно узком интервале концентраций ИаС1: от 0,2 до 0,4 М, что указывает на его кооперативность. Диссоциация комплекса ПЛ-липосома сопровождается уменьшением размера частиц в суспензии до размера исходных липосом. Последний результат подтверждает сделанный выше вывод о сохранении целостности малых липосом после включения их в комплекс с ПЛ. Таким образом, адсорбция ПЛ на поверхности малых КЛ/ЯЛ липосом определяется в основном ионными контактами протонированных аминогрупп ПЛ с отрицательно заряженными фосфатными группами КЛ.

Состав комплекса ПЛ-липосома был определен следующим образом. Как упоминалось выше, ПЛ связывается с липосомами количественно. Поэтому в точке ЭФП=0 привносимый ПЛ заряд численно равен поверхностному заряду липосом. Иными словами, в этой точке концентрация звеньев поликатиона, образовавших ионные контакты с поверхностью липосомы, [ПЛ]о, равна концентрации отрицательно заряженных групп молекул КЛ, сосредоточенных во внешнем слое липосомальной мембраны 2[КЛ]ЛНеш. Доля заряженных групп КЛ или, что то же самое, доля молекул КЛ, образовавших комплекс с поликатионом, была определена из соотношения у=[ПЛ]/2[КЛ]=2[КЛ],нсш /2[КЛ], где [КЛ] - общая мольная

Рис.4.

Зависимость относи-

тельной интенсивности флуоресценции малых меченых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом от концентра-ции ПЛ до (1) и после добавления ПАК (2); [ПАК]/[ПЛ]=3/1. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции малых меченых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом в комплексе с ПЛ от концентрации ИаС1 (Г); [ПЛ]=2х10-4. Концентрация липосом I мг/мл, 20°С.

по данным рис.1 дает

Из этого следует, что в жидких КЛ/ЯЛ липосомад отрицательно заряженные молекулы КЛ практически равномерно распределены между обеими сторонами липосомальной мембраны и только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне мембраны, участвуют в образовании межфазного комплекса с адсорбированным ПЛ.

Влияние ПЛ на ЭФП и размер малых твердых КЛ/ДПФХ липосом с тем же содержанием КЛ (у=0,2) представлено кривыми 2 (рис.1) н 2 (рис.2). Видно, что эти кривые практически полностью накладываются соответственно на кривые 1 (рис.1) и 1 (рис.2), описывающие изменение ЭФП и размера малых жидких КЛ/ЯЛ (20/80) липосом в присутствии ПЛ.

1/1.

1,0

0,5

0,0

1

1 --1 ' 1

0 12 0 [ПЛ]х10\ М

0,2

0,4 0,6 0,1 [N301], М

Концентрация КЛ в растворе. Расчет значение у= 1,5х 10"4М/2,9х Ю"4М=0,52.

В твердых КЛ/ДПФХ липосомах, как и в жидких, состоящих из КЛ и ЯЛ, молекулы КЛ равномерно распределены между обоими монослоями мембраны. Однако в мембране твердой липосомы липидные молекулы не могут перемещаться в трансмембранном направлении. Поэтому с поликатионом заведомо связываются только молекулы КЛ, находящиеся во внешнем слое мембраны. Следовательно, отмеченное выше совпадение пар кривых 1 и 2 на рис.1 и кривых 1 и 2 на рис.2 подтверждает вывод о том, что и в жидких КЛ/ЯЛ липосомах в образовании ионных контактов со звеньями адсорбированного ПЛ участвуют только молекулы КЛ, находящиеся во внешнем слое мембраны.

Известно, что адсорбция поликатионов на смешанных жидких липидных мембранах может сопровождаться латеральной сегрегацией липидов, то есть образованием двух микрофаз, одна из которых обогащена электронейтральным липидом, а другая - отрицательно заряженным, связанным в ионный комплекс с адсорбированным полимером. За процессом латеральной сегрегации липидов в смешанной жидкой КЛ/ДПФХ (20/80) мембране после добавления ПЛ следили с помощью метода калориметрии (рис.5). Один из компонентов мембраны, ДПФХ, характеризуется узким пиком фазовог® перехода при ТП=41,5°С (кривая I). Второй компонент, КЛ, представляет собой смесь липидов с набором фазовых переходов в области температур ниже 10°С (на рисунке не показаны). Фазовый переход в мембране КЛ/ДПФХ (20/80) липосом описывается кривой 2 с максимумом при ТП=36°С.

К суспензии этих липосом предварительно прогретой до 55°С добавляли различные концентрации ПЛ. В этих условиях фазовое состояние липосомальной мембраны было жидким. Полученные смеси охлаждали до 20°С и записывали калориметрические кривые. Как следует из данных рис.5, добавление возрастающих концентраций ПЛ приводит к постепенному смещению пика плавления в область более высоких температур, при этом сам пик становится более узким (кривые 3-6). Это означает, что адсорбция ПЛ приводит к перераспределению липидных молекул в мембране: в ней формируются области с повышенным содержанием ДПФХ. Такие области могут возникнуть лишь вследствие выделения второго компонента, КЛ, в отдельные кластеры при его связывании с ПЛ. Температура плавления КЛ-ПЛ комплекса находится в низкотемпературной области за пределами исследуемого интервала и потому не представлена на рис.5. Отмеченные выше изменения в положении и форме пика на кривой плавления КЛ/ДПФХ липосом прекращаются после того, как концентрация добавленного ПЛ

Рис.5.

Калориметрические кривые плавления малых ДПФХ липосом (1), малых КЛ/ДПФХ (20/80) липосом (2) и комплексов ПЛ-КЛ/ДПФХ липосома (3-6) и КЛ/ДПФХ липосом в присутствии комплекса ПАК/ПЛ (7). Концентрация липосом: 0,5 (1) и 1 мг/мл (2-7). [ПЛ]=0,5х10-4 (3), 1x10-4 (4), 1,5x10-4(5,7) и 2x10-4 М(6).

т.'с

становится равной 1,5x10*4 М. Это совпадает с концентрацией ПЛ необходимой для нейтрализации всех молекул КЛ, расположенных во внешнем монослое мембраны (ср. кривая 5, рис.5 и кривая 2, рис.1). Полученные результаты означают, что адсорбция ПЛ индуцирует латеральную сегрегацию липидов в мембране жидких смешанных отрицательно заряженных липосом и этот процесс развивается только во внешнем монослое мембраны.

Ранее было показано, что такие же липосомы в присутствии другого поликатиона, поли-М-этнл-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП), ведут себя несколько иначе. Адсорбция ПЭВП на поверхности липосом сопровождается переходом отрицательно заряженных лнпидных молекул с внутренней стороны мембраны на внешнюю (индуцированный флип-флоп) и латеральной сегрегацией, в которую вовлекаются все липидные молекулы, изначально распределенные по обеим сторонам липопосомальной мембраны.

Таким образом, адсорбция обоих поликатионов, ПЛ и ПЭВП, на поверхности жидких смешанных липосом вызывает латеральную сегрегацию липидов. Однако в случае ПЛ в этом принимают участие липиды только внешнего монослоя мембраны, а в случае ПЭВП - все липиды обоих монослоев.

Что касается механизма ускорения трансмембранного перехода отрицательно заряженных липидных молекул при адсорбции ПЭВП и причин, по которым мембрана смешанных жидких липосом по-разному реагирует на ПЛ и ПЭВП, эти вопросы пока остаются

открытыми. Возможно, способность поликатиона ускорять флип-флоп определяется конформацией, которую принимает адсорбированная полимерная цепь. Если это так, то отсутствие флип-флопа в случае ПЛ может быть связано с переходом адсорбированных молекул ПЛ в конформацию р-структуры и формированием жестких упорядоченных структур за счет образования межмолекулярных водородных связей. Такой конформационный переход в молекулах ПЛ при их адсорбции на отрицательно заряженной бислойной мембране был обнаружен экспериментально и описан в литературе.

ЭФП

г о

-5-

(мкм/с)/(В/см)

10 15

[ПЛ]хЮ\ М

Рис.6.

Зависимость ЭФП частиц комплексов ПЛ с малыми КЛ/ЯЛ липосомами от

концентрации ПЛ. V: 0,2 (1); 0,4 (2); 0,6 (3) и I (4). Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С.

Рис.7.

Зависимость концентрации ПЛ необходимой для полной нейтрализации заряда малых КЛ/ЯЛ липосом от доли КЛ в мембране.

Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С.

Увеличение содержания КЛ в КЛ/ЯЛ липосомах приводило к прямо пропорциональному возрастанию количества ПЛ

необходимого для нейтрализации поверхностного заряда липосомальной мембраны (рис.6 и 7). Это указывало на то, что во всех случаях в образовании ионных связен с адсорбированным ПЛ принимали участие только молекулы КЛ, расположенные на внешней стороне мембраны.

Вместе с тем увеличение доли КЛ в мембране сопровождалось заметным возрастанием ее проницаемости. Выше упоминалось о том, что КЛ/ЯЛ липосомы с v=0,2 сохраняли свою целостность как до так и после адсорбции ПЛ: низкомолекулярный электролит, NaCl, которым был заполнен внутренний водный объем липосом, в обоих случаях не вытекал во внешний раствор (кривые 1 и 2, рнс.З). В отличие от них мембрана липосом с v= 1 была проницаема для соли даже в отсутствии поликатиона (кривая 3, рис.3). Адсорбция ПЛ на мембране резко увеличивала скорость вытекания соли (кривая 4, рис.3).

Одновременно комплексы ПЛ с липосомами, в которых доля КЛ v>0,5, приобретали дополнительную устойчивость в водно-солевых средах. Такие комплексы сохранялись даже при [NaCl]=lM, которая была заведомо достаточна для диссоциации всех ионных связей ПЛ-КЛ.

По-видимому, причина описанных выше изменений свойств КЛ/ЯЛ липосом с ростом содержания КЛ заключается в следующем. Известно, что в молекуле ЯЛ площадь, занимаемая полярной "головкой", Sn, больше площади сечения углеводородных цепей, Sy, а в молекуле КЛ наоборот: Sn < Sy. Подобная геометрия липндных молекул позволяет им, взаимно дополняя друг друга, образовывать стабильные смешанные бислои с достаточно плотной упаковкой липидных молекул. Увеличение доли КЛ в КЛ/ЯЛ бислое должно приводить к нарушению этой упаковки, то есть появлению дефектов в бислое, а следовательно, увеличению его проницаемости. Кроме того, по местам дефектов может происходить встраивание в мембрану молекул ПЛ, делающее его адсорбцию на поверхности липосом необратимой.

2. Адсорбция полилизина на поверхности больших отрицательно заряженных липосом.

Все сказанное выше касается поведения молекул ПЛ на поверхности малых липосом, диаметр которых составяет около 50 нм. Небольшие размеры этих липосом, будь то жидких или твердых, обеспечивают значительную жесткость их формы. В отличие от этого мембрана нативных клеток, размер которых лежит в микронной области, обладает высокой эластичностью, которая позволяет ей выдерживать без разрушения значительные деформации. Это свойство клеточной мембраны может играть важную роль в ее взаимодействии с макромолекулярными объектами, к числу которых относятся и

синтетические полиэлектролиты. Для моделирования этой особенности строения клеточной мембраны были приготовлены большие моноламеллярные КЛ/ЯЛ (20/80) липосомы. Мембрана этих липосом содержала небольшое количество ФИТЦ-меченого липида.

На первый взгляд взаимодействие ПЛ с большими КЛ/ЯЛ (20/80) липосомами подчинялось тем же закономерностям, что и его взаимодействие с малыми КЛ/ЯЛ липосомами того же состава. ПЛ практически полностью адсорбировался на поверхности больших липосом. Адсорбция ПЛ сопровождалась нейтрализацией поверхностного заряда липосом (рис.8), тушением встроенной в бислой метки (рис.9) и образованием крупных агрегатов (кривая 1,

[ПЛ]х104, м

Рис.8.

Зависимость ЭФП частиц комплексов ПЛ с большими КЛ/ЯЛ (20/80)

липосомами от

концентрации ПЛ. Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С.

1/1,

1.0 0,8 0,6 0,4 0,20,0

ОТНО-

интен-флуорес-больших КЛ/ЯЛ

[ПЛ]х10 , М

Рис.9.

Зависимость сителыюй сивности ценции меченых (20/80) липосом от концентрации ПЛ до (1) и после добавления ПАК (2), а также в присутствии комплекса ПЛ-ПАК (3). Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С; [ПАК]/[ПЛ]=3/1.

рис.10). При этом в образовании ионных связей с ПЛ принимали участие только КЛ молекулы внешнего слоя мембраны.

Однако поведение комплексов ПЛ с малыми и большими липосомами в солевых растворах было совершенно различным. Напомним, что в случае малых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом их комплекс с ПЛ полностью диссоциировал при концентрации №С1 равной 0,4 М. На это указывало количественное восстановление флуоресценции встроенной в липидный бислой метки (кривая Г, рис.4). В случае больших меченых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом флуоресценция, первоначально затушенная в комплексе ПЛ-липосома, не

о, нм

3000. 2500. 2000150010005000-

Рнс.10.

Зависимость размера частиц комплекса ПЛ с большими КЛ/ЯЛ (20/80) липосомами от концентрации ПЛ. Концентрация липосом 1 мг/мл; 20°С.

[ПЛ]х10\ М

"'о 1,0,

0,80,6-,-.---.-,

0,40,20,0-1-,-----------,-----

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Рис.11.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции больших меченых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом в комплексе с ПЛ от концентрации ИаС1. Концентрация липосом 1 мг/мл; [ПЛ]=2,5х10-4 М; 20°С.

[ЫаС1], М

восстанавливалась при добавлении №С1 вплоть до концентрации 1М (рис.11). Это означало, что ПЛ не десорбировался с поверхности больших липосом даже при тех концентрациях соли, которая была достаточна для полной диссоциации всех ионных связей между звеньями ПЛ и входящими в состав мембраны молекулами КЛ.

Данные флуоресцентных исследований хорошо коррелировали с результатами измерений размеров частиц комплексов ПЛ с большими липосомами в присутствии ИаС1. Увеличение концентрации соли в растворе приводило лишь к некоторому восстановлению их размера.

Полученные результаты указывали на то, что природа адсорбции ПЛ на поверхности больших отрицательно заряженных КЛ/ЯЛ липосом была не только электростатической. В литературе отмечается, что комплекс ПЛ с большими липосомами, сформированными из отрицательно заряженных липидов, стабилизирован не только электростатическим, но и гидрофобным взаимодействием боковых заместителей адсорбированного полипептида с ацильными группами липидных молекул. Естественно было ожидать, что встраивание ПЛ в мембрану больших липосом будет сопровождаться появлением в ней дефектов, что можно зарегистрировать по увеличению проницаемости мембраны. Для проверки этого предположения были использованы большие липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен 1М раствором №С1.

Оказалось, что связывание ПЛ с большими липосомами сопровождалось значительным возрастанием проводимости раствора (на 95 % за время смешения компонентов) , то есть увеличением проницаемости мембраны, по-видимому, благодаря встраиванию отдельных фрагментов адсорбированных макромолекул в липидный бислой.

Таким образом, размер жидких отрицательно заряженных липосом решающим образом влияет на их взаимодействие с линейным поликатионом. Увеличение диаметра липосом с 40-60 до 300-350 нм делает адсорбцию поликатиона на них необратимой: комплекс поликатиона с большими липосомами сохраняет устойчивость в концентрированных растворах солей. По-видимому, это связано с тем, что увеличение размера липосом повышает гибкость мембраны: в нее могут встраиваться достаточно протяженные фрагменты адсорбированных макромолекул. Такой комплекс оказывается стабилизированным не только электростатическими, но и гидрофобными взаимодействиями.

3. Конкурентные реакции в тронной системе лнпосома-поликатион-полианнон.

В качестве отрицательно заряженного полимерного конкурента способного взаимодействовать с ПЛ и тем самым препятствовать его

адсорбции на отрицательно заряженнной мембране были использованы полиакрилат-анионы. Как следует из данных рис. 12а, ЭФП ПАК уменьшается при титровании его поликатионом и нулевое значение ЭФП достигается при соотношениии [ПЛ]/[ПАК]= I. Это свидетельствует о практически количественном связывании обоих компонентов в интерполиэлектролитный комплекс (ИПЭК). Нулевому размеру соответствует и максимум размера частиц комплекса (рис.126).

ЭФП, (мкм/с)/(В/см) 1,0-

0,5 0,0 -0,5 •1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -3,0

0,5 1,0 1,5 2.0 2,5 3,0

[ПЛ1Х101, М

3,5

4.0

Рис. 12а.

Зависимость ЭФП частиц интерпо-лиэлектролитного комплекса ПЛ-ПАК от концентрации ПЛ. [ПАК]=1х10-3 М. Концентрация липосом 1 мг/мл; фосфатный буфер, 1(И М, рН 7 ; 20°С.

О, нм 4000-,

3000-

2000

1000

0,0

0,5 1,0

(ПЛ1х10\ М

1.5

2,0

Рис. 126.

Зависимость размера частиц интерполиэлектро-литного комплекса ПЛ-ПАК от концентрации ПЛ. [ПАК]=1х10° М; фосфатный буфер, 10"2 М, рН 7 ; 20°С.

За удалением ПЛ с поверхности липосом следили по возгоранию флуореценции встроенной в мембрану метки, ФХ-Пирен. Добавление ПАК к комплексам ПЛ с мечеными малыми К Л/ЯЛ (20/80)

липосомами в соотношении [ПАК]/[ПЛ]=3 приводило к восстановлению флуоресценции лнпосом до исходного уровня (кривая 2, рис.4). Одновременно размер частиц комплекса уменьшался до размера исходных липосом. Это означало, что ПАК количественно удалял ПЛ с поверхности малых липосом, по-видимому, образуя с ним водорастворимый ИПЭК.

В то же время добавление такого же избытка ПАК к комплексу ПЛ с большими мечеными КЛ/ЯЛ (20/80) липосомами практически не влияло на флуоресценцию раствора (кривая 2, рис.9). Размер частиц комплекса ПЛ-липосома при этом также практически не менялся. Иными словами, избыток ПАК не мог вытеснить ПЛ из комплекса с большими липосомами. По-видимому, и в этих случаях полиакрилат-анион образовывал ионный комплекс с ПЛ. Однако включенный в этот комплекс полипептид сохранял контакт с липосомальной мембраной, очевидно, благодаря встраиванию своих боковых фрагментов и/или участков основной цепи в гидрофобную часть липидного бислоя.

Иными словами, даже взятый в избытке полианион не может разрушить уже сформированный комплекс ПЛ с большими отрицательно заряженными липосомами. Между тем, учитывая высокую концентрацию и подвижность отрицательно заряженных макроионов-конкурентов в биологической жидкости, следует ожидать, что добавленный в нее поликатион в первую очередь будет взаимодействовать именно с этими компонентами. При этом размер образующихся частиц комплекса ПЛ-макроанион может быть весьма значительным и даже сопоставим с клеточным как это, например, следует из данных рис.12 (кривая 2).

Чтобы проверить, сохранит ли ПЛ способность взаимодействовать с мембраной больших липосом, если он включен в отрицательно заряженный комплекс с полианионом, был приготовлен комплекс ПАК/ПЛ состава 2/1 и добавлен к суспензии меченых больших КЛ/ЯЛ (20/80) липосом. Это привело к понижению интенсивности флуоресценции раствора (кривая 3, рис.9). Наблюдаемое в эксперименте тушение флуоресценции могло быть результатом адсорбции недиссоциированного поликомплекса или же только одного из его компонентов - ПЛ. Чтобы различить эти случаи, мы приготовили комплекс флуоресцентно меченной ПАК с ПЛ, в котором флуоресценция метки была частично затушена. Добавление этого комплеса к большим липосомам не вызвало возгорания флуоресценции. Это доказывало, что комплекс ПАК/ПЛ при взаимодействии с липосомами не диссоциирует на компоненты, а адсорбируется на липосомальной мембране как целое.

Этот вывод был подтвержден данными калориметрии. Добавление комплекса ПАК/ПЛ (2/1) к большим КЛ/ДПФХ (20/80) липосомам никак не сказывалось на положении и форме кривой

плавления липидного бислоя (ср. кривые 1 и 7, рис.5), то есть не вызывало латеральной сегрегации липидов в мембране. Это значило, что ПЛ не образовывал ионных контактов с молекулами КЛ, а адсорбировался на мембране в составе недиссоциированного поликомплекса.

По-видимому, отрицательно заряженный поликомплекс закрепляется на мембране больших липосом за счет встраивания гидрофобных частей, образованных в результате взаимной нейтрализации его компонентов - ПАК и ПЛ, в гидрофобную часть липидного бислоя. С этим согласуется тот факт, что проницаемость мембраны после добавления поликомплекса резко возрастает: соль, которой наполнен внутренний объем липосом, полностью вытекает из них за 30 секунд. Очень важно, что липосомы при этом сохраняют свою целостность: их размер после добавления поликомплекса не меняется.

Таким образом, размер жидких отрицательно заряженных липосом решающим образом влияет на их взаимодействие с линейным поликатионом. Увеличение диаметра липосом с 40-60 до 300-350 нм делает адсорбцию поликатиона на них необратимой: комплекс поликатиона с большими липосомами сохраняет устойчивость в концентрированных растворах солей и в присутствии полианионов-конкурентов. Поликатион сохраняет способность взаимодействовать с такими липосомами даже если он включен в отрицательно заряженный комплекс с полианионом. По-видимому, это связано с тем, что увеличение размера липосом повышает гибкость мембраны: в нее могут встраиваться достаточно протяженные фрагменты адсорбированных макромолекул. Такой комплекс оказывается стабилизированным не только электростатическими, но и гидрофобными взаимодействиями.

Строение межфазных комплексов поликатион-мембрана требует дополнительных исследований. Однако уже сейчас ясно, что обнаруженное различие в поведении поликатионов, адсорбированных на поверхности малых и больших липосом, представляет очевидный практический интерес и должно быть принято во внимание при обсуждении биологического действия полиэлектролитов и биологически активных веществ на их основе.

Выводы:

1. Исследовано взаимодействие катионного полипептида, полилизнна (ПЛ), с жидкими малыми (диаметр около 50 нм) и большими (диаметр около 350 нм) липидными везикулами (липосомами), сформированными из смеси отрицательно заряженного кардиолипина (КЛ) и электронейтрального яичного лецитина (ЯЛ).

2. Адсорбция ПЛ на поверхности малых КЛ/ЯЛ (20/80) липосом определяется электростатическим взаимодействием положительно заряженных протонированных аминогрупп поликатиона с отрицательно заряженными группами КЛ. Целостность липосомальной мембраны при этом сохраняется. Комплекс ПЛ с малыми КЛ/ЯЛ (у>0,5) липосомами и большими КЛ/ЯЛ (80/20) липосомами помимо электростатических контактов дополнительно стабилизован гидрофобными взаимодействиями за счет встраивания адсорбированных макромолекул в гидрофобную часть липидного бислоя. Это приводит к появлению дефектов в липосомальной мембране.

3. В образовании ионных связей с адсорбированным ПЛ принимают участие только молекулы КЛ, находящиеся во внешнем монослое мембраны. КЛ молекулы внутреннего монослоя мембраны участия в образовании комплекса с ПЛ не принимают.

4. Адсорбция ПЛ на поверхности смешанных КЛ/ЯЛ липосом сопровождается латеральной сегрегацией липидов и формированием двух микрофаз, одна из которых обогащена молекулами КЛ, связанными в комплекс с ПЛ, другая - молекулами ЯЛ. Этот процесс развивается только во внешнем монослое мембраны.

5. Устойчивость комплексов ПЛ с КЛ/ЯЛ липосомами зависит от с состава и размера последних. ПЛ может быть полностью удален с поверхности малых липосом (у<0,5) при увеличении ионной силы раствора или в результате добавления избытка полианиона. Напротив, комплексы ПЛ с малыми (у<0,5) и большими липосомами устойчивы в водно-солевых средах и в присутствии избыточного количества полианиона.

6. Большие КЛ/ЯЛ липосомы способны без разрушения взаимодействовать с отрицательно заряженными интерполиэлектролитными комплексами ПЛ-полианион.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. О.Е.Кученкова, А.А.Ярославов. Адсорбция поли-Ь-лизина на поверхности отрицательно заряженных липосом, 6 Международная конференция по проблемам сольватации и комплексообразования в растворах, Иваново (Россия) 1995, Тезисы докладов, p.L-29.

2. O.E.Kuchenkova, A.A.Yaroslavov. Interaction of interpolyelectrolyte complexes with liposomes, 7 International conference on polymer supported reactions in organic chemistry, Wroslaw (Poland) 1996, Abstracts, p.328.

3. O.E.Kuchenkova. Interaction of poly-L-lysine with negatively charged liposomes, 11 International conference on chemistry of phosphorus compounds, Kazan (Russia) 1996, Abstracts, p.234.

4. A.A.Yaroslavov, V.Ye.Koulkov, E.G.Yaroslavova, O.Ye.Kuchenkova. Polycomplexes in contact with biomembranes, 213 ACS National Meeting, San Francisco (USA) 1997, abstracts, No.055.

5. А.А.Ярославов, О.Е.Кученкова, Е.Г.Ярославова, В.А.Кабанов. О кардинальном различии во взаимодействии жидких отрицательно заряженных липосом с полилизином и поли-М-этил-4-винилпиридиний бромидом, Доклады Акад. наук, 354 (1997) 350-354.

6. A.A.Yaroslavov, A.A.Efimova, O.Ye.Kuchenkova, E.A.Kiseliova. Polyelectrolyte-induced rearrangements in the bilayer lipid membrane, 9 International conference on surface and colloid science, Sofia (Bulgaria) 1997, Abstracts, p.440.

7. О.Е.Кученкова, А.А.Ярославов. Интерполиэлектролитные комплексы в контакте с липосомальной мембраной. Международная конференция "Фундаментальные проблемы науки о полимерах", Москва (Россия) 1997,

р.СЗ-54.

8. О.Е.Кученкова, А.А.Ярославов, В.А.Кабанов. Влияние размера отрицательно заряженных липосом на их взаимодействие с полилизином. Доклады Акад. наук (подготовлена для печати).